PROCESO DE INACTIVACION VIRAL(ES2052872)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
ES 2 052 872
kInt. Cl. : A61L 2/18
11 N.◦ de publicación:
5
51
ESPAÑA
k
A01N 37/02
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 89122657.3
kFecha de presentación : 08.12.89
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 374 625
kFecha de publicación de la solicitud: 27.06.90
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Procedimiento de inactivación de virus.
k
73 Titular/es: Miles Inc.
k
72 Inventor/es: Seng, Richard L. y
k
74 Agente: Carpintero López, Francisco
30 Prioridad: 20.12.88 US 287368
1127 Myrtle Street
Elkhart Indiana 46514, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.07.94
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.07.94
Aviso:
k
k
Lundblad, John L.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
2 052 872
DESCRIPCION
Antecedentes de la Invención
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Campo:
Esta invención se refiere generalmente a procedimientos de inactivación vı́rica y especı́ficamente a
procedimientos de inactivación en productos proteı́nicos terapéuticos, biológicamente activos.
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Técnica Anterior:
La seguridad de los productos farmacéuticos es siempre motivo de preocupación, especialmente en
casos donde es posible la contaminación vı́rica (por ejemplo en productos obtenidos de la sangre, o en sistemas de cultivo celulares diseñados para producir proteı́nas biológicamente activas). Desgraciadamente,
los mismos productos en que se encuentran los virus son comúnmente lábiles y totalmente sensibles a
muchas técnicas de inactivación convencionales conocidas. También, en algunos casos, los esfuerzos para
proteger la proteı́na protegen también al virus.
Se han realizado diversos intentos para superar esta situación. Por ejemplo, se conoce bien que
las proteı́nas biológicamente activas pueden volverse inactivas mediante ciertos tratamientos por calor
controlados o mediante agentes quı́micos elegidos especı́ficamente. Se han ideado diversos tratamientos
por calor para inactivar virus sin afectar adversamente la actividad biológica de la proteı́na o reducir
sustancialmente su cantidad. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. 4.440.679, concedida a Fernández y
Lundblad (estabilizadores de carbohidratos para la pasteurización de la proteı́na de la coagulación muy
lábil conocida como Factor VIII) y la Patente U.S. 4.762.714 concedida a Mitra y Mozen (que muestra
la inactivación vı́rica en un producto inmune a la globulina mediante condiciones de pH, temperatura y
tiempo controladas). Véase también, la Patente U.S. 4.456.590 de Reubenstein que muestra que el Factor
VIII puede someterse a condiciones de pasteurización (al menos a 60◦ C durante 10 horas) si se liofiliza
primero, y la patente U.S. 4.495.278 de Thomas (tratamiento por calor similar del Factor IX liofilizado).
Se han usado también diversos métodos quı́micos para inactivar virus. Véase, por ejemplo, la Patente
U.S. 4.534. - 972, de Lembach (uso de fenantrolina de cobre y productos relacionados) y la Patente U.S.
4.481.189 de Horowitz (uso de fosfato de tri - n - butilo y compuestos relacionados).
Se han usado ácidos carboxı́licos tales como el ácido caprı́lico tanto en la preparación de productos
de plasma (precipitación de globulinas) como incluso en la inactivación de virus revestidos de lı́pidos,
pero no en la presencia de proteı́nas terapéuticas biológicamente activas (véase J. A. Sands y otros, Anti
Microbial agents and Chemotherapy, enero 1979, página 134 - 136). Los ácidos carboxı́licos (caprilato de
sodio) se han utilizado también en combinación con calor y aminoácidos para la inactivación vı́rica del
Factor VIII (véase la Patente US 4.446.136 de Naito y otros). Véase también, el uso secuencial de ácidos
grasos para la inactivación de derivados de plasma como se describe por Horowitz y otros, Vox. Sang.
54:14 - 20 (1988).
La precipitación de las proteı́nas del plasma totales con ácido caprı́lico sin afectar al IgG, ceruloplasmina e IgA se ha descrito (Steinbuch, M. y Audran,r.,Arch. Biochem. Biophys., 134, 279 - 294 [1969]).
Los sueros o plasma de seres humanos, equinos, ovinos y conejos se diluyeron con tampón de acetato 0,06
M hasta aproximadamente 1,7% de proteı́nas, se ajustó a pH 4,8 a 20◦ C, y se hizo 0,174 M (2,5% en
peso) con respecto al ácido caprı́lico. La atención a la molaridad del tampón (0,06 M) y al pH (pH 4,8
+ 0,05) era crı́tica para un IgG de elevada pureza.
