Comparación de Técnicas Utilizadas en la Preparación de

Comparación de Técnicas Utilizadas en la Preparación de Mandioca
para su Observación al Microscopio Electrónico de Barrido
López, Alfredo E.
Servicio de Microscopía Electrónica de Barrido, MEB - UNNE.
Cátedra de Cultivos III, Fac. Cs. Agrarias.
Sgto. Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina.
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
La observación de la mayoría de los tejidos de origen vegetal utilizando el Microscopio Electrónico de
Barrido (MEB) convencional requieren de una cuidadosa preparación de los especímenes con el objeto de
deshidratarlos y de esta manera evitar el colapso de las estructuras celulares así como la producción de
artefactos debidos a la exposición al alto vacío (Uwins et al., 1993; Sorrivas y Morales, 1991; Anónimo,
1997).
Hasta la aparición de la Microscopía Electrónica de Barrido de Bajo Vacío o Ambiental no era posible la
observación de material sin procesar (Anónimo 1995), por lo que los biólogos habían trabajado en la
elaboración de complejos procedimientos dirigidos a preservar las estructuras celulares. A pesar de ello se
realizaron pocos trabajos de comparación de técnicas involucradas en la preparación de muestras aplicadas a
un mismo material, entre ellos los trabajos de Parsons et al., (1973), Hardy et al., (1992) y Uwins et. al.,
(1993). En la utilización del MEB Ambiental se utilizan presiones de trabajo comprendidas entre 100 y 1000
Pa (Goldstein et al., 1993) evitando de esta manera la deformación de los especímenes por vacío y la
aparición del efecto de carga (Anónimo, 1995).
El objetivo de este trabajo es comparar diferentes técnicas de preparación de material de origen vegetal para
su observación en el MEB de Bajo Vacío. Para ello se eligió tejido de raíces tuberosas de mandioca debido a
su contenido acuoso y de almidón. Se incluyen en la comparación tejidos frescos sin procesar, y tejidos
preparados con cinco técnicas convencionales en microscopía electrónica.
M ATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron raíces de mandioca (Manihot esculenta Krantz) adquiridas en un comercio local. Para ello se
cortaron trocitos de aproximadamente 8x5x5mm utilizando una hoja de bisturí. Se realizaron seis tratamientos
diferentes:
Tratamiento 1: se utilizaron trozos frescos de mandioca sin procesar. Las muestras fueron cortadas
inmediatamente antes de ser observadas.
Tratamiento 2: se utilizaron trozos de mandioca secados al aire por 48h.
Tratamiento 3: se utilizó la técnica de deshidratación propuesta por Goldman & Leif (1973), con
modificaciones. Para ello se sumergieron los trocitos de raíz en agua de canilla y se les agregó acetona
gota a gota hasta alcanzar 4 veces el volúmen inicial. Luego se los pasó a acetona pura, dos veces. A
continuación se pusieron en soluciones de acetona - xilol con concentraciones crecientes de xilol: 2:1,
1:1, 1:2 y finalmente, xilol puro. Cada cambio se realizó después de una hora. Después de esto se dejó
secar al aire por 48 hs.
Tratamiento 4: es similar al anterior , pero se realizó el metalizado antes de ser observado.
Tratamiento 5: se fijaron las muestras en AFA (alcohol - formol - ácido acético) durante una noche a
temperatura de laboratorio. Luego se realizó una deshidratación, partiendo de una solución 1:1 AFA alcohol, pasando luego a concentraciones crecientes de alcohol, 1:2, 1:3 hasta llegar a alcohol puro.
Seguidamente, se procedió de igual manera partiendo de alcohol - acetona 1:1 hasta llegar a la acetona
pura. Los cambios se realizaron cada 30 minutos. Posteriormente se realizó un secado por punto crítico
(SPC), con CO2 líquido.
Tratamiento 6: similar al anterior, pero las muestras fueron metalizadas.
