PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR SEDE IBARRA PUCE - SI ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y AMBIENTALES E.C.A.A. INFORME FINAL DE TESIS TÍTULO: CARACTERIZACIÓN MORFOAGRONÓMICA Y MOLECULAR DE DE LA COLECCIÓN DE TOMATE DE ÁRBOL (Cyphomandra betacea Sendt) Sendt) DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL INIAP, ECUADOR PREVIA OBTENCIÓN DEL TITULO DE INGENIERA AGROPECUARIA AUTORAS: CHALAMPUENTE DORIS PRADO PRISCILA ASESOR: BIÓL. GALO PABÓN IBARRA - 2005 AUTORIA Declaramos que la presente investigación es de total responsabilidad de las autoras. ……………………………… Doris Salomé Chalampuente Flores C.I. 100261053-1 …………………………… Priscila Fernanda Prado Beltrán C.I. 171274322-6 2 PRESENTACIÓN La presente investigación titulada “Caracterización morfoagronómica y molecular de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) del banco de germoplasma del INIAP” está conformada por cinco capítulos que se detallan en los acápites siguientes. El Capítulo I, está conformado por: planteamiento del problema que detalla los problemas relacionados con el cultivo de tomate de árbol, como la pérdida de variedades puras y la proliferación de plagas y enfermedades; justificación se hace hincapié en la importancia de la caracterización morfológica y molecular para la identificación de material promisorio, y la conservación del germoplasma; objetivos se plantea estudiar la variabilidad genética de la colección de tomate de árbol mediante la identificación de caracteres morfológicos discriminantes y la caracterización molecular mediante la técnica RAPDs. El Capítulo II, se detalla toda la revisión bibliográfica del cultivo de tomate de árbol, la caracterización y evaluación del germoplasma y la técnica molecular RAPDs, obtenida en libros y páginas web. El Capítulo III, está dividido en dos etapas: caracterización morfoagronómica en la que se detalla la ubicación en campo de la granja de la Unión de Organizaciones Campesinas e Indígenas de Cotacachi (UNORCAC), materiales y la metodología de análisis multivariado empleado en la evaluación de los descriptores en estudio; en la caracterización molecular se detalla la ubicación del laboratorio de Biotecnología del Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología (DENAREF) del INIAP, así como los protocolos 3 empleados en la caracterización molecular y el análisis estadístico de los resultados obtenidos. En el Capítulo IV, se presentan los resultados obtenidos en la caracterización morfoagronómica, y molecular de tomate de árbol, así como la discusión de estos resultados y la correlación de las dos fases en estudio. En el Capítulo V, se establecen las conclusiones y recomendaciones a las que se llegó con el análisis de los resultados obtenidos, así como la estrecha relación genética entre las accesiones que fueron evaluadas en la presente investigación. 4 DEDICATORIA A mi Dios por el diario vivir A mi Papi Héctor y a mi mami Josefina por el apoyo incondicional que me han brindado durante este tiempo, permitiendo culminar con una etapa más de mi vida profesional. Gracias padres por todo su amor. A mis hermanos Christian, Héctor, Sandra, Daniel, Andrés por su cariño y comprensión. A mi hermana Lix, Juan y mis sobrinos, gracias por todo. A mis abuelitos y tíos por su apoyo moral y todo su cariño. A todos los quiero mucho. DORIS 5 A mi papi, por ser el mentor de lo que ahora soy, por enseñarme a soñar y a entender que por el camino más difícil, siempre se llega a la cumbre. A mi mamita, por su ternura y entrega, y por darme cada día fuerzas y valor para salir adelante. A mis hermanas, por ser mis cómplices, y por todo el apoyo recibido . A mis sobrinos, por ser la alegaría que llena mi corazón A mis abuelitos por que su apoyo y cariño Al ti Wilito, por estar siempre a mi lado, y por todos los momentos compartidos Priscila 6 AGRADECIMIENTO A la Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra, y en especial a la Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales por abrirnos sus puertas durante los años de carrera estudiantil, y a los docentes por habernos impartido los conocimientos que nos formaron como profesionales. Al Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias en las personas Ing. Victor Hugo Cardoso Director General, Dr. Julio Delgado Director de Investigaciones. A la “Estación Experimental Santa Catalina” en la persona del Ing. Luis Fernando Rodríguez Director de la Estación. Al Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología del INIAP, y en especial a su Líder M.Sc. César Tapia por habernos dado la apertura para realizar la presente investigación, por la confianza depositada en nuestro trabajo y la amistad brindada; a la Biól. Gabriela Piedra por brindarnos sus conocimientos desinteresadamente, por su apoyo y amistad incondicional, gracias “madre”; y a todo el personal que forma parte del DENAREF que de una u otra manera contribuyeron con la culminación de esta investigación. Al Biól. Galo Pabón por la amistad, el apoyo y por aportar con sus conocimientos en el desarrollo de esta tesis. Al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos USDA y en especial a Dr. David Willams y la Dra. Karen Willams; a la Secretaría del Programa de Apoyo Alimentario PL-480 por el financiamiento recibido para el desarrollo de la presente investigación. 7 Al IPGRI por la asistencia técnica. A nuestros queridos compañeros y amigos de la promoción 2000 “B” con quienes compartimos muchos momentos agradables, y que los llevaremos siempre en nuestros corazones. A todas las personas que de una u otra manera colaboraron con la culminación de esta investigación. 8 RESUMEN Los recursos fitogenéticos se conservan para ser utilizados y ello solo es posible si se conocen sus características y posibles usos. La información que permitió conocer el germoplasma de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) se obtuvo a partir de la caracterización y evaluación de 37 accesiones colectadas en provincias del norte, centro y sur del Ecuador, para lo que se utilizó 48 descriptores morfoagronómicos (21 cuantitativo y 27 cualitativos). Con el paquete estadístico SAS (Sistema de Análisis Estadístico) se determinó la similitud genética en base a descriptores morfológicos, y con el algoritmo de Gower se calculó una matriz de distancias genéticas, que analizadas con el agrupamiento jerárquico de Ward generó un fenograma que reveló tres grupos principales de accesiones, con una estrecha relación genética. Los descriptores cualitativos que aportaron a la discriminación entre grupos fueron: color de la lámina foliar, color de las nervaduras, color de los brotes apicales, color primario de la epidermis del fruto, color del mucílago adherido a la semilla y color de la semilla; los descriptores cuantitativos de alto poder discriminante están relacionados con el tamaño del fruto; estos descriptores permitieron identificar siete morfotipos dentro de la colección de tomate de árbol. Por otro lado, para la caracterización molecular se empleo la técnica RAPDs (Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar), mediante la cual se evaluó 37 polimorfismos que utilizando el coeficiente de Jaccard se calculó la matriz de similitud para las accesiones; las relaciones genéticas de las 37 accesiones estudiadas fueron evaluadas en un dendrograma, en el que no se observó un agrupamiento definido de las accesiones debido a que el número de polimorfismos evaluados no fue el adecuado para esta especie. El resultado de la correlación entre datos morfoagronómicos y moleculares no fue significativo en el presente estudio, lo que quiere decir que la relación genética entre entradas de la colección es estrecha, siendo necesario el uso de otras técnicas moleculares que permitan detectar esta baja variabilidad; por lo que el estudio de la variabilidad de C. betacea se generó únicamente de los datos obtenidos en la caracterización morfoagronómica. Se identificó posibles 9 materiales promisorios con características deseables de producción y tolerancia a plagas y enfermedades, con los que se podrá iniciar programas de fitomejoramiento. 10 ABSTRACT The plant genetic resources are preserved to be used afterwards. It is possible only if their characteristics and potential applications are known. The information that allowed us to know the germplasm of tree tomato (Cyphomandra betacea Sendt) was obtained from the characterization and evaluation of 37 accessions collected in central, north and south provinces of the country. To carry out this investigation, it was used 48 morphoagronomical descriptors (21 quantitative and 27 qualitative). The genetic similarity was determined using the statistical package SAS (System of Statistical Analysis) based on morphologic descriptors, besides, a genetic distances matrix was calculated using the algorithm of Gower. They were analyzed using the Ward method of clustering and generated a phenogram that revealed three main groups of accessions that have a close genetic relation. The qualitative descriptors that contributed to the discrimination among groups were: foliar sheet colour, veins colour, apical buds colour, primary colour of the epidermis of the fruit, mucilage adhered to the seed colour and seed colour; the quantitative descriptors of high discriminant reference are related to the size of the fruit. These descriptors permitted to identify seven morphotypes inside the collection tree tomato. On the other hand, to carry out the molecular characterization it was used the RAPDs (Random Amplified Polymorphisms of DNA) technique, by means of which was evaluated 37 polymorphisms that using the coefficient of Jaccard, the matrix of similarity for the accessions was calculated. The genetic relations of the 37 accessions involved in the investigation were evaluated in a phenogram, where it was not observed a defined grouping of the accessions due to the number of Polymorphisms evaluated was not the adequate for this species. The result of the correlation between morphoagronomical and molecular data was not significant in the current investigation. It means that the genetic relation among entrances of the collection is close, being necessary the use of molecular techniques that detect this low variability. Therefore, the variability of C. betacea investigation was generated only based on the data obtained since the morphoagronomic characterization. It 11 was identified possible promising germplasm with desirable characteristics of production and resistance to plagues and illnesses, which will be helpful to initiate programs of plant improvement. 12 PORTADA 1 PRESENTACIÓN 3 DEDICATORIA 5 AGRADECIMIENTO 7 RESUMEN 9 ABSTRACT 11 INDICE 13 CAPITULO I INTRODUCCIÓN 19 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 19 1.2 JUSTIFICACION 21 1.3 OBJETIVOS 23 1.3.1 OBJETIVO GENERAL 23 1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 23 1.4 HIPÓTESIS CAPITULO II 2.1 24 MARCO TEORICO TOMATE DE ÁRBOL 25 25 2.1.1 ORIGEN, TAXONOMIA E IMPORTACIA DEL CULTIVO 25 2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTANICA Y FENOLÓGICA 27 2.1.2.1 Tallo 27 2.1.2.2 Hojas 28 2.1.2.3 Flores 28 2.1.2.4 Fruto 28 2.1.2.5 Semillas 29 2.1.2.6 Descripción fenológica 29 2.1.3 AGRONOMÍA 30 2.1.3.1 Condiciones Agro Ecológicas 30 2.1.3.2 Requerimientos edáficos 30 2.1.3.3 Técnicas del cultivo 31 2.1.3.4 Cosecha 33 2.1.3.5 Plagas y Enfermedades 34 2.1.4 USOS Y COMPOSICIÓN NUTRICIONAL 34 13 2.1.4.1 Usos 34 2.1.4.2 Composición Nutricional 34 2.1.5 RECURSOS GENÉTICOS 36 2.2 CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DEL GERMOPLASMA 2.2.1 37 MÉTODOS DE CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y EVALUACIÓN AGRONÓMICA 38 2.2.2 MÉTODOS MOLECULARES 39 2.2.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa 40 2.2.2.2 Polimorfismos del ADN Amplificados al Azar RAPDs 42 2.3 RELACIÓN ENTRE LA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR CAPITULO III 3.1 MATERIALES Y METODOS MATERIALES 46 48 48 3.1.1 DE CAMPO 48 3.1.1.1 Insumos 48 3.1.1.2 Herramientas 48 3.1.1.3 Recursos Humanos 49 3.1.1.4 Material de Oficina 49 3.1.2 DE LABORATORIO 49 3.1.2.1 Materiales de laboratorio 49 3.1.2.2 Reactivos 50 3.2 METODOS 50 3.2.1 UBICACIÓN 51 3.2.2 CARACTERÍSTICAS AGROCLIMÁTICAS 52 3.2.3 DESCRIPCIÓN DE LA INVESTIGACIÓN 52 3.2.3.1 Caracterización Morfológica y Evaluación Agronómica 52 3.2.3.2 Análisis Estadístico para la Evaluación en Campo 54 3.2.3.3 Caracterización Molecular 56 3.2.3.4 Análisis Estadístico para datos Moleculares 59 3.2.3.5 Relación de datos Morfológicos y Moleculares 61 14 CAPÍTULO IV 4.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS 63 63 4.1.1 DATOS PASAPORTE 63 4.1.1.1 Provincia de Colección 63 4.1.1.2 Altitud 63 4.1.2 CARACTERIZACIÓN MORFOAGRONÓMICA 63 4.1.2.1 Variabilidad Morfológica 64 4.1.2.2 Agrupamiento de las Entradas 65 4.1.2.3 Valor discriminante de los Caracteres 65 4.1.2.4 Análisis de los caracteres Cualitativos discriminantes para los Grupos 67 4.1.2.5 Estructura de los Agrupamientos 70 4.1.2.6 Análisis de la ubicación Espacial 72 4.1.2.7 Análisis de los Agrupamientos 72 4.1.2.8 Descriptores Morfológicos y Agronómicos 77 4.1.3 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR 94 4.1.3.1 Extracción de ADN 94 4.1.3.2 Productos de Amplificación 94 4.1.3.3 Análisis de Agrupamiento 95 4.1.4 CORRELACION ENTRE MARCADORES MORFOLOGICOS Y MOLECULARES 95 4.1.5 IDENTIFICACION DE MATERIAL PROMISORIO 96 4.2 CONSIDERACIONES FINALES 97 5. CAPITULO V 5.1 CONCLUSIONES 101 5.2 RECOMENDACIONES 103 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 101 15 Lista de Tablas Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Parámetros usados para la estimación de la variabilidad genética de la colección de tomate de árbol (C. betacea) del DENAREF – INIAP 110 Distribución de las 37 entradas de Cyphomandra betaacea porr grupos, según el análisis de agrupamiento jerárquico de Ward, evaluados en la granja de la UNORCAC, Cotacachi – Ecuador, 111 2004 Parámetros usados para la estimación del valor discriminante en caracteres cualitativos para la colección ecuatoriana del tomate de árbol (Cyphomandra betacea) del DENAREF-INIAP Valores promedio para caracteres cuantitativos de los grupos definidos del análisis del agrupamiento de Ward en la colección de tomate de árbol del DENAREF – INIAP Valor promedio y desviación estándar para caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante para la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea) Frecuencias de los grupos de accesiones de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sent), según el estado de los caracteres cualitativos. Tabla 7 Morfotipos identificados en la colección betacea Sendt) (Cyphomandra Tabla 8 Rendimiento del ADN genómico de tomate de árbol 112 113 114 115 118 110 Primers y fragmentos RAPDs evaluados en la colección de C. Tabla 9 betacea 120 16 Lista de Figuras Figura 1 Croquis del ensayo 111 Figura 2 Flujograma del análisis estadístico para morfoagronómicos la colección de C. betacea Figura 3 Distribución geográfica de las accesiones de la colección de tomate de árbol 123 Figura 4 Agrupamiento jerárquico de WArd de la colección de tomate de árbol, según datos morfoagronómicos 124 Figura 5 Dendrograma de 16 entradas de C. betacea en el agrupamiento 1 125 Figura 6 Dendrograma de 13 entradas de C. betacea en el agrupamiento 2 126 Figura 7 Dendrograma de 8 entradas agrupamiento 3 127 Figura 8 Distribución de las accesiones de C. betacea de Ubicación espacial y las distancias de Mahalanovis entre grupos. 128 Figura 9 Cuantificación de ADN genómico 129 Figura 10 Patrones RAPDs observados para la colección de C. betacea del INIAP. 130 Figura 11 los datos de C. betacea en el Dendrograma de la colección de tomate de árbol basado en polimorfismos RAPDs 112 131 17 Lista de Anexos Anexo 1 Datos pasaporte de la colección de tomate de árbol 131 Anexo 2 Lista descriptores utilizados para la caracterización morfoagronómica para tomate de árbol 134 Anexo 3 Matriz de similitud generada de los datos morfológicos 144 Anexo 4 Matriz de similitud generada a partir de datos moleculares 145 Anexo 5 Base de datos de los descriptores morfológicos y agronómicos 146 Anexo 6 Caracteres cualitativos discrimininantes para los subgrupo del Grupo 1 148 Anexo 7 Caracteres cualitativos discriminantes para los subgrupo del Grupo 149 Anexo 8 Caracteres cualitativos discriminante para los subgrupos del Grupo 150 Anexo 9 Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 1 151 Anexo 10 Anexo 11 Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 2 Caracteres cuantitativos discriminantes para los subgrupos del Grupo 3. 152 153 18 CAPITULO I INTRODUCCIÓN 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En el Ecuador se estima una producción de 4 062 has del cultivo de tomate de árbol, de las cuales 3 920 has se encuentran en la sierra, distribuidas entre las provincias de Azuay, Bolívar, Carchi, Cotopaxi, Imbabura, Loja, Pichincha y Tungurahua (INEC, 2003). Estas áreas de producción se han establecido debido a la gran demanda del frutal a nivel nacional, sin embargo los niveles de producción se han visto afectados por la proliferación de plagas y enfermedades incrementando los costos de producción y disminuyendo la calidad del fruto, reduciendo de dos a tres años la vida útil del cultivo. Albornoz (1992), en observaciones de frutos recolectados en el callejón interandino determinó que en el Ecuador no existen variedades puras, clasificándolas en cinco grupos básicos de acuerdo a sus características, estas son: amarillo, criollo redondo, criollo puntón, negro o púrpura y rojo o mora. En la actualidad el cultivo se caracteriza por la gran heterogeneidad en colores, formas y tamaños de frutos en todos los huertos y dentro de una misma plantación, fenómeno derivado de constantes hibridaciones y mezclas de material genético producidas a lo largo del tiempo, generado la pérdida de variedades puras. La investigación científica en muchos frutales andinos, entre ellos el tomate de árbol, esta iniciando y pese al trabajo constante de instituciones y centros de investigación nacionales, es muy poco el conocimiento que se posee sobre estos frutales, por lo que es necesario diseñar una estrategia de uso y conservación de estos recursos fitogenéticos. En el caso del tomate de árbol, se han logrado avances en cuanto a mejora genética, enfocada mayormente hacia la producción 19 o la calidad del fruto, sin embargo no hay estudios de los caracteres vegetativos, lo mismo que en aspectos relacionados con respuesta a plagas y enfermedades, estrés ambiental abiótico y vida post-cosecha. 20 1.2 JUSTIFICACIÓN El fenómeno de erosión genética, es la constante de un sin número de cultivos que constituyen la base alimentaria en muchas comunidades. Es así que la pérdida de estos recursos fitogenéticos o germoplasma vegetal representa una seria amenaza a la seguridad alimentaria, por lo que es deber de la comunidad científica generar investigaciones que propongan su uso en la agricultura e industria. La caracterización morfológica tiene como finalidad proteger los recursos genéticos que generalmente se pierden por mal manejo en el cultivo ya sea por el reemplazo de variedades originarias de una región por variedades mejoradas, o por destrucción de la vegetación montañosa (Albornoz, 19992). Mediante la caracterización y evaluación del germoplasma de tomate de árbol se pretende establecer analogías y diferencias entre accesiones, e identificar el material promisorio que será de gran utilidad al momento de definir estrategias de manejo del cultivo, como base para la solución de un elevado número de problemas agronómicos, relacionados con producción, adaptabilidad, patología y entomología de este cultivos. Además se generará información científica desde el punto de vista botánico y molecular aportando con conocimientos útiles para fitomejoradores, promotores campesinos y agricultores conservacionistas que permitan el óptimo aprovechamiento de estos recursos. Por otro lado, la identificación de los centros de variabilidad de Cyphomandra betacea Sendt en el Ecuador, permitirá establecer estrategias para la conservación y uso racional del germoplasma de esta especie, reduciendo de esta manera la erosión genética. 