trasplante de bulbo olfatorio en lesiones

Artículo Original/Artigo Original/Original Article
TRASPLANTE DE BULBO OLFATORIO EN LESIONES MEDULARES
COMPLETAS: REGENERACIÓN AXONAL Y RECUPERACIÓN LOCOMOTORA
Transplante de bulbo olfatório em lesão medular completa:
regeneração axonal e recuperação locomotora
OLFACTORY BULB TRANSPLANTATION IN COMPLETE SPINAL CORD INJURY:
AXONAL REGENERATION AND LOCOMOTOR RECOVERY
Carlos Abraham Arellanes-Chávez1,2, Ariana Martínez Bojórquez2, Ernesto Ramos Martínez1
RESUMEN
Objetivos: Si la intervención en ratas prueba su efectividad respecto a la regeneración medular y la recuperación locomotora con el fin
de obtener evidencia suficiente para aplicar la terapia en humanos.Métodos: Se realizóun estudio prospectivo experimental controlado
aleatorizado, donde se incluyóuna muestra de 15 ratas adultas hembras Sprague-Dawley de 250 gr. Se dividieron por tercias las cuales
se entrenaron durante 2 semanas en base al método de Pavlov de condicionamiento clásico con el fin de fortalecer los músculos de las
4 patas, estimularlas anímicamente y mantenerlas saludables para el acto quirúrgico. Resultados: Se ha observado que el implante de
estas células en el sitio de la lesión, puede resultar benéfico para el proceso de regeneración medular después del trauma al mediar la
secreción de quimiocinas neurotróficas y neuroprotectoras, asímismo las OECs poseen la habilidad de puentear el sitio de reparación y
disminuir la formación de gliosis creando un ambiente permisivo para la regeneración axonal. Conclusión: Cabe destacar que las células
de la glia olfatoria poseen propiedades regeneradoras únicas, sin embargo no fue sino hasta hace poco que su actividad promotora de
regeneración del sistema nervioso central se reconoció.
Descriptores: Traumatismos de la médula espinal; Regeneración de la medula espinal; Bulbo olfatorio.
RESUMO
Objetivos: Verificar se intervenção em ratos tem eficácia comprovada na regeneração medular e na recuperação locomotora, visando obter evidência suficiente para aplicar a terapia ao ser humano. Métodos: Estudo prospectivo experimental controlado e randomizado, com
amostra de 15 ratas Sprague-Dawley adultas pesando 250 gramas. Os indivíduos foram divididos em três grupos que foram treinados
durante 2 semanas pelo método de Pavlov de condicionamento clássico, de modo a fortalecer os músculos das quatro patas, estimular os
animais mentalmente e mantê-los saudáveis para a cirurgia. Resultados: Constatou-se que a implantação dessas células no local da lesão
pode ser benéfica para o processo de regeneração medular depois do trauma, visto que medeia secreção de quimiocinas neurotróficas
e neuroprotetoras; da mesma maneira que as células olfatórias da glia (OEC) têm a capacidade de fazer ponto no local do reparo e de
diminuir a formação de gliose, criando ambiente propício para a regeneração axonal. Conclusão: Cabe destacar que as células olfatórias
da glia têm propriedades regeneradoras únicas, porém, apenas recentemente sua atividade promotora de regeneração do sistema nervoso
central foi reconhecida.
Descritores: Traumatismos da medula espinal; Regeneração da medula espinal; Bulbo olfatório.
ABSTRACT
Objectives: To determine whether the intervention in rats is effective in terms of spinal cord regeneration and locomotor recovery, in order to
obtain sufficient evidence to apply the therapy in humans. Methods: a randomized, controlled, experimental, prospective, randomized trial
was conducted, with a sample of 15 adult female Sprague-Dawley rats weighing 250 gr. They were divided into three equal groups, and
trained for 2 weeks based on Pavlov’s classical conditioning method, to strengthen the muscles of the 4 legs, stimulate the rats mentally,
and keep them healthy for the surgery. Results: It was observed that implantation of these cells into the site of injury may be beneficial to the
process of spinal cord regeneration after spinal trauma, to mediate secretion of neurotrophic and neuroprotective chemokines, and that the
OECs have the ability to bridge the repair site and decrease the formation of gliosis, creating a favorable environment for axonal regeneration. Conclusion: It is emphasized that the olfactory ensheathing glial cells possess unique regenerative properties; however, it was not until
recently that the activity of promoting central nervous system regeneration was recognized.
