La fase reversa del remodelado oseo BOGADO

La Fase Reversa del Remodelado Óseo
De Eslabón Perdido a Blanco Terapéutico
Ateneos 2014
04 de Septiembre de 2014
Ciclo del Remodelado Óseo
El remodelado óseo requiere la resorción del hueso por los osteoclastos y la
formación del hueso por los osteoblastos. Acoplando la resorción y la formación
existe una fase reversa muy poco investigada.
La Fase Reversa
• Los esfuerzos para entender el remodelado óseo
han prestado poca atención a la fase reversa, aun
cuando es responsable del acoplamiento entre
resorción y formación.
• Las superficies de remodelado muestran no solo
OC y OB, también células mono nucleadas que
colonizan las superficies resorbidas cuando se
marchan los OC.
• Estas células mono nucleadas han sido llamadas
“células reversas” (Rv.Cs).
Las Células Reversas (Rv.Cs)
• En
la superficie de remodelado las Rv.Cs se posicionan entre los OC y los OB.
• Representan hasta el 80% de las superficies resorbidas y el 25% de la
superficie de remodelado del hueso trabecular en humanos.
Las Células Reversas (Rv.Cs)
• La posición de las Rv.Cs entre OCs y OBs las hacen
un candidato natural a mediar la interacción entre
OCs y OBs, así como candidatas a alterar las
propiedades moleculares de la superficie de
remodelado para facilitar la transición entre
resorción y formación.
• Por lo tanto, pueden representar el eslabón perdido
para entender el mecanismo de acople entre
resorción y formación.
Las Células Reversas (Rv.Cs)
• Pese a todo la hipótesis que las Rv.Cs pueden ser
criticas para el balance del remodelado ha recibido
poca atención.
• No se conoce el linaje de las Rv.Cs. Se ha propuesto
que son OC mono nucleados, células fagocitarias
(macrófagos-like) o células de linaje osteoblástico,
como, por ejemplo, pre OBs.
• Mas aun, no sabemos si una alteración de la
actividad de las Rv.Cs puede contribuir a la perdida
de masa ósea en patologías como la osteoporosis.
Este estudio es parte de un proyecto para investigar la hipótesis que las Rv.Cs
juegan un papel importante en el acople entre resorción y formación ósea.
Mas específicamente, el objetivo fue determinar el origen celular de las Rv.Cs
y su papel en la perdida de masa ósea.
Material y Métodos I
• Se realizo histomorfometria e inmunohistoquímica en muestras
de biopsias de pacientes con osteoporosis post menopáusica
(PMO), correspondientes controles post menopáusicos (PMC) y
pacientes con HPP (PHPT).
• Estas muestras de biopsias representan diferentes situaciones
respecto al balance entre resorción y formación. En particular las
muestras de HPP representan una situación en la que el acople
entre resorción y formación es optimo (en el hueso trabecular)*.
* Eriksen EF: Primary hyperparathyroidism: lessons from bone histomorphometry.
J Bone Miner Res 2002, 17(Suppl 2):N95-N97
Material y Métodos II
Histomorfometria
• Biopsias de cresta iliaca de 23 pacientes PMO con Fx
prevalente (edad 70±5 años), 10 pacientes PMC
(edad 65±9 años) y 10 pacientes PHPT (8 M y 2 H,
edad 57±7 años).
• Además de los parámetros histomorfométricos
clásicos, las superficies reversas (Rv.S/BS) fueron
calificadas en activas, cuando estaban flanqueadas
por OCs y/o osteoide (OS); o inactivas, cuando no
tenían OCs o OS vecinos.
Material y Métodos III
Inmunohistoquímica
• La caracterización IHC de las Rv.Cs se realizo en:
• Biopsias de cresta iliaca de 10 pacientes PHPT.
• Biopsias de cresta iliaca de 10 controles sanos (6 M y 4
H, edad 60±8 años).
• Muestras óseas de cabeza de fémur de 10 pacientes
PMO obtenidas durante cirugía de reemplazo de cadera.
Material y Métodos IV
Inmunohistoquímica
• Se realizo tinción para:
• Marcadores de OBs (Runx2, osterix, actina de
musculo liso (SMA), AP y CD56), en combinación con
TRAcP como marcador de Ocs.
