Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”

Resumen del artículo: “Mutant
PTEN in Cancer: Worse Than
Nothing”
Nick R. Leslie and Jeroen den Hertog
GENÉTICA MOLECULAR CURSO 2014-2015
November 16, 2014
José Carlos Paredes Franco
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Índice
Resumen........................................................................................................................................ 2
Introducción .................................................................................................................................. 2
Resultados ..................................................................................................................................... 3
PTEN existe como complejo dimérico. ...................................................................................... 3
PTEN en su forma dimérica es catalíticamente activo. ............................................................. 4
La fosforilación de la cola C-t de PTEN regula su dimerización................................................. 5
Mutaciones de PTEN ejercen un efecto dominante negativo sobre las proteínas wild-type.
Generación de ratones Pten Knockin y confirmación in vivo.................................................... 6
PTEN tiende a formar heterodímeros en presencia de variantes mutantes en la membrana
plasmática. ................................................................................................................................ 7
Evaluación funcional de la mutación PTENR130G. ................................................................... 8
Conclusiones ................................................................................................................................. 9
Bibliografía .................................................................................................................................. 10
José Carlos Paredes Franco
Página 1
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Resumen
De entre los llamados genes supresores, PTEN es uno de los mas estudiados, no solo por su
implicación en numerosas enfermedades agrupadas bajo el nombre de síndromes tumorales
hamartoma PTEN (PHTS), sino porque su propio funcionamiento bioquímico y molecular sigue
siendo parcialmente desconocido. Nuevos hallazgos demuestran que PTEN es una proteína
más compleja de lo que se creía, cuyas distintas anomalías, ya sean a nivel genético o proteico,
inducen todo un cuadro patológico que podría ser tratado conforme el conocimiento sobre
esta proteína siga aumentando.
Introducción
Los genes supresores de tumores bloquean el desarrollo del cáncer en individuos sanos, por lo
que mutaciones en ellos son causa principal del desarrollo tumoral. Uno de estos genes es
PTEN (phosphatase and tensin homolog), el cual genera la proteína PTEN o fosfatidilinositol-3,
4, 5-trisfosfato (PIP3) 3-fosfatasa, cuya actividad consiste en eliminar el fosfato 3 del PIP3, el
cual es fosforilado por la PI3K, induciendo la activación de AKT, que promueve crecimiento
celular, proliferación y aumento de la actividad metabólica (Maehama and Dixon, 1998).
Estructuralmente, PTEN pertenece a la superfamilia de las protein tirosin phosphatases (PTPs),
específicamente a la clase I, dentro de la cual se encuentra en la familia VH-1-like o fosfatasas
doble específicas (DSPs), ya que pueden quitar fosfatos de tirosinas y de serinas o treoninas
(Alonso et al., 2004) . PTEN tiene un dominio fosfatasa N-terminal, un dominio C2 C-terminal
(de anclaje a la membrana plasmática), dos secuencias PEST (prolina-glutamato-serinatreonina) que sirven de señal para degradación proteolítica en proteasoma, y un dominio PDZ,
típico de interacción entre proteínas (Lee et al., 1999), con el que puede dimerizar (Papa et al.,
2014).
PTEN es un supresor de tumores que se pierde frecuentemente, tanto parcial como
totalmente, en muchos tipos de tumores. Las causas de la pérdida de PTEN son varias:
mutaciones de cambio de sentido, mutaciones sin sentido, deleciones en o del gen PTEN,
metilación del promotor (lo que baja la expresión de PTEN activo), acción de miRNAs o
supresión de la actividad enzimática de PTEN (Leslie and Foti, 2011). Se ha demostrado que las
consecuencias de la pérdida parcial de proteína PTEN pueden ser agravadas por la expresión
de proteína PTEN mutante inactiva, ya que al poder dimerizar, monómeros PTEN mutantes
ejercen un efecto dominante negativo sobre los monómeros activos (Papa et al., 2014).
Así, Papa et al. (2014), mediante diversos experimentos, demuestran que la pérdida genética
de PTEN y mutaciones que inducen la pérdida de función en PTEN no son lo mismo, ya que
puede dimerizar e inducirse un fenómeno dominante negativo que reduce aún mas la
inhibición de la vía PIP3K/Akt, favoreciéndose la aparición de todo tipo de patologías
encuadradas como PHTS, tales como la enfermedad de Cowden o el síndrome BannayanZonana. Nos centraremos en su trabajo de investigación para poder comprender el
funcionamiento biológico de PTEN.
José Carlos Paredes Franco
Página 2
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Resultados
PTEN existe como complejo dimérico.