El método de precipitación de Steinbuch, M., véase anteriormente se ha aplicado a medios gastados
de cultivos de hibidroma y fluidos ascı́tico del ratón, usando ácido caprı́lico a una concentración de 0,066
M (0,86% en peso) para la recuperación de IgG (Russo, C., Callegaro, L., Lanza, E., Ferrone, S., J.
Immunol. Methods, 65, 269 - 271 [1983]). El mismo método se aplicó a plasma humano diluido ajustado
a ácido caprı́lico 0,15 M, ó 2,16% en peso, (Habeeb, A. F. S. A. y Francis, E. R., Prep. Biochem., 14 (1),
1 - 17 [1984]).
El IgA aislado de la Fracción III en etanol frı́o de Cohn mediante adsorción con DEAE celulosa y
elución se purificó posteriormente por separación de la alfa - 2 macroglobulina mediante precipitación
con ácido caprı́lico (Pejaudier, L., Audran, R. y Steinbuch, M., Vox Sang., 23, 165 - 175 [1972]). Los
parámetros para la precipitación consistı́an de 1,5 a 2,0% de concentración de proteı́na ajustada a cloruro
de sodio 0,9%, pH 5, y se añadió ácido caprı́lico a temperatura ambiente hasta 0,078 M ó 1,12% en peso.
La alfa - 2 macroglobulina precipitada se separó por centrifugación.
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El ácido caprı́lico se usó para precipitar la mayor parte de las proteı́nas y lipoproteı́nas distintas que
las inmunoglobulinas presentes en la Fracción III en etanol frı́o de Cohn (Steinbuch, M., Audran, R.,
Pejaudier, L., Blatrix, C., Prep. Biochem., 3 (4), 363 - 373 [1973]). Una suspensión de Fracción III a
aproximadamente 2,5% de proteı́na se ajustó a acetato 0,05 M a pH 4,8 y se llevó a temperatura ambiente. Se añadió ácido caprı́lico a una concentración 0,174 m ó 2,5% en peso. Se eliminó el precipitado
resultante. El sobrenadante se enriqueció con IgG, IgM ó IgA. Deberı́a advertirse que en todos los casos
donde se usó ácido caprı́lico como agente precipitante, está presente en una cantidad considerablemente
superior a su solubilidad máxima en agua bajo condiciones ideales de pH, temperatura y disponibilidad
de ácido caprı́lico (como se discute más adelante). Tales cantidades, comúnmente aproximadamente 0,86
- 2,5% en peso, son necesarias para asegurar cantidad suficiente del relativamente insoluble ácido caprı́lico
en una forma insoluble (una emulsión), útil ası́ como un agente precipitante.
A pesar de las numerosas publicaciones anteriores, no tenemos conocimiento de método que use ácido
caprı́lico en cantidad menor a una concentración de precipitación y sólo para inactivar sustancialmente
todos los virus revestidos de lı́pidos sin afectar adversamente la actividad biológica o la cantidad recuperable de proteı́nas terapéuticas. Hemos encontrado que por control cuidadoso de las condiciones de su
uso, se puede usar ácido caprı́lico para inactivar virus revestidos de lı́pidos en un producto terapéutico
biológicamente activo sin afectar biológicamente la actividad del producto. Los detalles de nuestros descubrimientos se muestran más adelante.
Resumen de la invención
25
Los beneficios de nuestro método se basan en el preciso control de la cantidad de ácido caprı́lico sin
ionizar generado de acuerdo a la siguiente reacción de disociación:
CH3 (CH2 ) 6 COO− + H+
forma ionizada
CH3 (CH2 ) 6 COOH
ácido caprı́lico
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60
Ası́, nuestro método de inactivar sustancialmente todos los virus revestidos de lı́pidos en un producto
terapéutico, proteı́nico, biológicamente activo, lábil, comprende la etapa de poner en contacto el producto
con ácido caprı́lico bajo condiciones de concentración, pH y ambiente iónico suficiente para controlar la
cantidad de ácido caprilico sin ionizar y asegurar todavı́a la inactivación de los virus sin afectar adversamente la cantidad, actividad biológica y eficacia terapéutica del producto.
En una realización preferida, el procedimiento de inactivación de la invención contempla el uso selectivo de una concentración de sal de caprilato y pH para controlar la cantidad de ácido caprı́lico generado
sin afectar adversamente la estabilidad o cantidad de la proteı́na en particular que están siendo inactivada.