• Marcadores de macrofagos (CD68, CD14 y CD163),
en combinación con tinción para Runx2.
• La proporción e intensidad de la inmunoreactividad
nuclear fue además analizada semi
cuantitativamente en diferentes sub poblaciones.
Material y Métodos V
Inmunohistoquímica
• Las sub poblaciones que se compararon fueron:
Las Rv.Cs junto a los OCs (tempranas) vs las junto
al osteoide producido por los OBs (tardias) y las
Rv.Cs en Rv.S activas vs las Rv.Cs en Rv.S inactivas.
• Para el grado semi cuantitativo se uso un score
H: H-score = Σ Pi * i, donde i es la intensidad
visual de la tinción (0 ausente, 1 débil, 2
moderada/intensa) y Pi es el % de células de cada
intensidad.*
* Detre S, Saclani JG, Dowsett M: A “quickscore” method for immunohistochemical
semiquantitation: validation for oestrogen receptor inbreast carcinomas.
J Clin Pathol 1995, 48:876e878
Resultados I
Localización y Morfología de las Rv.Cs
La figura ilustra especímenes de pacientes con HPP donde el acoplamiento entre
resorción y formación ocurre en forma optima.
La morfología depende de la proximidad a OCs u OS. Las Rv.Cs aparecen como
células planas y núcleo alongado, pero a medida que se acercan a la OS se tornan
gradualmente mas cuboides, semejando a OBs activos.
Resultados II: Caracterización IHC de las
Rv.Cs
La tinción con los marcadores de
macrofagos (rojo) CD14 (C), CD68 (E)
y CD163 (G) fue negativa en las
Rv.Cs Runx2 positivas (flechas, marrón).
Como es de esperar, los OCs fueron
positivos para CD68.
Resultados III: Caracterización IHC de las
Rv.Cs
La tinción con los marcadores
osteoblasticos Runx2 (D), ALP (F)
y CD56 (H) fue positiva para Rv.Cs
(marrón) junto a o debajo de Ocs
TRAcP positivos (rojo).
Resultados IV
•Runx2, un marcador temprano de
diferenciación OB es igualmente
expresado en ambas sub poblaciones.
• Osterix, un marcador mas
tardío, se expresa con mas intensidad
y en mas Rv.Cs junto a la OS.
• En cambio, SMA, un marcador de
osteoprogenitores, se comporta en
sentido contrario.
• Colectivamente, los datos de IHC
indican que las Rv.Cs son células de
linaje osteoblastico, que progresan a
OBs maduros durante la Fase Reversa.
Resultados V: Histomorfometría
PMO vs PMC
BV/TV= Volumen Trabecular
E.De= Profundidad de la laguna de resorción
ES/BS= Superficie resorbida
OS/BS= Superficie osteoide
Ob.BS= Superficie osteoblastica
* P< 0.05, *** P< 0.001
Rv.S Activas vs Rv.S Inactivas
Pueden distinguirse 2 tipos de Rv.S: una vecina a OCs y OS llamadas activas
(Panel izquierdo) y otras sin OCs u OS cercanos llamadas inactivas
(Panel derecho).
La flecha negra indica OCs, las flechas amarillas las Rv.Cs que tapizan la Rv.S
Rv.S Activas vs Rv.S Inactivas
Reconstrucción 3D
Para la reconstrucción 3D se tomaron 50 cortes adyacentes a los mostrados
en la diapositiva anterior.
Se puede ver las Rv.S activas en proximidad de la OS (azul) y OCs (rojo) en
K y en contraste la pobre OS y ausencia de Ocs en L.
La imagen insertada corresponde a los cortes mostrados en la diapositiva
anterior.
Resultados VI
Características Moleculares de Rv.S Activas vs Inactivas
Las Rv.S inactivas mostraron
una significativa menor
proporción de células positivas
para el linaje OB, comparado
con las Rv.S activas.
Resultados VII
Abundancia Relativa de Rv.S Activas e Inactivas
A
B
C
A: La proporción de Rv.S inactivas en PMO y PMC fue significativamente superior a la
del grupo PHTP. La proporción fue mayor en el grupo PMO que en PMC pero la
diferencia no fue estadísticamente significativa.