Keywords: Spinal cord injuries; Spinal cord regeneration; Olfactory bulb.
INTRODUCCIÓN
Las lesiones de la médula espinal (LME) representan una enfermedad compleja con múltiples cuadros clínicos dependiendo del
nivel y la complejidad de la lesión. En general la rehabilitación y el
manejo de la LME es un fenómeno relativamente reciente.1
Las terapias de trasplante celular han recibido creciente atención
en investigaciones pre-clínicas como estrategias para el tratamiento
de las lesiones medulares espinales. El trasplante de células de la
glía olfatoria, la cual reprodujimos en el laboratorio, es una técnica
ampliamente estudiada, principalmente por Ramón-Cueto quien ha
1. Hospital CIMA y Hospital Central del Estado, Chihuahua, Chihuahua, México.
2. Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Chihuahua, Chihuahua, México.
Trabajo realizado en Laboratorio de Microcirugía, Edificio de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Chihuahua, Chihuahua, México
Correspondência: Haciendas del Valle #7120-418, Plaza las Haciendas Chihuahua, Chihuahua. México, C.P. 31238. [email protected]
Recibido en 14/09/2014, acepto en 06/11/2014.
http://dx.doi.org/10.1590/S1808-1851201514010R128
Coluna/Columna. 2015;14(1):50-2
TRASPLANTE DE BULBO OLFATORIO EN LESIONES MEDULARES COMPLETAS: REGENERACIÓN AXONAL Y RECUPERACIÓN LOCOMOTORA
demostrado la habilidad de la glía olfatoria para promover la reparación
funcional e histológica en lesiones del sistema nervioso central (SNC). 2
Basados en las observaciones de que el sistema olfatorio exhibe
neurogénesis y envía procesos axonales al SNC de por vida, se
propuso que la OECs presentan propiedades regenerativas únicas.
Estas células permiten la regeneración axonal, dirigen los axones
en crecimiento a través de la cicatriz glial, poseen la habilidad de
remover axones degenerados vía fagocitosis, producen canales
por los cuales los axones recién formados se guían para su recrecimiento y mientras que las OECs no forman mielina en el sistema
olfatorio, sí la generan una vez trasplantadas en el sitio de lesión.3-5
Los estudios preclínicos muestran que los efectos de las OECs
adultas son reproducibles en modelos experimentales de lesiones medulares espinales.6 En este estudio medimos los efectos del trasplante
intraespinal de bulbo olfatorio en una población de ratas con lesión
medular aguda que pueden adecuadamente simular una LME aguda en
un paciente, con el objetivo de comprobar la utilidad del trasplante de
OECs en la regeneración medular después de LME completas y medir
la recuperación funcional posterior al trasplante y entrenamiento físico.7-9
Objetivo: Comprobar la utilidad del trasplante del bulbo olfatorio en la regeneración medular después de lesiones medulares
completas. Medir la recuperación funcional de las ratas con sección medular completa posterior al transplante del bulbo olfatorio
Demostrar la regeneración axonal de las medulas espinales seccionadas completamente posterior al transplante del bulbo olfatorio.
MÉTODOS
Se realizó un estudio prospectivo experimental controlado aleatorizado, donde se incluyó una muestra de 15 ratas adultas singénicas hembras Sprague-Dawley de 250 gr. Se dividieron por tercias
las cuales se entrenaron durante 2 semanas en base al método
de Pavlov de condicionamiento clásico con el fin de fortalecer los
músculos de las 4 patas, estimularlas anímicamente y mantenerlas saludables para el acto quirúrgico. El entrenamiento consistió
en hacerlas escalar una gradilla a la cual se le modificó el ángulo
de inclinación de 0 a 90 grados cada tercer día de acuerdo a la
respuesta de los animales al entrenamiento.10 Una vez cumplidas
las dos semanas de entrenamiento se dividieron al azar las tercias
en rata caso, control y donadora. Todos los especímenes fueron
anestesiados con tiopentotal sódico en la cavidad peritoneal.