La pérdida indeseable de proteı́na se evita al asegurar condiciones que no den lugar a la formación de
más de 0,068, o aproximadamente 0,07% de ácido caprı́lico, su máxima solubilidad. Las concentraciones
de ácido caprı́lico que exceden de aproximadamente de 0,07% (base % en peso) puede da - - lugar a una
emulsión del ácido caprı́lico y la proteı́na, dando lugar ası́ a una pérdida indeseable de proteı́na. Por otra
parte, la cantidad de ácido caprı́lico debe ser suficiente (al menos 0,001%) para asegurar la inactivación
de los virus revestidos de lı́pidos dentro de un tiempo razonable. Sorprendentemente, a pHs inferiores (6,5
ó menos) si el ácido caprı́lico está presente a 0,07 a 0,001%, la inactivación de los virus se consigue casi
instantáneamente. A pHs superiores, donde el caprilato es claramente la especie dominante, se requiere
una concentración superior y un tiempo más prolongado para conseguir la misma reducción logarı́tmica
de los virus. Ası́, en una realización preferida, la concentración de ácido caprı́lico útil para esta invención
está en el intervalo de 0,07 a 0,001% sobre una base de % en peso.
La ventaja principal de la invención es su versatilidad. A una concentración baja la invención puede
usarse a bajo pH para inactivar instantáneamente ciertos virus. El método permite también inactivar, si
es necesario, a pHs más elevados a concentraciones superiores y tiempos más prolongados. Esto permite
seleccionar una inactivación al pH más estable de la proteı́na de interés de tal manera que la proteı́na
no se altere o destruya durante la inactivación del virus. Ası́, en los casos preferidos, la concentración
de ácido caprı́lico está en el intervalo de 0,07 a 0,001% sobre una base de % peso/peso en agua, y esto
se controla por control tanto del pH como de la cantidad de caprilato en forma iónica (esto es tal como
caprilato de sodio) como se discute en más detalle más adelante.
El ácido caprı́lico tiene ventajosamente una toxicidad baja, inofensiva para los seres humanos, y se
usa actualmente como un estabilizante para la albúminao la fracción proteı́nica del plasma (PPF) que se
infunde en grandes cantidades a los pacientes humanos. otra ventaja de la invención es que asegura la
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disponibilidad de proteı́nas terapéuticamente activas libres de virus tales como IgM/IgG que se purifica
de la pasta de Fracción III de Cohn, un notorio deposito de virus del plasma. Una ventaja básica es que
es un procedimiento que, cuando se controla cuidadosamente, es suave para las proteı́nas y es aplicable
a cualquier proteı́na estable en alguna parte entre aproximadamente pH 4,0 y pH 8,0.
5
Breve descripción de la figura
La figura es un gráfico con respecto a la concentración de ácido caprı́lico al pH y al tiempo de inactivación
vı́rica de una solución dada.
10
Descripción Detallada y Realizaciones Especı́ficas.
Por convención bioquı́mica estándar y como se usa aquı́, el sufijo “ - ato” (es decir, caprilato) denota
cualquier mezcla del ácido y su forma ionizada, como en la reacción de disociación:
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CH3 (CH2 ) 6 - COOH
ácido caprı́lico
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CH3 (CH2 )
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- COO− + H+
forma ionizada
El pKa del ácido caprı́lico es de 4,89 (CRC Handbook of Chemistry and Physics, Edición 56). La
ecuación de Henderson - Hasselbalch:
[forma ionizada]
[ácido]
pH = pKa + log
25
6
da la concentración del ácido y su forma ionizada a diversos pHs. Ası́, se puede proveer fácilmente una
concentración dada de ácido caprı́lico mediante control cuidadoso del pH y de la concentración de caprilato. Por ejemplo, si la concentración de ácido caprı́lico se mantiene constante a 0,07% (0,0035 M)
y la forma ionizada (por ejemplo, caprilato de sodio) se varı́a entre 0,06% a pH 4,9 y 2,0% a pH=8, se
produce la cantidad de ácido caprı́lico que se muestra en la Figura 1. Como se usa aquı́, el ácido caprı́lico
se refiere a la forma sin ionizar del ácido (conocido también como ácido octanóico).
Se ha encontrado que es relativamente fácil conseguir una concentración práctica y preferida de ácido
caprı́lico. Esto puede efectuarse por variación de la concentración de caprilato de sodio entre 0,1% a
pH 4,8 y 20% a aproximadamente pH = 9,0 para proporcionar una inactivación instantánea de los virus
revestidos de lı́pidos. Más preferiblemente, la concentración total de caprilato se mantiene entre 0,1% a
pH 4,8 y se incrementa linealmente hasta 2,0% a 6,5 para dar una inactivación instantánea de los virus.