21 El Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología (DENAREF) del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), dispone de una colección de 37 entradas de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) colectadas en la Sierra ecuatoriana, la que fue caracterizada morfológica y molecularmente. Los resultados obtenidos en la presente investigación permitirán ampliar los conocimientos de la variación genética que se ha venido dando en los últimos años. 22 1.3 OBJETIVOS 1.3.1 OBJETIVO GENERAL Estudiar la variabilidad genética de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) del banco de germoplasma de DENAREF INIAP, mediante la caracterización morfológica y molecular, y evaluación agronómica preliminar. 1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Caracterizar morfoagronómicamente 37 entradas de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), mediante el empleo de descriptores morfológicos y agronómicos. Determinar los caracteres cuantitativos y cualitativos de alto poder discriminante, que permitan identificar relaciones genéticas entre grupos y entradas de la colección. Caracterizar molecularmente 37 accesiones de la colección de tomate de árbol del INIAP, mediante la técnica RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA). Determinar correlaciones entre caracteres morfológicos y moleculares utilizando técnicas de análisis multivariado. 23 Identificar y seleccionar materiales promisorios en base a criterios de tolerancia a plagas y enfermedades y producción. 1.4 HIPÓTESIS Las entradas de la colección nacional de tomate de árbol de la Estación Experimental Santa Catalina-INIAP presentan variabilidad genética. Los descriptores agromorfológicos empleados permiten identificar diferenciar genéticas entre los materiales en estudio. Entre los materiales de la colección nacional de tomate de árbol existen materiales promisorios relacionados en aspectos de calidad, producción y resistencia a plagas y enfermedades que puedan ser utilizados en planes de fitomejoramiento. 24 CAPITULO II MARCO TEÓRICO 2.1 TOMATE DE ÁRBOL A continuación se detalla la revisión bibliográfica del tomate de árbol, describiendo su origen, taxonomía y los aspectos agronómicos de importancia para el desarrollo de este cultivo. 2.1.1 ORIGEN, TAXONOMÍA E IMPORTANCIA DEL CULTIVO El género Cyphomandra, al cual pertenece el tomate de árbol, abarca entre 25 y 50 especies originarias de América tropical, en latitudes que van desde los 20° N hasta los 30° S, encontrándose dispersas en América del Sur (García et al, 2002 citado por León et al, 2004). Hasta hace pocos años, muchos autores mantenían que el tomate de árbol era nativo de la región andina, principalmente de la vertiente oriental de Ecuador y Perú, sin embargo de acuerdo a evidencias moleculares, estudios morfológicos y datos de campo, el tomate de árbol está estrechamente relacionado con un complejo de materiales silvestres bolivianos, por lo que se cree que las variedades cultivadas se originaron en esa región (Bohs y Nelson, 1999, citado por León et al, 2004). El tomate de árbol es un cultivar autóctono ecuatoriano, puesto que existen variedades propias, seleccionadas y domesticadas por los pobladores aborígenes, colonos y agricultores, a partir de las especies silvestres que aún se conservan entre la vegetación montañosa subtropical y de altura (Albornoz, 1992). 25 El tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt), posee la siguiente estructura taxonómica (Feicán et al, 1999; León et al, 2004). REINO: Plantae (Vegetal) DIVISIÓN: Magnoliphyta (Angiospermas) CLASE: Magnoliopsida (Dicotiledóneas) ORDEN: Solanales FAMILIA: Solanaceae GENERO: Cyphomandra ESPECIE: Cyphomandra betacea Sendt Se le conoce popularmente con el nombre de "tomate de árbol" aunque recibe otros nombres comunes tales como: "tomate cimarrón, tomate extranjero, granadilla y contragallinazo" en Centroamérica; " berenjena y tomate de palo" en México; "tomate de monte, tomate silvestre, pepino de monte, gallinazo panga y tamarillo" en Colombia y Perú; "chilto, sima, tomate de lima" en Bolivia; "tomate chimango, tomateiro da serra" en Brasil; y en Nueva Zelanda país donde ha sido introducido alrededor del año 1970, se la designó como "Tamarillo" (www.sica. gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio%20MAG%20IICA/productos/tomatearbo l_mag.pdf). El cultivo del tomate de árbol es antiguo en el Ecuador principalmente en zonas como Patate y Baños, a pesar de que se cultiva en toda la serranía ecuatoriana. Desde hace 15 años se ha incrementado la demanda interna, extendiéndose comercialmente a otras zonas de producción principalmente en los valles interandinos temperados, en donde se cultivan alrededor de 5 000 has, con rendimientos que oscilan entre 60 – 80 t/ha/año. La variedad más difundida es la tradicional anaranjada, habiéndose introducido últimamente el tomate “mora”, de color morado y pulpa más rojiza, pero de palatabilidad inferior (www.ibiologia. unam.mx/jardin/gela/page2.html). 26 Este cultivo es altamente productivo, ya que ha dado sustento y desarrollo económico a agricultores, que en pequeñas extensiones de terreno (0.5-1 ha) han logrado incrementar sus ingresos y mejorar sus condiciones de vida (www.sica. gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/princip al.htm). El tomate de árbol tiene excelentes cualidades nutritivas y medicinales que han sido poco difundidas. Es considerado dentro de la medicina natural como una de las frutas que fortalecen el cerebro, y contribuye a curar migrañas y cefaleas severas (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2.html). 2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y FENOLÓGICA Las características botánicas de C. betacea y su fenología se detalla a continuación. 2.1.2.1 Tallo El tallo inicialmente es suculento para luego tornarse leñoso a medida que se desarrolla y ramifica (tres ramas principales), lo que ocurre cuando alcanza una altura entre 1 y 2 metros dependiendo del genotipo de la planta, el clima y fertilidad del suelo (http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para %20 invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf), sin embargo esta forma de desarrollo puede variar con podas de formación (Sánchez et al, 1996). 27 2.1.2.2 Hojas La hoja es de inserción alterna y caducifolia, tiene cierto aroma a almizcle y forma más o menos acorazonada, en la base, y ovalada con punta en el ápice. Su rango de tamaño está entre 10 a 30 cm de largo, y de 4 a 12 cm de ancho (http:// www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20ar bol/epftomarbol.pdf). Son de color verde oscuro o brillante, la nervadura central y laterales son prominentes (Feicán et al, 1999). 2.1.2.3 Flores Son fragantes y están distribuidas en pequeños racimos axilares, supra axilares o en cimas escorpioides. Tienen color blanco o rosado con cinco pétalos largos unidos por la base. El cáliz se forma de una base semejante a una campana de cinco dientes agudos (Feicán et al, 1999). Son por lo regular autógamas, es decir de auto polinización, existiendo también la posibilidad de polinización cruzada por factores como el viento y la presencia de insectos. Las flores no polinizadas tienden a caer prematuramente (http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos %20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf). 2.1.2.4 Fruto Son largos y colgantes nacen solos o en racimos en número de tres a 12 frutos. El rango de tamaño oscila entre 5 a 10 cm de largo y de 3.8 a 5 cm de ancho. Tienen forma elipsoidal u ovoide más o menos alargada. El color de la pulpa o carne del fruto varía en un rango que va desde anaranjado claro a oscuro, tiene contextura firme, suculenta y muy agradable al paladar, se presenta rodeando las dos bandas de semillas insertas longitudinalmente (http://www.sica.gov.ec/ agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.p 28 df). La cáscara o piel del fruto es dura y desagradable al gusto, de colores anaranjado y morado (Sánchez et al, 1996). 2.1.2.5 Semillas Las semillas de naturaleza comestible son delgadas, casi planas y circulares, más largas y duras que las del tomate riñón y se encuentran rodeadas de la pulpa (Feicán et al, 1999). 2.1.2.6 Descripción Fenológica No se encuentran reportadas investigaciones que permitan conocer las fases de crecimiento de esta planta, por esta razón se dispone de descripciones fenológicas muy ambiguas y son el resultado de observaciones de campo e información proporcionada por campesinos (Albornoz, 1992). La propagación más frecuente es por semilla, sin embargo también puede hacerse por esquejes. La planta tiene un tiempo de vida aproximado de tres a cuatro años y la floración inicia de ocho a diez meses después de la siembra (Feicán et al, 1999). El período de floración comienza simultáneamente con la ramificación del tallo principal donde aparece la primera inflorescencia y las siguientes en el extremo de las ramas, la floración es continua y el número de inflorescencias está en relación directa con la ramificación de la planta (Albornoz, 1992). 29 La planta es perennifolia y la emisión de hojas es continua, sin embargo estas caen sucesivamente quedando el tallo principal y la parte inferior de las ramas desprovistas de follaje (Feicán et al, 1999). 2.1.3 AGRONOMÍA Las condiciones agro ecológicas y edáficas óptimas para el desarrollo del cultivo, de tomate de árbol se detallan a continuación (www.ibiologia.unam.mx/jardin/ gelapage2.html). 2.1.3.1 Condiciones Agro Ecológicas Clima: Templado seco y sub-cálido húmedo Temperatura: 13° C – 24° C Humedad: 70% - 80% Pluviosidad: 600 –1500 mm Altitud: 1800 – 2800 m.s.n.m. Formación ecológica: Bosque húmedo montano bajo (bh-MB) Bosque seco montano bajo (bs-MB) 2.1.3.2 Requerimientos Edáficos Textura: Francos, franco arenosos, sueltos, con buen drenaje y aireación Acidez: pH 6.5 – 7.0 Tipo de suelo: Ricos en materia orgánica 30 2.1.3.3 Técnicas del Cultivo Los aspectos técnicos que deben tomarse en consideración para el cultivo del tomate de árbol son: A) Almácigo Las semillas extraídas de frutos maduros se dejan secar de 10 a 15 días al ambiente y luego se colocan en un almácigo, con un sustrato compuesto por una parte de tierra cultivable, una de arena y una parte de materia orgánica (Feicán et al, 1999) B) Repique y Transplante La germinación tarda alrededor de 30 días y cuando las plantas tienen de 15 a 20 cm de alto (3 ó 4 hojas) se realiza el repique, es decir el transplante de plántulas del almácigo a fundas. Después de 60 días se transplanta al terreno definitivo (Feicán et al, 1999). C) Preparación del Terreno Se realiza una arada y cruzada para hacer un volteado del suelo, debe hacerse con pasadas de 30 a 40 cm de profundidad, e incorporar materia orgánica para incrementar la microflora y micro fauna del suelo (Albornoz, 1992). 31 D) Trazado y Plantación Según Feicán et al (1999), las distancias de siembra más usadas son: 2,50 m x 1,50 m (2600 plantas por ha), 2 m x 2 m (2500 plantas por ha) ó 1,8 m x 1,8 m (3600 plantas por ha). Los hoyos deben tener un tamaño de 0,40 x 0,40 x 0,40 m de ancho, largo y profundidad respectivamente. Si la siembra se realiza por surcos, la planta debe ser colocada en la parte alta para evitar el encharcamiento de ésta cuando se efectúen los riegos o se presenten precipitaciones fuertes que provoquen inundación en el terreno (www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Convenio% 20MAG%20IICA/productos/tomate_arbol_mag.pdf). E) Fertilización Según Feicán et al (1999), la fertilización se realiza de acuerdo al nivel de nutrientes disponibles en el suelo y debe ser permanente durante el ciclo de cultivo, se recomienda los valores en kg/ha/año que se detallan en el Cuadro 2.1. Cuadro 2.1 Requerimientos nutricionales del tomate de árbol de acuerdo al contenido de nutrientes del suelo. NIVEL N P2O5 K2O MgO BAJO 710 – 780 280 – 330 1180 – 1280 130 – 150 MEDIO 630 – 710 230 – 280 1110 – 1180 110 – 130 ALTO 590 – 630 170 – 230 1170 – 1110 90 – 110 Fuente: INIAP – BULLCAY, 1998 32 F) Riegos El cultivo de tomate de árbol requiere una precipitación anual entre 600 y 1 500 mm distribuidos durante todo el año. En épocas secas es necesario regar la plantación para mantener un nivel adecuado de humedad en el suelo y de contenido de agua en las plantas, que permitirá tener un desarrollo vegetativo normal, buena producción y cosechas de calidad (Feicán et al, 1999). G) Podas Para las podas de formación se recomienda conservar de tres a cuatro ramas principales, en el transcurso del crecimiento se deben eliminar brotes o chupones que aparecen sobre el tallo principal (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2 .html). Se realizan también podas fitosanitarias para eliminar periódicamente las ramas dañadas, enfermas o afectadas mecánicamente, especialmente por la influencia del viento (Feicán et al, 1999). 2.1.3.4 Cosecha Según la variedad, el tomate de árbol se cosecha cuando está amarillo con visos rojos y textura firme (www.ibiologia.unam.mx/jardin/gela/page2.html). La cosecha es manual y se debe dejar el pedúnculo inserto en el fruto para evitar excesiva deshidratación, el ingreso de hongos en la base y para dar una agradable presentación al exhibirlo. Generalmente, dependiendo de la cantidad de frutos maduros y de la extensión a cosechar, se realizan cosechas cada 10 a 15 días (http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/frutas/tomate %20arbol/epftomarbol.pdf). 33 2.1.3.5 Plagas y Enfermedades Según León et al (2004) las enfermedades más comunes que afectan a este cultivo son: antracnosis de la fruta (Colletotrichum gloesporoides), oidio (Oidium spp.), virus (Virus Y de la papa, virus de la mancha anular del tomate y virus del mosaico de la alfalfa), que atacan ramas, hojas y frutos. Las plagas más importantes son áfidos (Myzus sp.), chinches (Leptoglosus zanatus) y nemátodos de la raíz (Meloidogyne incognita). 2.1.4 USOS Y COMPOSICIÓN NUTRICIONAL Las características nutricionales y los usos que se dan al tomate de árbol se detallan a continuación. 2.1.4.1 Usos Se sirve fresco sin emplear la corteza, y se utiliza para la preparación de jaleas, jugos, helados, dulces, mermeladas y ensaladas. Industrialmente se han fabricado mermeladas, néctares, jugos turbios, y conservas con resultados muy satisfactorios. Se observa un rendimiento de 83 a 86% en pulpa, en comparación a otras frutas como la tuna, el mango y el melón que ofrecen rendimientos de 45%, 64% y 59% respectivamente (http://www.sica.gov.ec/agronegocios /productos%20para%20invertir/frutas/tomate%20arbol/epftomarbol.pdf). 2.1.4.2 Composición Nutricional El tomate de árbol tiene gran contenido de agua, siendo un fruto de moderado valor calórico a expensas de su aporte de hidratos de carbono. Destaca su contenido de provitamina A o beta caroteno. La vitamina A es esencial para la 34 visión, el buen estado de la piel, el cabello, las mucosas, los huesos y para el buen funcionamiento del sistema inmunológico. Contiene además vitamina C que interviene en la formación de colágeno, huesos y dientes, glóbulos rojos y favorece la absorción del hierro de los alimentos y la resistencia a las infecciones; ambas vitaminas (A y C), cumplen una función antioxidante. En menor proporción contiene otras vitaminas del grupo B, como la B6 o piridoxina, necesarias para el buen funcionamiento del sistema nervioso. Su contenido de fibra (soluble, pectina) es alto mejorando el tránsito intestinal (www.frutas.consumer.es/documentos/ tropicales/tamarillo/intro.php). El tomate de árbol tiene buenas cualidades físicas, nutritivas y organolépticas, pese a sus características alimenticias sobresalientes no se da la importancia que merece dentro de la alimentación humana (Feicán et al, 1999). La composición nutricional de 100 g de pulpa de tomate de se detalla en el Cuadro 2.2. Cuadro 2.2 Composición nutricional del tomate de árbol en 100 g de pulpa COMPONENTES Acidez Brix Calorías pH Humedad (%) Carbohidratos (g) Ceniza (g) Fibra (g) Proteína (g) Caroteno (IU) Calcio (mg) Fósforo (mg) Hierro (mg) Niacina (mg) Riboflavina (mg) Tiamina (mg) Vitamina C (mg) Vitamina E (mg) CONTENIDO 1,93 - 1,60 11,60 - 10,50 30 3,17 - 3,80 86,03 - 87,07 7 0,6 1,1 2 1000 9 41 0,9 1,07 0,03 0,1 25 2010 Fuente: Caribbean Fruit, CORPEI 35 2.1.5 RECURSOS GENÉTICOS Las variedades nativas de tomate de árbol en el país debieron haber sido sometidas a selección y domesticación por los primeros pobladores del Ecuador a partir de las especies silvestres, que aún se conservan entre la vegetación montañosa subtropical y de altura desde la provincia del Carchi hasta Loja en la Sierra y en provincias del Oriente como Napo y Pastaza (Albornoz, 1992). Según Albornoz (1992), el cultivo de tomate de árbol en el Ecuador muestra gran heterogeneidad ya sea en formas y tamaños de los frutos, este fenómeno es generado por hibridación y mezcla de material genético que se da por la polinización mixta del cultivo (autógama y entomófila). Las poblaciones muestran variabilidad en el color y espesor de la pulpa del fruto, así como en el color del follaje tierno, y el color de los brotes apicales. Según los agricultores, el color del follaje verde amarillento está relacionado con la producción de frutos morados, y el follaje púrpura con la producción de frutos rojos o anaranjados. La forma de los frutos varía de esféricos a ovoides con ápice puntón o redondo (Albornoz, 1992). Según Albornoz (1992), en el Ecuador existen posiblemente cinco variedades o cultivares: Amarilla, conocida con el nombre de “Oro de Inca”, se caracteriza por tener árboles de tamaño medio, el follaje y los brotes apicales son de color verde claro, frutos de forma ovoide con ápice puntón y de color amarillo, el mucílago adherido a la semilla es anaranjado claro, y presenta precocidad a la cosecha. Negra o “tomate de altura”, se caracteriza por tener árboles de tamaño medio, el follaje es verde medio y los brotes apicales son de color púrpura claro, frutos de forma ovoide con ápice puntón y de color púrpura, el mucílago adherido a la semilla es púrpura, y es un cultivar tardío. Criollo puntón, se caracteriza por 36 presentar árboles de tamaño medio, el follaje verde oscuro y brotes apicales púrpura oscuro, frutos de forma ovoide con ápice puntón y de color anaranjado oscuro, y el mucílago adherido a la semilla es anaranjado claro. Criollo redondo presenta árboles de tamaño bajo, el follaje verde oscuro y los brotes apicales son de color púrpura oscuro, frutos de forma esféricos con ápice redondo y de color anaranjado oscuro, el mucílago adherido a la semilla es anaranjado claro, y presenta precocidad a la cosecha. Tomate mora, “rojo o mora” posible variedad híbrida de “negra” por una de las ancestrales, quizás con criollo redondo; se caracteriza por tener árboles de tamaño medio, el follaje verde medio y los brotes apicales son de color púrpura claro, frutos de forma ovoide con ápice redondo y de color púrpura, y el mucílago adherido a la semilla es púrpura. León et al ( 2004) menciona otros genotipos o cultivares que son los siguientes: Anaranjado gigante Mora gigante Morado Neocelandés 2.2 CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DEL GERMOPLASMA El proceso de caracterización de germoplasma es un factor estratégico en el proceso investigativo debido a que es un componente de peso decisivo en la solución de los problemas actuales y futuros, relacionados con el desarrollo de nuevas alternativas dirigidas a la obtención de variedades vegetales mediante la utilización de métodos tradicionales o biotecnológicos (IPGRI, 1995; Karp et al, 1997). Para la caracterización y evaluación del germoplasma se pueden usar los siguientes métodos: 37 2.2.1 MÉTODOS DE CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y EVALUACIÓN AGRONÓMICA Este método se desarrolla en el campo e incluye dos fases de toma de datos: caracterización y evaluación, que sirven para diferenciar accesiones de una colección dada, determinar materiales promisorios y su utilidad, así como para identificar su estructura y variabilidad genética (Jaramillo y Baena, 2000). La caracterización de germoplasma se realiza en una población representativa de la accesión mediante el empleo de descriptores que son caracteres o atributos referentes a la forma, estructura o comportamiento de un individuo dentro de un banco de germoplasma (Taba, 1991). La evaluación, por su parte, consiste en describir las características agronómicas de las accesiones que generalmente corresponden a variables cuantitativas influenciadas por el ambiente y de baja heredabilidad. El objetivo último del proceso de evaluación es ampliar la información necesaria para determinar el potencial de uso de la especie evaluada; dicho proceso se realiza mediante descriptores (Jaramillo y Baena, 2000). Los caracteres morfológicos han sido muy usados para la identificación de especies, familias y géneros de plantas. Así mismo, las características morfológicas y etnobotánicas han sido el tema de numerosos estudios en genética de poblaciones y agricultura, donde la resistencia a plagas, enfermedades y rendimiento han sido factores determinantes para el fitomejoramiento (Falconer, 1981; citado por Tapia, 1998). 