DETERMINACIÓN DE NIVELES DE CORTICOSTERONA
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DETERMINACIÓN DE NIVELES DE CORTICOSTERONA PLASMÁTICA Y PILOSA EN RATAS WISTAR ADOLESCENTES HACINADAS Duván Fernando González Uarquin Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Bogotá D.C., Colombia 2014. II DETERMINACIÓN DE NIVELES DE CORTICOSTERONA PLASMÁTICA Y PILOSA EN RATAS WISTAR ADOLESCENTES HACINADAS Duván Fernando González Uarquin Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magíster en Neurociencias Director: Manuel Joaquín Rojas Barreto DMV. MSc. Codirector: Luis Fernando Cárdenas Parra, Psicólogo MSc PhD Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Bogotá D.C., Colombia 2014 III IV "Una cosa es segura, cuanto más profundamente confundido hayas estado en tu vida, más abierta se vuelve tu mente a nuevas ideas" Neil deGrasse Tyson. V VI Agradecimientos A mi familia y a Liliana. A mi director de tesis, Manuel Rojas y mi codirector, Fernando Cárdenas Al profesor Jerrold Meyer y a su laboratorio en la Universidad de Massachusetts por enseñarme sobre este tópico de investigación, y por brindarme la posibilidad de procesar y analizar las muestras. A Marykate, Carly, Mike y a todo el equipo de softball “Owls” por brindarme su confianza, respeto y amistad durante la estadía en Estados Unidos. Al equipo del laboratorio de Neurociencia y comportamiento de la Universidad de los Andes, dónde desarrollé la fase experimental. A los profesores que me apoyaron en el desarrollo de este trabajo. A quienes han mostrado su interés por continuar trabajando en esta área del conocimiento. VII Resumen En el presente trabajo se pretende determinar si hay cambios en la concentración de corticosterona en plasma y pelo de ratas Wistar en etapa juvenil sometidas a condiciones de hacinamiento como modelo de estrés crónico. Se utilizaron 18 ratas Wistar machos de 38 días de edad, distribuidas en dos grupos, control y experimental. Los sujetos experimentales se sometieron a un periodo de hacinamiento durante la fase final de la etapa juvenil (27 días). Los sujetos hacinados presentaron disminución significativa P<0,05 en el peso final promedio (266,5 ± 9,63g) respecto a los controles (341,2 ± 23,52g), además presentaron aumento significativo P<0,05 en los niveles promedio de corticosterona plasmática (470,16 ± 113,24 ng/ml) y pilosa (40,5 ± 9,75pg/mg) frente a los niveles hallados en los controles (232,6 ± 78,72 ng/ml y 19,67 ± 2,57 pg/mg en plasma y pelo respectivamente). Este estudio contribuye al desarrollo científico en la búsqueda de métodos no invasivos para el monitoreo de la corticosterona. Palabras clave: corticosterona, estrés crónico, etapa juvenil, hacinamiento, pelo, Wistar. VIII DETERMINATION OF PLASMA AND HAIR CORTICOSTERONE LEVELS IN OVERCROWDED ADOLESCENT RATS. Abstract For this study we determine whether exist changes in levels of plasma and hair corticosterone of young Wistar rats under crowded conditions like chronic stress model. 18 Wistar rats of 38 days old were divided in two groups, control and overcrowding; the experimental subjects were exposed to an overcrowding period during their youth (Post natal day 65). The overcrowded subjects showed significant difference P<0, 05 for the final body weight average (266,5 ± 9.63g) compared to control animals (23.52 ± 341,2g). Additionally, the overcrowded group showed higher corticosterone plasma concentration (470, 16 ± 113.24 ng / ml) and also hair corticosterone concentration (40, 5 ± 9.75 pg / mg) compared to control subjects (232, 6 ± 78.72 ng / ml and 19.67 ± 2.57 pg/ml in plasma and hair respectively). This work contributes to the search of noninvasive methods and the monitoring of corticosterone levels. Keywords: chronic stress, corticosterone, hair, overcrowding, Wistar, youth. IX Contenido Resumen ................................................................................................................. VIII Abstract ..................................................................................................................... IX Lista de Figuras ...................................................................................................... XIII Lista de Tablas........................................................................................................ XIV Lista de Abreviaturas .............................................................................................. XV Capítulo 1 Introducción .......................................................................................................... 16 1.1. Problema Científico .............................................................................. 16 1.2. Justificación ........................................................................................... 17 Capítulo 2 Estado del Arte ...................................................................................................... 18 2.1. Estrés ..................................................................................................... 18 2.2. Clasificación del estrés: agudo y crónico .............................................. 19 2.3. Hacinamiento como modelo de estrés crónico ..................................... 23 2.4. Etapa juvenil y hacinamiento ................................................................ 23 2.5. Glucocorticoides y medición de estrés crónico..................................... 26 2.6. Glucocorticoides en pelo como indicadores fisiológicos de estrés crónico……………………………...……………………....………..26 2.7. Técnicas para cuantificación de Glucocorticoides en pelo ................... 29 X Capítulo 3 Objetivos ............................................................................................................... 31 3.1. Objetivo general .................................................................................... 31 3.2. Objetivos específicos ............................................................................ 31 Capítulo 4 Materiales y métodos ............................................................................................ 32 4.1.Animales y condiciones de alojamiento .............................................. 32 4.2.Muestras de sangre y análisis hormonal ................................................ 32 4.3. Muestras de pelo y análisis hormonal ................................................... 33 4.4. Punto final/Eutanasia ............................................................................ 34 4.5. Análisis estadístico ................................................................................ 34 4.6. Consideraciones éticas y disposiciones vigentes .................................. 34 Capítulo 5 Resultados ............................................................................................................. 36 5.1. El pelo de rata Wistar expresa corticosterona y el hacinamiento durante el periodo juvenil causa incremento en los niveles de corticosterona pilosa ........................................................................... 36 5.2. El hacinamiento de ratas Wistar durante su periodo juvenil causa incremento en los niveles de corticosterona plasmática ...................... 37 5.3. No hay correlación entre los niveles plasmáticos y pilosos de corticosterona en ratas jóvenes hacinadas ............................................................................................................ 38 XI 5.4. El hacinamiento causa diferencias significativas en la ganancia de peso durante la etapa juvenil de ratas Wistar .......................................................................................................... 39 5.5. El peso de los órganos analizados no está significativamente correlacionado con el peso corporal tanto en sujetos controles como en sujetos hacinados. ........................................................................................................ 40 5.6. Peso absoluto de pulmones y glándulas adrenales no varía entre ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas; sin embargo si se presenta aumento significativo entre el peso del corazón y riñones de los sujetos controles versus los sujetos hacinados. ............................................................................................................ 42 5.7. Peso relativo calculado a partir del peso de los órganos sobre el peso corporal de ratas Wistar jóvenes en condiciones de hacinamiento. ............................................................................................................ 43 Discusión ............................................................................................................ 44 Capítulo 6 6.1. Conclusiones ......................................................................................... 48 6.2. Recomendaciones .................................................................................. 49 Bibliografía ................................................................................................................ 