Alternativamente, el caprilato puede mantenerse a 2% entre pH 6,5 y 9,5 durante un perı́odo mayor de
tiempo (por ejemplo, 2 a 4 horas) para dar una concentración apropiada de ácido caprı́lico para la inactivación de los virus. La premisa aquı́ es que la forma del ácido sin ionizar (ácido caprı́lico) es el agente
activo en matar los virus de alguna manera que afecta la envoltura de lı́pidos o las proteı́nas encajadas
en ella y que debido a la reacción de disociación el ácido caprı́lico puede mantenerse a una concentración
suficientemente elevada a pHs más elevados por incremento de la concentración de la forma ionizada
(caprilato de sodio) para matar los virus.
La mezcla de la composición de proteı́na y agentes de inactivación vı́rica y bacteriana se mantienen
usualmente a una temperatura de 2 - 60◦C (preferiblemente 4 - 20◦ C) durante un perı́odo de al menos de
0,25 horas (preferiblemente 0,5 - 3 horas). Como se advirtió anteriormente, el tratamiento de la invención
se realiza usualmente bajo condiciones de pH que son compatibles con el material proteı́nico que está
siendo tratado. Ası́, dependiendo de la proteı́na, el ph de la mezcla deberı́a estar generalmente dentro
del intervalo de 4 - 10, preferiblemente 4,5 a 8,5, más preferiblemente 4,8 a 8,0 para la mayor parte de las
proteı́nas biológicamente activas. En general, los intervalos de pH y temperatura se eligen para asegurar
el menor trastorno a la proteı́na activa en la composición. Aquellos especializados en la técnica están
familiarizados con los intervalos de pH preferidos para una dada proteı́na.
Aquellos con experiencia en la técnica añadirı́an también estabilizantes adecuados para la proteı́na de
interés durante el tratamiento de la mezcla como se describió anteriormente. La composición proteı́nica
puede tratarse posteriormente para separar el ácido caprı́lico/caprilato añadido. Puede emplearse para
conseguir este fin técnicas convencionales. Por ejemplo, la mezcla puede dializarse o la proteı́na de interés
puede unirse a una resina cambiadora de ion y lavarse para separar el ácido caprı́lico/caprilato añadido
con la subsiguiente elución de la proteı́na de interés. otros medios de separación de los agentes se le
ofrecerá a aquellos especializados en la técnica.
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Se ha encontrado que nuestro tratamiento de inactivación vı́rica opera sobre una amplia variedad de
proteı́nas terapéuticas biológicamente activas tales como anticuerpos (derivados de plasma y monoclonales), albúmina del suero humano, factores de coagulación fibronectina y transferrina.
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Definición de Términos
El ácido caprı́lico significa la forma no ionizada como se definió anteriormente. Como se usa aquı́, la
reducción sustancial de la infectividad significa que el tı́tulo de la infectividad vı́rica de una preparación
dada se reduce al menos 4 unidades logarı́tmicas o hasta un nivel no detectable (nivel ND). Inactivación
vı́rica sustancialmente instantánea significa que la inactivación se produce antes de que el tı́tulo vı́rico
pueda medirse (por ejemplo, es no detectable) usando técnicas convencionales puntuales. Sin afectar
adversamente la actividad biológica significa que el contacto con el ácido caprı́lico da lugar a menos
de aproximadamente 30% de pérdida de la actividad biológica original usando técnicas convencionales
para la proteı́na de interés biológicamente activa. sin afectar adversamente la cantidad de la proteı́na
biológicamente activa significa que el contacto con el ácido caprı́lico da lugar a una pérdida de menos del
40% de la cantidad de proteı́na original (la cantidad de tratamiento de inactivación pre - vı́rica). Esta es
preferiblemente menos de aproximadamente 10%. Un virus revestido de lı́pidos, como se utiliza aquı́, significa un virus cuyo ácido nucleı́co está encapsulado por una capsida que contiene lı́pidos. Estos son bien
conocidos para aquellos especializados en la técnica, ası́ como la expresión virus envuelto (o revestido)
por lı́pidos. Terapéutico significa capaz de proveer un efecto médico beneficioso cuando se administra a
un mamı́fero.
Ejemplos de nuestra descripción se dan a continuación para mostrar como variables tales como las
concentraciones de ácido caprı́lico y caprilato, pH, temperatura y tiempo, pueden afectar la reducción de
la infectividad vı́rica, recuperación de la proteı́na, y retención de la actividad biológica de la proteı́na.