38 El método de caracterización involucra el uso de caracteres que son usualmente dominantes o recesivos, siendo los más útiles para la descripción morfológica aquellos menos influenciados por el ambiente, como son la flor y el fruto; le siguen en importancia las hojas, ramas, raíces y tejidos celulares (Enríquez, 1991; Lefebvre y Chevre, 1995). Los métodos morfológicos son útiles para estimar niveles de variabilidad de los caracteres dentro y entre plantas de un cultivar de tal manera que se puedan definir caracteres discriminantes de la especie en estudio, los mismos que pueden ser utilizados para posteriores procesos de caracterización y evaluación (Wolf, 1998). 2.2.2 MÉTODOS MOLECULARES Las técnicas moleculares, han permitido conocer y caracterizar el contenido genético de los organismos, así como estudiar su diversidad, las relaciones genéticas y el grado de similitud entre individuos de poblaciones naturales o mejoradas. Han encontrado utilidad en estudios de mapeo genético, filogenia, sistemática molecular, estrategias de mejoramiento asistido por marcadores moleculares e identificación varietal (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Un marcador molecular es cualquier característica química o molecular medible que es heredada según el Modelo Mendeliano Simple (Walton, 1993 citado por Tapia, 1998), incluyendo tanto a los que analizan directamente los ácidos nucleicos (ADN y RNA) como también a los que analizan los productos del ADN como son las proteínas (principalmente las isoenzimas). Ferreira y Grattapagllia (1998) definen como marcador molecular a cualquier fenotipo molecular oriundo de la expresión de un gen o de un segmento específico de ADN correspondiente a regiones codificantes o no codificantes del genoma y cuya secuencia puede o 39 no ser conocida, que presenta diferencias entre individuos y un patrón de heredabilidad medible. Los marcadores moleculares exploraran la variación de las secuencias del ADN de los individuos en estudio y, por lo mismo, han generado una herramienta eficiente para distinguir entre genotipos estrechamente relacionados (Weising et al, 1994) Los marcadores bioquímicos o moleculares como isoenzimas o fragmentos de ADN, pueden ser utilizados para caracterizar el genotipo de un individuo a partir de muestras de células o de tejidos por lo que pueden ser utilizados en cualquier fase del desarrollo de la planta, siempre que sea posible obtener suficiente ADN (Ferreira y Grattapaglia, 1998). 2.2.2.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La "Reacción en Cadena de la Polimerasa" (Abrev. PCR; del inglés, "Polymerase Chain Reaction") es una técnica poderosa, que comprende la síntesis in vitro de millones de copias de un segmento específico de ADN en presencia de ADN polimerasa. Un ciclo de PCR consta de tres etapas: denaturación, anillamiento o pareamiento y elongación o polimerización (Ferreira y Grattapaglia, 1998): A) Denaturación El ADN de doble cadena es desnaturalizado mediante el aumento de la temperatura que puede variar de 92 a 950C. En esta fase los enlaces de hidrógeno que unen la cadena se rompen por aumento de la temperatura y 40 permanecen así hasta que la temperatura baje y pueda favorecer el anillamiento de los primers. B) Anillamiento o Pareamiento La temperatura es rápidamente reducida entre 37 y 600C, dependiendo especialmente del tamaño y la secuencia del primer utilizado. Esta disminución de temperatura permite la hibridación de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región “blanco”. C) Elongación o Polimerización La temperatura es elevada a 720 C para que la enzima ADN polimerasa realice la extensión de la cadena a partir de cada terminal 3’ de los primers, mediante la incorporación de nucleótidos a la secuencia de ADN molde, de manera que se produce una cadena complementaria en el proceso. La cantidad de ADN de la secuencia-blanco se duplica en cada ciclo y la amplificación sigue una progresión geométrica de manera que después de 30 ciclos, se produce más de un millón de veces la cantidad inicial de la secuencia de interés. Esta escala de amplificación permite, por lo tanto iniciar con cantidades mínimas de ADN (nanogramos) y terminar la reacción con cantidades grandes de ADN de una secuencia específica (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Los fragmentos amplificados pueden ser visualizados realizando una electroforesis en gel de agarosa y tiñendo los fragmentos con bromuro de etidio que es un colorante que se intercala en la cadena de ADN y produce una 41 fluorescencia anaranjada cuando es expuesto a la luz ultravioleta (Ferreira y Grattapaglia, 1998). 2.2.2.2 Polimorfismos del ADN Amplificado al Azar (RAPDs) La técnica RAPDs (Abrev. RAPD; del inglés Random Amplified Polymorphic DNA) es una modificación de la PCR con un primer de secuencia arbitraria. Desde su descripción, el uso de marcadores RAPDs en el análisis genético y en el mejoramiento de plantas ha tenido una difusión extremadamente rápida. Las aplicaciones incluyen la obtención de “fingerprints” genómicos de individuos, variedades y poblaciones, así como el análisis de la estructura y diversidad genética en poblaciones naturales, de mejoramiento y bancos de germoplasma. La utilización de marcadores RAPDs también es utilizada para la construcción de mapas genéticos de alta cobertura genómica y localización de genes de interés económico (Rafalski et al, 1991; Caetano-Anollés et al, 1991; Williams et al, 1993; Tingey y Delfuto, 1993; citado por Ferreira y Grattapaglia, 1998). Pillips et al (1998) informa que la eficiencia de la técnica RAPDs depende de cuatro factores: número de ciclos de amplificación, al respecto se debe tener en cuenta que en los primeros ciclos el producto se incrementa más rápidamente que en los ciclos finales; cantidad de ADN inicial, las muestras con concentraciones relativamente altas de ADN producen rendimientos más bajos de amplificación que las reacciones en que se usan bajas concentraciones; longitud del ADN, la eficiencia es inversamente proporcional a la longitud del ADN; y temperatura factor que regula el proceso de amplificación. 42 A) Base Genética La técnica de RAPDs tiene dos características distintivas de la PCR: utiliza un primer único en vez de un par de primers que tienen secuencia arbitraria formada por 10 nucleótidos, por tanto su secuencia es desconocida (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Para que ocurra la amplificación de un fragmento RAPD en el genoma analizado las secuencias de ADN complementarias al primer arbitrario deben estar suficientemente adyacentes (<4000 pares de bases) y en orientación opuesta, de manera que sea posible la amplificación exponencial de este segmento. En función de la gran cantidad de ADN producido, el fragmento amplificado puede ser visualizado entre dos y 10 bandas en gel de agarosa mediante electroforesis (Ferreira y Grattapaglia, 1998). B) Base Molecular de los Loci RAPD La base molecular del polimorfismo RAPD no es enteramente conocida. No obstante, las evidencias experimentales indican que diferencias de solo un par de bases (mutaciones de punto) son suficientes para causar la no complementariedad del primer con el sitio de iniciación e impedir así la amplificación de un segmento (Williams et al, 1990; citado por Ferreira y Grattapaglia, 1998). Entre las causas para la generación de polimorfismos se puede citar: deleciones en el sitio de complementariedad del primer; inserciones que provocan que dos sitios de iniciación se ubiquen a una distancia superior a 4000 pb imposibilitando que la enzima ADN polimerasa pueda actuar; inversiones de cualquiera de los sitios de iniciación o de segmentos localizados entre ellos; o bien, sustituciones de 43 nucleótidos que pueden afectar la complementación del primer con el ADN molde (Williams et al, 1993; Weising et al, 1994) C) Competencia por Sitios de Amplificación RAPDs La competitividad de un sitio de amplificación arbitraria es determinada esencialmente por su complementariedad con el primer utilizado. Sin embargo, en algunos casos los segmentos son amplificados aunque la complementación entre los sitios de iniciación y el primer no sea perfecta (Williams et al, 1990). Parece ser que el pareamiento perfecto en la extremidad 3’ del primer, a partir del cual se inicia la polimerización es más crítico que en el pareamiento 5’, esto se debe a que está permitido un cierto nivel de no complementariedad que varía con la composición de las bases (Williams et al, 1990; citado por Ferreira y Grattapaglia, 1998). Los pareamientos GC son evidentemente más estables que los AT debido al tipo de enlace trivalente (Ferreira y Grattapaglia, 1998). D) Dominancia de los Marcadores RAPDs Una característica fundamental de los marcadores RAPDs es su comportamiento como marcadores genéticos dominantes. En esta técnica se distinguen dos estados: presencia o ausencia de la banda, asumiendo que cada banda corresponde a un locus con dos alelos (Williams et al, 1990). La dominancia en este caso no se refiere al concepto clásico de interacción genética entre alelos de un mismo locus, sino puramente al punto de vista de la interpretación relativa entre genotipo y fenotipo de un individuo (Ferreira y Grattapaglia, 1998). 44 El genotipo homocigótico recesivo (aa), que corresponde al fenotipo nulo, es identificado por la ausencia de banda en el gel, mientras que los genotipos homocigóticos dominante (AA) y heterocigóticos (Aa) don identificados por la presencia de la banda en el gel y considerados como una misma clase fenotípica. Es precisamente en esta instancia en la cual estriba la dominancia de la técnica RAPDs, al detectar solamente un alelo por locus (Ferreira y Grattapaglia, 1998). E) Ventajas de los RAPDs Esta técnica tiene una serie de ventajas prácticas que se resumen en simplicidad, rapidez y bajo costo. No requiere el desarrollo previo de una biblioteca de sondas específicas para el organismo de interés, pudiendo utilizar un conjunto único de primers arbitrarios (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Es una técnica rápida y no radioactiva. El tiempo de amplificación dura alrededor de tres horas y es completamente automatizado. Utiliza una mínima cantidad de ADN (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Por basarse en PCR, la técnica RAPDs es mucho más sensible en la detección de polimorfismo a nivel de ADN distribuido por todo el genoma del organismo (Ferreira y Grattapaglia, 1998). El costo de esta técnica es bajo, tanto de implementación como de operación ya que no requiere de instalaciones de laboratorio sofisticado, con relación a otros marcadores moleculares (Ferreira y Grattapaglia, 1998). 45 F) Limitaciones de los Marcadores RAPDs La principal limitación de los marcadores RAPDs es el bajo contenido de información genética por locus, debido a que los genotipos heterocigóticos no pueden ser discriminados directamente de los homocigóticos. La sensibilidad de la técnica hace que cualquier modificación en el proceso de amplificación se detecte nuevos loci y que otros anteriormente visualizados pasen desapercibidos (Ferreira y Grattapaglia, 1998). Los RAPDs pueden presentar el inconveniente de una baja consistencia (repetitividad), sin embargo empleando una metodología controlada y constante (termociclador, tipo y concentración de reactivos, etc.), pueden conseguirse resultados satisfactorios (www.webcd.usal.es/web/transgen00/Unidadesdocumen 01/ caballero/cap7htm). 2.3 RELACIÓN ENTRE LA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR Es importante establecer el grado de concordancia entre los rasgos morfoagronómicos y los marcadores moleculares, ya que los estudios que combinan estas dos técnicas maximizan la información y la utilidad de las colecciones de germoplasma. Los caracteres morfoagronómicos son influenciados por el ambiente y algunos de ellos son poco convenientes para el estudio de la biodiversidad; por otro lado los marcadores moleculares, no consideran las interacciones del genotipo con el medio ambiente, sin embargo la combinación de estos dos métodos de caracterización pueden proveer un amplio y real conocimiento de la diversidad de las especies (Hillis, 1987). No siempre existe una adecuada correlación entre los marcadores morfológicos y 46 moleculares por lo que se han desarrollado dos métodos de consenso: técnicas de consenso que enfatizan la estabilidad e información en común; y la combinación de técnicas, que enfatiza el poder descriptivo y parsimonia global (Miyamoto, 1985). La manera de comparar matrices de datos es calculando para los caracteres moleculares, los coeficientes de similitud en base a Jaccard o Nei principalmente, mientras que los datos morfológicos se realiza una transformación (z) en cada característica y luego se ejecuta una transformación de rangos o análisis de componentes principales. Este tipo de comparación da como resultado la identificación de correlaciones entre los caracteres morfológicos y moleculares (Mantel, 1967) 47 CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES Los materiales utilizados en la presente investigación tanto de campo y laboratorio como de oficina se detallan a continuación. 3.1.1 DE CAMPO Los materiales de campo que se utilizaron en la presente investigación son los siguientes: 3.1.1.1 Insumos Semilla de las 37 accesiones (Colección DENAREF). Fungicidas ( Ridomil, Mancozeb, Cursate, Antracol, Fitoraz). Insecticidas (Curacron, Kañón plus, Cipermetrina, Basudín, Malathion 57%). Fertilizantes (Hidrocomplex, 10 – 30 – 10, sulpomag, 0 – 0 - 60). Foliares Humus 3.1.1.2 Herramientas Azadones Palas Barras 48 Balanza Bomba de fumigar 3.1.1.3 Recurso Humano Técnicos INIAP Tesistas 3.1.1.4 Material de Oficina Libro de campo Computadora Hojas Cámara fotográfica Otros 3.1.2 DE LABORATORIO Los materiales de laboratorio utilizados en la presente investigación se detallan a continuación: 3.1.2.1 Materiales de laboratorio Morteros y pistilos Tubos eppendorf de 2 y 0.6 ml Puntas amarillas Puntas azules Erlenmeyer de vidrio de 250 y 1000 ml Micro pipetas 49 Micro centrifuga Micro estufa Baño María Termocicladores MJPTC100 Cámara de electroforesis 3.1.2.2 Reactivos Buffer de extracción de ADN ( CTAB, Tris, EDTA y NaCl) Cloroformo/ Alcohol isoamílico Etanol, Isopropanol Tris – EDTA (TE) Tris – Ácido Acético – EDTA (TAE) Agarosa Bromuro de etidio Buffer 5X (MgCl2, KCl, BSA) Agua grado de biología molecular Primer RAPDs Operon dNTPs Taq polimerasa 3.2 MÉTODOS La metodología empleada en la presente investigación se detalla en los siguientes párrafos. 50 3.2.1 UBICACIÓN La presente investigación se desarrolló en dos etapas, la primera etapa denominada Caracterización morfológica y evaluación agronómica y la segunda etapa Caracterización molecular. ETAPA 1. Caracterización morfológica y evaluación agronómica La etapa 1 de la presente investigación se realizó en: Provincia: Imbabura Cantón: Cotacachi Parroquia: San Francisco Comunidad: Eloy Alfaro Sitio: Granja de la Unión de Organizaciones Campesinas e Indígenas de Cotacachi (UNORCAC) ETAPA 2. Caracterización molecular La etapa 2 se realizó en: Provincia: Pichincha Cantón: Mejía Parroquia: Cutuglahua Sitio: Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP). Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos y Biotecnología (DENAREF). Estación Experimental Santa Catalina (EESC), Quito. 51 3.2.2 CARACTERÍSTICAS AGROCLIMÁTICAS ETAPA 1 Altitud: 1 500 m.s.n.m. X coord: 693067.2 UTM Y coord: 9533871.0 UTM Temperatura media anual: 20.5° C Precipitación media anual: 642,2 mm Déficit hídrico: 388 mm Meses secos: 8 meses Uso anterior: Barbecho Tipo de suelo: Franco Arenosos Fuente: UNORCAC, 2003 3.2.3 DESCRIPCIÓN DE LA INVESTIGACIÓN El procedimiento general para el desarrollo de las dos etapas de la presente investigación se detalla a continuación. 3.2.3.1 Caracterización Morfológica y Evaluación Agronómica El ensayo estuvo constituido por 37 entradas de la colección nacional de tomate de árbol del Banco de Germoplasma del DENAREF – INIAP, el detalle de los datos pasaporte de las accesiones caracterizadas se encuentran en el Anexo 1. Se inició con la geminación de las semillas en los bancos de propagación, a los 15 días se realizó el repique de las plantas con sus respectivos códigos a fundas, en un sustrato que estuvo compuesto de una parte de cascarilla de arroz, una 52 parte de pomina y una parte de tierra. Estas plántulas permanecieron en los invernaderos durante tres semanas y luego fueron trasladadas a la granja de la UNORCAC – Cotacachi, para la aclimatación de las mismas. El transplante se realizó a los dos meses del repique. La preparación del terreno fue mecanizada, dando un pase de arado y uno de rastra, los hoyos realizados tuvieron una dimensión de 0,40 x 0,40 x 0,40 cm, se trazó a una distancia de 1,50 m entre plantas y 2 m entre hileras, se transplantaron 12 plantas por hilera. Para la fertilización de fondo se utilizaron 100 g de hidrocomplex y 4,5 kg de humus por hoyo. Cada tres meses las plantas fueron fertilizadas utilizando sulpomag, úrea, muriato de potasio, 10-30-10 y humus de lombriz. Se sembraron 12 plantas por hilera a una distancia de 1,5 m entre plantas y 2 m entre hileras, dando un área de 3 m2 por planta. Cada hilera tuvo 18 m de largo y 2 m de ancho, resultando un área total de 36 m2 por entrada. Para eliminar los efectos de borde, se evaluaron solamente diez plantas, dando un área neta de 30 m2 por entrada. El área total del ensayo fue 1 332 m2, y un área neta de 1 110 m2, el croquis de la distribución en campo se encuentra en la Figura 1. Constantemente se realizaron deshierbas y podas de formación y sanitarias. Los controles fitosanitarios se dieron de acuerdo a la incidencia de plagas y enfermedades, se realizaron aplicaciones principalmente para pulgón (Aphis sp.), chinche (Leptoglossus zonatus), lancha (Phytophthora infestans) y antracnosis (Colletotrichum sp.). Para el registro de caracteres morfológicos y evaluación agronómica se utilizó preliminarmente la lista de descriptores establecida por Albornoz (1992), a la que 53 se le hicieron modificaciones en ciertos estados de los caracteres, ya que en el presente estudio se observó algunos caracteres y estados diferentes. Se evaluaron 48 descriptores morfológicos y agronómicos (21 cuantitativos y 27 cualitativos). El detalle de los descriptores utilizados en esta investigación se encuentra en el Anexo 2. 