50 XII Lista de Figuras Figura No. 1. Regulación del sistema hipotalámico-Pituitario-Adrenal. .........22 Figura No. 2. Principales momentos del desarrollo desde la gestación hasta la edad adluta de la rata. .............................................................................24 Figura No. 3. Rutas de secreción de cortisol en el tallo del pelo .....................27 XIII Lista de gráficas Gráfica No. 1. Niveles de corticosterona pilosa ..............................................36 Gráfica No. 2. Niveles de corticosterona plasmática. ......................................37 Gráfica No. 3. Correlación entre niveles de corticosterona plasmática y corticosterona pilosa. .................................................................................38 Gráfica No. 4. Promedio de ganancia de peso .................................................39 Gráfica No. 5. Correlación entre el peso de órganos y el peso corporal en los sujetos controles. ..................................................................................40 Gráfica No. 6. Correlación entre el peso de órganos y el peso corporal en los sujetos hacinados.. ................................................................................41 Gráfica No. 7. Peso absoluto de organos. ........................................................42 Gráfica No. 8. Peso relativo de órganos ...........................................................43 XIV Lista de Abreviaturas °C Grados centígrados µl Microlitro ACTH Hormona adenocorticotropa ANOVA Análisis de varianza CA Cuerno de Amón cm Centímetro cm2 Centímetro cuadrado CRF o CRH Hormona liberadora de corticotrofina DE Desviación estándar DPN Día posnatal HPA Eje Hipotálamo – Hipófisis – Adrenal. g Gramo Gc Glucocorticoide h Hora Kg Kilogramo m Metro mg Miligramo ml Mililitro ng Nanogramo NPV Núcleo paraventricular pl Picolitro RPM Revoluciones por minuto SN Sistema nervioso SNS Sistema nervioso simpático XV Capítulo 1 Introducción Constantemente los seres vivos son desafiados por factores que se asocian a variaciones del equilibrio del organismo (Hogan et al., 2012), estos factores se denominan eventos estresantes, los cuales desencadenan respuestas fisiológicas y comportamentales que pueden causar alteraciones en el estado de salud y del bienestar del individuo. La activación del eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal es responsable de la secreción de glucocorticoides desde la corteza adrenal. En ratas el glucocorticoide más importante es la corticosterona (Dallman et al., 2004), esta hormona es responsable de la aparición de síntomas asociados al estrés crónico. En ratas jóvenes las condiciones de alojamiento tienen impacto significativo en el desarrollo, la salud y el bienestar. El hacinamiento es un evento estresante para el animal joven y se ha demostrado que promueve la aparición de ansiedad, depresión, hipertensión, aumento de la capacidad de respuesta al estrés en la edad adulta (Fournier et al., 2011) e influye en el funcionamiento del sistema cardiovascular (Puzserova et al., 2010). Actualmente se utilizan métodos para medir el estrés crónico que van desde los estudios relacionados con comportamiento exploratorio, ansiedad y depresión, hasta la cuantificación de los niveles de glucocorticoides en sangre, saliva, heces y orina (Stalder and Kirschbaum, 2012). Estas técnicas han resultado útiles, sin embargo resultan en algún grado invasivos y suelen requerir mayor número de muestras para evaluar estrés crónico. Una técnica nueva para el diagnóstico de estrés crónico parece encontrarse en la determinación de la concentración de corticosterona en pelo. Investigadores han encontrado que el folículo piloso, representa un eje periférico del eje Hipotálamo-pituitaria-adrenal (Arck et al., 2006; Sharpley et al., 2012), lo que podría ser de valor diagnóstico y no invasivo en la cuantificación de estrés crónico. 1.1. Problema de investigación El rápido crecimiento de la población mundial podría implicar sobrepoblación y aumento de animales para la producción de alimentos. Esto podría contribuir al estrés crónico. El hacinamiento es una de las causas de estrés crónico y se caracteriza por la reducción del espacio vital mínimo del individuo. 16 Hormonas como cortisol y corticosterona actúan como mensajeros químicos y a su vez como indicadores del equilibrio fisiológico, es por esto que su cuantificación es una de las herramientas más utilizadas en el diagnóstico del estrés (McCormick and Mathews, 2010). La importancia del estudio en métodos no invasivos asociados a la cuantificación de estrés crónico radica en monitorear y diagnosticar estados que desencadenen patologías relacionadas con el bienestar de humanos y animales (Russell et al., 2012). La búsqueda de nuevos métodos y técnicas contribuye a la generación de conocimiento científico, propendiendo por la mejora en la calidad de vida de los seres vivos. 1.2. Justificación Diversos estudios han planteado que el estrés por hacinamiento afecta seriamente a los sujetos jóvenes, pues a medida que pasa el tiempo es frecuente la aparición de dolencias corporales, hipertensión arterial, desórdenes metabólicos, disminución en la respuesta inmune, propensión a las adicciones, ansiedad y depresión, entre otros (Simeon et al., 2007). La investigación sobre evaluación efectiva y no invasiva para la medición de hormonas asociadas al estrés crónico en animales de laboratorio se está perfilando como una nueva línea de conocimiento para el bienestar animal. Algunos grupos de investigación están trabajando en métodos y estandarización de protocolos para el monitoreo de corticoides en pelo. En este ámbito la literatura científica aún es pobre, lo que denota la importancia de investigar en este campo. El desarrollo de este estudio contribuye a demostrar que la corticosterona pilosa es un indicador de estrés crónico, y aporta una herramienta en la evaluación del modelo de hacinamiento durante la etapa juvenil de la rata Wistar. 17 Capítulo 2 Estado del Arte 2.1. Estrés El término estrés fue formulado por primera vez por el endocrinólogo Hans Selye, quien desde 1936 lo definió como la respuesta no específica del cuerpo a cualquier demanda de cambio. Actualmente el estrés se puede definir como una reacción ante una condición que cause una perturbación real o percibida que cause desequilibrio en el equilibrio del organismo o bien como una respuesta biológica provocada cuando un individuo percibe una amenaza (modificado de Hogan et al., 2012). La "respuesta de estrés" es el conjunto de cambios fisiológicos o comportamentales que se producen en respuesta al factor estresante (Hogan et al., 2012). Los factores que causan estrés pueden ser factores físicos tales como la temperatura, exposición a radiación ultravioleta (Hiramoto et al., 2009), (Skobowiat et al., 2011), o de comportamiento (Russell et al., 2012) como el aislamiento, la confrontación, entre otros. La respuesta del organismo al evento estresante varía de acuerdo al tipo de amenaza y al tiempo al que esté sometido a la misma, pues algunas experiencias catalogadas como estrés pueden resultar placenteras y positivas para el organismo, así, la magnitud de la respuesta al estrés y sus posteriores efectos fisiológicos, dependen en gran medida de la percepción del individuo y su capacidad para adaptarse a las situaciones planteadas por el medio (Kim and Diamond, 2002). La respuesta del organismo al estrés se compone de tres fases: reacción, recuperación y adaptación (Oitzl et al., 2010). Los procesos corporales que mantienen la homeostasis durante las tres fases de estrés se denominan “alostasis” (McEwen, 2003). Inicialmente, los cambios fisiológicos inducidos por la respuesta al estrés desempeñan una función adaptativa tratando de mantener la homeostasis a pesar del factor de estrés, pero un sostenido aumento en la carga alostática se asocia con una serie de consecuencias perjudiciales como la desensibilización del receptor de glucocorticoides, el daño tisular y la falla en la regulación crónica del eje HPA (Russell et al., 2012) (McEwen, 2003). (Staufenbiel et al., 2012). 