A la rata donadora se le realizó una craniectomía para extraer ambos bulbos olfatorios, los cuales inmediatamente se colocaron en un
tubo de ensayo con solución salina fisiológica. Inmediatamente después se tomó al azar la rata control y se le practicó una sección medular
completa a nivel de T10, a ésta no se le implantó ningún bulbo olfatorio.
Acto seguido se intervino microquirúrgicamente la rata caso, ocasionandole una lesión medular espinal completa a nivel de T10 similar a
la de la rata control la cual se le implanta uno de los bulbos olfatorios.
Una vez hecho lo anterior se suturó la herida en un solo plano.
Se otorgaron cuidados pre y post anestésicos a todos los animales, excepto las ratas donadoras que fueron sacrificadas. Una
51
semana después de la cirugía se retomaron los entrenamientos
tanto de las ratas caso como de las ratas control. La evolución de
los animales de experimentación fue videograbada.
Entre los 80 y los 120 días postquirúrgicos dependiendo del estado clínico de las ratas se procedió a la extracción de la médula espinal. Todas las médulas espinales extraídas fueron teñidas con proteína
ácido glial fibrilar y estudiadas histológica e inminohistoquímicamente.
Cabe mencionar que el estudio cumplió con todos los criterios
bioéticos y regulatorios de protección animal.
RESULTADOS
En el tiempo post quirúrgico inmediato todos los animales mostraron parálisis flácida de ambas patas traseras.
Durante la evolución se observó que las ratas control fallecían
antes de los 30 días de vida sin mostrar evidencia de recuperación
locomotora alguna, únicamente dos de las ratas control lograron
sobrevivir hasta los 60 días.
Previo a su deterioro clínico y fallecimiento se extrajo la médula
espinal para estudio patológico. Cabe mencionar que todos los
controles continuaron parapléjicos hasta su deceso.
En el acto quirúrgico de extracción medular se observó que las
médulas espinales de las ratas control se encontraban seccionadas
completamente, con presencia de abundante tejido cicatrizal en
piel, músculos y tejido celular subcutáneo que dificultó el abordaje
quirúrgico. (Figura 1)
Todas las ratas caso evolucionaron de forma similar respecto a
la recuperación locomotora, recuperando: la flexión en garra de las
patas aproximadamente al día 12 posquirúrgico, la posición normal
en cuatro patas al día 30, la movilidad de los muslos y tobillos al día
60 y volvieron a caminar con las patas traseras aproximadamente
a los 90 días postoperatorios siendo la marcha débil e inestable,
pero a los 140 días las patas traseras recuperaron fuerza y mayor
ángulo de movilidad. (Tabla 1, Figura 2)
A
B
C
Figura 1. A) Rata control primera semana post-quirúrgica se observa paraplejía completa de patas traseras. B) Rata control 30 días pos-quirúrgicos
continúa la paraplejía completa de las patas traseras. C) 60 días post-quirúrgicos no hay signos de recuperación locomotora.
Tabla 1. Evolucion posquirurgico.
Rata (caso)
12-14 dias
40
1
Flexión en garra Flexión del muslo y tobillo,
apoyada en 4 patas (posición
de los ortejos
original) no fuerza
(bilateral)
2
Flexión en garra Flexión del muslo y tobillo,
apoyada en 4 patas (posición
de los ortejos
original) no fuerza
(bilateral)
3
4
5
Flexión en garra Flexión del muslo y tobillo,
de los ortejos (bien 4 patas (posición
lateral), Flexión del apoyada
original) no fuerza
muslo derecho
Flexión del muslo y tobillo izFlexión en garra quierdo,
apoyada en 3 patas,
de los ortejos
la pata derecha sigue exten(bilateral)
dida hacia atrás
Flexión en garra Flexión del muslo y tobillo,
apoyada en 4 patas (posición
de los ortejos
original) no fuerza
(bilateral)
Coluna/Columna. 2015;14(1):50-2
60
Movimiento del muslo, tobillo y cadera, camina sobre 4 pata. Se agarra de
la gradilla con las 4 patas. Recuperación de la fuerza
Movimiento del muslo, tobillo y cadera, camina sobre 4 pata. Se agarra de
la gradilla con las 4 patas. Recuperación de la fuerza
Movimiento bilateral , de muslo, tobillo y cadera, camina sobre 4 patas.
