regulación de la muerte celular programada de una línea celular

Concurso: Proyecto Química ORT del Genoma Humano
Subsidios a la Investigación en: Bioquímica Molecular y Genética
Año 2015
REGULACIÓN DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA
DE UNA LÍNEA CELULAR TUMORAL (MEG01)
Directora del Proyecto: Dra. Paola D’Atri
Lugar del trabajo:
Laboratorio Trombosis Experimental
Instituto de Medicina Experimental
(CONICET-Academia Nacional de Medicina)
Pacheco de Melo 3081 - Ciudad Autónoma de Buenos Aires
INTRODUCCIÓN
Desde el embrión hasta el organismo adulto fisiológicamente sano, millones de células mueren de
manera programa en un proceso denominado Apoptosis. Este fenómeno no tiene lugar de forma
aleatoria sino que se trata de un proceso activo, genéticamente bien definido, en el que las células
están destinadas a morir en un tiempo determinado. La apoptosis es un proceso fisiológico que
controla el normal desarrollo y funcionamiento de los organismos multicelulares, ya que
interviene en la embriogénesis, la homeostasis tisular y los procesos inmunes [1]. Alteraciones en
este proceso pueden contribuir a una gran variedad de enfermedades, incluyendo cáncer,
autoinmunidad y desórdenes degenerativos [2].
La muerte celular puede ocurrir básicamente por dos mecanismos diferentes, necrosis o
apoptosis. Estos difieren tanto en sus características morfológicas y moleculares como en las
consecuencias que ocasionan al tejido circundante.
Durante el proceso de apoptosis las células sufren cambios metabólicos y morfológicos como el
encogimiento celular, la fragmentación de la membrana plasmática, condensación del núcleo y
fragmentación nuclear. Se produce además, disrupción de la arquitectura del citoesqueleto, la
célula se contrae y se liberan fragmentos celulares envueltos por membrana, conocidos como
cuerpos apoptóticos que rápidamente son ingeridos por macrófagos u otras células fagocíticas [3].
Debido a que el fraccionamiento celular mediante liberación de cuerpos apoptóticos no induce
liberación de citoquinas no desencadena una concomitante respuesta inflamatoria [4, 5].
La necrosis, a diferencia de la apoptosis, puede ser clasificada como una forma violenta o
catastrófica de muerte celular que ocurre como consecuencia de un daño traumático o mediante
la exposición a toxinas, es decir, es un proceso pasivo, desregulado y disparado por un estímulo no
fisiológico. Este proceso no requiere de energía en forma de ATP ni de la síntesis de ácidos
nucléicos o proteínas. Morfológicamente se observa hinchazón y falla mitocondrial, así como
también disfunción de la membrana plasmática, pérdida de la homeostasis y ruptura celular con la
consecuente liberación del contenido intracelular. Este fenómeno conduce hacia la muerte a
células vecinas y al mismo tiempo se atraen macrófagos y demás células inflamatorias al área
necrosada [5, 6].
Figura 1: Diferencias entre el proceso de necrosis y el de apoptosis.
Vías y moléculas que participan en la apoptosis.
El proceso apoptótico puede ser desencadenado tanto por señales intracelulares como
extracelulares las cuales convergen en una maquinaria común de destrucción celular que es
activada enzimaticamente por cisteínoproteasas. El desmantelamiento celular se traduce en
proteólisis de constituyentes celulares vitales, degradación del ADN y fagocitosis de la célula
afectada por células vecinas [7].
Cuando las señales de muerte o ligandos de muerte (death ligands, DL) son reconocidas por
receptores de muerte (death receptors, DR) que se expresan en la membrana plasmática de
alguno tipos celulares, se habla de apoptosis extrínseca. Recibida la señal, estos receptores inician
en segundos una cascada de señalización molecular en la que juegan un papel fundamental un
grupo de enzimas proteolíticas denominadas caspasas que ejecutan la muerte de la célula en
pocas horas.