18 2.2. Clasificación del estrés: agudo y crónico. Como se mencionó previamente, los estímulos precursores del estrés generan diversos tipos de respuestas en el organismo, estas varían de acuerdo con la intensidad y la frecuencia del evento estresor. La primera respuesta es inmediata, se inicia en cuestión de segundos a través de la activación del sistema nervioso simpático (SNS) preparando el cuerpo para la supervivencia mediante la liberación de catecolaminas como la epinefrina y norepinefrina (Gow et al., 2010). La segunda respuesta endocrina al estrés involucra al eje HPA, es más lenta y resulta en la liberación de glucocorticoides, los cuales desempeñan un papel fundamental en la adaptación de larga duración a los factores de estrés (McCormick and Mathews, 2010). Comúnmente el estrés de corta duración se denomina estrés agudo o “eustrés” y el estrés de larga duración es denominado estrés crónico o “distrés”. Estrés agudo: Considerado como estrés positivo, es producto de las respuestas inmediatas a los estímulos inesperados del medio. Reacciones como lucha y huida suelen estar relacionadas con este tipo de estrés (Gow et al., 2010). Las catecolaminas (como la epinefrina y norepinefrina) generalmente indican estrés agudo, (Gow et al., 2010). Son responsables de causar manifestaciones metabólicas y comportamentales de manera temporal, la hormona más importante para la regulación del eustrés es la epinefrina. Según estudios de Kvetnansky en 2009 citados por (McCormick and Mathews, 2010), las catecolaminas son reguladas por el SNS el cual consta de componentes simpato-neuronales y simpato-suprarrenales que liberan catecolaminas desde los nervios simpáticos y la médula adrenal, respectivamente. La liberación de catecolaminas en ambos sistemas está regulada por proyecciones colinérgicas de la médula espinal y la liberación de catecolaminas se activa mediante la unión de los receptores nicotínicos y muscarínicos en los ganglios simpáticos y las células cromafines. La función principal de catecolaminas liberadas es redistribuir los recursos hacia los procesos que promueven la supervivencia, lo que resulta en una mayor utilización de la glucosa, aumento de la frecuencia cardíaca, dilatación de la pupila, broncodilatación, disminución de la motilidad y vasoconstricción intestinal (McCormick and Mathews, 2010). 19 Estrés crónico: Es el resultado de una exposición continua del organismo a eventos estresantes. Comportamentalmente podría generar desde variación de consumo de alimento (Ruis et al., 2001) y peso corporal (Bartolomucci et al., 2004) hasta ansiedad, depresión (Bourke and Neigh, 2011), variación en la capacidad de respuesta a situaciones de estrés (van der Staay et al., 2010) e incluso auto-agresiones (Davenport et al., 2008). Fisiológicamente, el distrés es mediado por glucocorticoides, entre ellos los más importantes están el cortisol en la gran mayoría de mamíferos y la corticosterona en la rata (Dallman et al., 2004). Tanto el cortisol como la corticosterona son secretados por acción del centro hipotálamo-pituitaria-adrenal afectando órganos blanco (Sharpley et al., 2009) como riñones, corazón, pulmones, huesos, entre otros, y manteniendo una activación sostenida del HPA (Johnson et al., 1992). El estrés crónico y la exposición prolongada a glucocorticoides alteran la estructura y la función de regiones cerebrales implicadas en procesos de memoria y aprendizaje como hipocampo, amígdala y corteza pre-frontal (Morrissey et al., 2011). El organismo de los mamíferos produce respuestas a los eventos de estrés para protegerse y adaptarse. La respuesta sistémica a los factores estresantes incluye la retroalimentación entre la estructura hipocampal y el eje HPA (Alfonso., 2005). Según Alfonso J., 2005, el hipocampo hace parte del sistema límbico. Las neuronas del hipocampo se encuentran particularmente alineadas por lo que se pueden distinguir capas compuestas predominantemente por dendritas apicales, somas, dendritas basales y axones. La formación hipocampal se encuentra dividida en regiones, denominadas las zonas Cornu Ammonis CA1 a CA4, el giro dentado y el subiculum. La información inicia en el hipocampo desde el giro dentado, a través de las zonas CA3 y CA1, hacia el subiculum. La entrada de información se produce principalmente a través de la vía perforante compuesta por axones provenientes de la corteza entorrinal que atraviesan el subiculum y llegan hasta las células granulares del giro dentado donde establecen contacto sináptico. Los axones de las neuronas del giro dentado conforman las fibras musgosas haciendo sinapsis con las neuronas piramidales de la zona CA3. La información va posteriormente hacia las neuronas piramidales de la zona CA1 a través de las fibras colaterales de Schaffer. 20 Los axones de las neuronas de la zona CA1 proyectan hacia el subiculum y la corteza entorrinal constituyendo la principal vía de salida de información del hipocampo, (Alfonso et al., 2005b; Alfonso et al., 2006; Alfonso et al., 2005a). El hipocampo posee una alta densidad de receptores para glucocorticoides, motivo por el cual esta estructura resultaría particularmente sensible a la acción de los mismos, los receptores ubicados en el hipocampo son de tipo I o de alta afinidad y de tipo II de baja afinidad (McEwen, 2003). El hipocampo se relaciona en muchas especies con la conducta exploratoria, la memoria explícita, episódica, declarativa, contextual (McEwen, 2000) y controla las funciones autonómicas y vegetativas (Kandel ER, 2000, citado por Valencia-Alfonso et al en 2004). El hipocampo regula la liberación hipotalámica desde el núcleo paraventricular (PVN) del complejo arginina-vasopresina (AVP) y de la hormona liberadora de corticotropina (CRH), la cual activa los receptores hipofisarios (CRH CRH-R), seguido por la producción y liberación de propiomelanocortina (POMC) (Tobin and Kauser, 2005), de ella se deriva la adenocorticotropina (ACTH) que por vía sanguínea va a las glándulas adrenales para estimular la secreción de cortisol y corticosterona (Figura 1). Se ha identificado que los niveles basales de glucocorticoides contribuyen al desarrollo de funciones cognitivas, sin embargo cuando el nivel aumenta pueden presentarse efectos nocivos sobre la estructura y función hipocampal (de Kloet et al., 1999). La corticosterona es una hormona esteroidea que junto a su receptor posee función transcripcional específica, regulando genes que intervienen en la plasticidad neuronal (de Kloet et al., 1998). La corticosterona se libera como respuesta al estrés y retroalimenta negativamente la estructura hipocampo-HPA. La actividad del sistema Hipotálamo-pituitaria-adrenocortical muestra cambios cíclicos a lo largo de las veinticuatro horas, que se manifiestan en variaciones de la concentración de corticosterona en plasma. Esta periodicidad circadiana activa se describe en especies diurnas como los humanos, y nocturnas como la rata en. La corticosterona también incrementa el nivel de azúcar en la sangre a través de la gluconeogénesis y la lipólisis, contribuye con la supresión del sistema inmunológico, con la inhibición de la síntesis de proteínas y también disminución de la formación ósea. 21 Figura 1. Regulación del sistema Hipotalámico-Pituitario-Adrenal. El principal centro modulador de la respuesta al estrés es el hipotálamo, el cual posee conexiones con niveles superiores como el sistema límbico, incluyendo aferentes excitatorios desde la amígdala e inhibitorios (polisinápticos) desde el hipocampo. Las neuronas del núcleo paraventricular del hipotálamo (NPV) secretan el factor liberador de la corticotrofina (CRF o CRH) que se transporta a través de los capilares del sistema circulatorio portahipofisiario al órgano blanco, las células corticotróficas de la adenohipófisis. Éstas, a su vez, liberan adenocorticotrofina (ACTH) que pasa al torrente sanguíneo y alcanza la corteza de las glándulas suprarrenales, cuyas partes facsiculada y reticular secretan gluococorticoides en respuesta a la ACTH. Además de otras numerosas funciones, los glucocorticoides inhiben la síntesis y liberación de CRF y ACTH, regulando su propia liberación. (Tomado de Alfonso J., 2005). La respuesta sistémica de estrés incluye el bloqueo en la fosforilación de la familia AKT Serina/Treonina quinasa, activando a Foxo, el cual es responsable de iniciar el proceso de gluconeogénesis en músculo. La corticosterona también modula la vía de señalización Camp/PKA/CREB (Li et al., 2008) además de la vía FosB y C-Fos (Das et al., 2009), (Donet et al., 2008, Szakacs et al., 2010) influyendo en la función del sistema inmune (Ito, 2010), que a su vez regula las funciones del sistema nervioso central recíprocamente a través de la liberación de citoquinas (Botchkarev, 2003), las cuales participan activamente en reacciones inflamatorias (Black, 2002). Recientes investigaciones han hallado que los corticosteroides en la piel pueden regular las actividades inmunes locales y una falla en la regulación de los mismos está ligada a la aparición de respuestas inflamatorias cutáneas (Slominski et al., 2013) 22 2.3. Hacinamiento como modelo de estrés crónico La exposición a situaciones estresantes durante la maduración puberal está implicada en alteraciones fisiológicas y psicológicas en la etapa adulta (Romeo, 2010). El desarrollo de modelos animales permite estudiar los procesos desencadenados por la respuesta al estrés. El hacinamiento consiste en la convivencia de varios individuos en un espacio reducido; se considera importante como modelo de estrés crónico en la investigación con modelos animales, además tiene impacto directo en animales de producción y en la calidad de vida humana. Investigaciones indican que en ratas adultas un rango de 4 a 12 animales por caja parece provocar menor ansiedad; cuando los animales son agrupados en números fuera de este rango, las ratas muestran comportamientos ansiogénicos, evidenciando que el tamaño de grupo es una medida importante a tener en cuenta en términos de alojamiento (Botelho et al., 2007). En ratas, las condiciones de espacio vital desde el destete hasta la edad adulta tienen impacto en el desarrollo y la salud (Valencia-Alfonso et al., 2004). El hacinamiento es estresante para el animal juvenil y promueve la aparición de ansiedad, depresión e hipertensión, además aumenta la capacidad de respuesta al estrés en la edad adulta (Fournier et al., 2011). El estrés crónico generado por condiciones de hacinamiento refleja cambios a largo plazo en la regulación del sistema HPA como hipercortisolemia, el incremento en la capacidad de generar esteroides y la sensibilidad de las glándulas adrenales a la ACTH, CRF y vasopresina, provocando decrementos notables de peso, e induciendo el crecimiento anormal de las glándulas adrenales en ratones (Aioi et al., 2001). Adicionalmente, estudios han demostrado que periodos de hacinamiento en ratas causan incremento en los niveles de los neurotransmisores serotonina y noradrenalina (Boranic et al., 1982), hiperactividad del eje HPA (Ely et al., 1997), supresión de la conducta exploratoria y remodelación neuronal del área CA3 del hipocampo (Valencia-Alfonso et al., 2004). 