Ejemplo 1
30
35
40
45
Se produjo anticuerpo (humano) IgM monoclonal de la Pseudomonas aeruginosa por linfocitos B
humanos (A.T:C.C. CRL 8752) transformados por el virus de Epstein - Barr (EBV). Las células pre transformadas se obtuvieron de donantes que tienen tı́tulos de anticuerpo existentes naturalmente especı́ficos a uno de los siete serotipos Fisher - Devlin, F - 4. El antı́cuerpo se fija a un determinante
serotı́pico sobre las moléculas de liposacáridos superficiales de esa bacteria. El cultivo de células cosechado para el anticuerpo F - 4 se clarificó, se purificó parcialmente y se ajustó a pH 8 con NaOH 1 N. A
temperatura ambiente (R.T.) la solución de IgM a 0,38 mg/ml (19 mg en total) se puso inicialmente en
contacto con el virus del Herpes Simplex I (HSV - 1) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV). después
de esto se añadió 2% en peso de caprilato de sodio y la solución se reajustó a pH 8 lo que por el calculo
de Henderson - Hasselbalch a pH 8 representa 0,0014% en peso de ácido caprı́lico y 1, 9986% en peso de
caprilato en forma ionizada. Después de inutilizar el virus la solución se conservó durante 60 minutos.
Las Muestras de pretratamiento del virus inutilizado sirvieron como controles en este y en los ejemplos
posteriores.
Los valores del rendimiento en proteı́na Ps MAb - IgM F - 4 se basaron en los ensayos de difusión
inmuno radial (RID). La actividad funcional se estableció como la capacidad especı́fica de fijación al lipo
poli - sacárido (LPS). Los estudios en posteriores Ejemplos del IgM F - 4 demuestran asimismo una
capacidad no menor de fijación al LPS.
Los resultados del Ejemplo 1 se muestran en la Tabla I:
TABLA I
50
Temp
Tiempo
(minutos)
Ambiente
0
60
120
55
60
IgM (f - 4)
mg % Rendimiento
Capacidad
fijación
al LPS,%
19,0
100
100
19,2
101
98
N.D.: No detectable (limite inferior de detección ≤ 1,5)
5
Virus
(Log10 TCID50 /ml)
HSV - 1
VSV
5,25
N.D
N.D.
7,0
N.D.
N.D.
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Ejemplo 2
5
Se preparó Ps MAb IgM (F - 4) y se trató como en el Ejemplo 1 con la excepción de que en adición
al VSV, el estudio incluyó el virus de Epstein Barr (EBV) y la etapa de inactivación se realizó a una
temperatura más baja (5◦ C). Después de inactivar el virus la solución se mantuvo 120 minutos.
Los resultados del Ejemplo 2 se muestran en la Tabla II.
TABLA II
10
Temp
Tiempo
(minutos)
5◦ C
0
60
120
IgM (F - 4)
mg % Rendimiento
Virus (Log10 TCID50 /ml)
VSV
EBV
19,0
—
19,4
7,50
5,75
5,0
15
20
100
—
102
7,9
3,7
N.T.
N.T.: No ensayado
25
30
Ejemplo 3
Se preparó Ps MAb IgM (F - 4) como en el Ejemplo 1 con la excepción de que la solución de IgM
para inactivación parcialmente purificada estaba a 5◦ C y se ajustó a pH 4,8 con HCl 1N. La muestra se
puso inicialmente en contacto con virus y después de esto se añadió 0,1% en peso de ácido caprı́lico y se
reajustó a pH 4,8 con NAOH 1N lo que por el calculo de Henderson - Hasselbalch a pH 4,8 representa
0,055% en peso de ácido caprilico y 0,045% en peso de caprilato en forma ionizada. Después de inactivar
el virus la solución se mantuvo 60 minutos a 4◦C.
Los resultados del Ejemplo 3 se muestran en la Tabla III.
35
TABLA III
Temp
Tiempo
(minutos)
5◦ C
0
30
60
40
45
IgM (F - 4)
mg % Rendimiento
9,5
100
10,3
108
Virus (Log10 TCID50 /ml)
HSV - 1
VSV
6,75
3,25
N.D
7,5
6,0
5,5
N.D.: No detectable (limite inferior de detección ≤ 1,5)
50
55
60
Ejemplo 4
Se produjo anticuerpo IgG (humano) de la exotoxina A de Pseudomonas (MAb Exo A IgG) por
linfocitos B humanos transformados por EBV (A.T.C.C. CRL 8833) obtenidos de donantes que tienen
tı́tulos de anticuerpos a la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa existentes naturalmente. El cultivo
de células cosechadas para MAb Exo A IgG se clarificó y purificó. A 5◦ C el MAb Exo A IgG se ajustó a
0,5 mg/ml (25 mg total) a pH 6,5, se puso en contacto inicialmente con virus VSV y HSV - 1. Después
de esto se añadió 2,0% en peso de caprilato de sodio y se reajustó a pH 6,5 con HCl 1N lo que por el
calculo de Henderson - Hasselbalch a pH 6,5 representa 0,042% en peso de ácido caprı́lico y 1,958% en
peso de caprilato en forma ionizada. Después de inactivar la solución se mantuvo durante 30 minutos.