Se examinó si PTEN podía formar complejos con él mismo. Para ello, se realizó
coinmunoprecipitacion (co-IP) usando la línea celular carente de PTEN, PC3. En ella se
cotransfectaron variantes mutantes de PTEN, GFPPTEN y MycPTEN, que se obtuvieron juntas
por co-IP (figura 1A). Posteriormente, para aumentar la validez de la hipótesis, se empleo la
técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, en ingles BRET).
Para la realización de esta técnica, basada en la transferencia de energía de una proteína de
fusión fluorescente a otra, haciendo que la segunda emita fluorescencia a su vez, se usaron
Renilla luciferasa-PTEN (PTENRluc) como donador de energía y GFPPTEN como aceptor de
energía; además de usar coelenterazina como sustrato de la luciferasa. Así, en células
coexpresando ambos PTEN se genero una señal alta de BRET. Ya que para que haya emisión
del aceptor (en este caso GFPPTEN) donador y aceptor deben estar muy próximos (a una
distancia de entre 10 a 100 Å), se confirma así que PTEN puede dimerizar (Figura 1B).
Figura 1. Demostración de la dimerización de PTEN. (A) Co-IPs de los lisados de células PC3. La IP de
MycPTEN esta arriba y la de GFPPTEN, abajo. El uso de anticuerpos específicos para cada proteína de
fusión muestra la interacción PTEN-PTEN. (B) La emisión de luciferasa y GFP son distintas, pero la
administración de coelenterazina induce la excitación de la luciferasa, que genera BRET solo si está
próxima a la GFP. Las imágenes de abajo muestran las señales fluorescentes producidas por las
diferentes proteínas de fusión. Figura modificada de Papa et al. (2014).
José Carlos Paredes Franco
Página 3
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
PTEN en su forma dimérica es catalíticamente activo.
Para certificar que dominio es el que induce la dimerización se generaron por ingeniería
genética diversas variantes de PTEN unidos a la proteína Myc de tal forma que en cada unión
una parte de la proteína se perdiese. Así, se generaron MycPTEN FL (PTEN de longitud
completa unido a Myc), MycPTEN ΔC-terminus (PTEN sin extremo C-terminal ni dominio C2,
unido a Myc), MycPTEN ΔN-terminus (PTEN sin dominio fosfatasa en su N-t, unido a Myc),
MycPTEN ΔPDZ (PTEN sin dominio PDZ, unido a Myc) y MycPTEN ΔCCTD (PTEN sin extremo C-t
compuesto por las dos secuencias PEST y PDZ, unido a Myc) (Figura 2A); las cuales fueron
transfectadas en células PC3, para ser posteriormente lisadas y corridas las proteínas en un
SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Usando anticuerpos específicos para Myc, se realizo
un Western blot en el que se puede ver como solo en aquella proteína de fusión que conserva
el dominio PDZ se produce la dimerización, ya que se ve una banda mayor que PTEN
monomérico (de 50-55kDa si está completo, como es el caso de MycPTEN FL) (Figura 2).
Figura 2. La generación de distintas proteínas de
fusión entre PTEN y Myc permite determinar cual es
el dominio que induce la dimerización en PTEN. Solo
cuando hay dominio PDZ se genera en el gel SDSPAGE (en condiciones no reductoras) una banda de
mayor tamaño que la que corresponde a PTEN de
tamaño completo, es decir MycPTEN FL, de 50-55
kDa. Figura modificada de Papa et al. (2014).
José Carlos Paredes Franco
Página 4
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Para demostrar la actividad de PTEN dimérico se realizó una cromatografía de filtración en gel
para aislar PTEN a partir de HEK293 transfectadas previamente. Posteriormente se realizó un
ensayo de actividad fosfatasa usando PIP3 como sustrato. Así, en las fracciones
correspondientes a PTEN dimérico (fracciones 26-27) se generó una mayor liberación de
fosfato en comparación a las fracciones con peso molecular menor, las cuales contenían PTEN
monomérico. Se concluye así que la dimerización de PTEN genera un complejo más activo que
PTEN monomérico (Figura 3).
Figura 3. Tras la cromatografía de
filtración en gel, se comprueba que las
fracciones de mayor peso molecular (26
y 27) son las que contienen PTEN
dimérico y generan mas fosfato. Figura
modificada de Papa et al. (2014).
La fosforilación de la cola C-t de PTEN regula su dimerización.