2.4. Etapa juvenil y hacinamiento En animales, el periodo juvenil (referenciado como adolescencia por algunos autores), es un periodo de transición de la infancia a la edad adulta, que implica la maduración de la conducta tanto fisiológica como cognitiva (Sisk and Foster, 2004). Un sistema general de clasificación juvenil para roedores como la rata consiste en tres etapas: en primer lugar, la pre pubescencia, la cual es el período de adolescencia de los días 21 a 34 de edad (las ratas son destetadas normalmente a los 21 días de edad), en segundo lugar un 23 período de adolescencia media, la cual está entre los días 34 a 46 de edad, y un período final de la adolescencia de días de 46 a 59 de edad (Tirelli et al., 2003). Un método diferente consiste en observar la separación balano-prepucial (separación del prepucio y el glande del pene) en el macho, la cual se da a partir de los 40 días y está relacionada con el aumento de testosterona y estimulación en los procesos de motilidad espermática (McCormick and Mathews, 2007). Independientemente de los métodos de clasificación, se ha consensuado que a partir del día 60 se inicia la edad adulta y que en la etapa final de la adolescencia el animal ha alcanzado la madurez física y sexual (Figura 2), implicando aumento pulsátil de hormona liberadora de gonadotrofina y la activación del eje hipotálamo-hipófisis-gonadal (McCormick and Mathews, 2007). Figura 2. Principales momentos del desarrollo desde la gestación hasta la edad adulta en la rata. Fuente: McCormick and Mathews., 2010. Modificado por el autor. El eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal es inmaduro en la adolescencia, la necesidad de consolidarse morfológica y funcionalmente le da mayor plasticidad, por ello los eventos de neurogénesis y densidad dendrítica son altos antes de la pubertad (<40 días después del parto en las ratas macho) y disminuyen en la edad adulta (Morrissey et al., 2011). Durante el periodo juvenil, el cerebro está madurando, lo que sugiere que ratas jóvenes pueden ser más susceptibles a los factores de estrés, exponiéndose a altos niveles de glucocorticoides con respecto a la edad adulta. Los animales jóvenes pueden estar en mayor riesgo que los adultos de sufrir los efectos nocivos del estrés crónico (McCormick and Mathews, 2007) por lo tanto se presume que si bien a nivel morfológico no existen variaciones significativas en el hipocampo de animales jóvenes estresados, la exposición a factores de estrés conduce a cambios 24 relativamente permanentes en el comportamiento cognitivo y tal vez, a diferencias en las respuestas neuroendocrinas a factores de estrés en la edad adulta (Ver Hoeve et al., 2013). A nivel comportamental existen marcadas diferencias entre jóvenes y adultos, por ejemplo, animales en etapa juvenil tienden a mayores niveles de búsqueda de la novedad, la impulsividad y la reducción de estrés en respuesta a la novedad que los adultos (McCormick and Mathews, 2007). Como se ha mencionado previamente, la etapa juvenil es un periodo de cambios en el desarrollo y la reorganización de los circuitos cerebrales, por lo tanto animales jóvenes pueden ser más vulnerables que los adultos a los efectos del estrés crónico (Morrissey et al., 2011). El hacinamiento como modelo de estrés crónico en ratas jóvenes recién destetadas produce un retraso en el desarrollo de la talla y el peso corporal, así como un déficit en el aprendizaje espacial de ratas macho (McCormick et al., 2008). Además, conduce a alteraciones de la conducta exploratoria, en las que los machos muestran mayor excitabilidad y actividad en la exploración (Valencia-Alfonso et al., 2004). El estrés crónico en la etapa juvenil altera particularmente el desarrollo del hipocampo, aumentando así comportamientos patológicos en la edad adulta. Por lo tanto, la exposición a los factores de estrés en la etapa juvenil puede alterar el desarrollo cerebral permanente llevando a una alteración del rendimiento cognitivo en la edad adulta (McCormick and Green, 2012). Las ratas jóvenes muestran aumento de la neurogénesis en el giro dentado en respuesta al estrés crónico, mientras que los adultos que experimentan el mismo procedimiento responden con una reducción de la neurogénesis. Los roedores jóvenes muestran una liberación prolongada de glucocorticoides en respuesta a factores de estrés crónico en comparación con los adultos (Morrissey et al., 2011). Además se ha demostrado que el estrés en el periodo adolescente (28-56 días) afecta el desempeño de ratas en su edad adulta, pues entre otros cambios, modulan la respuesta adrenal a estresores agudos y generan disminución en los receptores para glucocorticoides en el hipocampo (Weintraub et al., 2010). La evidencia anterior, se puede establecer que ante eventos de estrés crónico los sistemas de aprendizaje y la memoria son más vulnerables en la etapa juvenil, pero sus efectos más marcados se presentan en la edad adulta (Romeo, 2010). 25 2.5. Glucocorticoides y medición de estrés crónico Cambios a largo plazo de la secreción de glucocorticoides se considera que desempeñan un papel crucial en la mediación de la relación entre el estrés crónico y el desarrollo de numerosas enfermedades relacionadas con la resistencia a insulina (Vinson, 2009), el sistema inmune (Stalder and Kirschbaum, 2012), además del adecuado desarrollo fisiológico y comportamental (Munsterhjelm., 2010). La determinación de glucocorticoides es uno de los métodos más aplicados en la evaluación de estrés crónico en humanos y animales. Se ha demostrado que en todas las especies de mamíferos la dinámica del cortisol y la corticosterona es similar (Cockrem, 2013). La vía principal para la obtención de estas hormonas en mamíferos es el plasma, sin embargo durante los últimos años la búsqueda de métodos no invasivos para el diagnóstico de estrés crónico ha permitido la ampliación del conocimiento hasta la obtención de glucocorticoides en saliva, heces, orina y pelo (Accorsi et al., 2008). Una de las principales desventajas en la determinación de estrés crónico por los métodos mencionados es que se requiere un número mayor de mediciones, pues en el caso de plasma y saliva dependen del ciclo circadiano, además implica cierto grado de invasividad en la recolección de las muestras (Russell et al., 2012) (Rutherford et al., 2006). Algunos estudios plantean que las concentraciones de glucocorticoides en plasma, orina y heces no serían fieles marcadores de estrés crónico, debido a eventos como ritmo circadiano y unión de las hormonas a proteínas globulares y conjugación (Hellhammer et al., 2009). Durante los últimos años la investigación sobre fisiología del estrés crónico se ha enfocado a buscar sitios alternativos de síntesis y/o almacenamiento de glucocorticoides, que garanticen fiabilidad y disminuyan la Invasividad en la toma de muestras. 2.6. Glucocorticoides en pelo como indicadores fisiológicos de estrés crónico Las investigaciones han arrojado que la piel es uno de los lugares de mayor actividad e importancia en la homeostasis (Slominski and Wortsman, 2000). No está dilucidado si los niveles de corticoides hallados en pelo dependen directamente de los niveles en el torrente sanguíneo, o si existe producción de corticoides en la piel y/o el pelo (Sharpley et al., 2009). 