3.2.3.2 Análisis Estadístico para la Evaluación en Campo En el flujograma de la Figura 2, se observan los análisis estadísticos realizados para la caracterización morfológica. En los siguientes acápites se detalla cada uno de los análisis . A) Matriz de similitud y distancia La similitud general entre dos entradas es función de sus similitudes individuales en cada uno de los caracteres para los cuales son comparados. Utilizando el paquete estadístico SAS versión 6.12 (SAS Institute Inc., 1990) y la distancia de Gower (1967), se estimó la similitud taxonómica entre cada par de entradas para caracteres continuos, mientras que para los cualitativos se utilizó el coeficiente de asociación que se detalla a continuación: Sij = Σ Sij / n Donde: n = número de caracteres cualitativos Sij = coeficiente de asociación entre las entradas i y j Luego se transformó en una matriz de distancia (D1), mediante el complejo Sij: D1(i,j)= ( 1 - Sij) 54 Además se calculó una Matriz de Distancia Euclideana: D2(i,j)= Σ (X ki – X kj) 2 / n Donde: X ki = registro estandarizado del carácter k en la entrada i X kj = registro estandarizado del carácter k en la entrada j Dando la matriz final: D = ( n1D1 + n2D2) / (n1+n2) La estructura taxonómica de las entradas fue analizada por medio del agrupamiento jerárquico de Ward (1963) que hace posible encontrar en cada estado aquellos dos grupos cuya unión produzca el mínimo incremento en la suma total de cuadrados del error, dentro de grupos. La elección del número de grupos de entradas se hizo con los criterios de Pseudo F y Pseudo t2 utilizando el procedimiento CLUSTER del paquete estadístico SAS. B) Determinación del valor discriminante entre grupos Mediante este análisis se reconocieron dentro del grupo de caracteres utilizados aquellos que tuvieron el mayor valor discriminante y que por lo tanto permitieron una eficiente identificación de la relación entre los clones o entradas de la población en estudio para un determinado carácter y para el grupo de caracteres. 55 Caracteres Cuantitativos El valor discriminante o índice “D” de un descriptor cuantitativo es el número de diferencias significativas detectadas por la prueba Duncan, expresadas como una fracción del número total de posibles comparaciones dentro de un grupo de clones. Con el análisis de esta comparación se identificó los descriptores de mayor valor discriminantes (Engels, 1983), que permitió la formación de grupos dentro de la colección. Caracteres Cualitativos El valor índice “D” para caracteres cualitativos se basa en el número de pares de taxa que un cierto descriptor puede separar y en la cantidad de información que este descriptor comparte con otros descriptores del mismo estudio (Engels, 1983). La comparación de valores “D” entre el grupo de descriptores permitió seleccionar aquellos con mayor valor discriminante. En general, la magnitud de “D” expresa la mayor o menor relación entre clones de un grupo con relación a un determinado carácter; entre mayor sea la relación de los clones de un grupo, menor será el valor “D” (Engels, 1983). El valor discriminante para separar grupos se estimó sobre la base del análisis de frecuencias y las estadísticas de Cramer (Kendall & Stuart, 1979), coeficiente de asociación (Fienberg, 1977) y Chi cuadrado X2 (Cochran, 1954). 3.2.3.3 Caracterización Molecular Los procedimientos que se llevaron a cabo para la caracterización molecular se detallan en los párrafos siguientes. 56 A) Extracción de ADN genómico Para la extracción de ADN de C. betacea, se colectaron de dos a tres hojas de plantas jóvenes (15 a 30 días) de cada accesión, que fueron envueltas con papel aluminio y colocadas sobre hielo hasta su extracción. Se siguió el protocolo establecido por Colombo (1998) modificado por Piedra∗ (2004, comunicación personal). Para el proceso de extracción de ADN, las muestras colectadas fueron maceradas en morteros con 300 µl de buffer de extracción, se colocó el macerado en un tubo Eppendorf de 2 ml con 30 µl de antioxidante (β-mercapto etanol), a continuación se aforó la muestra a 2 ml y se homogenizó mediante agitación, se incubó a 65º C por una hora y media, agitando cada 30 minutos. Posteriormente se dejó enfriar y se centrifugaron por diez minutos a 14000 r.p.m. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo, y se añadió 1 ml de Cloroformo/Alcohol Isoamílico (CIA 24:1). Nuevamente la muestra fue homogenizada y se centrifugó por cinco minutos a 14000 r.p.m. El sobrenadante fue transferido a otro tubo y se repitió la limpieza con CIA. Una vez finalizada la limpieza, el ADN fue precipitado con Isopropanol, obteniendo un pellet o pastilla al que se le realizó una nueva limpieza con Etanol/Acetato de Sodio y finalmente con Etanol/Acetato de Amonio. Se colocó la muestra en la microestufa por una hora a 37º C con la finalidad de secar el pellet. Una vez eliminado los residuos de alcohol, se procedió a diluir el pellet de ADN en TE (Tris-HCl EDTA) a 65ºC por 30 min; para eliminar el ARN se colocó ARNasa (10 µg/ml; R-4642, SIGMA) por 30 min a 37ºC. Finalmente las muestras fueron almacenadas a -20ºC hasta su utilización. ∗ Piedra, G. 2004. Protocolo de Extracción de ADN (Comunicación personal). DENAREF - INIAP. Quito, Ecuador. 57 B) Cuantificación del ADN La integridad y concentración de ADN fueron analizadas por electroforesis en geles de agarosa 0,8% en tampón TAE 1X y cuantificado comparativamente utilizando el estándar ADN Low Mass Ladder (10068-013, INVITROGEN),. La electroforesis se realizó a 70 V por 15 minutos. Sobre la base de estas determinaciones, la concentración de ADN de cada una de las accesiones se estandarizó en tampón TE 0,1M tartrazine hasta lograr una concentración final de 1,25 ng /µl. C) Reacción RAPDs En cada tubo de reacción se colocó una alícuota de los siguientes componentes: Componentes 1 Rx ADN (1.25 ng /µl) 1,5 µl 5X buffer 2,2 µl Primer (1,0 µM) 0,4 µl dNTPs (2,5 mM cada uno) 0.8 µl Taq polimerasa (5U/µl) 0,13 µl H2O ultra pura 2,3 µl Volumen final 7,33 µl La reacción fue cubierta con una gota de aceite mineral (para evitar la evaporación de los componentes) y esta fue amplificada en un termociclador MJ – Research, de acuerdo al siguiente programa: 58 1 Denaturación inicial Temperatura ºC 94 2 Denaturación cíclica 94 30 seg. 3 Anillamiento 42 1 min. 4 Elongación 72 2 min. Paso Tiempo 5 min. 40 veces el paso 2 hasta el paso 4 6 Elongación final 72 7 min. 7 Conservación de la muestra 4 5 min. Los productos de amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X con bromuro de etidio. La electroforesis fue realizada a 110 V. Se usó el estándar 1Kb DNA Ladder Marker (10381-010 INVITROGEN) como marcador de referencia. Para la visualización de las bandas se colocó el gel bajo un transiluminador UV y posteriormente las bandas fueron documentadas. Primer evaluados Se probaron 145 primers pertenecientes a los Kits OPA, OPAC, OPAN, OPAM, OPR, OPS, OPW, OPAA, de Operon Technologies en un sondeo preliminar (screening) para el que se escogieron cinco accesiones morfológicamente diferentes. Como resultado del proceso de screening se seleccionaron ocho primers que presentaron polimorfismos reproducibles y confiables, los mismos que se emplearon para amplificar el ADN de las 37 accesiones estudiadas. 3.2.3.4 Análisis Estadístico para Datos Moleculares Las bandas polimórficas fueron evaluadas a través de las variables presencia (1) o ausencia (0) y se registraron por inspección en una matriz de datos binarios en el programa NTEDIT del paquete estadístico NTSYS pc ver.2,0 (Applied Biostatistic 59 Inc, 1998). No se tomaron en cuenta polimorfismos que involucren datos dudosos. Los tamaños de las bandas polimórficas se calcularon mediante la aplicación LENGTH (Templeton & Lawrence, 1988) y se expresaron en pb. La principal ventaja de esta codificación es la de dar el mismo peso a todos los individuos independientemente del número de bandas. El número de locus es el número de bandas diferentes observadas en el germoplasma en estudio. Al comparar dos accesiones, los estados posibles a un mismo locus son: ACCESIÓN Y ACCESIÓN X + - + a b - c d Hay que recalcar que el número de dobles ausencias (carácter <<d>>) corresponde al número de loci homocigotos para el alelo nulo en dos individuos ya que solo informa sobre la ausencia del alelo amplificado lo que no constituye una evidencia de similitud entre dos accesiones. Por lo tanto, la selección del índice de similaridad sobre este tipo de marcadores moleculares tiene que basarse en las características de la técnica usada. A) Matriz de similitud y distancias Utilizando el coeficiente de Jaccard se calculó la similitud genética entre pares de accesiones mediante la opción SIMQUAL del paquete estadístico NTSYS. La base molecular para la presencia de una banda RAPDs no está claramente entendida, pero se considera que la ausencia de una banda compartida no necesariamente implica un ancestro común o similitud genética entre las muestras, clones o accesiones. Por lo tanto el coeficiente de Jaccard fue considerado como el mejor algoritmo para obtener la matriz de similitud y distancia en este estudio, puesto 60 que este coeficiente no considera a la ausencia de banda entre dos muestras como elemento a favor de la similitud entre ellas, y se expresa de la siguiente manera: F= Mxy ______________ (Mt – Mxyo) Donde: F = Coeficiente de Jaccard Mxy = número de fragmentos compartidos entre dos accesiones Mt = número total de bandas en la matriz de datos Mxyo = número de bandas en la matriz Sobre la matriz obtenida se aplicó la técnica de Cluster análisis empleando el método de agrupamiento UPGMA (Media Aritmética No Ponderada; Sneath & Sokal, 1973) mediante la opción de SAHN CLUSTERING del paquete estadístico NTSYS. Mediante la opción TREE DISPLAY fueron visualizados los agrupamientos o relaciones entre entradas de la colección generándose diagramas arborescentes o dendrogramas que mostraron las relaciones genéticas entre accesiones. 3.2.3.5 Relación de Datos Morfológicos y Moleculares Se utilizó la opción MXCOMP del paquete estadístico NTSYS, la cual procede de la siguiente manera: Utiliza las matrices de distancia moleculares “X” obtenidas con el coeficiente de Jaccard y las morfológicas “Y” obtenidas con el coeficiente de Gower; y se las correlaciona entre ellas con el valor estadístico Mantel (1967), que se define como: 61 Z = ∑j ∑k X jk Y jk Donde X jk y Y jk = son elementos de js líneas y ks columnas de Xnxn y Ynxn, respectivamente, y k es < j. 62 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 RESULTADOS Los resultados obtenidos de la caracterización morfoagronómica y molecular, así como la comparación estadística de estas dos fases se detalla a continuación: 4.1.1 4.1.1.1 DATOS PASAPORTE Provincias de Colección Las 37 accesiones evaluadas en el presente estudio, fueron colectadas en ocho provincias de la Sierra ecuatoriana tanto del norte (Carchi, Imbabura y Pichincha), centro (Tungurahua y Chimborazo) y sur del país (Cañar, Azuay y Loja). La distribución geográfica de las colectas se observa en la Figura 3. 4.1.1.2 Altitud Las colectas fueron realizadas en altitudes comprendidas entre los 1 360 y 2 670 m.s.n.m. y seis de las accesiones evaluadas (ECUs-12883, 12884, 12885, 5546, 5579, 6690) fueron colectadas bajo los 2 000 m.s.n.m. (Anexo 1). 4.1.2 CARACTERIZACIÓN MORFOAGRONÓMICA Los resultados obtenidos del análisis estadístico de los descriptores morfológicos y agronómicos evaluados en la colección de tomate de árbol del INIAP, se detallan en los siguientes acápites. 63 4.1.2.1 Variabilidad morfológica Para determinar la variabilidad de los datos morfológicos de la colección de C. betacea se usaron como parámetros estadísticos, la media aritmética y el coeficiente de variación para los 21 descriptores cuantitativos (Tabla 1). Mientras más bajo sea el valor de coeficiente de variación más homogéneo serán los datos y por lo tanto la variación será menor por lo que, con los valores observados, el descriptor días a la madurez fisiológica presentó un valor de 6%, siendo el carácter de menor variabilidad, por otro lado el descriptor número de frutos cosechados por inflorescencia presentó un valor de 27,83% siendo el de mayor variación. Los descriptores que mayor variación presentaron en la evaluación fueron: número de frutos cosechados por inflorescencia (27,83%), tamaño del eje transversal de la semilla (24,37%), número de frutos caídos por inflorescencia (22,51%), y número de flores y botones por inflorescencia (19,43%). Esta alta variación observada es producto, posiblemente, de la influencia del ambiente sobre estos caracteres, por lo que deberían ser evaluados en otros ciclos de cultivo o realizar repeticiones en otras localidades que permitan verificar los valores obtenidos en la presente investigación. Los descriptores que presentaron menor coeficiente de variación fueron días a la madurez fisiológica (6,01%), tamaño del eje transversal mayor del fruto (6,09%), tamaño del eje longitudinal de la semilla (6,58%), y días de duración de floración (6,83%). Como se había mencionado anteriormente, los valores bajos de coeficiente de variación indican que hay homogeneidad en los resultados y por lo tanto un buen manejo del experimento, por lo que se puede considerar estos descriptores para evaluaciones preliminares de germoplasma de tomate de árbol. 64 4.1.2.2 Agrupamiento de las Entradas. El agrupamiento jerárquico de Ward (1963) obtenido a partir de la matriz de distancia generada por el algoritmo de Gower, identificó tres grupos de entradas (Tabla 2), representadas gráficamente en el dendrograma que puede observarse en la Figura 4. Este dendrograma muestra la variabilidad y parentesco genético entre entradas y grupos de accesiones. 4.1.2.3 Valor Discriminante de los Caracteres Los parámetros estadísticos para la selección de descriptores discriminantes cualitativos y cuantitativos se detallan en los párrafos siguientes. A) Caracteres cualitativos Para determinar los descriptores discriminantes de los 27 caracteres cualitativos evaluados, se aplicó la prueba X2, determinando a seis caracteres como altamente significativos al 1%, cuatro como significativos al 5% y siete caracteres como no significativos (Tabla 3). En la Tabla 3 se detallan los resultados de la prueba X2, coeficiente de asociación (P) y Cramer de los caracteres cualitativos analizados. Los descriptores con valores totalmente homogéneos (diez descriptores) no fueron considerados dentro del análisis (Anexo 5). Se determinaron seis caracteres discriminantes por ser los que presentaron un mayor valor de X2 y son altamente significativos: color del mucílago adherido a la semilla (39,37), color de la semilla (37,75), color de la lámina foliar (37,00), 65 color de las nervaduras (37,00), color primario de la epidermis del fruto (33,15), y color de los brotes apicales (31,98); como se puede observar hay caracteres que describen tanto la parte vegetativa como el fruto. Estos caracteres identificados por su mayor valor discriminante, pueden utilizarse para establecer diferencias entre grupos genéticos. Los descriptores de mayor valor según la prueba de Cramer fueron: color de la lámina foliar y color de las nervaduras con un valor de 1,00, y color de los brotes apicales con 0,93, por lo que son los de mayor contribución en la discriminación entre grupos genéticos. B) Caracteres cuantitativos Según Engels (1983), un carácter para el cual los grupos genéticos tengan valores marcadamente distintos, tendrá un valor “D” máximo de 1. El presente estudio tuvo un valor de 1 entre las comparaciones posibles entre grupos y por lo tanto fue posible seleccionar los descriptores cuantitativos de mayor poder discriminante. Los valores de la prueba de Duncan y promedios calculados para los descriptores cuantitativos evaluados se detallan en la Tabla 4. De los 21 caracteres cuantitativos evaluados solo tres resultaron discriminantes: tamaño del eje longitudinal del fruto, tamaño del eje transversal mayor y transversal menor del fruto (Tabla 5). Los valores de desviación estándar de los descriptores cuantitativos discriminantes son bajos (Tabla 5), esto quiere decir que los datos de las accesiones de cada grupo no presentan alta variación. 66 4.1.2.4 Análisis de los Caracteres Cualitativos Discriminantes para los Grupos Los descriptores o caracteres cualitativos están constituidos por varios estados que expresan la variabilidad de la colección. La relación de los agrupamientos con los estados de los caracteres de mayor poder discriminante permite comprender con facilidad la naturaleza del agrupamiento (Tabla 6). A) Color de la lamina foliar 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Verde claro Verde medio Verde oscuro G1 G2 G3 El Grupo 1 y 2 presentaron el 100% de las entradas laminas foliares de color verde oscuro, mientras que el grupo 3 en su totalidad presentó laminas foliares de color verde normal. 67 B) Color de las nervaduras 100 80 60 Amarillo Marron claro Marron oscuro 40 20 0 G1 G2 G3 Tanto el grupo 1 como el grupo 2 presentaron en el 100% de las entradas nervaduras de color marrón oscuro y el grupo 3 se diferencia por presentar nervaduras de color marrón claro. C) Color de los brotes apicales 100 80 60 Verde claro 40 Purpura claro Purpura oscuro 20 0 G1 G2 G3 El Grupo 1 y 2 presentaron el 100% brotes apicales de color púrpura oscuro, mientras que el Grupo 3 presentó en su totalidad brotes apicales de color púrpura claro. 68 D) Color primario de la epidermis del fruto 100 80 Am arillo 60 Anaranjado claro 40 Anaranjado oscuro Morado 20 Rosado oscuro 0 G1 G2 G3 Respecto al color primario de la epidermis del fruto solo el grupo 1 tiene frutos de color anaranjado claro con el 68,75% y el 31,25% presentaron frutos de color anaranjado oscuro. El grupo 2 presentó el 92,31% de las entradas frutos de color anaranjado oscuro y una entrada (7,69%) fue de color rosado oscuro. El grupo 3 presentó el 50% de las entradas de color morado, el 37,5% fueron de color anaranjado oscuro y una accesión (12,5%) fue de color rosado oscuro. E) Color del mucílago adherido a la semilla 100 Incoloro 80 Anaranjado claro 60 Anaranjado medio 40 Anaranjado oscuro Purpura claro 20 Purpura oscuro 0 G1 G2 G3 El grupo 1 presentó el 93,75% de las entradas con mucílagos adheridos a la semilla de color anaranjado medio y el 6,25% fueron anaranjado oscuro. El grupo 2 tiene 30,77% de entradas mucílago adherido a la semilla de color anaranjado oscuros, y el 61,54% de las entradas fueron de color anaranjado medio y una accesión (7,69%) presentó color púrpura oscuro. El grupo 3 se destaca por 69 presentar mucílagos adheridos a la semilla de color púrpura claro en todas sus accesiones. F) Color de la semilla 100 80 Crem a claro 60 Crem a oscuro 40 Pardo Purpura claro 20 Purpura oscuro 0 G1 G2 G3 El grupo 3 es homogéneo porque el 100% de las entradas presenta semillas de color púrpura claro. El grupo 2 presentó el 92,31% semillas de color crema oscuro, el 7,69% fueron de color púrpura oscuro. El grupo 1 presenta 75% de las entradas semillas de color crema oscuro y 25% fueron pardas. 4.1.2.5 Estructura de los Agrupamientos El Grupo 1 consta de 16 entradas agrupando el mayor número de accesiones, que han sido colectadas en el norte y sur del país, este grupo se encuentra a una distancia genética de 0,047 en relación a los otros dos grupos (G2, G3). Las accesiones de este grupo muestran una estrecha relación y parentesco, dividiéndose en cuatro subgrupos A, B, C, y D (Figura 5) de acuerdo a los estados de los caracteres cualitativos y cuantitativos discriminantes, el subgrupo A tiene una distancia genética de 0,0076; el subgrupo B se encuentra a una distancia de 0,017; el subgrupo C está a una distancia de 0,015; estos tres subgrupos tienen una estrecha relación genética, ya que se encuentran en un mismo cluster a una distancia de 0,039 del subgrupo D. 70 Con base en los Anexos 6 y 9, el subgrupo B se diferencia del resto de subgrupos por presentar frutos de color anaranjado oscuro; y el subgrupo D se diferencia por presenta frutos de mayor tamaño dentro del Grupo 1. El Grupo 2 está conformado por 13 entradas, que fueron colectadas al norte y sur del país, se encuentra separada de los otros dos grupos (G1, G3) a una distancia genética de 0,038 y se divide en dos subgrupos A y B (Figura 6); el subgrupo A se encuentra a una distancia genética de 0,032 y el subgrupo B está separado genéticamente a 0,016, valores de distancia genética similares a las del Grupo 1. Con base a los Anexos 7 y 10, el subgrupo A se diferencia del subgrupo B por presentar el color del mucílago adherido a la semilla de color anaranjado claro, sin embargo los dos subgrupos presentan frutos de tamaño similar. El Grupo 3 consta de ocho entradas colectadas al norte, centro y sur del país; se separa del grupo 1 y 2 a una distancia genética de 0,051. De igual manera este grupo se divide en dos subgrupos A y B (Figura 8), el subgrupo A se encuentra a una distancia genética de 0,018 y el subgrupo B está separado por una distancia de 0,033, mostrando una relación genética similar a la del Grupo 1 y 2. Con base a los Anexos 8 y 11, el subgrupo A se diferencia del subgrupo B por el color morado de la epidermis del fruto y por presentar frutos de menor tamaño. 