Se agarra de la gradilla con 4 patas.
Recuperación de la fuerza.
Movimiento de cadera, muslo y tobillo izquierdos (flexión y extensión),
camina sobre 3 patas. Se agarra de
la gradilla con 3 patas.
Movimiento bilateral de cadera, muslo y tobillo (flexión y extensión), camina sobre 4 patas. Se agarra de la
gradilla con 4 patas.
80
120
Fallece a los 80 días. Extracción medular antes de morir.
Camina en 4 patas, recupera velocidad y
coordinación de los movimientos de las
patas traseras
Camina en 4 patas, recupera velocidad y
coordinación de los movimientos de las
patas traseras
Movimiento bilateral de cadera, muslo y tobillo (flexión y extensión), camina sobre 4
patas. Se agarra de la gradilla con 3 patas.
Recuperación de la fuerza.
Se rasca el cuerpo con las patas traseras (flexión y extensión
coordinada y rápida de cadera,
rodilla y tobillo)
Se rasca el cuerpo con las patas traseras (flexión y extensión
coordinada y rápida de cadera,
rodilla y tobillo)
Camina en 3 patas con mas velocidad y movimientos coordinados. Aumento de la fuerza de la
pata trasera derecha
Movimiento bilateral de cadera, muslo y
tobillo (flexión y extensión), camina sobre 4 patas. Recuperación de la fuerza.
52
A
# de articulaiones
com movimiento
Resultados
40
Casos
30
20
10
0
12-14
40
60
80
120
Control
B
Días postoperatorios
Figura 2. Transplante del bulbo olfatório en lesión medular espinal aguda:
estudio experimental.
Durante el abordaje para la extracción de la médula espinal el
tejido cicatrizal era mínimo facilitando la realización de la cirugía
y permitiendo disecar la médula fácilmente. Una vez expuesto el
cordón medular se observó continuidad del mismo a través del sitio
de trasplante sin identificarse el bulbo olfatorio o la brecha entre los
extremos seccionados semejando una médula intacta.
Los estudios histológicos demostraron presencia de tejido neural en el sitio de lesión con escasa gliosis en las muestras caso,
teñidas con hematoxilina y eosina.
Inmunohistoquímicamente en las muestras teñidas con proteína
ácida glial fibrilar se observaron indicios de continuidad del tejido axonal indicando regeneración medular en las muestras caso.
(Figuras 3 e 4)
Ninguna muestra control mostró hallazgos de regeneración axonal, pero sí abundante gliosis.
A
B
C
Figura 4. A) Testigo de cerebro con PAGF, las neuronas y axones se muestran en
color café. B) Área de sección en médula de rata caso, se observa continuidad
del tejido neural y conexión axonal.
CONCLUSIÓN
El trasplante intraespinal de las células de recubrimiento olfatorio
mejora la función locomotora y estimula la regeneración axonal en
las ratas con lesiones agudas de la medula espinal, sugiriendo
la posibilidad de eficacia en humanos. Sin embargo, las lesiones
medulares espinales en animales de laboratorio no pueden modelar
de forma precisa la heterogenicidad inherente del daño neurológico
vistos en los pacientes, como tampoco son todos los aspectos de
la función medular fácilmente susceptibles de evaluación objetiva.
Estos hallazgos nos estimulan a continuar realizando investigaciones dentro del tema pues son importantes para el desarrollo de futuros
tratamientos para los pacientes lesionados medulares, que hasta el
momento continúa siendo un padecimiento incapacitante de por vida.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Valeria García médico interno del ISSSTE por su apoyo
en el cuidado y manejo de los animales durante lo que duró el
estudio de experimentación.
Figura 3. A) Rata caso primera semana post quirúrgica, se observa paraplejía de
las patas traseras. B) Rata caso 60 días postoperatorios, se observa recuperación de la movilidad y la fuerza de las patas traseras. C) 120 días post operatorios
se observa recuperación de movimientos finos en dedos de patas traseras.
Todos los autores declaran que no hay ningún potencial conflicto
de intereses con referencia a este artículo.
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Coluna/Columna. 2015;14(1):50-2