26 Estudios en cultivos de fibroblastos (Slominski et al., 2006) y folículos pilosos de cuero cabelludo humano (Ito et al., 2005) indican que la piel de mamíferos podría ser un sitio extra-adrenal de síntesis de glucocorticoides, allí se ha documentado una vía esteroidogénica estimulada por la hormona ACTH, CRH (Slominski et al., 2007) y propiomelanocortina, provocando producción de corticosteroides en humanos (Slominski et al., 2005). La hipótesis de producción de corticosteroides por la existencia de un eje HPA cutaneo producido en melanocitos, fibroblastos (Slominski et al., 2008), folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas viene teniendo amplia aceptación en la literatura (Sharpley el al., 2010; Sharpley et al., 2012; Arck et al., 2006; Keckeis et al., 2012; Russell et al., 2011), esto plantea que la síntesis y producción periférica de cortisol no depende únicamente del ritmo circadiano normal sino también de su propio ritmo (figura 3). Figura 3. Rutas de secreción de cortisol en el tallo del pelo. Diagrama que ilustra las posibles vías por las que el corticoide puede ser secretado en el tallo piloso. El tallo del pelo podría tener dos depósitos de cortisol. Uno que está incorporado dentro del tallo piloso y puede reflejar las concentraciones de cortisol histórico, y otro que es transitorio y refleja las concentraciones de cortisol actuales. Se mantiene incógnita de si la fuente de corticoides almacenados en pelo es la sangre, la piel o el folículo piloso, y si el estímulo para la producción de cortisol es central (a través del sistema nervioso simpático) o inducida por los efectos directos de un factor de estrés local. Fuente: Sharpley et al., 2012. Modificado por el autor. 27 Si bien la relación entre piel, glucocorticoides y pelo no es clara, está evidenciada la presencia de glucocorticoides en pelo ante eventos de estrés crónico (Paus et al., 2008) (Raul et al., 2004). Investigadores han demostrado que el folículo piloso representa un vástago rico en células ectodérmicas y mesodérmicas (Paus and Foitzik, 2004). La piel y sus anexos podrían permitir el estudio de respuesta neuroinmunoendocrinas complejas como base para la identificación de nuevos blancos para la intervención terapéutica del estrés (Paus et al., 2006). Aunque la literatura relacionada con producción de corticosterona pilosa es escaza, existen trabajos que demuestran niveles del corticoide en plumas (Fairhurst et al., 2013) (Will et al., 2014). Independientemente de la procedencia del corticoide, se sabe es precedido por la progesterona (Slominski et al., 2000), tiene la capacidad de sintetizarse en los fibroblastos y llegar al folículo piloso (Ito et al., 2005). El hallazgo de esta hormona en el pelo (Meyer and Novak, 2012; Mcbeth et al., 2010) apoya la hipótesis de que el folículo piloso tiene la capacidad de modularse de acuerdo a la respuesta al estrés (Tobin and Kauser., 2005). Actualmente es rutinaria la cuantificación de los niveles de corticoides en pelo como indicador de estrés crónico en varias especies de mamíferos (Davenport et al., 2008) (Morris et al., 2011) (Steudte et al., 2011) (Zoccola and Dickerson, 2012) ) (Staufenbiel et al., 2012) (Cavigelli and Chaundhry, 2012) (Meyer and Novak, 2012) (Luo et al., 2012) (Comin et al 2012), (Sinicalchi et al., 2013). Es importante tener en cuenta que aunque los glucocorticoides de las muestras de pelo son herramientas útiles para el seguimiento de enfermedades asociadas al metabolismo hormonal a largo plazo, siendo estratégico en el monitoreo del eje HPA de animales comprometidos en etapa adulta, prenatal y neonatal (Comin et al 2012); algunas investigaciones han arrojado resultados que indican que la concentración de glucocorticoides en pelo están ampliamente asociadas con efectos ambientales (Davenport et al., 2008; Morris et al., 2011), nutricionales (Zoccola and Dickerson, 2012), respuestas emocionales, temperamento (Sinicalchi et al., 2013), acondicionamiento físico (Staufenbiel et al., 2012), alteraciones metabólicas (Cavigelli and Chaundhry, 2012), enfermedades infecciosas (Meyer and Novak, 2012), desordenes psicológicos como la ansiedad (Steudte et al., 2011), el estrés postraumático (Luo et al., 2012), el color del pelo (González-de-la-Vara Mdel et al., 2007; Bennet and Hayssen, 2010), (Mcbeth et al., 2010 y la genética (Fairbanks et al., 2011), causando un modelo aditivo dependiente de influencias genéticas y ambientales en la actividad HPA a largo plazo (Dickerson and Kemeny, 2004). La determinación del contenido de glucocorticoides en muestras de pelo es una herramienta útil para el seguimiento de enfermedades asociadas al metabolismo hormonal a largo plazo, siendo estratégico en el monitoreo del eje HPA de animales en etapa adulta, prenatal y neonatal (Comin et al 2012). 28 Es importante destacar que la medición de glucocorticoides en pelo no puede detectar el impacto de los factores de estrés que se producen durante periodos breves de tiempo (Haverbeke et al., 2008). Para la evaluación de estrés, la medición de cortisol en pelo debe ser pensada como medida de largo plazo, complementaria al cortisol salival o plasmático, si lo que se pretende lograr es una curva de diagnóstico completo (Jensen et al., 1996). En lo respectivo a la muestra de pelo, investigaciones han establecido que se deben tomar de la región del cuello posterior, puesto que en ese lugar existe menor riesgo de contaminación por contacto (Gow et al., 2010; Keckeis et al., 2012. Para la obtención de las muestras es recomendable afeitar al ras de la piel y lavar aproximadamente tres veces, con esto se disminuyen los inconvenientes de contaminación por glándulas, folículos y restos de sangre (Bechshoft et al., 2012). Comparar los niveles hormonales en muestras de pelo es un método alternativo no invasivo que puede ser utilizado para evaluar una gran variedad de animales en el campo, la cantidad de pelo para recolección según estudios va desde los 5 mg en humanos, hasta los 60mg en perros y 250 mg en monos (Koren et al., 2008). 2.7. Técnicas para la cuantificación de glucocorticoides en pelo De acuerdo con Gow en 2010, para obtener niveles de corticoides como indicadores de estrés crónico, estos se analizan por medio de diferentes métodos, entre los cuales los más utilizados son: El Inmunoensayo enzimático (ELISA), el Radioinmunoanálisis (RIA) y la espectrometría de masa-HPLC. A continuación se describen brevemente las técnicas: ELISA (o EIA): Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. Es una técnica en la cual un antígeno se detecta mediante anticuerpos ligados a enzimas, generando un cambio colorimétrico para su detección. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante un espectrofotometro la cantidad de antígeno en la muestra. Espectrometría de masas: consiste en la medición de iones derivados de moléculas. Se basa en el análisis de la composición de diferentes elementos químicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-carga (m/z). Los métodos de espectrometría de masas son técnicas muy específicas y sensibles. Hasta ahora sólo HPLC / MS (o LC / MS) se ha utilizado para cuantificar cortisol en el pelo. Radioinmunoensayo (RIA): El radioinmunoensayo (RIA) Su fundamento es la competencia existente para la unión de anticuerpos específicos entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma 29 sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición, a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo El método ELISA ofrece varias ventajas, tales como una buena sensibilidad, bajo costo y resultados bastante rápidos, el método de espectrometría de masas se considera el más fiel para análisis de pelo, proporcionando mayor sensibilidad y especificidad. El tema de la contaminación externa en vivo es una preocupación para todas las medidas de análisis de cabello (Gow et al., 2010). Finalmente, es importante estudiar la asociación entre estrés y el desarrollo en diferentes órganos (Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009), para así lograr establecer relaciones que permitan profundizar en la dinámica del estrés en sujetos durante la etapa juvenil (Sisk and Foster, 2004) (McCormick and Mathews, 2007) (Morrissey et al., 2011). Aunque el desarrollo de este trabajo tiene como eje el contribuir en la búsqueda de métodos no invasivos en la cuantificación de glucocorticoides, son muchos los interrogantes que hay en torno a la cuantificación de corticosterona pilosa, hasta ahora no se tiene certeza absoluta de cuál es la dinámica de los glucocorticoides en el pelo y solo recientemente se ha comenzado a trabajar en protocolos para extracción de esteroides en pelo de ratas, pues son muy pocos los resultados publicados en los que han cuantificado corticosterona pilosa en cualquier especie. 30 Capítulo 3 Objetivos 3.1. Objetivo General: Determinar cambios en la concentración de corticosterona en plasma y pelo de ratas Wistar en etapa juvenil sometidas a condiciones de hacinamiento como modelo de estrés crónico. 3.2. Objetivos Específicos: Determinar si se deposita corticosterona en el pelo de rata Wistar. Identificar si los niveles de corticosterona plasmáticos y pilosos se ven afectados por un modelo de hacinamiento en ratas Wistar en etapa juvenil. Evaluar si existe correlación entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa al final de la etapa juvenil. Estandarizar de la técnica desarrollada para cuantificación de corticosterona en pelo de rata. Determinar si el peso del corazón, riñones, pulmones y glándulas adrenales se ve afectado por un modelo de hacinamiento en ratas Wistar jóvenes. 