PROGRAMA Módulo teórico -Métodos para la caracterización fisiológica en diferentes niveles de regulación: Genoma, Transcriptoma, Proteoma, Metaboloma y Fluxoma. Introducción a Metabolómica y Fluxómica. -Metabolismo Central: Metabolismo energético, aporte de precursores para biomasa, anabolismo, catabolismo, anaplerosis, Coordinación de reacciones metabólicas -Modelos para analizar reacciones celulares: estequiometría de reacciones celulares, velocidades de reacción, Balance de masa. -Métodos para cuantificación de flujos metabólicos: análisis de flujos metabólicos, Análisis de balance de flujos, Análisis de vías metabólicas (modos elementales), nociones de MS y NMR en medidas de marcado, Experimentos con trazadores. -Aplicaciones: Producción de biocombustibles de segunda generación. Síntesis de biomateriales, biopolímeros, etc. Módulo práctico Los prácticos se desarrollarán durante las dos semanas de curso (48 horas) e incluirán sesiones de trabajo en laboratorio y análisis de datos in silico. Se estudiará la producción de un biopolímero de interés (polihidroxibutirato) empleando 13Cglucosa (U y marcada en posición 1) como fuente de carbono para el cultivo de un microorganismo. Se determinarán distintos parámetros del cultivo y posteriormente se analizará el perfil de marcado de aminoácidos proteinogénicos en el GC-MS (IIBCE). Los datos generados serán analizados mediante el software FIAT -Flux (Zamboni et al., 2005) para el correspondiente análisis de flujos metabólicos y METATOOL para el análisis de modos elementales de flujos. Se discutirán los resultados obtenidos. También se incluirán sesiones prácticas para el análisis in silico de los datos generados a partir del estudio de la producción de bioetanol por Saccharomyces cerevisiae empleando glucosa y xilosa como fuentes de carbono. Históricamente, S. cerevisiae ha sido ampliamente utilizado para la producción de alcohol a partir de glucosa. La producción industrial actual se basa en cultivos como la caña de azúcar, el almidón de maíz y otros, que también se utilizan para la alimentación y forraje. La competencia por estos commodities promueve la suba de precios de los alimentos y el combustible. Los compuestos químicos usados para producir etanol son azúcares, en general hexosas, presentes como tal en los vegetales, como disacáridos o en forma de almidón. Estos cultivos generan grandes cantidades de residuos, incluyendo material lignocelulósico. Dado que la lignocelulosa contiene glucosa (en celulosa y hemicelulosa), xilosa (más abundante en hemicelulosa) y arabinosa, se han investigado distintas estrategias dirigidas a consumir estos azúcares para generar el llamado bioetanol de segunda generación. S. cerevisiae no fermenta xilosa, aunque otras levaduras tienen la capacidad de fermentar los azúcares de pentosa en etanol. La vía de metabolización de xilosa en Scheffersomyces stipitis (anteriormente Pichia stipitis) incluye una xilosa reductasa (XR) (transforma xilosa en xilitol) y una xilitol deshidrogenasa (XDH) (transforma el xilitol en xilulosa). S cerevisiae tiene estas enzimas, pero muestra un metabolismo mínimo de xilosa, produciendo principalmente xilitol (Van Vleet y Jeffries 2009). En S. cerevisiae, la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) propias muestran preferencia por la producción de xilitol a partir de xilosa debido a su especificidad por el cofactor (Jeffries2006 ). La enzima XR de S. cerevisiae codificada por el gen GRE3, tiene una fuerte preferencia por NADPH como cofactor, mientras que el gen XYL2 que codifica XDH de S. cerevisiae, tiene una fuerte preferencia por NAD+ como cofactor (Jeffries 2006). Este proceso da lugar a una disminución gradual de la reserva de NADPH, que resulta en la acumulación de xilitol. El gen XYL1 de S. stipitis, que codifica para la XR, tiene especificidad doble y puede utilizar ya sea NADH o NADPH, permitiendo la reposición del NADH posteriormente. Esta descripción del primer paso del metabolismo de xilosa por distintas levaduras nos permite visualizar las distintas consideraciones que se deben tener en cuenta al pretender optimizar la producción de un producto. El AFM de S. cerevisiae ha sido ampliamente descrito por distintos investigadores (Pitkänen et al. 2003; Da Silva y Srikrishnan 2012) y la discusión de los resultados se tratará en el módulo práctico. -Da Silva N. A., and Srikrishnan, S.. 2012. Introduction and expression of genes for metabolic engineering applications in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 12:197-214. DOI: http://10.1111/j-1567-1346.2011.00769.x -Jeffries, T.W. 2006. Engineering Yeasts for Xylose Metabolism. Current Opinion in Biotechnology 17 (3) (June): 320–6. doi:10.1016/j.copbio.2006.05.008. -Pitkänen, J., Aristidou, A., Salusjärvi, L., Ruohonen, L., and Penttiläetabolic, L. 2003. Metabolic flux analysis of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae using continuous culture.Metabolic Engineering. 