Los DR pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF),
caracterizados por poseer un dominio intracelular llamado dominio de muerte (death domain,
DD). Los DR caracterizados hasta el momento son, el receptor de TNF-1 (TNFR1), Fas, DR3, DR4 y
el DR5 que son activados por sus respectivos ligandos pertenecientes a la superfamilia del TNF. La
activación del DD promueve el reclutamiento de la procaspasa-8 activándola. La caspasa-8 es una
caspasa iniciadora que tiene la capacidad de clivar a otras caspasas conocidas como caspasas
efectoras. Las caspasas efectoras clivan más de 40 sustratos, todos ellos componentes
estructurales de la célula, de manera tal que la célula es “desarmada”. En el proceso de desarme
celular las caspasas inactivan proteínas que protegen a la célula de la apoptosis activando
nucleasas que fragmentan el ADN. Además destruyen moléculas que regulan la estructura del
citoesqueleto celular haciendo que la célula pierda su forma y el contacto con células vecinas, se
desarma el núcleo y se suprime la reparación y replicación celular. Todo este proceso produce
cambios en la membrana celular como la exposición de fosfatidilserina, un lípido que en células
normales se encuentra en la cara interna de la bicapa lipídica, y que sirve como “etiqueta” para
aquellas células que deben ser fagocitadas. Finalmente la célula se fragmenta formando cuerpos
apoptóticos que contienen parte del citoplasma celular y que son fagocitados por los macrófagos
[7].
El proceso apoptótico puede desencadenarse no solo por la vía extrínseca, sino que también
puede dispararse por señales de estrés celular detectadas en el citoplasma de la célula en lo que
se conoce como apoptosis intrínseca. Dentro de los estímulos que activan esta vía se encuentran
el daño al ADN, el estrés oxidativo, una sobrecarga de Ca2+ citoplasmático y estrés del retículo
endoplasmático entre otros. En la apoptosis desencadenada por esta vía juega un papel muy
importante la mitocondria y la familia de proteínas Bcl-2. La superfamilia de las proteínas Bcl-2
está constituida por miembros anti- y pro-apoptóticos claves en la regulación de la muerte celular
programada. El balance entre los miembros de pro- antiapoptóticos en el citoplasma celular define
el destino final de la célula, de esta manera, cuando predominan los miembros anti- por sobre los
pro-apoptóticos la célula sobrevive, en caso contrario la célula muere por apoptosis [8]. En el
proceso de apoptosis por vía mitocondrial la activación de caspasas se da posteriormente a la
activación de los miembros pro-apoptóticos de la familia bcl-2 que promueven la permeabilidad
de la membrana mitocondrial. La pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial detiene la
síntesis de ATP y promueve la liberación de proteínas mitocondriales como el citocromo c y APAF1 al citoplasma de la célula. Estas dos moléculas forman en presencia de ATP una estructura
conocida como Apoptosoma que recluta a la procaspasa iniciadora -9. La activación de la caspasa9 desencadena la cascada de activación de caspasas efectoras como la caspasa-3 resultando en la
ejecución del proceso de muerte. En algunos tipos celulares, la vía extrínseca puede conectarse
con la vía intrínseca a través de uno de los miembros pro-apoptoticos de la familia bcl-2 llamado
Bid que al ser clivado por la caspasa-8 se genera un fragmento permeabilizador de la mitocondria
[9].
Figura 2: Distintos mecanismos que conducen a apoptosis. La apoptosis inducida vía receptores de muerte involucra el
reclutamiento de proteínas adaptadoras, la activación de caspasa-8 (iniciadora) y la subsiguiente activación de caspasas
efectoras como la caspasa-3. En la muerte celular inducida por estrés se produce la liberación de citocromo-c desde la
mitocondria. El cit-c se une al APAF-1 y procaspasa-9 conformando el apoptosoma que promueve la autoactivación de la
caspasa-9, quien a continuación activa a la caspasa-3.