31 Capítulo 4 Materiales y métodos La investigación se llevó a cabo en el bioterio del laboratorio de Neurociencia y Comportamiento de la Universidad de los Andes. El espacio se encuentra localizado en la ciudad de Bogotá Colombia, bajo un clima templado y una altura sobre el nivel del mar de 2640 m. Las coordenadas a informar son Latitud Norte 4°35'56''57 Longitud Oeste de Greenwich 74°04'51''30. 4.1. Animales y condiciones de alojamiento. El experimento fue aprobado por el CICUAL de la Universidad de los Andes y por el comité de bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia. Dieciocho ratas Wistar machos de treinta y ocho días de edad (DPN 38), provenientes del bioterio del laboratorio de Neurociencia de la Universidad de los Andes se dividieron aleatoriamente en un grupo control compuesto por nueve individuos distribuidos en tres cajas de acrílico de 15 cm X 31cm X 18cm, es decir, 155 cm2 por animal (Jayo y Cisneros, 1999) y un grupo experimental de nueve individuos distribuidos en tres cajas de acrílico en un área de 15,2cm X 10cm X18cm, es decir 50,5 cm2 por animal (Cárdenas y col, 2010; Díaz y col, 2010; Djordjevic y col, 2005 & Dronjak y col en 2004). El DPN 38 Se Tomaron las muestras iniciales dando inicio a la fase experimental, En el DPN 65 fueron obtenidas las muestras finales y se llevó a cabo el sacrificio de los sujetos experimentales. Los sujetos fueron mantenidos en un ciclo luz/oscuridad de 12 h (encendido de la luz a las 09:00 h), a una temperatura de 21±2 ˚C. 4.2. Muestras de sangre y análisis hormonal Se tomó la muestra de sangre de la vena safena en el DPN 38 y DPN 65, todas las muestras fueron recogidas por el personal veterinario adscrito al laboratorio de Neurociencia y comportamiento de la Universidad de los Andes. Para obtener las muestras de sangre se usaron agujas 23G x 25mm. Posterior a la punción, la sangre obtenida fue almacenada en dos o tres tubos capilares heparinizados de 80 µL por muestra. Para el análisis hormonal, las muestras de sangre fueron centrifugadas a 2500 RPM durante 10 minutos y el plasma extraído se almacenó a -20°C. Para la 32 obtención de los niveles de corticosterona plasmática se utilizó el Kit de Enzo Life Sciences inmunoensayo enzimático (Catálogo # ADI-901-097). Inmediatamente después de la aplicación del Kit las muestras fueron leídas a una longitud de onda de 490nm. Finalmente las concentraciones de corticosterona se determinaron a partir de la curva de calibración del Kit, utilizando en software GEN 5. | 4.3. Muestras de pelo y análisis hormonal Para la obtención de las muestras de pelo se afeitó el flanco derecho de cada animal en el DPN 38 o inicio del experimento y el DPN 65 o final del experimento. Las muestras de pelo sin folículo se lavaron durante cinco minutos (x3) con 5 mL de isopropanol con el fin de disminuir contaminación del pelo por contacto con glándulas, folículos y restos de sangre, (Bechshoft et al., 2012). Posteriormente las muestras fueron secadas durante cuatro días a temperatura ambiente. Luego del proceso de secado, cada muestra de 150 a 200mg de pelo se pulverizó en un molino electrónico (Grinding ball mil). El pelo pulverizado (49,5 – 50,5g por muestra), se incubo en un eppendorf durante un día con 1mL de metanol a temperatura ambiente. Para secar las muestras, se sometieron a evaporación por medio del SpeedVac durante dos horas. Para la purificación por extracción en fase sólida se utilizaron columnas de 1mL Supelco Super Select C18-30mg. Cada una de las columnas fue activada usando 1mL de metanol y 1mL de agua des-ionizada. Posterior a la preparación, para el ensayo, las muestras fueron adicionadas a las columnas y lavadas con metanol 5%. Finalmente, en el proceso de elución las muestras fueron colectadas en tubos con 1mL de metanol y secadas en el SpeedVac por 3 horas. Este protocolo fue formulado y desarrollado por el Profesor Jerrold Meyer de la Universidad de Massachusetts en EE.UU. Para el análisis de corticosterona en pelo, se usó el kit Arbor Assays DetectX enzyme inmunoassay (Catalog # K104-H1). Las absorbancias se leyeron a una longitud de onda de 450nm y las concentraciones de corticosterona se determinaron a partir de la curva patrón usando el software GEN 5. El nivel de corticosterona obtenido en pg/ml fue transformado a pg/mg de acuerdo al protocolo. 33 4.4. Punto final/Eutanasia Previo al sacrificio los animales fueron anestesiados con 90 mg/Kg de ketamina y 10 mg/Kg de xilacina. El método de eutanasia utilizado fue el de perfusión, que permitió obtener las mediciones de peso de algunos órganos. Tanto el veterinario responsable como los investigadores tomaron todas las medidas para minimizar el sufrimiento de los sujetos experimentales. 4.5. Análisis estadístico Las concentraciones de corticosterona en el pelo (pg/mg) y plasma (ng/mL) se transformaron logarítmicamente con el fin de normalizar los datos. Para las muestras de plasma y corticosterona y para el peso corporal se utilizó ANOVA de dos vías mixto con variable entre sujetos (tratamiento) y variable intra sujeto (día) seguido por un post-hoc univariado para ANOVA´s. Para observar si existe relación entre la corticosterona pilosa y plasmática se usó la correlación de Pearson. Comparaciones del peso de los órganos entre el grupo control y el grupo experimental se evaluaron utilizando la prueba t-student. Para la ejecución de los análisis estadísticos se utilizó el GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.) y Systat 11 (Systat Software, San Jose, CA, EE.UU). En este experimento, un valor de P < 0.05 fue considerado significativo y todas las barras de error muestran el error estándar (SEM). 4.6. Consideraciones éticas y disposiciones vigentes El presente proyecto contribuye al desarrollo de estrategias asociadas al uso y cuidado de los animales, el desarrollo del mismo aporta a la estandarización y aplicación de técnicas no invasivas de cuantificación de estrés en animales de laboratorio. Este estudio se realizó cumpliendo la ley 84 de 1989 y la Resolución 008430 de 1993 (por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud). Los investigadores principales: Luis Fernando Cárdenas, Manuel J. Rojas y Duván Fernando González Uarquin, acompañados y asesorados por la profesional en Medicina Veterinaria Marlly Guarín garantizaron el cumplimiento de los protocolos de uso y cuidado de animales, así como los protocolos de bioseguridad. Los investigadores declaran que no tienen conflictos de interés derivados de la investigación propuesta. 34 Respecto a las implicaciones de bioseguridad: 1. En el presente proyecto fueron mínimos los riesgos para la salud humana. 2. En el presente proyecto se detallaron las muestras biológicas obtenidas de los diferentes ensayos y el uso que éstas recibieron. 3. En el laboratorio de neurociencias de la Universidad de los Andes así como en la Universidad de Massachusetts disponen de instalaciones de laboratorio apropiadas para el manejo de las diferentes técnicas experimentales. 4. Los desechos biológicos fueron depositados en bolsa roja y entregados al centro encargado de manipulación de residuos biológicos. 5. La unidad de recursos físicos de la Universidad de los Andes y de la Universidad de Massachusetts se hicieron cargo de la disposición definitiva de los desechos orgánicos y químicos producidos por el presente proyecto. 35 Capítulo 5 Resultados y discusión 5.1. El pelo de rata Wistar contiene corticosterona y el hacinamiento durante el periodo juvenil causa incremento en los niveles de corticosterona pilosa. Los resultados presentados confirman que el pelo de la rata Wistar almacena corticosterona. Los niveles del corticosteroide durante el periodo inicial fueron significativamente mayores a los niveles presentados por el control durante el periodo final. Se encontró diferencia significativa que (P<0,05) entre el grupo control (19,67± 9,75pg/mg) y el grupo experimental (40,5 ± 9,75pg/mg) posterior al tratamiento. La gráfica No. 1 muestra los niveles de corticosterona en pelo. Gráfica 1. Niveles de corticosterona pilosa de ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas en el día posnatal 38 y el día posnatal 65. Para este experimento el n fue de 9 por grupo. El valor de P fue < 0,05. Hay diferencias significativas entre los sujetos controles y hacinados el día posnatal 65. Las barras de error indican el error estándar (SEM) de los promedios. 36 5.2. El hacinamiento de ratas Wistar durante su periodo juvenil causa incremento en los niveles de corticosterona plasmática. La gráfica No. 2 indica alta dispersión de los niveles de corticosterona de los sujetos experimentales a los 38 días de edad, por lo que no se presentó diferencia significativa entre los niveles iniciales y finales del corticosteroide. Respecto a la comparación entre tratamientos, el análisis mostró que existen diferencias significativas entre los sujetos controles (232,6 ± 78,72 ng/ml) y hacinados (470,16 ± 113,24 ng/ml) el día posnatal 65. La gráfica No. 2 muestra los niveles de corticosterona en pelo. Todos los sujetos al día posnatal 38 fueron homogéneos”. * 550 500 C o r t ic o s t e r o n a n g /m l 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 L in e a d e b a s e D P N 3 8 C o n tr o l D P N 6 5 H a c in a m ie n to D P N 6 5 Gráfica 2. Niveles de corticosterona plasmática de ratas Wistar jovenes controles y hacinadas en el día posnatal 38 y el día posnatal 65. Para este experimento el n fue de 9 por grupo. El valor de P fue < 0,05. Hay diferencias significativas entre los sujetos controles y hacinados el día posnatal 65.Las barras de error indican el error estándar (SEM) de los promedios. 