6
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Los resultados del Ejemplo 4 se muestran en la Tabla IV.
TABLA IV
5
Temp
Tiempo
Tratamiento
(minutos)
IgM (F - 4)
mg % Rendimiento
Virus (Log10 TCID50 /ml)
VSV
HSV - 1
25
26
7,5
N.D.
10
5◦ C
15
0
30
100
104
7,0
N.D.
N.D.: No detectable (limite inferior de detección ≤ 1,5)
Ejemplo 5
20
25
Se preparó MAb Exo A IgG como en el ejemplo 4 excepto que se aplicó dos concentraciones de
caprilato de sodio como se indica en los resultados. Las nuestras para los estudios de la eficacia de la
inactivación vı́rica estaban a pH 6,3 y 5◦ C durante 60 minutos de contacto. Las especies de virus incluyen
el VSV, HSV - L, el virus de las viruela vacuna y el virus sindbis.
Los resultados del Ejemplo 5 se muestran en la Tabla V.
TABLA V
30
Temperatura
35
5◦
40
45
50
Tiempo
Tratamiento
(minutos)
0
1
10
15
20
30
60
Virus (Log10 TCID50 /ml)
HSV - 1
Viruela Vacuna
A
B
A
B
VSV
A∗
B∗∗
8,0
—
2,7
—
2,5
2,75
—
7,5
1,5
ND
—
ND
—
—
6,25
—
ND
—
ND
—
—
6,5
ND
ND
—
ND
—
—
5,25
—
5,0
—
5,0
4,25
—
5,0
—
—
ND
—
—
—
Sindbis
A
8,5
—
—
—
—
ND
—
ND: No detectable (limite inferior de detección ≤ 1,5)
A∗ Las muestras recibieron 1,0 % en peso de caprilato de sodio y se reajustaron a pH 6,3 con HC1
1N que por el cálculo de Henderson - Hasselbalch representa 0,033% en peso de ácido caprı́lico y
0,967% en peso de caprileto en forma ionizada
B∗∗ Las muestras recibieron 2,0% en peso de caprilato de sodio y se reajustaron a pH 6,3 con HCl 1N
lo que por el cálculo de Handerson - Hasselbalch represente 0,065% en peso de ácido caprı́lico y
2,935% de caprilato en forma ionizada.
55
Ejemplo 6
60
Dos virus no revestidos por lı́pidos, el Parvovirus Bovino (BPV) y el Polio II, se hicieron reaccionar
con ácido caprı́lico para demostrar la falta de eficacia en contraste con la inactivación de virus revestidos
de lı́pidos. Se preparó MoAb IgM (F - 4) y se trató quı́micamente como en el Ejemplo 1 con la excepción
de que la temperatura de inactivación era de 5◦ C y el virus era el BPV. Se preparó MoAb Exo A IgG y
se trató quı́micamente como en el Ejemplo 5 con la excepción de que la solución de IgG se ajustó a pH
6,3. Las muestras de IgG se pusieron inicialmente en contacto con los virus BPV y Polio II y después de
7
2 052 872
esto se añadió caprilato de sodio al 2% en peso y se reajustó a pH 6,3 con HCl 1N lo que por el cálculo
de Henderson - Hasselbalch a pH 6,3 consiste de 0,065% en peso de ácido caprı́lico y 1,935% en peso de
caprilato en forma ionizada. Después de inactivar el virus la solución se mantuvo 120 minutos.
5
Los resultados del Ejemplo 6 se muestran en la Tabla VI.
TABLA VI
10
15
Temperatura
Tiempo Tratamiento
(minutos)
5◦ C
0
30
60
120
Virus (Log10 TCID50/ml)
Ps MoAb IgM MAb Exo A IgG
BPV
BPV
Polio II
2,75
3,75
3,00
3,25
3,50
3,25
3,25
3,50
6,00
—
6,25
6,50
20
Ejemplo 7
25
Se aisló albúmina de suero humano del Sobrenadante IV - 4 del método de purificación con alcohol
frı́o de E.J. Cohn. La albúmina se ajustó a una concentración de 0,5 mg/ml (25 mg total) a pH 6,0. A
4◦C la solución de albúmina se puso en contacto con el virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) y después
de esto se añadió caprilato de sodio a 1,0% en peso y se reajustó a pH 6,0 con HCl 1N lo que por el
cálculo de Henderson - Hasselbalch a pH 6 representa 0,062% en peso de ácido caprı́lico y 0,938% en peso
de caprilato en forma ionizada. Después de inactivar el virus la solución se mantuvo 60 minutos.
30
Los resultados del Ejemplo 7 se muestran en la Tabla VII.