B: En el grupo PMO, la proporción de Rv.S inactivas correlaciono positivamente con
la profundidad de las cavidades de resorción.
C: La densidad celular en las Rv.S inactivas fue significativamente inferior a la de las
Rv.S activas y similar a la de las células que recubren las superficies quiescentes.
Resultados VIII
Correlación de Rv.S Inactivas con Masa Ósea e Indicadores de Formación
En el grupo PMO la extensión de Rv.S inactivas correlaciono significativamente con la disminución
de BV/TV. Además, la proporción de Rv.S inactivas correlaciono significativamente con la disminución
en marcadores de formación. Esto sugiere una relación entre la acumulación de Rv.S inactivas y la
disminución de formación y perdida de masa ósea en la PMO.
Cuando se analizaron los grupos PMO y PMC en conjunto, los resultados fueron similares, excepto
que el grupo PMC no mostro correlación con BV/TV.
Esto sugiere que la asociación entre Rv.S inactivas y disminución de la formación también esta presente
en algún grado en el grupo PMC.
Resumen I
Caracterización de las Células Reversas
•
Las Rv.Cs mostraron inmunoreactividad para marcadores
osteoblasticos.
• El análisis de inmureactividad a distintos marcadores osteoblasticos
sugiere que las Rv.Cs
progresan a OBs maduros durante la fase reversa.
• Además, las Rv.Cs tardías (mas cercanas a la OS)
muestran una morfología mas cuboide, semejante a
OBs maduros.
• Por lo tanto, las Rv.Cs parecen ser células especializadas en brindar a
la BS las propiedades moleculares propicias a la formación ósea.
Resumen II
Existencia de las Rv.S Inactivas
• Los datos sugieren que realmente existen Rv.S Inactivas.
Estas muestran numerosas características que las diferencian de
las Rv.S activas:
• Se las encuentra distantes de OCs y OBs activos, lo que sugiere
inactividad.
• Rv.Cs en las Rv.S son mas alongadas y menos densas
semejantes a las células en superficies quiescentes.
• Rv.Cs en las Rv.S inactivas expresan significativamente menos
osterix, Runx2 y SMA, comparadas con Rv.Cs en Rv.S activas. Esto
indica falta de progreso en la diferenciación y nuevamente
semejanza a las células quiescentes.
Resumen II
Existencia de las Rv.S Inactivas (cont.)
• La proporción de Rv.S inactivas correlaciona positivamente con la
profundidad de las cavidades de resorción.
• La prevalencia de Rv.S inactivas parece variar de acuerdo a la
condición fisiopatológica, siendo mayor en la PMO, un poco
menor en PMC y prácticamente ausentes en PHPT, donde el
acoplamiento es optimo. En cambio, la prevalencia de Rv.S activas
no difiere.
• Finalmente, la extensión de Rv.S correlaciona con disminución de
la masa y formación ósea. Esto sugiere que las Rv.S inactivas
representan ausencia de transición de resorción a formación ósea,
o sea desacople del remodelado.
Conclusiones
• La perdida de masa ósea en enfermedades como
la osteoporosis puede resultar no solo de un
llenado incompleto de las cavidades de resorción
por déficit de formación, sino también de una
falla en la fase reversa, que produce un desacople
entre resorción y formación en algunas unidades
de remodelado.
• Por lo tanto, las Rv.Cs pueden ser un blanco
terapéutico critico en el tratamiento de la
osteoporosis.
• Para esto, las propiedades moleculares de las
Rv.Cs deben ser estudiadas y caracterizadas.
Importancia del Acople entre Resorción
y Formación
Bonus Article
In conclusion, so far treatments of bone diseases have focused mainly
on bone resorption itself or bone formation itself. However, bone
diseases may not simply be due to a direct failure of resorption or
formation but result from a lack of coordination between resorption and
formation.
Here, we propose that ODN is a bone resorption inhibitor which acts
positively on the mechanism coordinating resorption with formation,
through recruitment of osteoblast progenitors.
The Blue Hole - Belize