37 5.3. No hay correlación entre los niveles plasmáticos y pilosos de corticosterona en ratas jóvenes hacinadas. Como se ha observado previamente, el grupo control y el grupo hacinado muestran un patrón en los niveles de corticosterona plasmática y pilosa, indicando diferencias significativas entre los tratamientos; sin embargo el análisis de Pearson no arrojó correlación significativa entre los niveles totales del glucocorticoide en plasma sanguíneo y pelo. De acuerdo con lo observado en la gráfica No 3, los C soportan o r r e l a la c iindependencia ó n e n t r e entre c o r los t i cniveles o s t e rdeo corticosterona n a p l a s m en á tplasma i c a yy p ilo s a resultados pelo. C o r tic o s te r o n a e n p e lo (p g /m g ) 80 2 R = 0,1381 P = 0,1418 60 40 20 0 0 200 400 600 800 C o r t ic o s t e r o n a e n p la s m a ( n g /m l ) Gráfica 3. Correlación de Pearson entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa de ratas Wistar jóvenes hacinadas en el día posnatal 65. Para este experimento, el n fue de 17. La correlación no fue significativa. El análisis detallado de la correlación de Pearson entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa arrojó, para el grupo control un R 2=0,017 y P=0,75 y para el grupo hacinado un R2=0,0013 y P=0,92. 38 5.4. El hacinamiento demostró diferencias significativas en la ganancia de peso con respecto al grupo control durante la etapa juvenil de ratas Wistar. La ganancia del peso entre los individuos control y los individuos experimentales se muestra en la gráfica No. 4 Se observa que la condición de hacinamiento causó una variación significativa entre el peso de los grupos durante el tratamiento. El promedio de peso al final del experimento para el grupo control fue de 347,53g y para el grupo experimental fue de 266,52g. Gráfica 4. Promedio de ganancia de peso de ratas Wistar jóvenes desde el día posnatal 38 al día posnatal 65. Para el presente experimento el n por grupo fue de 9. La línea gris corresponde al grupo control, mientras que la línea verde corresponde a los sujetos hacinados,* es considerado como diferencia significativa (P<0,05). y ** como diferencia altamente significativa (P<0,01). Las líneas verticales corresponden al error estándar (SEM) de los promedios. 39 5.5. El peso de los órganos analizados en este estudio no está significativamente correlacionado con el peso corporal tanto en sujetos controles como en sujetos hacinados. La gráfica No. 5 muestra que según el análisis estadístico de Pearson, no existe correlación significativa entre el peso del corazón, los pulmones, riñones, glándulas adrenales y el peso corporal. Correlación entre el peso absoluto de los órganos evaluados y el peso corporal del grupo control: Gráfica 5. Correlación de Pearson entre los pesos de corazón, pulmones, riñones y glándulas adrenales y el peso corporal de ratas Wistar jóvenes controles en el día posnatal 65. No hay correlación entre el peso de órganos y el peso corporal. 40 Resultados similares al grupo control fueron encontrados en el grupo hacinado (gráfica No 6), en este caso se encontró que ninguno de los órganos evaluados posee correlación significativa con el peso corporal de los sujetos experimentales. Correlación entre el peso absoluto de los órganos evaluados y el peso corporal del grupo hacinado: Gráfica 6. Correlación de Pearson entre los pesos de corazón, pulmones, riñones y glándulas adrenales y el peso corporal de ratas Wistar jóvenes hacinadas en el día posnatal 65. El experimento contó con un n de 18 animales por grupo. No hay correlación entre el peso de los órganos y el peso corporal. 41 5.6. El peso absoluto de pulmones y glándulas adrenales no varía entre ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas; sin embargo sí se presenta aumento significativo entre el peso del corazón y riñones de los sujetos controles versus los sujetos hacinados. La gráfica No 7 muestra que en concordancia con la disminución de peso corporal, los sujetos hacinados presentaron disminución significativa en el peso de corazón y riñón respecto al grupo control; sin embargo no hubo diferencias entre los grupos en lo que respecta al peso de los pulmones y de las glándulas adrenales. Gráfica 7. Peso absoluto de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales de ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas en el día posnatal 65. Para el presente experimento el n por grupo fue de 9 animales. La barra negra corresponde al grupo control, mientras que la barra gris corresponde al grupo hacinado. * es considerado como diferencia significativa (P<0,05). y ** como diferencia altamente significativa (P<0,01). Las líneas verticales corresponden al error estándar (SEM) de los promedios. 42 5.7. El peso relativo calculado a partir del peso de los órganos sobre el peso corporal de ratas Wistar jóvenes en condiciones de hacinamiento muestra diferencias significativas en el peso de los pulmones, riñones y glándulas adrenales respecto a los controles. Aunque se evidenció que no existe correlación entre el peso de los órganos y el peso corporal, la gráfica No 8 indica que el peso relativo, donde se resalta la diferencia significativa entre el peso de la glándula adrenal derecha del grupo control y del grupo hacinado. Gráfica 8. Índice de peso de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales con relación al peso corporal de ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas en el día posnatal 65. La formula utilizada para obtener los índices fue: “(Peso del órgano / peso corporal)*100”. n=9 por grupo. (P<0,05). * índica diferencia significativa y ** índica diferencia altamente significativa (P<0,01). Las líneas verticales corresponden al error estándar (SEM) de los promedios. 43 Discusión Reportes previos han demostrado la utilidad de cuantificar corticosterona plasmática para la evaluación de estrés en periodos breves de tiempo (Stalder, Kirschbaum., 2012). La concentración de corticosterona en muestras de plasma varía en función del ritmo circadiano y es susceptibles a variación por perturbaciones ambientales (Meyer and Novak., 2012). Se sabe que el estado físico, social y la defensa de territorio son factores constantes que determinan la vulnerabilidad de los animales expuestos a estrés (Bartolomucci et al., 2004). La medición de glucocorticoides en plasma, saliva, orina y/o heces permite monitorear concentraciones de corticoides por minutos horas y días después de aplicado el evento estresor. Estudios sobre la concentración de glucocorticoides en pelo representan una nueva herramienta, válida, no invasiva y efectiva para cuantificar glucocorticoides para el diagnóstico de estrés crónico (Sharpley et al., 2012) (Siniscalchi et al., 2013). Los datos obtenidos en el presente trabajo (gráfica No. 1) exponen por primera vez la presencia de corticosterona en pelo de rata Wistar macho en etapa juvenil. También se cuantificó la concentración (pg/mg) de corticosterona pilosa, evidenciando que como herramienta de diagnóstico para estrés crónico su dinámica se comporta de manera similar al cortisol en pelo de otros mamíferos. El hacinamiento generó aumento significativo de la concentración de corticosterona pilosa frente a los sujetos control. Probablemente, el pelo de la zona afeitada crece almacenando la corticosterona plasmática circundante en el organismo durante el periodo de hacinamiento, o crece sintetizando corticosterona en conexión con un eje HPA autónomo durante el periodo de hacinamiento (Sharpley et al., 2009). Aún no se tiene evidencia certera de cuál de las dos vías está regulando los niveles de corticosterona en el pelo, por lo que lo único que se puede concluir de acuerdo a los resultados de este estudio, es que se comporta de la misma forma que el cortisol en otros mamíferos (Davenport et al., 2008) (Morris et al., 2011) (Steudte et al., 2011) (Zoccola and Dickerson, 2012) ) (Staufenbiel et al., 2012) (Cavigelli and Chaundhry, 2012) (Meyer and Novak, 2012) (Luo et al., 2012) (Comin et al 2012), (Sinicalchi et al., 2013), la corticosterona pilosa es una herramienta útil y no invasiva para el diagnóstico de estrés crónico en ratas Wistar. Algunos estudios han planteado que el cortisol piloso es mayor en etapas juveniles y va disminuyendo con el tiempo (Sharpley et al., 2012) (Ouschan et al., 2013), lo que podría explicar los elevados niveles de corticosterona encontrados el DPN 38; sin embargo los datos obtenidos en este estudio no son suficientes para corroborar esta hipótesis, para ello se requiere hacer una curva durante las etapas de vida de la rata Wistar. 