TABLA VII
35
Temperatura
40
45
4◦ C
Tiempo
(minutos)
Albumina
% Rendimiento
VSV (Log10 TCID50 /ml)
mg
0
60
25,00
24,75
100
99
6,75
N.D.
N.D.: No detectable (lı́mite inferior de detección ≤ 1,5)
Ejemplo 8
50
55
Se separó proteı́na del suero humano enriquecida con los factores de coagulación lábiles II, VII, IX y
X por adsorción por cambio de anión del Efluente I del método de purificación con etanol frı́o de E. J.
Cohn. Los factores de coagulación fluidos se purificaron posteriormente y se ajustó a una concentración
de proteı́nas de 1,73 mg/ml a pH 6,8. Se añadió caprilato de sodio a una concentración de 2,0% en peso
y se reajustó a ph 6,8 con HCl 1N lo que por el cálculo de Henderson - Hasselbalch a pH 6,8 representa
0,022% en peso de ácido caprı́lico y 1,978% en peso de caprilato de forma ionizada. Después de la
incubación a 4◦C durante 2 horas las proteı́nas de coagulación se separaron de los productos quı́micos
reaccionantes mediante cromatografı́a de exclusión por tamaño usando Sephadex G - 50. Los resultados
de los rendimientos basados sobre la actividad de coagulación funcional se muestran en la Tabla VIII.
60
8
2 052 872
TABLA VIII
Temperatura
5
5◦
20
25
Descripción
Muestra
Factores de Coagulación (unidades/ml)
II
VII
IX
X
0
sin tratar
120
tratada
Porcentaje
Rendimiento Funcional
10
15
Tiempo
(minutos)
1,82
1,89
0,17
0,19
1,59
1,60
2,09
2,12
104
112
101
101
Ejemplo 9
Se aı́sla proteı́na enriquecida en fibronectina de una fracción de proteı́na desechada durante la purificación del Factor VIII humano del crioprecipitado. La fibronectina se ajustó a una concentración de
proteı́na de 1,34 mg/ml a pH 6,9 (33,5 mg en total). Se añadió caprilato de sodio a una concentración
de 2,0% en peso y se reajustó a pH 6,9 con HCl 1N lo que por la ecuación de Henderson - Hasselbalch
a pH 6,9 representa 0,014% en peso de ácido caprı́lico y 1,986% en peso de caprilato en forma ionizada.
Después de incubación a 5◦ C durante 1 hora la fibronectina se separó de los productos quı́micos reaccionantes por cromatografı́a de exclusión por tamaño usando Sephadex G - 50. Las muestras antes y
después del tratamiento con ácido caprı́lico se ensayaron por el ensayo de inmunosorbente unido a enzima
para establecer el rendimiento y se analizaron para cambios estructurales por cromatografı́a lı́quida de
proteı́nas rápidas (PPLC). Los resultados del Ejemplo 9 se muestran en la Tabla IX.
TABLA IX
30
Temperatura
35
40
45
50
Tiempo
(minutos)
mg
0
60
33,5
32,7
5◦ C
Fibronectina
% Rendimiento
100,0
97,8
Ejemplo 10
Se aisló transferrina, conocida también como globulina a, de combinación de metal, de la Fracción IV
- 1 del método de purificación con alcohol frı́o de E. J. Cohn. La transferrina se ajustó a 3,35 mg/ml (105
mg en total) a pH 6,8. Se añadió caprilato de sodio a una concentración de 2,0% en peso y se reajustó
a pH 6,8 con HCl 1N lo que por el cálculo de Henderson - Hasselbalch a pH 6,8 representa 0,022% en
peso de ácido caprı́lico y 1,978% en peso de caprilato en forma ionizada. Después de incubación a 5◦C
durante 60 minutos, la fibronectina se separó de los productos quı́micos reaccionantes por cromatografı́a
de exclusión por tamaño usando Sephadex G - 50. Las muestras antes y después del tratamiento con ácido
caprı́lico se ensayaron por RID para establecer rendimientos y se analizaron para cambios estructurales
por FPLC. Los resultados del experimento 10 se muestran en la Tabla X.