71 4.1.2.6 Análisis de la Ubicación Espacial En la Figura 8, se encuentra representada gráficamente la ubicación espacial de las entradas, que están en función de las ecuaciones construidas a partir del coeficiente de Gower en el análisis discriminante canónico. La distancia que separa el Grupo 1 del Grupo 2 es de 3,99; el Grupo 2 está separado del Grupo 3 por una distancia de 7,71 y la distancia que existe entre el Grupo 3 y el Grupo 1 es de 13,14; siendo estos dos últimos grupos los que menos características comparten, encontrando mayor relación genética entre los grupos 1 y 2. 4.1.2.7 Análisis de los Agrupamientos El análisis del agrupamiento jerárquico de Ward formó tres grupos de entradas, pudiendo identificarse siete morfotipos grupo de accesiones que comparten caracteres morfológicos y agronómicos similares de acuerdo a los caracteres compartidos en la caracterización morfológica realizada en el presente estudio. A continuación se detalla las características de cada grupo y sus respectivos morfotipos. Grupo 1 Las 16 entradas de este grupo han sido colectadas en Carchi (3), Imbabura (1), Pichincha (1), Tungurahua (1), Chimborazo (1), Cañar (1), Azuay (5), y Loja (3), Los estados de los descriptores cualitativos discriminantes que presentó el Grupo 1 son: mucílago adherido a la semilla anaranjado medio; epidermis del fruto 72 de color anaranjado claro u oscuro; lámina foliar verde oscuro; nervaduras color marrón oscuro; brotes apicales de color morado oscuro y semillas crema oscuro o pardas (Tabla 6). Para los descriptores cuantitativos discriminantes (Tabla 5), el tamaño longitudinal del fruto presentó un promedio de 5,76 cm; el eje transversal mayor dio un valor promedio de 4,59 cm; y para el eje transversal menor fue de 3,30 cm; siendo los frutos de menor tamaño dentro de la colección. Para los descriptores de interés agronómico el grupo presentó valores promedios de 225 días al inicio de floración; 30 flores y dos frutos cosechados por inflorescencia, siendo un valor bajo para producción; para el descriptor días a la madurez fisiológica el grupo presentó un promedio de 416 días, considerándolo como precoz en la presente investigación (Tabla 4). Durante el ciclo de cultivo en el que se realizó la presente caracterización, el grupo presentó de media a alta la incidencia de virus. Dentro de este grupo se han identificado dos morfotipos (M1 y M2),y el detalle de los caracteres evaluados se detalla en la Tabla 7. Morfotipo 1. Este morfotipo consta de 11 accesiones: ECU-3473, ECU-3789, ECU-5546, ECU-5579, ECU-6690, ECU-12781, ECU-12873, ECU-12874, ECU12880, ECU-12890, ECU-12895, provenientes de las provincia de Carchi, Imbabura, Azuay, Tungurahua, Pichincha y Loja. 73 Morfotipo 2. Este morfotipo consta de cinco accesiones (ECU-12883, ECU12884, ECU-12886, ECU-12887, ECU-12889), provenientes de las provincias de Azuay y Loja. La diferencia entre los dos morfotipos está dada por el color anaranjado oscuro de la epidermis del fruto presente en el morfotipo 2. Grupo 2. Las 13 entradas de este grupo han sido colectadas en Carchi (1), Imbabura (5), Tungurahua (5), Azuay (1), y Loja (1). Los estados de los descriptores cualitativos discriminantes evaluados para este grupo son: mucílago adherido a la semilla de color anaranjado medio, anaranjado claro o púrpura oscuro; epidermis del fruto de color anaranjado oscuro o rosado oscuro; lámina foliar verde oscuro; nervaduras marrón oscuro; brotes apicales morado oscuro y semillas de color crema oscuro o púrpura oscuro. Las entradas de este grupo presentaron frutos de forma ovoide (Tabla 6). Para los descriptores cuantitativos discriminantes, el tamaño longitudinal del fruto presentó un promedio de 7,24 cm; el promedio del eje transversal mayor fue de 5,40 cm; y el eje transversal menor presentó un promedio de 4,01 cm (Tabla 5); siendo los frutos de mayor tamaño dentro de la colección, comúnmente se los conoce como tomates gigantes (León et al., 2004). Para los descriptores de interés agronómico, este grupo presentó valores promedio de 236 días al inicio de floración, siendo el grupo con floración tardía; 41 74 flores y tres frutos cosechados por inflorescencia, siendo un valor medio para producción; para el descriptor días a la madurez fisiológica el grupo presentó un promedio de 415 días, pese a que este grupo fue considerado como tardío para la floración, mostró una madurez fisiológica precoz en la presente investigación (Tabla 4). Durante el ciclo de cultivo en el que se realizó la presente caracterización, el grupo presentó de baja a media la incidencia de virus. Dentro de este grupo se han identificado dos morfotipos (M3 y M4), y sus caracteres cualitativos se detallan en la Tabla 7. Morfotipo 3. Este morfotipo consta de 12 accesiones (ECU-12871, ECU-12872, ECU-12876, ECU-12877, ECU-12879, ECU-12882, ECU-12885, ECU-12888, ECU-12891, ECU-12893, ECU-12894A, ECU-12898), provenientes de las provincias de Azuay, Carchi, Imbabura, Tungurahua y Loja. Este morfotipo se caracteriza por presentar la epidermis de color anaranjado oscuro y el mucílago adherido a la semilla de color anaranjado medio. Morfotipo 4. Este morfotipo consta de la accesión ECU-12896A, que es de la provincia de Tungurahua. A este morfotipo se lo conoce comúnmente como blanco hueso, debido a que en estado inmaduro la epidermis del fruto es de color blanco amarillento, y al llegar a la madurez se torna de color rosado oscuro, además presenta mucílago adherido a la semilla de color púrpura oscuro. Grupo 3. Es el grupo está conformado por el menor número de accesiones, que han sido colectada en Carchi (1), Imbabura (1), Tungurahua (4), Azuay (1), y Cañar (1). 75 Los estados de los descriptores cualitativos discriminantes que presentó este grupo fueron: mucílago adherido a la semilla púrpura claro; epidermis del fruto de color anaranjado oscuro o morado; lámina foliar verde medio; nervaduras marrón claro; brotes apicales y semillas de color púrpura claro (Tabla 6). Para los descriptores cuantitativos discriminantes, el promedio del tamaño longitudinal del fruto fue de 6,50 cm; para el eje transversal mayor fue de 4,89 cm; y el eje transversal menor dio un promedio de 3,70 cm (Tabla 5), siendo los frutos de tamaño medio dentro de la colección. Para los descriptores de interés agronómico, este grupo presentó valores promedio de 227 días al inicio de floración; 34 flores y tres frutos cosechados por inflorescencia, siendo un valor medio para producción; para el descriptor días a la madurez fisiológica el grupo presentó un promedio de 430 días, siendo así el grupo más tardío en la presente investigación (Tabla 4). Durante el ciclo de cultivo en el que se realizó la presente caracterización, el grupo presentó de baja a media la incidencia de virus. Dentro de este grupo se ha identificado tres morfotipos (M5, M6 y M7), y sus caracteres cualitativos se detallan en la Tabla 7 Morfotipo 5. Este morfotipo consta de cuatro accesiones (ECU-3472, ECU12782, ECU-12875, ECU-12897), provenientes de las provincias de Azuay, Cañar, Carchi y Tungurahua. Este morfotipo se caracteriza por presentar frutos de color morado. 76 Morfotipo 6. Está conformado por tres accesiones (ECU-12892, ECU-12894B, ECU-12878), provenientes de las provincias de Imbabura y Tungurahua. Se caracteriza por presentar frutos de color anaranjado oscuro, a este morfotipo se lo conoce comúnmente como mora gigante (León et al., 2004). Morfotipo 7. A este morfotipo pertenece la accesión ECU-12896B, proveniente de la provincia de Tungurahua. Se diferencia de la accesión ECU-12896A que se encuentra en el Grupo 2 porque presentó la pulpa de color anaranjado claro. Igualmente a este morfotipo se le conoce comúnmente como blanco hueso. 4.1.2.8 Descriptores Morfológicos y Agronómicos A continuación se detallan los resultados de los caracteres morfológicos y agronómicos evaluados en la presente investigación, cabe recalcar que este análisis no se realizó en base al agrupamiento definido anteriormente, sino por accesiones para la identificación de materiales promisorios. Los descriptores morfológicos y agronómicos fueron evaluados desde el inicio de la floración hasta la madurez fisiológica en diez plantas para las variables cualitativas y cuantitativas. La lista de descriptores morfológicos y agronómicos se detalla en el Anexo 2. A) Fuste Altura del fuste (cm): El valor mínimo observado en la colección fue de 80 cm para el ECU-3789, y el valor máximo de 123,33 cm para el ECU-12891. El valor promedio para esta variable fue de 105,96 cm, mientras que el coeficiente de variación observado fue de 10,46% (Tabla 1). 77 Albornoz (1992), reporta como valor mínimo 88,21 cm, y como valor máximo 132 cm, siendo valores similares a los reportados en la presente investigación. B) Copa Densidad de la copa: La colección presentó 19 entradas (51,4%) con copa semidensa, 15 (40,5%) con copa densa y tres (8,11%) presentaron copas ralas (Anexo 5). Este descriptor está influenciado por el manejo agronómico principalmente por las podas fitosanitarias en las que se eliminan hojas viejas y enfermas, reduciendo en ciertos casos la densidad de la copa. Hábito de la copa: De las 37 entradas evaluadas, 30 (81,1%) presentaron copas de hábito convergente, esto quiere decir que las ramas tienden a ir hacia arriba; seis entradas (16,22%) presentaron copas de hábito normal es decir en forma de parasol, mientras que el ECU-12875 tuvo hábito de copa en forma caediza. (Anexo 5). Según Bohs (1994) el hábito de copa convergente, es una característica del género Cyphomandra. C) Follaje Forma del pecíolo: El 100% de las accesiones presentaron pecíolos de forma cilíndrica (Anexo 5), siendo un descriptor que no presenta variabilidad dentro de la colección caracterizada. El comportamiento homogéneo observado en este caracter concuerda con lo reportado por Albornoz (1992), lo que puede deberse a una estrecha base genética entre las entradas de la colección en estudio. 78 Longitud del pecíolo (cm): La colección presentó para este descriptor un valor mínimo de 4,76 cm para el ECU-3473, y un valor máximo de 10,50 cm (ECU12897), un promedio de 8,61 cm, y un coeficiente de variación 13,44% (Tabla 1). Estos valores son bajos comparados con los resultados observados por Albornoz (1992), ya que en su estudio el valor mínimo fue de 10,4 cm y valor máximo de 12,4 cm. En el presente estudio estos datos se tomaron en el tercio inferior de la copa, presentando tamaños distintos de hojas y pecíolos tanto en el tercio medio como en el superior. Forma de la lámina foliar: El 100% de la colección presentó hojas cordadas (Anexo 5), es decir que no se encontraron plantas con dimorfismo foliar. Según Bohs (1994) este carácter es una clave dicotómica para reconocer a la especie Cyphomandra betacea, por lo que es poco probable observar variación en este carácter dentro de esta especie. Tamaño del eje longitudinal de la lámina foliar (cm): El valor mínimo para este descriptor fue de 13,33 cm (ECU-3473), y el máximo 25,66 cm para el ECU12873, un promedio de 10,56 cm, con un coeficiente de variación de 20,90% (Tabla 1). Albornoz (1992) reporta para este caracter un valor mínimo de 24 cm, que en comparación con los resultados de esta investigación es un valor más alto, sin embargo cabe mencionar que el tamaño de la lámina foliar depende del estado de crecimiento del árbol como de la ubicación de la hoja en la copa. 79 Tamaño del eje transversal de la lámina foliar (cm): El ECU-3473 presentó el valor mínimo (9,53 cm) dentro de la colección, mientras que el valor máximo fue 21,51 cm para el ECU-12891, y un promedio de 17,17 cm, con un coeficiente de variación de 11,34% (Tabla 1). Color de la lámina foliar: El 78,38% de las entradas (29) presentaron hojas de color verde oscuro, mientras el 21,62% (8) fueron verde medio (Anexo 5), se podría decir que el color verde oscuro es un carácter dominante dentro de la colección. Nervaduras de la lámina: El 100% de las entradas de la colección presentó nervaduras prominentes (Anexo 5). El comportamiento homogéneo del caracter observado en la presente investigación concuerda con lo reportado por Albornoz (1992), lo que puede deberse a una estrecha base genética entre las entradas de la colección en estudio. Color de la nervadura: Las hojas color verde oscuro presentaron nervaduras de color marrón oscuro, mientras que las hojas verde medio mostraron nervaduras de color marrón claro (Anexo 5). Al parecer estos caracteres están relacionados. Color de los brotes apicales: En la colección se observó que los árboles que presentan hojas de color verde oscuro tienen los brotes apicales púrpura oscuro, y los árboles con hojas verde medio presentaron brotes púrpura claros (Anexo 5), por lo que se puede afirmar que estos caracteres están relacionados. 80 Después de analizar los resultados obtenidos para los descriptores: Color de la lámina foliar, color de las nervaduras y color de los brotes apicales se puede afirmar que hay una estrecha correlación entre estos. D) Flor Tamaño del cáliz (mm): Esta variable presentó un valor mínimo de 4,66 mm para el ECU-12889, un máximo de 7,10 mm (ECU-3472) un tamaño promedio de 5,56 mm, y con un coeficiente de variación de 8,17% (Tabla 1). El dato de valor mínimo observado concuerda con lo reportado por Albornoz (1992), ya que en su estudio el valor mínimo fue de 4,5 mm. Color del cáliz: La colección presentó en su totalidad flores con cáliz de color verde claro (Anexo 5). Los resultados obtenidos de este caracter en la presente investigación concuerdan con lo reportado por Albornoz (1992), pudiendo ser un carácter de herencia simple que se mantiene dentro de los cultivares. Tamaño de la corola (mm): El valor mínimo encontrado en la colección fue de 8,4 mm para el ECU-12892, el valor máximo de 11,77 mm (ECU-12877), con tamaño de corola promedio de 10,56 mm, con un coeficiente de variación de 7,43% (Tabla 1). No se puede hacer una comparación con lo reportado por Albornoz (1992) ya que en su investigación mide el tamaño de corola con la flor totalmente abierta y en la parte superior, mientras que en el presente estudio se midió en la parte media de la flor. Color primario de la corola: El 81,08% de las entradas (30) de la colección presentó corolas de color rosado, mientras que el 18.9% (7) presentó corolas 81 blancas (Anexo 5), pudiendo ser un carácter dominante dentro de la especie en estudio. Color secundario de la corola: No se encontró variabilidad para este descriptor ya que dentro de la colección todas las flores presentaron corolas con color secundario púrpura oscuro (Anexo 5). Sin embargo es importante mencionar que a pesar de Albornoz (1992) dentro de su estudio reporta corolas de un solo color en su mayoría ligeramente rosada, en el presente estudio se observaron corolas bicolores, por lo que fue necesario agregar el carácter color secundario de la corola a la lista de descriptores. Este cambio en la uniformidad del color de la corola, pudo haberse producido debido a las mezclas varietales que se han venido produciendo. Tipo de inflorescencia: El 100% de la colección presentó inflorescencias tipo cima-bipara escorpoide (Anexo 5), que concuerda con lo reportado por Albornoz (1992), ya que en su investigación también observó el mismo tipo de inflorescencia para todos los cultivares estudiados, lo que puede deberse a una estrecha base genética entre las entradas de la colección en estudio. Número de flores y botones por inflorescencia: El ECU-3473 presentó un valor mínimo de 11 flores y botones por inflorescencia, y un valor máximo de 50 para el ECU-12877; un promedio de 36 flores y botones, y con un coeficiente de variación de 19,43% (Tabla 1). Comparando con los resultados reportados por Albornoz (1992), se pude mencionar que hay valores similares. 82 Cabe mencionar que los ECUs-12891, 12878, 12896A y 12897 presentaron de 45 a 49 flores y botones por inflorescencia siendo un dato relevante para procesos de selección, ya que con un adecuado manejo agronómico se puede llegar a obtener un mayor número de frutos por inflorescencia. Número de frutos cuajados por inflorescencia: La colección presentó un valor mínimo de siete frutos cuajados por inflorescencia para el ECU-3473, el valor máximo fue de 33 para los ECUs-12896A, 12878, 12877, un promedio de 24 frutos cuajados y con coeficiente de variación de 19,50% (Tabla 1). Analizando los valores observados para los dos últimos descriptores, la accesión ECU-3473, presentó el menor número de flores y botones así como un menor número de frutos cuajados por inflorescencia. Por el contrario las accesiones ECU-12877, ECU-12878, y ECU-12896A fueron las que mayor número de flores y botones presentaron, así como un mayor número de frutos cuajados por inflorescencia. Con esto datos se pueden considerar estas entradas como material promisorio para programas de fitomejoramiento enfocado hacia la producción. E) Fruto Forma del fruto: En la colección se observó que 24 entradas (64,86%) presentaron frutos ovoides, 11 (28,73%) fueron frutos de forma elíptica y los ECUs-3789 y 12781 (5,41%) presentaron frutos esféricos (Anexo 5). Esto concuerda con las tres formas de fruto descritas por Albornoz (1992), que son ovoide, esférica y elíptica. 83 Forma del extremo apical del fruto: El 81,08% de las entradas (30) presentaron extremos apicales puntones, y apenas el 18,92% (7) tuvieron extremos redondos (Anexo 5), lo que demuestra que la colección presenta en su mayoría frutos con extremo apical puntón. La forma de fruto preferida en el mercado nacional e internacional son los de forma elíptica y con extremo apical puntón, por lo que en procesos de selección se debería tomar en cuenta estos parámetros. Tamaño del eje longitudinal del fruto (cm): El ECU-3789 presentó frutos con tamaño mínimo de 4,77 cm, un valor máximo de 8,05 cm para el ECU-12896A, un promedio de 6,44 cm, y con un coeficiente de variación de 8,83% (Tabla 1). Los valores reportados por Albornoz (1992), fueron de 5,45 cm para el valor mínimo y el valor máximo fue de 7,73 cm, que son similares a la presente investigación. Tamaño del eje transversal mayor del fruto (cm): El valor mínimo encontrado en la colección fue de 4.01 cm (ECU-12880), el tamaño máximo fue de 5,90 cm para el ECU-12896A, un promedio de 4,94 cm, y con un coeficiente de variación de 6,08% (Tabla 1). Tamaño del eje transversal menor del fruto (cm): El ECU-12880 presentó un valor mínimo de 2,81 cm, el valor máximo fue de 4,29 cm para el ECU-12891, el promedio del eje transversal menor del fruto fue de 3,63 cm, y con un coeficiente de variación de 7,87% (Tabla 1). 84 Dentro de la colección, la accesión ECU-12896A fue la que presentó frutos de mayor tamaño según los resultados obtenidos en los caracteres: tamaño del eje longitudinal del fruto y tamaño del eje transversal mayor del fruto. El mercado internacional demanda frutos de 8 cm para el tamaño longitudinal y 5 cm para el tamaño del eje transversal mayor (www.sica.gov.ec/agronegocios /BibliotecaConvenio%20MAG%20IICA/productos/tomate_arbol_mag.pdf); por lo tanto, los ECUs que cumplen con estas condiciones son: ECU-12898 con 7,96 cm de largo y 5,10 cm de longitud del eje transversal, el ECU-12891 con 7,86 cm de largo y 5,56 cm de longitud del eje transversal y el ECU-12882 con 7,41 cm de largo y 5,28 cm de longitud del eje transversal; por otro lado, el ECU-12896A no entraría dentro de este grupo por otras características que serán discutidas más adelante y que no concuerdan con los parámetros de exportación. Estos ECUs pueden ser considerados dentro de programas de fitomejoramiento, que estén enfocados hacia la producción de frutos para la exportación. Color primario de la epidermis del fruto: Se observaron 19 entradas (51,35%) con frutos color anaranjado oscuro, 11 (29,73%) fueron anaranjado claro, cinco entradas (13,51%) fueron de color morado y los ECUs-12896A y 12896B (5,41%) presentaron color rosado oscuro (Anexo 5), estos dos últimos ECUs en estado inmaduro son de color blanco amarillento, color característico de algunas especies silvestres, y que en estado maduro se torna rosado oscuro, este cultivar puede ser una mezcla varietal entre un material silvestre y uno cultivado. Son las pocas las accesiones que presentan color morado de los frutos, la pérdida de este material puede ser efecto de la poca aceptación de este fruto por los consumidores. 