5(1): 16-31. -Van Vleet, J.H., and Jeffries, T.W. 2009. Yeast Metabolic Engineering for Hemicellulosic Ethanol Production. Current Opinion in Biotechnology 20 (3) (June): 300–6. doi:10.1016/j.copbio.2009.06.001. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19545992 -Zamboni, N., Fischer, E., and Sauer, U. 2005 FiatFlux – a software for metabolic flux analysis from 13C-glucose Experiments. BMC Bioinformatics.6:209 (http://www.biomedcentral.com/1471-2105/6/209) CRONOGRAMA Día Fecha Horario Tema de la clase Profesor Teórico / Práctico 1 13/04 8:30-9:30 Presentación del curso, entrega de material, mecanismo de evaluación, organización general Silvia Batista T Max Chavarría T Introducción al ensayo experimental: Producción de PHA: Preparación de inóculos de H. seropedicae en medio rico Ana Inés Catalán/Ana Karen Malán/Silvia Batista P 9:30-12:30 Metabolismo Central: Metabolismo energético, aporte de precursores para biomasa, anabolismo, catabolismo, anaplerosis, Coordinación de reacciones metabólicas. Pablo Nikel T 14:0018:00 Subcultivo de inóculos en medios definidos LGI con la fuente carbonada en estudio. Preparación de matraces para el cultivo en batch Ana Inés Catalán/Ana Karen Malán/Silvia Batista P 15/04 8:00-9:00 Cultivo en batch en medio LGI en condiciones de ensayo, empleando glucosa (sin marcar, Ana Inés Catalán/Ana U-marcada y marcada en Karen Malán/Silvia posición 1) Inicio de extracción de Batista muestras para determinaciones analíticas P 3 15/04 Modelos para analizar reacciones celulares: estequiometría de 9:30-12:30 José Gregorio Cabrera reacciones celulares, velocidades de reacción. Balance de masa. T 3 15/04 1 1 2 2 3 4 13/04 9:45-12:45 13/04 14:0018:00 14/04 14/04 16/04 16/04 13:0021:00 Métodos para la caracterización fisiológica en diferentes niveles de regulación: Genoma, Transcriptoma, Proteoma, Metaboloma y Fluxoma. Introducción a Metabolómica y Fluxómica. Extracción de muestras a cada hora para determinaciones analíticas Modelos para analizar reacciones celulares: estequiometría de reacciones celulares, velocidades de reacción. Balance de masa. 9:30-12:30 (continuación) 13:30- Procesamiento de muestras para Ana Inés Catalán/Ana Karen Malán/Silvia Batista P Pablo Nikel / Luis Acerenza T Ana Inés Catalán/Ana P 4 19:00 5 17/04 5 17/04 6 6 7 7 20/04 20/04 21/04 21/04 8 22/04 8 22/04 9 23/04 9 23/04 10 24/04 análisis (sobrenadante, biomasa, PHB, determinación de aminoácidos proteinogénicos) Métodos para cuantificación de flujos metabólicos: análisis de flujos metabólicos. Análisis de 9:00-12:30 balance de flujos. Análisis de vías metabólicas (modos elementales). 13:3019:00 Determinación de metabolitos excretados y fuente C en sobrenadante Análisis de flujos con isótopos marcados. Nociones de MS y 9:00-12:30 NMR en medidas de marcado, Experimentos con trazadores. 14:0019:00 Determinación GC-MS aas. proteinogénicos Aplicaciones: Producción de biocombustibles de segunda 9:30-12:30 generación. Síntesis de biomateriales, biopolímeros, etc. 14:0019:00 Análisis y procesamiento de datos Aplicaciones: Producción de biocombustibles de segunda 9:30-12:30 generación. Síntesis de biomateriales, biopolímeros, etc. 14:0019:00 Seminario Aplicaciones: Producción de biocombustibles de segunda 9:30-12:30 generación. Síntesis de biomateriales, biopolímeros, etc. 14:0019:00 Seminario/ Análisis in silico (S. cereviciae) Presentación de líneas de trabajo 8:30-12:30 de estudiantes y posibles aplicaciones del curso Karen Malán/Verónica Saravia/Raúl Platero Luis Acerenza T Ana Inés Catalán/Verónica Saravia P Max Chavarría/José Gregorio Cabrera T Ana Inés Catalán/ Manuel Minteguiaga/A. Karen Malán/Raúl Platero P Luiziana Ferreira T Ana I. Catalán/K. Malán/M. Minteguiaga(Raúl Platero P Pablo Nikel T Gregorio Cabrera/Luiziana Ferreira P José Gregorio Cabrera T Max Chavarría/ Pablo Nikel /Raúl Platero P T