TABLA X
55
60
Temperatura
5◦ C
Tiempo
(minutos)
mg
0
60
105
100
Transferrina
% Rendimiento
100
103
9
Cambios Estructurales
Agregados Fragmentos
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
2 052 872
N.D.: No detectable
Ejemplo 11
5
10
Se recuperó crioprecipitado por centrifugación de conjuntos deshelados de plasma humano congelado
reciente. Se recuperó el Factor de Coagulación VIII, conocido también como Factor antihemofı́lico (AHF)
del crioprecipitado y se purificó. La solución de AHF purificada se ajustó a una concentración de AHF
de 1,7 unidades/ml (46,2 unidades AHF en total) a pH 7,2. A 5◦ C se añadió caprilato de sodio a una
concentración de 2,0% en peso y se reajustó a pH 7,2 con HCl 1N lo que por el cálculo de Henderson Hasselbalch a pH 7,2 representa 0,0087% en peso de ácido caprı́lico y 1,9913% en peso de caprilato en
forma ionizada. Después de incubación a 5◦ C durante 2 horas la proteı́na enriquecida con AHF se separó
de los productos quı́micos reaccionantes por cromatografı́a de exclusión por tamaño usando Sephadex
G - 50. Los resultados de los rendimientos basados sobre la actividad de coagulación del Factor VIII
funcional se muestran en la Tabla XI.
15
TABLA XI
Temperatura
Tiempo
(minutos)
5◦ C
0
120
20
25
Factor VIII
Unidades totales % Rendimiento
46,2
27,2
100
59
Ejemplo 12
30
35
Inmunoglobulina M (IgM - pd) obtenida del plasma humano purificada de la Fracción III se estudió
para dilucidar el papel del pH bajo (pH 4,8) en la destrucción del virus. La Fracción III en pasta se
trató del plasma humano normal por el método de fraccionamiento con etanol frı́o de Cohn - Oncley. La
Fracción III en pasta se suspendió por mezcla a 20◦C en acetato de sodio 0,05 M a pH 4,0. Las proteı́nas
insolubles se separaron por centrifugación y filtración. El filtrado clarificado, enriquecido en IgM - pd se
ajustó a pH 4,8. A 5◦ C la solución de IgM - pd se puso en contacto con VSV. Unamuestra de medios de
cultivo tisular (T.C.) se puso en contacto con VSV como control. No se añadió ácido caprı́lico a ninguna
de las muestras. Después de inactivar el virus las muestras se ensayaron para infectividad a intervalos de
hasta 8 horas. Los resultados del Ejemplo 12 se presentan en la Tabla XII.
TABLA XII
40
Temperatura
Tiempo
(horas)
Infectividad
IgM - pd
(Log10 TCID50 /ml)
Control T.C.
5◦ C
0
2
6
8
6,75
6,75
7,25
>6,5
8,0
N.T.
N.T.
7,5
45
50
N.T.: No ensayado
55
Dadas las descripciones y Ejemplos anteriores se presentarán variaciones a aquellos especializados en
la técnica. De acuerdo con esto, se piensa que la invención descrita aquı́ deberı́a estar limitada solamente
por las reivindicaciones siguientes.
60
10
2 052 872
REIVINDICACIONES
5
1. Un método de inactivación de un virus envuelto en lı́pidos en una solución de proteı́nas terapéuticas
biológicamente activas, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto la solución con ácido
caprı́lico bajo condiciones suficientes para reducir sustancialmente la infectividad del virus sin afectar
adversamente la cantidad y actividad y biológica de las proteı́nas.
2. El método de la Reivindicación 1, en donde el ácido caprı́lico está en la forma sin ionizar en una
cantidad en el intervalo de 0,07 a 0,001%, sobre una base de % en peso en agua.
10
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la infectividad se reduce a un nivel no detectable.
4. El método de las reivindicaciones 1 - 3 en donde, las condiciones de concentración de ácido caprı́lico
y de pH de la solución son aquellas definidas por la zona sombreada de la Figura.
15
20
25
5. El método de las reivindicaciones 1 - 4 en donde, la proteı́na terapéutica biológicamente activa es
un anticuerpo IgM y el pH de la solución es 8,0 o es anticuerpo IgG y el pH es 6,3.
6. El método de las reivindicaciones 1 - 4, en donde la proteı́na terapéutica biológicamente activa
es un anticuerpo humano monoclonal, que comprende la etapa de poner en contacto el virus con ácido
caprı́lico a una concentración en el intervalo de 0,07% a 0,001% sobre una base de % en peso durante un
tiempo suficiente para reducir el tı́tulo del virus a un nivel no detectable.
7. El método de la reivindicación 6, en donde los anticuerpos son anticuerpos que se fijan a un determinante serotipo sobre las moléculas de lipopolisacárido de una bacteria Pseudomonas aeruginosa..
8. El método de la reivindicación 7 en el que la bacteria es una de los inmunotipos 1 a 7 de Fisher Devlin.
30
9. El método de la reivindicación 8, en donde la bacteria es un inmunotipo 4 Fisher.
10. El método de la reivindicación 6, en donde los anticuerpos son anticuerpos que se fijan a la
exotoxina de em Pseudomonas aeruginosa.
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
11
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12