85 Color secundario de la epidermis del fruto: Se observaron 32 entradas (86,49%) que presentaron frutos con el color secundario de la epidermis morado claro y cinco (13,51%) fueron color morado oscuro (Anexo 5). Albornoz (1992) en su estudio reporta frutos de un solo color sin embargo concluye que las mezclas varietales o metaxenia producen cambios fenotípicos, como los que se han venido presentándose en los últimos años, debido a este fenómeno se han presentado cambios en el germoplasma caracterizado, por lo que fue necesario agregar el carácter color secundario de la epidermis del fruto para la evaluación del mismo. Actualmente el resultado del proceso de las mezclas varietales ha generado un cambio en la uniformidad del color del fruto. Este parámetro es considerado como un requisito para comercialización, que puede volverse crítico, especialmente si se trata de exportación de la fruta, en donde se demanda frutos de color homogéneo anaranjado claro y oscuro (www.sica.gov.ec/agronegocios /Biblioteca Convenio%20MAG%20IICA/productos/tomate_arbol_mag.pdf). Veteado de la epidermis del fruto: El 100% de las entradas presentaron frutos ligeramente veteados (Anexo 5), siendo un descriptor que no aporta para la diferenciación varietal. Según Albornoz (1992) este es un carácter ancestral que se encuentra en algunas especies silvestres y en todos los cultivares ecuatorianos. Color de la pulpa: En la colección se encontró 28 entradas (75,68%) que presentaron frutos con pulpas de color anaranjado medio, cinco (13,51%) tuvieron pulpas anaranjado claro, tres (8,11%) fueron de color anaranjado oscuro y solo el ECU-12896A presentó frutos con pulpa color crema (Anexo 5). Estos resultados 86 no concuerdan con lo reportado por Albornoz (1992) ya que en su estudio todos los cultivares presentaron pulpas color anaranjado claro, lo que pudo deberse al estado de madurez del fruto, luminosidad y apreciación visual. Grosor de la pulpa (mm): El valor mínimo encontrado en la colección fue de 3,08 mm para el ECU-12886, el valor máximo fue de 7,91 mm para el ECU-12891, un promedio de 5,32 mm, y con un coeficiente de variación de 16,02% (Tabla 1). Valores que no concuerdan con lo reportados por Albornoz (1992), ya que el valor mínimo fue de 7,70 mm y el máximo fue de 8,30 mm. Para fines agroindustriales, este descriptor resulta interesante ya que mientras más gruesa sea la pulpa del fruto, mayor será los rendimientos en los productos elaborados, cabe mencionar que este también es un descriptor que puede ser tomado en cuenta en programas de mejoramiento. Grosor del mucílago que contiene la semilla: El 70,87% de las entradas (26) presentaron mucílagos de grosor intermedio, el 21,62% (8) tuvo mucílago de grosor abundante y tres entradas (ECU-12877, ECU-12888, ECU-12891) presentaron escaso el grosor del mucílago que contiene la semilla (Anexo 5). Con los datos obtenidos se puede afirmar que las accesiones que tienen un mucílago abundante, presentaron pulpa de tamaño menor a diferencia de las que presentaron mucílago escaso cuya pulpa es de mayor tamaño como es el caso del ECU-12891. Color del mucílago que contiene la semilla: El 100% de la colección presentó incoloro el mucílago que contiene la semilla (Anexo 5). El comportamiento homogéneo de este caracter observado en la presente investigación concuerda 87 con lo reportado por Albornoz (1992), lo que puede deberse a una estrecha base genética entre las entradas de la colección en estudio. Color del mucílago adherido a la semilla: En la colección se observaron 22 entradas (59,46%) con mucílago adherido a la semilla color anaranjado medio, ocho (21,62%) púrpura claro, cuatro (10,81%) anaranjado claro y el ECU-12896A presentó el mucílago adherido a la semilla de color púrpura oscuro (Anexo 5). Los frutos de tomate de árbol de mucílago adherido a la semilla color anaranjado claro u oscuro, tienen mayor aceptación en mercados nacionales e internacionales (www.sica.gov.ec/agronegocios/BibliotecaConvenio%20MAG%20 IICA/productos/tomate_arbol_mag.pdf). Es así que los ECUs-12898, 12891 y 12882, cumplen con este parámetro. Además, cabe resaltar que estas accesiones también se ajustan a los requisitos mencionados anteriormente en cuanto a color primario de la epidermis y tamaño de fruto. El ECU-12896A, a pesar de que presenta el tamaño requerido para su exportación, se observó que el color de la epidermis y del mucílago adherido a la semilla, no son considerados en este tipo de comercialización. Número de frutos por inflorescencia: El valor mínimo observado en la colección fue de un fruto por inflorescencia (ECU-12890, ECU-12874), el valor máximo fue de cinco para el ECU-12894A, un promedio de 3 frutos por inflorescencia de y con un coeficiente de variación de 27,83% (Tabla 1). Se observó que los ECUs- 12885, 12889, 12892, 12894B, 12895, 12897 y 12898, presentaron cuatro frutos por inflorescencia, considerándolos también materiales de alta producción, que pueden ser evaluados en programas de mejoramiento genético. 88 Número de frutos caídos por inflorescencia: El valor mínimo encontrado dentro de la colección fue de cuatro frutos para el ECU-3473, el valor máximo fue de 30 frutos caídos por inflorescencia para el ECU-12877, un promedio de 21 y con un coeficiente de variación de 22,51% (Tabla 1). Se identificó al ECU-12877 como la accesión con mayor número de flores y botones por inflorescencia (50), así como frutos cuajados (33), pese a esto es la accesión que presentó mayor número de frutos caídos, cosechando tres frutos por inflorescencia. Con estos datos se puede indicar que es la entrada con mayor susceptibilidad al efecto de vientos y manejo agronómico. Con un manejo de fertilización adecuado, se pude reducir el nivel de pérdida de frutos caídos, incrementando los niveles de producción dentro de una plantación, además los ECUs que en la presente investigación presentaron menor número de frutos pueden ser considerados en programas de mejoramiento. Número de semillas por fruto: El valor mínimo de semillas por fruto fue de 155 para el ECU-12873, el valor máximo fue de 367 para el ECU-12877, un promedio de 261 semillas por fruto y con un coeficiente de variación de 16,38% (Tabla 1). Valores similares a los reportados por Albornoz (1992), que fueron de 175 semillas para el valor mínimo y de 384 semillas para el máximo. Este caracter tiene relevancia para agricultores que se dedican a la producción de plantas de tomate de árbol. Tamaño del eje longitudinal de la semilla (mm): El tamaño mínimo encontrado en la colección fue de 3,55 mm para el ECU-12893, el valor máximo fue de 5 mm (ECU-12896A), un tamaño promedio del eje longitudinal de la semilla de 4 mm, y con un coeficiente de variación de 6,57% (Tabla 1). 89 Tamaño del eje transversal de la semilla (mm): El ECU-12897 presentó un valor mínimo de 3,05 mm, el valor máximo fue de 4,25 mm para el ECU-12896A, un promedio de 3,62 mm y con un coeficiente de variación de 24,37% (Tabla 1). En el presente estudio se identificó al ECU-12896A como el fruto que presentó mayor tamaño así como el tamaño de semillas, además fue una de las accesiones que con mayor número de semillas, esto puede a que es un cultivar con características ancestrales. Cabe mencionar que las especies silvestres producen mayor número de semillas para su sobrevivencia. Color de la semilla: En la colección se observaron 23 entradas (62,16%) que presentaron semillas color crema oscuro, nueve (24,32%) fueron púrpura claro, cuatro (10,81%) fueron pardas y el ECU-12896A (2,70%) presentó semillas color púrpura oscuro (Anexo 5). Según Albornoz (1992), el color de la semilla cambia con el estado de maduración de los frutos, las semillas son más claras en frutos pintones, más oscuras en los frutos maduros fisiológicamente y muy oscuras en los frutos en proceso de fermentación, por lo que se debe considerar estos aspectos al momento de evaluar este descriptor. F) Descriptores agronómicos Altura de la planta (cm): La colección presentó plantas con altura mínima de 131 cm para el ECU-12896B, la altura máxima fue de 212,5 cm para el ECU-12896A, con un promedio de 176,83 cm y un coeficiente de variación de 10,38% (Tabla 1). 90 Cabe mencionar que las entradas ECU-3473 (139,66cm) y ECU-12882 (137cm) también presentaron alturas mínimas, y las accesiones en las que se observó alturas máximas fueron ECU-6690 (208,85 cm), ECU-5546 (201,85 cm) y ECU12891 (212,16 cm). Los valores reportados por Albornoz (1992) fueron de 190 cm para el valor mínimo y 230 cm para el valor máximo, comparando con los resultados del presente estudio se puede decir que la colección presentó plantas bajas, lo que puede ser efecto de adaptación a las condiciones climáticas y edáficas de la zona. Los productores de tomate de árbol prefieren árboles de tamaño bajo, ya que esto facilita el manejo fitosanitario y de cosecha, por los que debería tomarse en cuenta los ECUs que presentan tamaño bajo de planta para programas de mejoramiento genético, en el que se podría realizar cruzas entre plantas con altos rendimientos, tolerancia a plagas y enfermedades y con frutos de características deseables en el mercado. Días al inicio de la floración: El valor mínimo fue de 197 días para el ECU12882 considerándolo como precoz dentro de la colección en el presente estudio; el máximo de 261 días para el ECU-12898 siendo el más tardío, un promedio de 230 días y con un coeficiente de variación de 7,11% (Tabla 1) este valor indica que el comportamiento precoz de la accesión anteriormente mencionada se mantendrá en otros ciclos de cultivo por lo que puede ser evaluada para fitomejoramiento. Días de duración de la floración: El valor mínimo observado fue de 31 días para el ECU-12895, el valor máximo fue de 69 días para el ECU-12887, un promedio de 56 días y con un coeficiente de variación de 12,13% (Tabla 1). 91 Días a la madurez fisiológica: El valor mínimo observado fue de 382 días para el ECU-12893, considerándolo como precoz dentro del presente estudio; el valor máximo fue de 494 días para el ECU-12878 siendo el más tardío, un promedio de 418 días y con un coeficiente de variación de 6% (Tabla 1) Los descriptores días al inicio de floración, duración de la floración y madurez fisiológica no coinciden con los valores reportados por Albornoz (1992), ya que estos descriptores están influenciados por las condiciones agroclimáticas y el manejo agronómico que se al cultivo, sin embargo la accesión identificada como precoz en el presente estudio puede ser evaluada en programas de mejoramiento genético. G) Susceptibilidad a plagas y enfermedades Incidencia de pulgón (Aphis sp, Mysus sp.): El 43,24% de las entradas (16) presentaron baja incidencia de pulgones, el 51,35% (19) presentaron incidencia media y apenas el 5,41% de las entradas ECU-12884 y ECU-12888, presentaron una alta incidencia de pulgones (Anexo 5). Como se puede observar en el presente estudio, la incidencia de pulgón no fue un problema en la producción de tomate de árbol, sin embargo es importante el control de esta plaga porque es un vector en la transmisión de virus. Incidencia de chinche (Leptoglosus sp.): En la colección se observó que 33 entradas (89,19%) presentaron una incidencia media y cuatro (10,41%) que son los ECUs-12890, 12872, 12877 y 12892 presentaron una alta incidencia (Anexo 5). 92 La presencia de chinches en el presente ciclo de cultivo, no tuvo influencia directa con la producción, pese a esto los frutos se ven alterados externamente lo que puede afectar la comercialización del producto. Incidencia de lancha (Phytophthora infestans): El 100% de las entradas presentaron una incidencia media a la presencia de lancha (Anexo 5). Se puede afirmar que todos los cultivares de la colección de tomate de árbol del presente estudio, presentaron una incidencia media al ataque de Phytophthora infestans; cabe recalcar que durante el ciclo de investigación se realizaron constantes monitoreos para efectuar los controles fitosanitarios correspondientes. Incidencia de virus: En la colección se observó que 17 entradas (45,95%) presentaron una baja presencia de virus, 12 entradas (32,43%) presentaron incidencia media y ocho accesiones (21,62%) presentaron alta incidencia de virus (Anexo 5). La sintomatología para la identificación de virus en el que se basó el presente estudio fue dada mediante comunicación personal (Cevallos∗, 2003). Es necesario mantener un constante monitoreo para definir estrategias de control de plagas y enfermedades, además es importante la selección de frutos de plantas vigorosas y sanas para obtener mejores resultados al momento de la propagación. ∗ Cevallos, G. 2003. Sintomatología viral en tomate de árbol (comunicación personal). Granja Tumbaco INIAP. Quito, Ecuador. 93 4.1.3 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Los resultados obtenidos de la caracterización molecular y el análisis realizado con el paquete estadístico NTSYS se detallan a continuación. 4.1.3.1 Extracción de ADN Al realizar la extracción de ADN de Cyphomandra betacea con tejido fresco se logró obtener un ADN de buena calidad, con rendimientos bajos de algunas accesiones en tanto que otros presentaron altos rendimientos (Tabla 8). El ADN obtenido fue visualizado en un gel de agarosa como una banda única de alto peso molecular (Figura 9). 4.1.3.2 Productos de amplificación En un sondeo preliminar de 145 primers arbitrarios se seleccionaron ocho primers que amplificaron productos polimórficos y reproducibles que fueron evaluados en las 37 accesiones de tomate de árbol utilizadas en la presente investigación. Los primers polimórficos y sus secuencias de nucleótidos 5’ - 3’ se encuentran detallados en la Tabla 9. De las 94 bandas RAPDs observadas, 37 fueron polimórficas, con una tasa de polimorfismos de 3,92 polimorfismos por primer. El rango de amplificación observado fue de 5 a 16 productos obtenidos y el tamaño de las bandas varió de 300 a 1500 pb (Tabla 10). Solamente las bandas intensas y polimórficas que presentaron una amplificación consistente fueron analizadas, mientras que las bandas dudosas o borrosas no 94 fueron consideradas para el análisis. En la Figura 10, se muestra un ejemplo de la amplificación obtenida. 4.1.3.3 Análisis de Agrupamiento de los Datos moleculares (Cluster analysis) Los valores de similitud obtenidos en la comparación dos a dos entre todas las variables estudiadas estuvieron en un rango de 0,08 a 1,0, con un valor medio de 0,54 (Anexo 4). En la Figura 11 se representa gráficamente las relaciones genéticas del germoplasma en estudio, como se puede observar no hay un agrupamiento definido de las entradas como en el caso del dendrograma morfológico, ya que con los resultados del análisis de agrupamiento, se ubican en un mismo cluster accesiones que son diferentes morfológicamente; esto indica que hay una estrecha relación genética entre cada una de las accesiones, y que los polimorfismos evaluados no son los suficientes para determinar la baja variabilidad genética del tomate de árbol. 4.1.4 CORRELACIÓN ENTRE MARCADORES MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES Para realizar este análisis se compararon las matrices de distancias generadas a partir del algoritmo de Gower (caracteres morfológicos) y del coeficiente de Jaccard (caracteres moleculares). En el caso de descriptores morfológicos las comparaciones se realizaron con matrices generadas a partir de la totalidad de los descriptores; para marcadores moleculares se utilizó las 37 bandas polimórficas. 95 El valor de correlación obtenido a partir de este análisis fue de 0,036, que es un valor bajo en comparación con otros estudios de caracterización (Piedra, 2002 y Tapia 1998); la comparación de estas matrices dio como resultado una probabilidad de 0.66, lo que quiere decir que la comparación entre caracteres morfológicos y moleculares no es significativa, demostrando así que no hay relación entre las dos etapas del presente estudio, 4.1.5 IDENTIFICACIÓN DE MATERIAL PROMISORIO La caracterización morfoagronómica realizada en el presente estudio, ha permitido identificar posibles materiales promisorios dentro de la colección de tomate de árbol. Para la selección de material élite se tomó en cuenta descriptores relacionados con producción, tolerancia a virus y características del fruto que demanda el mercado nacional e internacional. Como materiales promisorios se han identificado las accesiones ECU-5546, ECU12871, ECU-12876, ECU-12879, ECU-12882, ECU-12885, ECU-12888, ECU12893, ECU-12894A, Estos materiales presentan un promedio de 25 a 28 frutos cuajados, siendo 23 la media para la colección, con una producción de dos a cinco frutos cosechados por inflorescencia siendo un valor de relevancia en producción; el tamaño del fruto oscila de 6 a 7 cm, y de color anaranjado para la epidermis del fruto y el mucílago adherido a la semilla, estas dos últimas características permiten ser competitivos en mercados nacionales e internacionales. 96 Se destaca el ECU-12882 por ser la accesión que presentó plantas de menor altura (137 cm) y que presentó las características anteriormente mencionadas, por lo que podría ser evaluada en un programa de fitomejoramiento en el que se pretenda conseguir árboles de tamaño bajo y de alta producción. En el presente estudio se destaca el ECU-12893 por la precocidad a la cosecha, material que puede ser evaluado en futuros estudios de mejoramiento, y que puede se difundida a los productores de tomate de árbol por sus características tanto de tamaño, color y producción. Uno de los problemas agronómicos que tiene mayor influencia en la producción de tomate de árbol es la incidencia de virus, las accesiones seleccionadas como promisorios mostraron una alta tolerancia a virus, confirmando así la importancia de evaluar estos materiales en otros ciclos de cultivo o en programas de mejoramiento con la finalidad de identificar materiales élites que permitan el desarrollo de variedades mejoradas con características de alto rendimiento y con cierta tolerancia a plagas y enfermedades que afectan al cultivo. Por otro lado, se debería comenzar un programa de cruzamiento con especies silvestres relacionadas para buscar genes de tolerancia que no han sido identificados en estos materiales promisorios 4.2 Consideraciones Finales La evaluación de la variabilidad genética de 37 accesiones de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) mediante la caracterización morfológica, permitió identificar tres grupos de entradas, que no coinciden con el agrupamiento 97 propuesto por Albornoz (1992), ya que para este estudio se utilizó el análisis multivariado para la discriminación de estos grupos. Se identificó seis descriptores cualitativos de alto poder discriminante, como color de la lámina foliar, color de las nervaduras, color de los brotes apicales, color de la epidermis del fruto, color del mucílago adherida la semilla y color de la semilla, para conformación de grupos. Albornoz (1992) utilizó los mismos descriptores cualitativos para identificar cultivares o grupos, incluyendo la forma del fruto en su análisis, descriptor que no es tomado como discriminante en el presente estudio, Dentro de los descriptores cuantitativos discriminantes, se identificaron tres descriptores, tales como tamaño del eje longitudinal del fruto, tamaño del eje transversal mayor y menor del fruto, estos descriptores son de gran utilidad para evaluar el germoplasma de tomate de árbol, ya que en el presente estudio la diferencia de tamaños de los frutos fue notable para cada grupo. Con el análisis morfológico realizado se determino que el germoplasma de tomate de árbol presentó una estrecha relación genética, sin embargo se observó variedad de formas y colores de frutos por lo que se realizó la identificación de morfotipos, Albornoz (1992) explica este fenómeno como resultado de las mezclas varietales que se han venido dando en los últimos años. Dentro del Grupo 1 se identificó materiales que pertenecen al grupo criollo redondo y criollo puntón, que en el estudio de Albornoz (1992) estos dos cultivares comparten ciertas características. Por otro lado el Grupo 2 comparte características del cultivar anaranjado gigante descrito por León et al (2004), y en la actualidad es el cultivar de mayor aceptación y demanda en el mercado. En el Grupo 3 se ubican los cultivares rojo o mora propuestos por Albornoz (1992), que 98 de igual manera comparten características vegetativas que los diferencia del resto. Entonces se puede decir que, los cultivares que comparten características similares en el estudio de Albornoz (1992), en la presente investigación esta relación las hace ubicarse en un mismo grupo. Se observó que las distancias genéticas entre accesiones fueron bajas, a pesar de esto, se identificó siete morfotipos que puede ser efecto de las mezclas varietales que realizan los agricultores dentro de una misma parcela, lo que ha inducido a la pérdida de la pureza de las variedades. La caracterización molecular empleando la técnica RAPDs en tomate de árbol, no generó la suficiente información que permita detectar la relación genética de la colección de C. betacea, en el presente estudio se encontró 37 polimorfismos que no fue el número adecuado para identificar la variabilidad genética a nivel molecular, sin embargo en otras especies se han logrado caracterizar el germoplasma utilizando un mínimo de 30 polimorfismos. Por lo tanto, en la presente investigación, la variabilidad genética del tomate de árbol está dada solo por la caracterización en campo, ya al comparar los datos morfoagronómicos con los moleculares, los resultados obtenidos fueron no significativos, es decir que no hay relación entre alguna entre las fases de estudio, debido principalmente a la técnica utilizada y disponible al momento de la investigación, ya que este técnica realiza un análisis del ADN al azar, por lo que en colecciones que tiene una base genética estrecha, se corre el riego de no detectar suficientes bandas polimórficas, que permitan una mayor relación entre la matriz de distancia morfológica y la matriz de distancia molecular. 