Basándose en estudios anteriores que demuestran que la cola de PTEN esta implicada en el
estadio fisiológico de la proteína, y que esta está regulada por fosforilación (Vazquez et al.,
2000); se ensaya una cromatografía de filtración de gel usando dos mutantes de PTEN, uno
que no puede ser fosforilado (PTEN4A) y otro que es fosfomimético (PTEN4E). Estos mutantes,
unidos por ingeniería genética a Myc y Flag, respectivamente, se cotransfectaron a células
HEK293, para luego lisarlas y usar el extracto proteico para la cromatografía. Se encontró que
mientras que PTEN4E genera una banda que corresponde a la proteína monomérica, PTEN4A
presenta conformaciones monoméricas y diméricas. Se demuestra así que la fosforilación de la
cola C-terminal mantiene a PTEN como un monómero, mientras que la ausencia de
fosforilación está asociada con la conformación dimérica de PTEN (Figura 4).
José Carlos Paredes Franco
Página 5
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Figura 4. Las fracciones eluidas fueron corridas
en SDS-PAGE en condiciones no reductoras
para luego hacer un Western blot sobre los
resultados mediante anticuerpos anti-Myc
(arriba) y anti-Flag (abajo). El asterisco indica
que parte de FlagPTEN4E ha corrido un poco
menos, se piensa que puede ser debido a
modificaciones postraduccionales. Figura
modificada de Papa et al. (2014).
Mutaciones de PTEN ejercen un efecto dominante negativo sobre las proteínas wildtype. Generación de ratones Pten Knockin y confirmación in vivo.
Para demostrar esta hipótesis se usaron dos mutaciones de PTEN muy estudiadas en trabajos
sobre cáncer asociado a estas proteínas, que son aquella en la que la Cys-124 pasa a Ser
(C124S) y aquella en la que Gly-129 pasa a Glu (G129E). C124S y G129E son parecidas en el
hecho de que ambas mutaciones afectan al centro catalítico de PTEN. Sin embargo C124S
genera una proteína PTEN sin ninguna actividad catalítica, asociada a cáncer de endometrio
(Bonneau and Longy, 2000; Myers et al., 1997); mientras que G129E esta asociada con
enfermedad de Crowden (CD, una enfermedad que entra dentro de las PHTS) y elimina la
actividad fosfoinositido fosfatasa (no es capaz de quitar el fosfato de PIP3) pero mantiene la
actividad para fosfopéptidos (Liaw et al., 1997; Myers et al., 1998).
Para investigar las consecuencias fisiológicas de heterodímeros mutantes de PTEN se
generaron ratones que expresasen PTENC124S y PTENG129E por la técnica de Knockin (KI). Así,
para la generación de ratones modelo Ptenc124s/+ y PtenG129E/+ se sustituyeron una T por una A
en posición 370 o una G por una A en posición 386 del exón 5 de Pten, respectivamente.
Finalmente, se observó que en un tercio de los ratones KI se generaron grandes
adenocarcinomas mamarios invasivos e hipertrofia cerebelar que recuerda a la enfermedad
human de Lhermitte-Duclos, ya que el efecto dominante negativo de los monómeros mutados
produce una bajada en la actividad de PTEN, impidiendo la regulación de la vía PIP3/Akt
(Figura 5)
José Carlos Paredes Franco
Página 6
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
A
B
Figura 5. Demostración in vivo del efecto de Pten mutado en ratones. (A) Cortes histológicos de mama
+/de ratón teñidos con H&E. Arriba se muestran los cortes de ratones Pten , donde las flechas marcan
zonas con hiperplasia (izquierda) y adenocarcinomas (derecha). Abajo se muestran los cortes de ratones
KI, tanto para C124S (cs/+), como para G129E (ge/+); los asteriscos marcan áreas de expansión epitelial
rodeadas por tejido conectivo, mientras que las flechas muestran zonas de tejido necrotizado en el
centro de tumores. (B) Cortes histológicos de cerebelo de ratón teñidos con H&E. Ratones wt y
+/heterocigotos Pten no presentan hipertrofia cerebelar. Sin embargo en ratones KI para uno u otro
tipo de mutación presentan un desarrollo de hipertrofia cerebelar, siendo mas acusada en ratones
G129E/+
Pten
. Figura modificada de Papa et al. (2014).
PTEN tiende a formar heterodímeros en presencia de variantes mutantes en la
membrana plasmática.
Para confirmar que PTEN en la membrana plasmática tiende mas a generar heterodímeros con
variantes mutantes que con otro PTEN catalíticamente activo, se cotransfectó y coexpresó en
células PC3 variantes GFPPTEN (del tipo C124S y G129E) y mCherryPTENWT. Tras calcular los
ratios GFP/Cherry en la membrana plasmática se vio que los mayores ratios los daban aquellas
células en las que se coexpresaba mCherryPTENWT con GFPPTEN de uno de los dos tipos
mutantes (Figura 6).