Las metalizaciones se realizaron con la técnica de sputtering con Au utilizando un Denton Desk II. El SPC se
realizó con un Critical Point Drying Apparatus Denton. Las observaciones fueron hechas con un Microscopio
Electrónico de Barrido Jeol 5800 LV utilizando una aceleración de 30 KeV, a una presión de 60-69 Pa.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
No se observaron grandes diferencias en la estructura celular del parénquima radicular ni en su contenido en
los distintos tratamientos realizados. Sin embargo es posible realizar una descripción más detallada para cada
tratamiento. En el caso de las muestras frescas sin procesar se pudo obtener muy buenas imágenes de las
células aparentemente turgentes, las paredes mostraron formas regulares, con alto contenido de granos de
almidón. En las muestras secadas al aire la calidad de imágenes fué similar, aunque se pudo apreciar cierto
grado de deshidratación, manifestado en la pérdida de la forma lineal de las paredes celulares así como una
aparente mayor concentración de los granos de almidón. Para la muestras en las que se usó el xilol seguido de
un secado al aire se pudo apreciar que la muestra sin metalizar mostraba una importante pérdida de brillo,
contraste y calidad de imágen, pero el tejido no manifestaba mayor deterioro estructural salvo una
disminución del espesor de las paredes celulares; la muestra que fué metalizada presentó una muy buena
calidad de imágenes, aunque había sufrido una importante pérdida del contenido celular, quizá debida a los
multiples pasajes por las diferentes soluciones de deshidratación. En los últimos casos, en los que se realizó
fijación del tejido con AFA seguida de un SPC se observó que cuando la muestra no fué metalizada la imágen
era similar a la obtenida con el tratamiento 3, es decir con baja calidad de imágen, a lo que se le sumó la
aparición de una gran cantidad de cristales muy brillantes al microscópio, además no se podía apreciar
claramente la estructura tisular; con la muestra metalizada se observó un incremento en calidad de la imágen
obtenida.
El estudio de material en fresco y sin procesar presenta muy pocos inconvenientes, excepto en que debe ser
inmediatamente observado después de su obtención y hasta no más de una hora (Uwins et al., 1993). La
técnica de Goldman & Leif(1973) produce, según los autores, el mismo efecto que el SPC. Segun lo
observado en nuestro caso, la calidad de material obtenido es buena, aunque la técnica debería estudiarse
mejor para tejidos vegetales. La fijación del material no ha producido mejora en la calidad de imágenes
obtenidas, en concordancia con lo observado por Uwins et al., 1993.
CONCLUSIONES
La utilización de material en fresco y sin procesar en el MEB Ambiental es perfectamente viable. Las otras
técnicas utilizadas deberían aplicarse en una mayor variedad de materiales para poder aceptar o descartar su
uso.
BIBLIOGRAFÍA
Anónimo. 1995. An introduction to Low Vacuum SEM (LV SEM). Jeol Datum. Jeol Ltd. Japan.
---------. 1997. A Guide to Scannig Microscope Observation. Jeol Datum. Jeol Ltd. Japan.
Goldman, M. A. and R. C. Leiff. 1973. A wet chemical method for rendering SEM samples conductives and
observation on the surface morphology of human eritrocites and Erlich ascites cells. Proc. Nat. Acad.
Sci. 70:3599-3603.
Goldstein, J. I., D.A. Newbury, P. Echlin, D. C. Joy, A. D. Romigs, Jr., C. A. Lyman, C. Fiori & E. Lifshin.
1993. Scanning electron microscopy and x-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists,
and geologists. Second ed. Plenum Press. New York.
Hardy, J. P., V. J. Anderson and J. S. Gardner. 1992. Stomatal characterisation of grass leves by four
preparation techniques. Microsc: The Key Research Tool 22(1):87-90.
Parsons, E., B. Bole, D. J. Hall and W. D. E. Thomas. 1973. A comparative survey of techniques for
preparing plant surfaces for the scanning electron microscope. J. Microsc. 101:59-74.
Uwins, P. J. R., M. Murray and R. J. Gould. 1993. Effects of Four Different Processing Techniques on the
Microstructure of Potatoes: Comparison With Fresh Samples in the ESEM. Microsc. Res. Tech.
25:412-418.