99 Para determinar los centros de mayor diversidad de tomate de árbol encontrada del país, se hizo un análisis de la distribución de los morfotipos por provincia de colección, observando que en la provincia de Tungurahua se colectó seis de los siete morfotipos identificados, de igual manera en la provincia del Azuay se colectó cuatro morfotipos; siendo estas dos provincias las que presentaron mayor variabilidad genética. Los esfuerzos realizados en este frutal a nivel de fitomejoramiento han sido muy puntuales lo que ha ocasionado que los agricultores no cuenten con variedades mejoradas con características deseables, en relación a calidad, rendimiento, precocidad y tolerancia a plagas y enfermedades. En esta investigación que se caracterizó germoplasma de zonas productoras del país se constata visiblemente que los productores manejan variedades criollas que son bastante susceptibles a varias plagas y enfermedades, lo que conlleva a una baja en la producción y en la disminución de la vida de la plantación; todos estos factores han repercutido en los costos de producción, así como en la degradación ambiental y humana ya que se tiene que realizar muchos controles con pesticidas para poder tener altas producciones que generen utilidades a los agricultores. 100 CAPITULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1 CONCLUSIONES La caracterización morfoagronómica, permitió ampliar el conocimiento de la variabilidad de tomate de árbol y su estrecha relación genética. La caracterización morfológica y evaluación agronómica evaluada con las distancias de Gower y el agrupamiento de Ward, generaron tres grupos jerárquicos dentro de la colección de tomate de árbol. De los 27 descriptores cualitativos evaluados, seis resultaron ser de alto poder discriminante, y corresponden a: color del mucílago adherido a la semilla, color de la semilla, color de la lámina foliar, color de las nervaduras, color primario de la epidermis del fruto, y color de los brotes apicales. De los 21 descriptores cuantitativos evaluados, tres resultaron ser de alto poder discriminante, y corresponden a: tamaño del eje longitudinal del fruto, tamaño del eje transversal mayor del fruto y tamaño del eje transversal menor del fruto. Estos caracteres a pesar de estar influenciados por el ambiente y manejo agronómico, son de alto poder discriminante, por lo que resultan útiles para una diferenciación preliminar entre grupos. Los descriptores que presentaron menor coeficiente de variación fueron, días a la madurez fisiológica (6%), tamaño del eje transversal mayor del 101 fruto (6,08%) y tamaño del eje longitudinal de la semilla (6,58%) por lo que estos descriptores pueden ser utilizados para una evaluación preliminar de tomate de árbol. La caracterización molecular no permitió un agrupamiento definido de las entradas como lo observado en la caracterización morfológica. Esto se dio por la estrecha relación genética que existe entre las accesiones de tomate de árbol, además la técnica RAPDs no detectó esta mínima variación genética del germoplasma. La comparación entre datos morfológicos y moleculares dio un valor de correlación no significativo (0,036), lo cual indica un bajo grado de concordancia lo que se puede observar en los dendrogramas. La provincia de Tungurahua es un centro de diversidad genética de tomate de árbol, ya que se colectó seis morfotipos (M3, M5, M6, M7, M8, M9) de los siete identificados en la colección; otro centro de diversidad es la provincia del Azuay donde se colectó cuatro morfotipos (M1, M2, M4, M5, M7). El proceso de caracterización realizado en el presente estudio, ha permitido identificar posibles materiales promisorios dentro de la colección de tomate de árbol, que podrán ser evaluados en futuras investigaciones y validar así los resultados obtenidos, que será de gran utilidad al momento de definir programas de fitomejoramiento. 102 5.2 RECOMENDACIONES Para caracterizaciones futuras de tomate de árbol se recomienda evaluar especies silvestres y cultivadas, con el fin de determinar la relación genética y definir estrategias para fitomejoramiento. Se recomienda utilizar los caracteres color del mucílago adherido a la semilla, color de la lámina foliar, color de las nervaduras, color primario de la epidermis del fruto, color de los brotes apicales y tamaño del eje longitudinal del fruto, para futuras caracterizaciones o evaluaciones preliminares de germoplasma de tomate de árbol. Evaluar molecularmente el germoplasma de tomate de árbol con técnicas más eficientes en la detección de polimorfismos, como son AFLPs (Del inglés Amplified Fragment Length Polymorphism) y Microsatélites (Abrev. SSRs, del inglés Simple Sequence Repeats). Se recomienda realizar otro ciclo de cultivo en diferentes zonas productoras de tomate de árbol, con las posibles líneas promisorias seleccionadas en la presente investigación, con el fin de validar los resultados obtenidos en cuanto a producción y tolerancia a plagas y enfermedades. Se debería establecer estrategias para la conservación in situ, especialmente en los centros de mayor variabilidad de este germoplasma (Tungurahua y Azuay) para mantener la diversidad y evitar la erosión genética. 103 Se recomienda a los agricultores evitar mezclar cultivares en una misma parcela, ya que debido al tipo de polinización autógama y alógama del tomate de árbol se producen mezclas varietales en el ciclo de cultivo. Realizar investigaciones en la producción de plántulas in vitro libres de virus, para garantizar la calidad y rendimiento de los frutos, para poder incursionar en mercados internacionales donde la demanda de este frutal se ha venido incrementando. 104 BIBLIOGRAFÍA ALBORNOZ, G. 1992. El tomate de árbol en el Ecuador. Universidad Central del Ecuador. Quito-Ecuador. 130p. BOHS, L. 1994. Flora neotropica, Cyphomandra (Solacaceae). Published for Organization for Flora Neotropica. The New Yok Botanical Garden, New York. Monograph 63:50-57. COCHRAN, W. 1954. 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Valor mínimo Valor máximo PROMEDIO CV % 80 123,33 105,96 10,46 4,76 10,50 8,61 13,44 13,33 25,66 20,90 10,56 9,53 21,51 17,17 11,34 Tamaño del cáliz 4,66 7,10 5,65 8,17 Tamaño de la corola 8,40 11,77 10,56 7,43 11,0 50,0 36,10 19,43 7,0 33,0 23,91 19,50 4,77 8,05 6,44 8,83 4,01 5,90 4,94 6,08 2,81 4,28 3,63 7,87 3,08 7,91 5,32 16,02 1,0 5,0 2,86 27,83 4,0 30,0 20,95 22,51 155,0 367,0 261,27 16,38 3,55 5,0 4,0 6,58 3,05 4,25 3,62 24,37 Altura de las planta 131,0 212,5 176,83 10,38 Días al inicio de la floración 197,0 261,0 230,0 7,11 Días de duración de floración 31,0 69,0 56,24 12,13 Días a la madurez fisiológica 382,0 494,0 418,72 6,0 Descriptor Altura del fuste Longitud del pecíolo Tamaño del eje longitudinal de la lámina foliar Tamaño del eje transversal de la lámina foliar Número de flores y botones por inflorescencia Número de frutos cuajados por inflorescencia Tamaño del eje longitudinal del fruto Tamaño del eje transversal mayor del fruto Tamaño del eje transversal menor del fruto Grosor de la pulpa Número de frutos por inflorescencia Número de frutos caídos por inflorescencia Número de semillas por fruto Tamaño del eje longitudinal de la semilla Tamaño del eje transversal de la semilla 110 Tabla 2. Distribución de las 37 accesiones de Cyphomandra betacea por grupos, según el análisis de agrupamiento jerárquico de Ward, evaluados en la granja de la UNORCAC, Cotacachi – Ecuador, 2004. GRUPO 1 No. del banco Sitio de colecta GRUPO 2 No. del banco GRUPO 3 Sitio de colecta Imbabura No. del banco ECU-6690 Carchi ECU-12876 ECU-12874 Carchi ECU-12894A Tungurahua ECU-12894B Tungurahua ECU-12883 Loja ECU-12872 Carchi ECU-12878 Imbabura ECU-12884 Loja ECU-12877 Imbabura ECU-3472 Cañar ECU-12887 Azuay ECU-12879 Imbabura ECU-12782 Azuay ECU-12886 Azuay ECU-12898 Tungurahua ECU-12875 Carchi ECU-12889 Azuay ECU-12885 Loja ECU-12781 Azuay ECU-12888 Azuay ECU-12880 Imbabura ECU-12891 Tungurahua ECU-12890 Azuay ECU-12893 Tungurahua ECU-12895 Chimborazo ECU-12871 ECU-5546 Tungurahua ECU-12896A Tungurahua ECU-5579 Loja ECU-12873 Carchi ECU-3789 Pichincha ECU-3473 Cañar ECU-12882 ECU-12892 Sitio de colecta Tungurahua ECU-12897 Tungurahua ECU-12896B Tungurahua Imbabura Imbabura 111 Tabla 3. Parámetros usados para la estimación del valor discriminante en caracteres cualitativos para la colección ecuatoriana del tomate de árbol (Cyphomandra betacea) del DENAREF INIAP. 2 COEFICIENTE DE ASOCIACIÓN (P) CRAMER (V) CARACTER X Color del mucílago adherido a la semilla a 39.373** 1.032 0.729 Color de la semilla a 37.753** 1.010 0.714 Color de la lámina foliar a 37.000** 1.000 1.000 Color de las nervaduras a 37.000** 1.000 1.000 Color primario de la epidermis del fruto a 33.145** 0.946 0.669 Color de los brotes apicales a 31.985** 0.930 0.930 Incidencia de virus 14.949* 0.636 0.449 Color de la pulpa 12.034ns 0.570 0.403 Color secundario de la epidermis del fruto Grosor del mucílago que contiene la semilla 11.866* 0.566 0.566 10.502* 0.533 0.377 Forma del fruto 8.585ns 0.482 0.341 Forma del extremo apical del fruto 6.849* 0.430 0.430 Incidencia de pulgón 5.565ns 0.388 0.274 Densidad de la copa 5.132ns 0.372 0.263 Color primario de la corola 5.126ns 0.372 0.372 Color del mucílago que contiene la semilla 3.726ns 0.317 0.317 Hábito de la copa 3.819ns 0.321 0.227 a ** * ns Caracteres de mayor valor discriminante Altamente significativo al 1 % de probabilidad Significativo al 5% de probabilidad No significativo 112 Tabla 4. Valores promedio para caracteres cuantitativos de los tres grupos definidos del análisis del agrupamiento de Ward en la colección de tomate de árbol del DENAREF - INIAP. Descriptor G1 G2 G3 Altura del fuste 100,785 B 111,952 A 106,548 AB Longitud del pecíolo 8,4013 A 8,9838 A 8,4563 A 19,6719 B 22,1354 A 21,3575 AB 15,6475 B 18,9092 A 17,3925 A Tamaño del cáliz 5, 6463 A 5,6162 A 5,7175 A Tamaño de la corola 10,4056 A 10,8800 A 10,3775 A 31,438 B 41,00 A 37,500 A Tamaño del eje longitudinal de la lámina foliar Tamaño del eje transversal de la lámina foliar Número de flores y botones por inflorescencia Número de frutos cuajados por inflorescencia Tamaño del eje longitudinal del fruto Tamaño del eje transversal mayor del fruto Tamaño del eje transversal menor del fruto 20.250 B 28.077 A 24.500 A 5,7613 C 7,2400 A 6.4988 B 4.5900 C 5.4015 A 4.8938 B 3.3025 C 4.0085 A 3.6962 B Grosor de la pulpa 4.3731 B 6.2646 A 5.7000 A 2.3125 B 3.2308 A 3.3750 A 17.688 B 24.692 A 21.400 AB 217.00 B 298.15 A 289,88 A 4,0031 A 4.0615 A 3.9313 A 3.7956 A 3.5431 A 3.4088 A Altura de las planta 174.657 A 182.283 A 172.344 A Días al inicio de la floración 225.813 A 236.846 A 227.250 A Días de duración de floración 56.938 A 54.769 A 57.250 A Días a la madurez fisiológica 416.00 A 415.08 A 430.13 A Número de frutos por inflorescencia Número de frutos caídos por inflorescencia Número de semillas por fruto Tamaño del eje longitudinal de la semilla Tamaño del eje transversal de la semilla Letras diferentes determinan diferencias significativas al 5% con la prueba de rango múltiple de Duncan y determinan las variables discriminantes entre grupos. 113 Tabla 5. Valor promedio y desviación estándar para caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante para la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea) Descriptor G1 G2 G3 Valor “D” Tamaño del eje longitudinal del fruto Tamaño del eje transversal mayor del fruto Tamaño del eje transversal menor del fruto 5,76 ± 0,52 7,24 ± 0,53 6,50 ± 0,72 1 4,59 ± 0,31 5,40 ± 0,27 4,89 ± 0,31 1 3,30 ± 0,28 4.01 ± 0,24 3,70 ± 0,37 1 114 Tabla 6. Frecuencias relativas de los tres grupos de accesiones obtenidos según el análisis de agrupamiento jerárquico de Ward, de la colección de Cyphomandra betacea, según el estado de los caracteres cualitativos de mayor poder discriminante. CARACTER Color de la lámina foliar 1. Verde claro 2. Verde normal 3. Verde oscuro Color de las nervaduras 1. Amarillo 2. Marrón claro 3. Marron oscuro Color de los brotes apicales 1. Verde claro 2. Púrpura claro 3. Púrpura oscuro Color primario de la epidermis del fruto 1. Amarillo 2. Anaranjado claro 3. Anaranjado oscuro 4. Morado 5. Rosado oscuro Color del mucílago adherido a la semilla 1. Incoloro 2. Anaranjado claro 3. Anaranjado medio 4. Anaranjado oscuro 5. Púrpura claro 6. Púrpura oscuro Color de la semilla 1. Crema claro 2. Crema oscuro 3. Pardo 4. Púrpura claro 5. Púrpura oscuro G1 (%) (43,2) G2 (%) (35,1) G3 (%) (21,6) Total Accesiones (%) ------------16 (100,00) ------------13 (100,00) ------8 (100,00) ------- ------8 (21,62) 29 (78,38) ------------16 (100,00) ------------13 (100,00) ------8 (100,00) ------- ------8 (21,62) 29 (78,38) ------8 (100,00) ------- ------9 (24,32) 28 (75,68) ------------16 (100,00) ------1 (7,69) 12 (92,31) ------11(68,75) 5 (31,25) ------------- ------------12 (92,31) ------1 (7,69) ------------3 (37,50) 4 (50,00) 1 (12,50) ------11(29,73) 19 (51,35) 5 (13,51) 2 (5,41) ------------15 (93,75) 1(6,25) ------------- ------4 (30,77) 8 (61,54) ------------1 (7,69) ------------------------8 (100, 0) ------- ------4 (10,81) 22 (59,46) 2 (5,41)) 8 (21,62) 1 (2,70) ------12 (75,00) 4 (25,00) ------------- ------11 (92,31) ------------1 (7,69) ------------------8 (100,00) ------- ------23 (62,16) 4 (10,81) 9 (24,32) 1 (2,70) 115 Tabla 7. Morfotipos del Grupo 1, determinados en base a caracteres cualitativos evaluados en la caracterización morfológica de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) del DENAREF - INIAP. M1 M2 3473, 3789, 5546, 5579, 6690. 12781, 12873,12874, 12880, 12890, 12895 12883, 12884, 12887, 12886, 12889 Rala/ Semidensa/Densa Semidensa No. identificación banco de germoplasma Densidad de la copa Hábito de la copa Normal/Convergente Convergente *Color de la lámina foliar Verde oscuro Verde oscuro *Color de las nervaduras Marrón oscuro Marrón oscuro *Color de los brotes apicales Púrpura oscuro Púrpura oscuro Rosada Rosada Color primario de la corola Forma del fruto Elíptico/ Esférico/ Ovoide Ovoide Forma del extremo apical del fruto Puntón/ Redondo Puntón/ Redondo *Color primario de la epidermis del fruto Anaranjado claro Anaranjado oscuro Púrpura claro Púrpura claro Color secundario del fruto Color de la pulpa Grosor del mucílago que contiene la semilla *Color del mucílago adherido a la semilla *Color de la semilla * Descriptores cualitativos de alto poder discriminante Anaranjado medio Anaranjado medio Abundante Intermedio/ Abundante Anaranjado medio Anaranjado medio Crema oscuro Crema oscuro 11 Tabla 7. Morfotipos del Grupo 2, determinados en base a caracteres cualitativos evaluados en la caracterización morfológica de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) del DENAREF - INIAP. M3 M4 12871, 12872, 12876, 12877, 12879, 12882, 12885, 12888, 12891, 12893, 12894A, 12898, 12896A Densa / semidensa Densa Normal / Convergente Convergente No. identificación banco de germoplasma Densidad de la copa Hábito de la copa *Color de la lámina foliar Verde oscuro Verde oscuro *Color de las nervaduras Marrón oscuro Marrón oscuro *Color de los brotes apicales Púrpura oscuro Púrpura oscuro Color primario de la corola Blanco / Rosado Blanco Forma del fruto Ovoide Ovoide Forma del extremo apical del fruto Puntón Puntón Anaranjado oscuro Rosado oscuro Púrpura claro Púrpura claro Anaranjado claro / Anaranjado medio Crema *Color primario de la epidermis del fruto Color secundario de la epidermis del fruto Color de la pulpa Grosor del mucílago que contiene la semilla *Color del mucílago adherido a la semilla *Color de la semilla * Descriptores cualitativos de alto poder discriminante Intermedio / Escaso Intermedio Anaranjado claro /Anaranjado medio Púrpura oscuro Crema oscuro Púrpura oscuro 11 Tabla 7. Morfotipos del Grupo 3, determinados en base a caracteres cualitativos evaluados en la caracterización morfológica de la colección de (Cyphomandra betacea Sendt) del DENAREF - INIAP. M5 M6 M7 3472, 12782, 12875, 12897 12892, 12894B, 12878 12896B Densa / semidensa Convergente Semidensa Hábito de la copa Convergente Convergente Convergente *Color de la lámina foliar Verde medio Verde medio Verde medio *Color de las nervaduras Marrón claro Marrón claro Marrón claro *Color de los brotes apicales Púrpura claro Púrpura claro Púrpura claro Color primario de la corola Rosado Rosada Blanco Forma del fruto Ovoide Elíptico Ovoide Forma del extremo apical del fruto Puntón Puntón Puntón *Color primario de la epidermis del fruto Morado Anaranjado oscuro Rosado oscuro Púrpura oscuro Púrpura claro Púrpura claro Anaranjado medio / oscuro Anaranjado medio Anaranjado claro No. identificación banco de germoplasma Densidad de la copa Color secundario de la epidermis del fruto Color de la pulpa Grosor del mucílago que contiene la semilla Intermedio/ abundante Intermedio Intermedio *Color del mucílago adherido a la semilla Púrpura claro Púrpura claro Púrpura claro *Color de la semilla Púrpura claro Púrpura claro Púrpura claro * Descriptores cualitativos de alto poder discriminante 11 Tabla 8. Rendimiento de ADN de 37 entradas de C. betacea del banco de germoplasma del DENAREF – INIAP. ENTRADA CANTIDAD ADN (ng/(µl) ENTRADA CANTIDAD ADN (ng/µl) ECU-3472 60 ECU-12883 200 ECU-3473 40 ECU-12884 150 ECU-3789 100 ECU-12885 200 ECU-5546 60 ECU-12886 100 ECU-5579 60 ECU-12887 100 ECU-6690 60 ECU-12888 200 ECU-12781 60 ECU-12889 200 ECU-12782 100 ECU-12890 150 ECU-12871 60 ECU-12891 180 ECU-12872 200 ECU-12892 100 ECU-12873 100 ECU-12893 200 ECU-12874 100 ECU-12894A 100 ECU-12875 200 ECU-12894B 100 ECU-12876 40 ECU-12895 30 ECU-12877 100 ECU-12896A 200 ECU-12878 40 ECU-12896B 40 ECU-12879 150 ECU-12897 200 ECU-12880 40 ECU-12898 20 ECU-12882 60 11 Tabla 9. Primers y fragmentos RAPDs polimórficos evaluados en la colección de C. betacea Sendt. del DENAREF - INIAP. Secuencia de Nº de Rango de nucleótidos productos Amplificación 5’ – 3’ obtenidos (pb) OPAC – 09 AGAGCGTACC 8 – 10 300 – 1000 479, 326 OPAC – 19 AGTCCGCCTG 5–2 350 – 1000 881, 798, 708, 668, 593, 548 OPAN – 12 AACGGCGGTC 8 – 11 350 – 1200 999, 749, 722 OPAM – 07 AACCGCGGCA 5 – 16 320 – 1100 1038, 758, 727, 654, 600, 550, 503, 428, 408, 361, 308 OPAM – 15 GATGCGATGG 9 – 10 480 – 1100 736 OPAM – 16 TGGCGGTTTG 7 – 10 300 – 1000 691, 600, 565 OPR – 16 CTCTGCGCGT 7 – 16 400 – 1500 1335, 1006, 890, 759, 715, 688, 613, 567, 477 OPS – 13 GTCGTTCCTG 7–9 500 – 800 751, 649 Primer A= Adenina C= Citosina G= Guanina T= Tiamina Polimorfismos evaluados (pb) 12 ECU-12986B ECU-12986A ECU-12892 ECU-12877 ECU-12890 ECU-12875 ECU-12883 ECU-12872 ECU-12984B ECU-12894A ECU-12879 ECU-128885 ECU-12895 ECU-12882 ECU-12876 ECU-12873 ECU-12893 ECU-12884 ECU-12887 ECU-12888 ECU-12889 ECU-12880 ECU-12898 ECU-12874 ECU-12878 ECU-12871 ECU-12886 ECU-12891 ECU-12897 ECU-12782 ECU-12781 ECU-6690 ECU-5579 ECU-5546 ECU-3789 ECU-3473 Ubicación en campo de las accesiones evaluadas de tomate de árbol (Cyphomandra betacea), en la granja de la UNORCAC- Cotacachi. ECU-3472 Figura 1. 