Comparación entre novillas y vacas como donantes de ovocitos

Comparaci ón entre novillas y vacas
como donantes de ovocitos para la
producci ón in vitro de embriones
Dpto. de Reproduccion Animal Y Conservación
de Recursos Zoogenéticos
INIA - Madrid
Índice
•
•
•
•
•
Introducci ón
Materiales y m étodos
Diseño Experimental
Resultados
Conclusi ón
Adaptado de Rizos, 2007
Introducci ón 1
La calidad del ovocito es el factor que mas afecta
al rendimiento de blastocistos.
(Rizos et al., 2002, 2003)
La calidad del ovocito está afectada por:
Estado fisiológico y reproductivo de la donante
Tamaño folicular
Amplitud e integridad de las células del cúmulo
(Lonergan et al., 1994; Fair et al., 1995; Leibfried-Rutledge, 1999;
Armstrong, 2001, Boland et al., 2001)
Los ovarios de vacas proporcionan menos ovocitos
que los de novillas.
(Zhang et al., 1991; Moreno et al., 1992; Mermillod et al., 1992).
Adaptado de Rizos, 2007
Introducci ón 2
Los ovocitos de vacas producen mas embriones que los
de las novillas.
(Galli et al., 2003)
En OPU durante 4 años: novillas (n=2.143 sesiones)
vacas (n=2.641 sesiones)
El número de embriones congelables y transferibles es el doble:
vacas (2.5 embriones por sesión)
novillas (1.4 embriones por sesión)
(Galli et al., 2003)
Adaptado de Rizos, 2007
Material y M étodos
Recuperaci ón ecográfica:
Ø Mediante punción folicular usando una sonda ecográfica transvaginal (OPU) en
animales vivos (Experimento 1).
Adaptado de Rizos, 2007
Experimento 1:
Diseño Experimental
• 8 novillas (19-21 meses)
• 8 vacas (3-5 años; 30-40 días post parto)
• OPU 2 veces/semana (5 semanas)
Parámetros medi da/animal:
• El tamaño de distribución de los folículos aspirados
• Número y calidad de los ovocitos recogidos
Producción In vitro de embriones/por grupo experimental de animales:
• Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC
Parámetros medi dos por grupo experi mental de animales :
• Tasa de división a las 48 h post inseminación
• Producción blastocistos los días 6, 7 y 8
Adaptado de Rizos, 2007
Experimento 1:
Resultados
Tabla 1. Distribución de tamaños foliculares en las novillas y vacas lactantes
post-parto .
Tipo de Animal
Numero Medio de Folículos Aspirados por Animal
2-4 mm
5-7 mm
8-10mm
>10mm
Novillas
5.9
3.2
1.1
0.3
Vacas
4.0
2.3
1.0
0.4
SCI
1.8±1.6
0.8±0.9
0.06±0.5
0.08±0.3
Significación (P)
< 0.05
NS
NS
NS
Nueve replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Tabla 2. Número de folículos aspirados y morfología de los ovocitos en
novillas y vacas Frisonas lactantes post-parto.
No. de
folículos
aspirados/
animal
No. de
ovocitos
recuperados/
animal
Novillas
10.4
4.7
3.0
1.6
Vacas
7.8
2.8
1.8
0.9
SCI
2.6±2.5
1.9±1.8
1.2±1.0
0.7±0.7
Significación (P)
< 0.001
< 0.001
< 0.05
<0.05
Tipo de Animal
Nueve replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Numero de Ovocitos
Grado 1-2
Grado 3-4
recuperados/
recuperados/
animal
animal
Tabla 3. Capacidad de desarrollo después de maduración, fecundación y
cultivo in vitro en novillas y vacas lactantes post-parto
Tipo de Animal
No. ovocitos
Divididos (%)
Blastocistos Obtenidos (%)
Día 6
Día 7
Día 8
Novillas
129
45.7
7.8
12.4
12.4
Vacas
74
48.7
5.4
8.1
8.11
0.928
0.399
0.188
0.188
Significación (P)
Cinco replicas
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Experimento 2:
Diseño experimental
• 205 ovarios de novillas (menos de 30 meses)
• 169 ovarios de vacas (4 años)
• Aspiración manual
Parámetros medi dos/ por ovario:
• Número de fol ículos aspirados
• Número y calidad de ovoci tos recogidos
Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales:
• Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC
Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales :
• Tasa de división a las 48 h post inseminación
• Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8
Adaptado de Rizos, 2007
Tabla 4. Número de folículos aspirados y morfología de los ovocitos en
novillas y vacas cruzadas .