44 Los datos iniciales (DPN 38) encontrados para corticosterona en pelo presentaron alta variabilidad. Aunque no existe evidencia sobre gestación y depósito de corticoides en folículo piloso, es importante tener en cuenta eventos relacionados con el estrés prenatal (Modir et al., 2014) (Amugongo and Hlusko, 2014) y alteraciones en la función de 11β-Hidroxiesteroide Deshidrogenasa (Chapman et al., 2014), eventos que además de favorecer el paso de corticoides al feto a través de la placenta (Weinstock, 2005), podrían aumentar la concentración de corticoides disponibles en el líquido amniótico (Tanswell and Smith 1978). Respecto a la variabilidad en la concentración de corticosterona plasmática, es importante tener en cuenta los eventos asociados a la reestructuración social de los grupos (Cavigelli et al., 2006) (Buwalda et al., 2011). La variabilidad de los niveles plasmáticos encontrada en las muestras del DPN 65 corroborarían que la dinámica fisiológica se ve alterada constantemente por factores físicos y sociales (Bartolomucci et al., 2004), en este caso, del estrés por hacinamiento. La evaluación realizada en este trabajo, comparando valores iniciales de corticosterona (DPN 38) y finalización de la etapa juvenil o adolescencia (DPN 65), no arrojó correlación significativa entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa. Respecto a este resultado (gráfica No. 3) es importante resaltar que actualmente no existe evidencia que concluya que los glucocorticoides presentes en el pelo deriven del flujo sanguíneo, de hecho algunos resultados sugieren que el cortisol piloso no se derivaría del torrente sanguíneo ni estaría mediado por la vía central ACTH (Sharpley et al., 2009), por otra parte existe evidencia que soporta la no correlación entre corticoides plasmático y piloso en humanos (Sauve et al., 2007), perros (Ouschan et al., 2013), osos polares (Bechshoft et al., 2011) y aves (Fairhurst et al., 2013), entre otros; esto posiblemente porque las concentraciones de cortisol piloso cambian de forma más gradual que en plasma sanguíneo, y por lo tanto parece representar una muestra ideal para el análisis de concentraciones de metabolitos de glucocorticoides a través del tiempo (Ouschan et al., 2013). La literatura científica ha documentado disminución significativa de peso en ratas Wistar sometidas a estrés social crónico (Aioi et al., 2001) (Bartolomucci et al., 2004) (McCormick et al., 2008) y a estrés por hacinamiento (Nagaraja and Jeganathan, 2002) (Bernatova et al., 2007) (Knyazeva et al., 2012) (Puzserova et al., 2010). La variación en peso corporal encontrada en este estudio podría explicarse de acuerdo a variaciones tanto sociales (derrota social, sobrepoblación) como físicos (espacio mínimo vital, manipulación) y/o ambientales (temperatura, humedad, amoniaco) propios de la complejidad del hacinamiento. 45 La discusión sobre la tasa de peso de algunos órganos respecto al peso corporal de ratas Wistar se ha estudiado en numerosos trabajos, no obstante la obtención de índices depende de diversos factores a considerar (Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009). En la presente investigación no se encontró correlación entre el peso corporal y el peso de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales tanto para el grupo control como en el grupo hacinado, esto se podría atribuir a que la etapa juvenil o adolescencia se considera una etapa de desarrollo y de constantes cambios fisiológicos (Sisk and Foster, 2004) (McCormick and Mathews, 2007) (Morrissey et al., 2011). De acuerdo a los anteriores argumentos, los resultados del presente estudio se han discutido de acuerdo al peso absoluto (gráfica N. 7), aunque es importante generar la discusión en cuanto a la cuantificación y exposición de pesos relativos (gráfica N. 8). Se ha demostrado que el peso de los riñones de animales sometidos a una condición de estrés crónico es significativamente menor que el peso del órgano en el grupo control, factor que según los autores está relacionado con menor volumen glomerular y menor número de nefronas por riñón (de Souza et al., 2001); sin embargo a nivel morfológico es poco lo que se sabe sobre la respuesta de los riñones a la exposición por hacinamiento. La diferencia encontrada entre el peso del corazón de los sujetos controles y los hacinados podría ser interpretada como resultado de una mayor actividad física, aumento del área de caja, y la posibilidad de expresar su comportamiento natural por medio de su nivel de actividad, en el grupo control (Spangenberg et al., 2005). Aunque no se midió el nivel de amoniaco en este experimento, es importante destacar que una cantidad considerable de estudios previos han documentado el efecto causado por el amoniaco en la respiración y calidad de vida de las ratas (Horn et al., 2012) (Burn et al., 2006). En el presente trabajo, el peso de los pulmones no fue significativamente diferente entre los dos grupos evaluados. Es necesario destacar la importancia de la limpieza y la frecuencia en el cambio de las camas. Los animales de ambos grupos fueron manipulados con la misma frecuencia y por el mismo tiempo. En relación con el peso de las glándulas adrenales, los resultados parecen depender del tipo de estresor utilizado. Estrés crónico por inmovilización (Rostamkhani et al., 2012) y por estrés crónico variable (Ulrich-Lai et al., 2006) presentan aumento significativo en el peso de las glándulas adrenales, mientras que acorde a lo mostrado en este estudio, el estrés crónico por hacinamiento no genera diferencias significativas en el peso de las glándulas adrenales de animales jóvenes (Armario et al., 1984) (Kirillov et al., 2003) (Nyuyki et al., 2012). Los anteriores resultados sugieren continuar el debate sobre características propias del estrés por hacinamiento, la exposición y la capacidad de adaptación (Puzserova et al., 2010). 46 Es importante plantear estudios futuros que involucren la variable de estrés por hacinamiento con análisis de peso, morfología y funcionalidad de los órganos, pues aunque existen estudios de proporcionalidad entre peso de algunos órganos y peso corporal (Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009) en este modelo de estrés crónico las variables, edad, dieta, temperatura, humedad, exposición a amoniaco y consumo de agua juegan un papel preponderante en la dinámica fisiológica. Además, debe tener en consideración los resultados en peso relativo, los cuales podrían ser útiles en la evaluación del peso de diferentes órganos en otras etapas de la vida. Falta dilucidar cuales son las posibles asociaciones entre niveles de corticosterona pilosa y masa corporal, peso total, peso de órganos, entre otras variables afectadas por eventos de estrés crónico, pues aunque haya datos prometedores en humanos (Stalder et al., 2012) y otras especies para algunas de estas variables, la investigación con animales para experimentación recién comienza. 47 Capítulo 6 6.1. Conclusiones En este estudio se demostró que la corticosterona se deposita en el pelo de rata Wistar en etapa juvenil. La técnica usada en este experimento para la cuantificación de corticoides demostró ser potencialmente útil para el monitoreo de la corticosterona en pelo de rata Wistar El hacinamiento induce diferencias significativas en la concentración de corticosterona pilosa y plasmática en ratas Wistar jóvenes Nuestros resultados demuestran que no hay correlación entre la variación de la corticosterona depositada en pelo y la concentración plasmática de la misma. 48 6.2. Recomendaciones El hallazgo obtenido en el presente trabajo, y la estandarización de la técnica en Colombia, contribuirán al desarrollo de metodologías más precisas y menos invasivas para la el monitoreo de corticosterona en eventos de estrés crónico Complementando el aporte al conocimiento que representa el presente trabajo, es relevante la necesidad de establecer mecanismos genéticos, epigenéticos, de señalización, procesos celulares y procesos sistémicos asociados a la dinámica de la corticosterona en pelo tanto en individuos machos como en hembras. Este trabajo plantea incógnitas importantes para el desarrollo de futuros estudios que permitan determinar entre otros factores, la curva de concentración de corticosterona en pelo durante la vida de la rata Wistar, y la relación entre aspectos comportamentales y corticosterona pilosa Se espera que este estudio contribuya al trabajo interdisciplinario relacionado con el monitoreo de estrés crónico y el bienestar animal. 49 Bibliografía 1. Accorsi PA, Carloni E, Valsecchi P, Viggiani R, Gamberoni M, Tamanini C, Seren E (2008) Cortisol determination in hair and faeces from domestic cats and dogs. Gen Comp Endocrinol 155:398-402. 2. Aioi A, Okuda M, Matsui M, Tonogaito H, Hamada K (2001) Effect of high population density environment on skin barrier function in mice. J Dermatol Sci 25:189-197. 3. Alfonso J, Fernandez ME, Cooper B, Flugge G, Frasch AC (2005a) The stress-regulated protein M6a is a key modulator for neurite outgrowth and filopodium/spine formation. 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