Figura 6. Los ratios GFP/Cherry son mayores en las células PC3 que
tenían una variante mutante de PTEN, indicando una tendencia a
formar heterodímeros catalíticamente reprimidos. Figura
modificada de Papa et al. (20114).
José Carlos Paredes Franco
Página 7
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Evaluación funcional de la mutación PTENR130G.
Siguiendo con la línea de estudio de diferentes mutaciones de PTEN, se testó la funcionalidad
de la mutación PTENR130G, en la que se genera una proteína estable que sufre una perdida de
su función fosfatasa (Kato et al., 2000). Por tanto, PTENR130G es una copia fenotípica de
PTENC124S y PTENG129E, por lo que se estudio también en ella si inducia un efecto dominante
negativo.
Primero se confirmo que esta mutación no tiene un efecto supresivo de la vía PIP3/Akt en
células PC3 (Figura 7A).
Después se determino que PTENR130G puede interactuar con PTEN WT en células eucariotas
por co-IP (Figura 7B).
También se observó que PTENR130 limita la función de la proteína WT inhibiendo la
defosforilacion de PIP3, mediante transformación en bacterias de PTEN fusionado por
ingeniería genética con GST y His; para luego hacer un ensayo de actividad fosfatasa usando
como sustrato PIP3 (Figura 7C).
Finalmente se observó que muestras con mutaciones en PTENR130 con cambio a Gly (R130G)
o a Gln (R130Q) en un total de 19 muestras de glioblastoma y cáncer de endometrio muestras
mayores niveles de Akt fosforilado y activado que muestras con pérdida monoalélica de PTEN
(Figura 7D).
B
C
Figura 7. Diferentes resultados sobre la funcionalidad de PTENR130G. (A) Se muestra Western blot de
lisados de células PC3 transfectadas con PTEN WT y variantes mutantes. Al igual que las otras
mutaciones que se han estudiado con anterioridad, PTENR130G no es capaz de impedir la fosforilación y
activación de AKT. (B)Se muestran co-IPs de lisados de células PC3 transfectadas con las proteínas de
fusión indicadas e IP con anticuerpo anti-Myc. El Western blot revela que hay interacción entre PTENWT
y PTENR130G. (C) Se muestran los resultados del ensayo de actividad fosfatasa con los lisados
purificados de dímeros PTEN en bacterias. La cantidad de PO4 generado es menor en heterodímeros
PTENR130G/PTENWT, confirmando el efecto dominante negativo de la proteína mutada. Figura
modificada de Papa et al. (2014).
José Carlos Paredes Franco
Página 8
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
D
Figura 7 (cont.). (D) Como puede observarse, la cantidad
de AKT fosforilado y activado en muestras de glioblastoma
y cáncer de endometrio con mutaciones de PTEN del tipo
R13G (arriba o R130Q (abajo) son mayores que en
muestras con pérdidas monoalélicas de PTEN, de las
cuales se disponían 374 muestras. Se demuestras así que
mutaciones por cambio de sentido inducen una mayor
activación de la vía PIP3/Akt. Figura modificada de Papa et
al. (2014).
Conclusiones
En este estudio, se han clarificado varios puntos sobre la biología de PTEN y su relación con el
cáncer.
En primer lugar la dimerización de PTEN es crítica para su actividad fosfatasa, ya que estos
dímeros son más activos que los monómeros. Mutaciones de cambio de sentido como C124S,
G129E o R130G inhiben la función de la proteína WT en trans mediante un efecto dominante
negativo resultante de la heterodimerización. Esta genera que se reduzca la actividad fosfatasa
lipídica de Pten, lo que conduce a una hiperactivación de Akt y un incremento tumorigénico en
ratones. También se ha demostrado que la defosforilacion de la cola C-t de PTEN, además de
favorecer una conformación abierta, permite la dimerización de PTEN.
Finalmente, mediante el estudio de distintas mutaciones missense de PTEN se ha llegado a la
conclusión de que son más susceptibles de generar cáncer maligno y de que este se extienda
más rápidamente que en pacientes expresando niveles reducido de PTEN WT o que tengan
mutaciones nonsense de PTEN. Esto abre una puerta a la posibilidad de que el estado
mutacional de PTEN pueda ser utilizado para clasificar a los pacientes, para que aquellos con
mutaciones más severas reciban terapias más tempranas y radicales.