No. de
ovarios
No. de
folículos
aspirados/ovario
Novillas
409
14.5
3.6
2.4
Vacas
337
16.4
3.8
2.4
-1.85±3.77
-0.19±1.79
0.09±1.83
NS
NS
NS
Tipo de Animal
SCI
Significación (P)
Ocho replicas; SCI: intervalos simultáneos de confianza
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Numero de Ovocitos
Grado 1-2
Grado 3-4
recuperados/
recuperados/
ovario
ovario
Tabla 5. Capacidad de desarrollo de los ovocitos después de la maduración,
fecundación y cultivo in vitro en novillas y vacas cruzadas.
Tipo Animal
No.
ovocitos
Divididos (%)
Blastocistos Obtenidos (%)
Día 6
Día 7
Día 8
Novillas
1241
79.9
15.2
29.0
33.4
Vacas
1125
80.8
20.7
42.6
46.5
0.819
0.333
0.005
0.007
Significación (P)
Ocho replicas
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Experimento 3:
Diseño experimental
• ovarios de novillas
• 12-18 meses
• 19-24 meses
• 25-30 meses
• ovarios de vacas ( 4 años )
• Aspiración manual
Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales:
• Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC
Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales :
• Tasa de división a las 48 h post inseminación
• Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8
Adaptado de Rizos, 2007
Tabla 6. Efecto de la edad de la novilla sobre la capacidad de desarrollo después
de la FIV.
Tipo de Animal
No. ovocitos
Divididos
(%)
Blastocistos Obtenidos (%)
Día 6
Día 7
Día 8
Novillas (12-18 m)
708
84.9ab
15.4
32.3ab
35.0a
Novillas (19-24 m)
804
81.2a
14.2
30.9a
35.2a
Novillas (25-30 m)
682
78.5a
15.5
32.0ab
36.5a
Vacas
588
86.7b
15.8
41.0b
48.3b
0.055
0.822
0.12
0.028
Significación (P)
Seis replicas
a, b
Valores en la misma co lumna con diferente superíndices difieren significativamente (P<0.05).
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Experimento 4:
Diseño experimental
• Ovarios de novillas (menos de 30 meses)
• Ovarios de vacas ( 4 años)
• Aspiración manual
Producción In vitro de embriones por grupo experi mental de animales:
• Solo son usados los ovocitos de grado 1y 2 para IVM/IVF/IVC
Parámetros medi dos/por grupo experimental de animales :
• Tasa de división a las 48 h post inseminación
• Producción de blastocistos a los Días 6, 7 y 8
Adaptado de Rizos, 2007
Ligadura del oviducto para evitar la pérdida de ovocitos
Transferencia
cigotos al oviducto
de oveja por la
fimbria
Recuperación
embriones
mediante lavado de la
fimbria del oviducto
Catéter para la transferencia de cigotos
Catéter para la recolección de embriones
o
o
mediante disección
del oviducto y lavado
en el laboratorio
Disección de oviducto
Adaptado de Rizos, 2007
Tabla 7. tasa de desarrollo de ovocitos de ovarios de matadero de novillas y
vacas, cultivados in vitro o in vivo en oviductos de oveja.
Origen
de los Ovocitos
No.
Transferidos
No. Obtenidos
n (%)
Blastocistos Obtenidos (%)
Día 7
Día 8
Novillas
930
564 (60.6)
20.4
25.2
Vacas
686
367 (53.5)
45.0
53.1
0.552
0.004
0.001
Significación (P)
Tres replicas
(Rizos et al,. 2005. Theriogenology 63: 939-949)
Conclusiones
• Las vacas lactantes durante el post-parto temprano presentan
menos folículos en sus ovarios que las novillas, lo cual origina
una menor recuperación de ovocitos de buena calidad por animal
sometido a la OPU.
• Independientemente del origen (vacas o novillas) los ovocitos de
calidad similar presentan una capacidad de desarrollo igualmente
similar.
Hay diferencias en la capacidad de desarrollo de los ovocitos
obtenidos de vacas y novillas considerando la edad, el
metabolismo, el manejo y otros factores.
Adaptado de Rizos, 2007