Apoptosis y cáncer
En la mayoría de los procesos patológicos los mecanismos moleculares son desregulados y pueden
estar en un estado hiper-activado o excesivamente inhibido. Una de las patologías donde la
apoptosis se encuentra inhibida o bloqueada es el cáncer. Normalmente la muerte celular
programada elimina a las células que no realizan un correcto ciclo celular o tienen un grosero daño
a nivel de su ADN. Sin embargo en muchos tumores se han identificados mutaciones en las
proteínas antiapoptóticas, que las hacen hiperactivas, o en proteínas pro-apoptóticas que las
hacen menos efectivas, permitiendo la proliferación celular por sobre la detención del ciclo y la
subsecuente apoptosis celular. Cuando esto ocurre, la progenie de estas células llevará la misma
anomalía y seguirá proliferando sin control.
OBJETIVO
El objetivo de este proyecto de investigación es evaluar el efecto de factores extrínsecos e
intrínsecos en el gatillo del proceso apoptótico en una línea celular tumoral Meg-01.
TÉCNICAS A EMPLEAR
Cultivo de la línea tumoral Meg-01
La línea celular Meg-01 fue establecida a partir de las células de médula ósea de un paciente con
leucemia mielógena crónica en el año 1985. Estas células crecen en suspensión y tardan entre 36 y
48 horas en dividirse. Se cultivan de manera estéril con un medio de cultivo denominado RPMI
1640 en presencia de suero fetal bovino y antibióticos a 37ºC en una atmosfera de 5% de CO2.
Inducción de apoptosis
Se inducirá apoptosis sobre las células utilizando la citoquina TNF como promotor de la apoptosis
extrínseca y un dador de óxido nítrico como inductor de apoptosis intrínseca. Como control
positivo las células serán cultivadas en ausencia de suero. El porcentaje de apoptosis será
evaluado a diferentes tiempos y con técnicas específicas descriptas posteriormente.
Determinación de la proliferación celular
Se evaluará si los inductores de apoptosis afectan la tasa de proliferación celular por recuento de
las células en cámara de Neubauer. El número de células viables se determinará utilizando un
colorante vital denominado azul trypan.
La proliferación y viabilidad celular será cuantificada con un ensayo colorimétrico utilizando un
reactivo que funciona como sustrato de la enzima fosfatasa ácida, presente y funcional en células
viables, que genera un producto de color que es medido por espectrofotometría.
Detección de muerte celular por microscopía de fluorescencia
Para evaluar el porcentaje de apoptosis, 24 o 48 horas después de la inducción del estímulo se
realizará una tinción con dos colorantes (naranja de acridina y bromuro de etidio) que permiten
identificar por microscopía de fluorescencia si las células son viables, apoptóticas o necróticas. Se
calculará el procentaje de células en cada estadio por recuento de al menos 100 células por
tratamiento.
Detección de muerte celular por citometría de flujo
La apoptosis será evaluada y cuantificada por cambios en los parámetros de tamaño (parámetro
FSC-H) y complejidad (SSC-H) que presentan las células a través de la utilización de un citómetro
de flujo. En este equipo cada una de las células es visualizada por un láser que a través de un
software acoplado genera un gráfico de puntos (como muestra la figura 3) cada uno de los cuales
corresponde al tamaño y la complejidad celular de cada una de las células evaluadas. Con esta
técnica se puede cuantificar y estudiar un gran número de células, generando valores
estadísticamente más confiables.
En el caso de inducción de apoptosis las células disminuyen en tamaño y aumentan su complejidad
intracelular generando una nueva población visualizada por el citómetro (Figura 3).
FIGURA 3: EVALUACIÓN DE APOPTOSIS POR CITOMETRÍA DE
FLUJO. El gráfico de puntos de la izquierda muestra
una población de células homogénea (viables). En el
gráfico de la derecha se observa una nueva población
correspondiente a las células apoptóticas delimitada
por una región generada por el software.
Además se evaluará por citometría de flujo la degradación del ADN celular, mediante la
incorporación de un colorante que se intercala en el ADN y emite fluorescencia que puede ser
captada por el citométro. El porcentaje de células apoptóticas será considerado como la cantidad
de células hipodiploides, es decir, con menor fluorescencia que la observada en el pico diploide.
REFERENCIAS
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