José Carlos Paredes Franco
Página 9
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Sin embargo, aun quedan muchas incógnitas sobre PTEN, tales como determinar que cantidad
de PTEN monomérico y dimérico se encuentra en cada tejido, cómo exactamente se regula la
dimerización de PTEN por fosforilación y defosforilación y otras posibles modificaciones
postraduccionales que pueda sufrir, tales como ubiquitinización, oxidación y acetilación. La
importancia de los efectos dominante-negativo hace que estas preguntas deban ser
respondidas lo antes posible, con el fin de que, en el futuro, la eficiencia de los tratamientos a
los pacientes refleje el conocimiento que se llegue a alcanzar de los efectos celulares
específicos para cada clase de mutación de PTEN.
Bibliografía
Alimonti, A., Carracedo, A., Clohessy, J.G., Trotman, L.C., Nardella, C., Egia, A., Salmena, L.,
Sampieri, K., Haveman, W.J., Brogi, E., et al. (2010). Subtle variations in Pten dose determine
cancer susceptibility. Nat. Genet. 42, 454–458.
Alonso, A., Sasin, J., Bottini, N., Friedberg, I., Friedberg, I., Osterman, A., Godzik, A., Hunter, T.,
Dixon, J., and Mustelin, T. (2004). Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell
117, 699–711.
Bonneau, D., and Longy, M. (2000). Mutations of the human PTEN gene. Hum. Mutat. 16, 109–
122.
Garcia-Cao, I., Song, M.S., Hobbs, R.M., Laurent, G., Giorgi, C., de Boer, V.C., Anastasiou, D., Ito,
K., Sasaki, A.T., Rameh, L., et al. (2012). Systemic elevation of PTEN induces a tumorsuppressive metabolic state. Cell 149, 49–62.
Kato, H., Kato, S., Kumabe, T., Sonoda, Y., Yoshimoto, T., Han, S.Y., Suzuki, T., Shibata, H.,
Kanamaru, R., and Ishioka, C. (2000). Functional evaluation of p53 and PTEN gene mutations in
gliomas. Clin. Cancer Res. 6, 3937–3943.
Lee, J.O., Yang, H., Georgescu, M.M., Di Cristofano, A., Maehama, T., Shi, Y., Dixon, J.E.,
Pandolfi, P., and Pavletich, N.P. (1999). Crystal structure of the PTEN tumor suppressor:
implications for its phosphoinositide phosphatase activity and membrane association. Cell 99,
323–334.
Leslie, N. R. & den Hertog, J. (2014). Mutant PTEN in cancer: worse than nothing. Cell 157, 527529.
Liaw, D., Marsh, D.J., Li, J., Dahia, P.L., Wang, S.I., Zheng, Z., Bose, S., Call, K.M., Tsou, H.C.,
Peacocke, M., et al. (1997). Germline mutations of the PTEN gene in Cowden disease, an
inherited breast and thyroid cancer syndrome. Nat. Genet. 16, 64–67.
Maehama, T., and Dixon, J.E. (1998). The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates
the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. J. Biol. Chem. 273,
13375–13378.
José Carlos Paredes Franco
Página 10
Resumen del artículo: “Mutant PTEN in Cancer: Worse Than Nothing”
Myers, M.P., Stolarov, J.P., Eng, C., Li, J., Wang, S.I., Wigler, M.H., Parsons, R., and Tonks, N.K.
(1997). P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is a dual-specificity
phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9052–9057.
Myers, M.P., Pass, I., Batty, I.H., Van der Kaay, J., Stolarov, J.P., Hemmings, B.A., Wigler, M.H.,
Downes, C.P., and Tonks, N.K. (1998). The lipid phosphatase activity of PTEN is critical for its
tumor suppressor function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13513–13518.
Papa, A., Wan, L., Bonora, M., Salmena, L., Song, M.S., Hobbs, R.M., Lunardi, A., Webster, K.,
Ng, C., Newton, R.H., et al. (2014). Cell 157, this issue, 595–610.
Trotman, L.C., Niki, M., Dotan, Z.A., Koutcher, J.A., Di Cristofano, A., Xiao, A., Khoo, A.S., RoyBurman, P., Greenberg, N.M., Van Dyke, T., et al. (2003). Pten dose dictates cancer progression
in the prostate. PLoS Biol. 1, E59.
Vazquez, F., Ramaswamy, S., Nakamura, N., and Sellers, W.R. (2000). Phosphorylation of the
PTEN tail regulates protein stability and function. Mol. Cell. Biol. 20, 5010–5018.
José Carlos Paredes Franco
Página 11