1, 5 m * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Plantas de tomate de árbol 2m 12 FIGURA 2. Flujograma del análisis estadístico de los datos morfológicos de la colección de C. betacea del DENAREF - INIAP REGISTRO DE DATOS (Matriz ) ANÁLISIS DISCRIMINANTE MATRIZ DE SIMILITUD (Gower) VALOR DISCRIMINANTE MATRIZ DE DISTANCIAS (Gower) DENDROGRAMA (Algoritmo de Ward) INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ANÁLISIS DE UBICACIÓN ESPACIAL 12 FIGURA 3. Distribución geográfica de las accesiones de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) del banco de germoplasma del INIAP (Fuente DENAREF) 12 Figura 4. Agrupamiento jerárquico de Ward de la colección del tomate de árbol (Cyphomandra betacea), basada en distancias genéticas de Gower, según los datos agromorfológicos. (M= morfotipo) 6690 Grupo 1 Carchi 12874 Carchi 12781 Azuay 12880 Imbabura 12883 Loja 12884 Loja 12887 Azuay 12886 Azuay 12889 Azuay 5546 Tungurahua 5579 Loja 3789 Pichincha 12890 Azuay 12895 Chimborazo M1 M2 M1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 12873 Carchi 3473 Cañar 12879 Imbabura 12898 Tungurahua 12893 Tungurahua 12871 Imbabura 12896A Tungurahua 12882 Imbabura 12872 Carchi 12877 Imbabura 12876 Imbabura 12894A Tungurahua 12885 Loja 12888 Azuay 12891 Tungurahua 3472 Cañar 12782 Azuay 12875 Carchi 12897 Tungurahua 12892 Tungurahua 12894B Tungurahua 12878 Imbabura 12896B Tungurahua M3 M4 M3 M5 M6 M7 12 Figura 5. Fonograma de 16 entradas de C. betacea que conforman el Grupo 1. 0 C ar chi 6 690 A C ar chi 1 287 4 A Az uay 1 278 1 A Imba b ura 1 288 0 A L oja 1 288 3 B L oja 1 288 4 B Az uay 1 288 7 B Az uay 1 288 6 B Az uay 1 288 9 B Tungur ahua 5 5 46 C L oja 5 5 79 C P ichincha 3 7 89 C 1 289 0 D C himbora zo 1 289 5 D C ar chi 1 287 3 D C aña r 3 4 73 D Azuay 0, 04 0, 17 0, 3 12 Figura 6. Fenograma de 13 entradas de C. betacea que conforman el Grupo 2 0 Imbabura 12879 A Tungurahua 12898 A Tungurahua 12893 A Imbabura 12871 A Tungurahua 12896A A Imbabura 12882 A Carchi 12872 B Imbabura 12877 B Imbabura 12876 B Tungurahua 12894A B Loja 12885 B Azuay 12888 B Tungurahua 12891 B 0, 04 0, 17 0, 3 12 Figura 7. Fonograma de 8 entradas de C. betacea que conforman el Grupo 3. 0 Cañar 3472 A Azuay 12782 A Carchi 12875 A Tungurahua 12897 A Tungurahua 12892 B Tungurahua 12894B B Imbabura 12878 B Tungurahua 12896B B 0, 04 0, 17 0, 3 12 Figura 8. Ubicación espacial de los accesiones de tomate de árbol y distancias de Mahalanobis entre grupos. 7, 41 3, 99 13, 14 12 FIGURA 9. Determinación de la concentración de ADN de la colección de C. betacea Sendt, mediante electroforesis en gel de agarosa. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ADN 100 ng/µl 60 ng/µl 40 ng/µl 20 ng/µl 10 ng/µl 5 ng/µl ARN M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 ADN 12 FIGURA 10 Perfiles RAPDs obtenidos en tomate de árbol (C. betacea Sendt) con el primer OPR-16. Carriles 1-29: ADN amplificado. A la izquierda el tamaño en pares de bases (pb) de algunas bandas polifórmificas evaluados. 1 1355 pb 1006 pb 759 pb 613 pb 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 13 ANEXO 1. ECU 3472 3473 3789 5546 5579 6690 12781 12782 12871 12872 12873 12874 Datos pasaporte de la colección nacional de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sent) LOCALIDAD Ecuador. Cañar. Azogues. Mercado Azogues; 02º44’ S, 78º50’ W; 2500 m.s.n.m. Ecuador. Cañar. Azogues. Mercado Azogues; 02º44’ S, 78º50’ W; 2500 m.s.n.m. Ecuador. Pichincha. Quito. Tumbaco; 00º12’ S, 78º24’ W, 2200 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Baños. Río Negro. Santa Inés; 01º24’ S, 78.14 W, 1360 m.s.n.m. Ecuador. Loja. Sozoranga. Sozoranga. Panecillo; 04º19’ S, 79º47’ W, 1650 m.s.n.m. Ecuador. Carchi. Tulcán. Maldonado. Maldonado; 00º53’ N, 78º07’ W, 1530 m.s.n.m. Ecuador. Azuay. Guachapata. Guachapata. Don Julio; 02º44.27’ S, 78º39.16’ W, 2501 m.s.n.m. Ecuador. Azuay. Guachapata. Guachapata. Don Julio; 02º44.27’ S, 78º39.16’ W, 2501 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Pimampiro. Pimampiro. El Inca. 0°21.426’S, 77°57.818’W, 2440 m.s.n.m. Ecuador. Carchi. Bolívar. Cuesaca; 0°30.809’N, 77°53.031’W, 2670 m.s.n.m. Ecuador. Carchi. Bolívar. Cuesaca; 0°30.809’N, 77°53.031’W, 2670 m.s.n.m. Ecuador. Carchi. Tulcán. Maldonado. La Pradera; 0°49.626’N, 78°02.275’W, 2360 m.s.n.m. OBSERVACIONES COLECTOR Fruto rojo RC-1027 Fruto anaranjado RC-1030 RC-1068 CS-012 CS-046 CP-022 ACX-053 ACX-051 8 km desde el parque de Pimampiro hasta C. Tapia, M. Tacán, El Inca. Densidad de siembra: 1 x 1 F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, Entre plantas 1.5 m y entre surcos 1 m. F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, Entre plantas 1.5 m y entre surcos 1 m. F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes 13 continuación ANEXO 1... 12875 12876 12877 12878 12879 12880 12882 12883 12884 12885 12886 Ecuador. Carchi. Bolívar. Cuesaca; 0°30.809’N, 77°53.031’W, 2670 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Antonio Ante. Atuntaqui. Tierra Blanca; 0°20.433’N, 78°12.408’W, 2220 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Antonio Ante. Atuntaqui. Tierra Blanca; 0°20.433’N, 78°12.408’W, 2220 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Antonio Ante. Atuntaqui. Tierra Blanca; 0°20.433’N, 78°12.408’W, 2220 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Antonio Ante. Atuntaqui. Tierra Blanca; 0°20.433’N, 78°12.408’W, 2220 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Urcuquí. Cahuasqui. Las Cochas; 0°30.748’N, 78°12.468’W, 2160 m.s.n.m. Ecuador. Imbabura. Antonio Ante. Atuntaqui. Tierra Blanca; 0°20.433’N, 78°12.408’W, 2220 m.s.n.m. Ecuador. Loja. Loja. Yongana. Yongana; 4°22.338’S, 79°10.481’W, 1740 m.s.n.m. Ecuador. Loja. Loja. Yongana. Maco; 4°22.273’S, 79°09.873’W, 1935 m.s.n.m. Ecuador. Loja. Loja. Yongana. Maco; 4°22.273’S, 79°09.873’W, 1935 m.s.n.m. Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay; 2°51.993’S, 78°46.634’W, 2040 m.s.n.m. C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes Gigante C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes Fruto mora Material traído de Ambato C. Tapia, M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes 13 continuación ANEXO 1… 12887 12888 12889 12890 12891 12892 12893 12894A 12894B 12895 12896A 12896B 12897 12898 Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay; 2°51.993’S, 78°46.634’W, 2040 m.s.n.m. Ecuador. Azuay. Sevilla de Oro. Sevilla de Oro. Chimal; 2°49.215’S, 78°38.933’W, 2270 m.s.n.m. Ecuador. Azuay. Sevilla de Oro. Sevilla de Oro. La Tina; 2°48.638’S, 78°39.585’W, 2160 m,s,n,m. Ecuador. Azuay. Gualaceo. Bulcay. Tulipa; 2°48.085’S, 78°40.034’W, 2350 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. Oriente; 1°20.034’S, 78°31.875’W, 2360 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. San Blas; 1°19.964’S, 78°31.867’W, 2350 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo Grande. Oriente; 1°20.081’S, 78°31.556’W, 2345 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. Guadalupe; 1°20.081’S, 78°31.556’W, 2245 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Pelileo. Guadalupe; 1°20.081’S, 78°31.556’W, 2245 m.s.n.m. Ecuador. Chimborazo. Penipe. Bilbao. Bilbao; 1°26.513’S, 78°30.080’W, 2120 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Cotalo. Cusua; 1°25.598’S, 78°29.231’W, 2100 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Pelileo. Cotalo. Cusua; 1°25.598’S, 78°29.231’W, 2100 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Patate. La Matriz. La Esperanza; 1°20.459’S, 78°29.509’W, 2260 m.s.n.m. Ecuador. Tungurahua. Patate. La Matriz. La Esperanza; 1°20.459’S, 78°29.509’W. 2260 m.s.n.m. M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes Séptimo año. El mejor para sacar semilla. Maduro. Rojo pálido. Altura de planta: baja Maduro. Rojo pálido. Altura de planta: baja M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes M. Tacán, F. Paredes 13 Anexo 2. Lista de descriptores para la caracterización morfoagronómica de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sent) Los datos se tomaron de diez plantas provenientes de cada entrada. 1. Altura del fuste. Midiendo en centímetros desde el cuello de la planta hasta el sitio en que el tallo se divide en tres ramas primarias, al momento que aparece la inflorescencia apical. 2. Densidad de la copa Los datos se determinaron por apreciación visual, la tendencia general es de diez árboles por entrada. 3. 1. Densa 2. Semidensa 3. Rala Hábito de la copa Se determinó visualmente de acuerdo a cómo se distribuyen las ramas. 4. 1. Normal: Ramas en forma de parasol. 2. Convergente: Ramas tienden a dirigirse hacia el eje axil. 3. Caediza: Ramas formen una dirección hacia abajo. Forma del Pecíolo Se hizo un corte transversal, al nivel medio de su longitud, en 10 hojas, una por cada árbol de las entradas, se registrará según las siguientes características. 5. 1. Cilíndrico 2. Aplanado Longitud del pecíolo (cm) Se midió la longitud en centímetros desde la base del limbo hasta el sitio de unión con el fuste, en las 10 hojas ya señaladas. 13 6. Forma de la lámina Se determinó por apreciación visual en las hojas ya señaladas, según las siguientes características: 7. 1. Ovaladas 2. Lanceoladas 3. Oval – lanceoladas 4. Cordadas Plantas con dimorfismo foliar Se determinó según las siguientes características: 8. 1. Cordadas y lobuladas 2. Sin dimorfismo Tamaño del eje longitudinal de la lámina foliar (cm) En 10 hojas ya señaladas se midió desde la base del pecíolo al ápice de la hoja sacando el promedio en centímetros. 9. Tamaño del eje transversal de la lámina foliar (cm) En las hojas ya señaladas se midió al nivel de su diámetro mayor, así mismo se sacó el promedio en centímetros. 10. Color de la lámina (atlas de colores) Los rangos de colores para el haz, envés son los mismos, se determinó según la siguiente escala de colores: 1. Verde claro 2. Verde medio 3. Verde oscuro 13 11. Nervaduras de la lámina Se determinó visualmente, según las siguientes características: 12. 1. No prominentes 2. Prominentes Color de las nervaduras Se determinó según la siguiente escala de colores: 13. 1. Amarillo 2. Marrón claro 3. Marrón oscuro Color de los brotes apicales Se determinó visualmente, según la siguiente escala de colores: 14. 1. Verde claro 2. Púrpura claro 3. Púrpura oscuro Tamaño del cáliz (mm) Se midió en milímetros, en los sépalos desde la base hasta el ápice. 15. Color del cáliz Se determinó mediante la siguiente escala de colores (5): 16. 1. Verde claro 2. Verde medio 3. Verde oscuro Tamaño de la corola Se midió el promedio del diámetro de la corola, en milímetros. 13 17. Color primario de la corola Se evaluó mediante los siguientes colores. 1. Blanco 2. Rosado 18. Color secundario de la corola Se evaluó mediante los siguientes colores. 1. Púrpura claro 2. Púrpura oscuro 19. Tipo de inflorescencia Se determinó según el tipo de ramificación, en diez inflorescencias una por cada árbol de cada entrada, para la caracterización se puede tomar las iniciales de los términos botánicos. 20. 1. Cima (C) 2. Cima escorpioide ( C.E ) 3. Cima bípara escorpioide ( C.B.E ) Número de flores y botones por inflorescencia Se contó las cinco primeras inflorescencias (50% de los diez árboles por entrada), que entren en floración, esto significa una por cada árbol y por cada entrada; contando el número de flores abiertas más los botones claramente visibles, al momento en que se abre la primera flor. 21. Número de frutos cuajados por inflorescencia En las inflorescencias señaladas se contó el número total de frutos cuajados después de la polinización de las mismas. 22. Forma del fruto Se cortó los frutos longitudinalmente por el eje axil, colocando sobre un papel la cara cortada y graficando el perímetro de cinco frutos por accesión. 1. Esférico 13 23. 2. Elíptico 3. Ovoide 4. Piriforme Forma del extremo apical del fruto Se determinó por observación directa. 24. 1. Redondo 2. Puntón Tamaño del eje longitudinal del fruto (cm) Midiendo con un calibrador en centímetros y milímetros, de cinco frutos por entrada y luego obteniendo la media de cada una de las tres medidas. 25. Tamaño del eje transversal mayor del fruto (cm) Midiendo con un calibrador en centímetros y milímetros, de cinco frutos por entrada y luego obteniendo la media de cada una de las tres medidas. 26. Tamaño del eje transversal mayor del fruto (cm) Midiendo con un calibrador en centímetros y milímetros, de cinco frutos por entrada y luego obteniendo la media de cada una de las tres medidas. 27. Color primario de la epidermis del fruto Se determinó por observación directa, en los cinco frutos ya seleccionados, se usará la siguiente escala de colores. 28. 1. Amarillo 2. Anaranjado claro 3. Anaranjado oscuro 4. Morado 5. Rosado oscuro Color secundario de la epidermis del fruto 13 Se determinó por observación directa, en los cinco frutos ya seleccionados, se usará la siguiente escala de colores. 29. 1. Morado claro 2. Morado oscuro Veteado de la epidermis del fruto Determinando la menor o mayor apariencia de unas franjas o vetas de color verdes oscuros, pardos o púrpuras que van del extremo basal en dirección del ápice del fruto, así: 30. 1. No veteado 2. Ligeramente veteado 3. Claramente veteado Color de la pulpa En cinco frutos por accesión, se efectuó un corte al nivel del diámetro mayor ecuatorial, por observación directa se determinó en la siguiente escala de colores: 31. 1. Anaranjado claro 2. Anaranjado medio 3. Anaranjado oscuro 4. Crema Grosor de la pulpa (mm) En los cinco frutos cortados transversalmente, se midió en milímetros y décimas de milímetros con un calibrador, desde la epidermis hasta el límite externo de la capa mucilaginosa. 32. Grosor del mucílago que contiene la semillas Este descriptor se refiere a la capa mucilaginosa que se encuentra hacia el interior, después de la pulpa, este mucílago engloba totalmente a las semillas implantadas en la placenta, se lo evaluó por apreciación visual en: 1. Escaso 2. Intermedio 13 3. Abundante 33. Color del mucílago que contiene las semilla Se lo puede calificar también de mucílago externo, en oposición al mucílago “adherido” a las semillas. El color se evaluó por observación directa, o usando un atlas de colores. 34. 1. Incoloro 2. Anaranjado claro 3. Anaranjado oscuro Color del mucílago “adherido” a la semilla Este mucílago se lo puede calificar de mucílago interno, está completamente adherido a cada una de las semillas; se diferencia del extremo porque en ocasiones contiene antocianinas. Además se encuentra, junto con las semillas inmerso en el mucílago externo. 1. Incoloro 2. Anaranjado claro 3. Anaranjado medio 4. Anaranjado oscuro 5. Púrpura claro 6. Púrpura oscuro 35. Número de frutos por inflorescencia En las cinco inflorescencias señaladas por entrada, se contó el número de frutos obtenidos. 36. Número de frutos caídos por inflorescencia Se determinó en las inflorescencias señaladas, por diferencia entre el número de frutos cuajados y el número de frutos en madurez fisiológica. 1. Escaso 2. Intermedio 3. Abundante 14 37. Número de semillas por fruto Contando en cinco frutos por entrada, el número de semillas de cada uno, luego sacando la media aritmética. 38. Tamaño del eje longitudinal de la semillas (mm) Se midió en milímetros, en diez semillas viables, tomando al azar en cada uno de los cinco frutos escogidos. 39. Tamaño del eje transversal de la semillas (mm) Se midió en milímetros, en diez semillas viables, tomando al azar en cada uno de los cinco frutos escogidos. 40. Color de las semillas Se determinó por apreciación visual, en las muestras de los cinco frutos escogidos: 1. Crema claro 2. Crema oscuro 3. Pardas 4. Púrpura claro 5. púrpura oscuro 41. Altura de las plantas Se midió en centímetros desde el suelo al límite superior de la copa, cuando se inicie la primera cosecha. 42. Días al inicio de floración Estos datos fueron tomados durante el primer ciclo de cosecha, contando los días desde la fecha de siembra, hasta el 50% de los árboles de cada entrada presenten por lo menos una primera flor abierta. 43. Duración de la Floración por inflorescencia 14 En las cinco inflorescencias señaladas se contó los días de inicio de floración hasta cuando no se vean ni botones ni flores potencialmente funcionales. 44. Días a la madurez fisiológica Se contó los días desde la siembra en el semillero, hasta cuando se inició la cosecha 50% de árboles de cada entrada, en la primera cosecha. 45. Incidencia de pulgón (aphis sp, mysus sp) Se monitoreó la presencia de pulgón durante el desarrollo del cultivo en el área neta de investigación. Se evaluó según los siguientes rangos: 1. Baja incidencia 2. Media incidencia 3. Alta incidencia 46. Incidencia de chinche (Leptoglosus sp) Se monitoreó la presencia de chinche durante el desarrollo del cultivo en el área neta de investigación. Se evaluó según los siguientes rangos: 1. Baja incidencia 2. Media incidencia 3. Alta incidencia 47. Incidencia de lancha (Phytophthora infestans) Se monitoreó la presencia de lancha durante el desarrollo del cultivo en el área neta de investigación. Se evaluó según los siguientes rangos: 1. Baja incidencia 2. Media incidencia 3. Alta incidencia 48. Incidencia de virus Se monitoreó la incidencia de virus durante el desarrollo del cultivo en el área neta de investigación. Se evaluó según los siguientes rangos: 14 1. Baja incidencia 2. Media incidencia 3. Alta incidencia 14 ANEXO 3. 1 2 3 Matriz de similitud generada a partir de datos morfológicos, utilizando la distancia de Gower 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 1 0.000 2 0.317 0.000 3 0.295 0.187 0.000 4 0.250 0.187 0.137 0.000 5 0.252 0.206 0.174 0.127 0.000 6 0.267 0.172 0.222 0.153 0.135 0.000 7 0.286 0.191 0.142 0.123 0.171 0.106 0.000 8 0.122 0.281 0.295 0.289 0.276 0.254 0.290 0.000 9 0.275 0.266 0.250 0.236 0.231 0.223 0.239 0.255 0.000 10 0.218 0.293 0.260 0.201 0.231 0.215 0.214 0.305 0.209 0.000 11 0.300 0.208 0.218 0.190 0.213 0.147 0.167 0.262 0.192 0.217 0.000 12 0.268 0.183 0.217 0.151 0.134 0.044 0.105 0.241 0.208 0.205 0.131 0.000 13 0.136 0.338 0.360 0.334 0.319 0.310 0.305 0.168 0.282 0.289 0.275 0.287 0.000 14 0.190 0.241 0.217 0.160 0.160 0.149 0.167 0.272 0.132 0.089 0.190 0.134 0.249 0.000 15 0.268 0.302 0.265 0.214 0.239 0.225 0.221 0.356 0.217 0.063 0.229 0.210 0.338 0.092 0.000 16 0.155 0.336 0.318 0.290 0.293 0.271 0.314 0.164 0.263 0.213 0.264 0.263 0.269 0.210 0.242 0.000 17 0.232 0.272 0.254 0.190 0.224 0.212 0.202 0.309 0.107 0.115 0.178 0.197 0.261 0.073 0.121 0.249 0.000 18 0.279 0.204 0.216 0.134 0.140 0.096 0.100 0.285 0.220 0.223 0.185 0.089 0.286 0.147 0.226 0.317 0.214 0.000 19 0.222 0.241 0.206 0.227 0.255 0.269 0.244 0.236 0.182 0.217 0.249 0.273 0.284 0.171 0.225 0.238 0.173 0.284 0.000 20 0.241 0.179 0.224 0.130 0.139 0.127 0.131 0.260 0.158 0.136 0.150 0.109 0.274 0.086 0.145 0.262 0.118 0.108 0.192 0.000 21 0.258 0.186 0.217 0.150 0.155 0.106 0.133 0.236 0.174 0.161 0.144 0.092 0.299 0.107 0.168 0.244 0.139 0.141 0.205 0.064 0.000 22 0.250 0.233 0.205 0.194 0.222 0.170 0.182 0.264 0.162 0.114 0.147 0.155 0.311 0.072 0.113 0.189 0.102 0.210 0.171 0.122 0.099 0.000 23 0.195 0.246 0.238 0.164 0.187 0.156 0.117 0.235 0.201 0.209 0.225 0.131 0.211 0.126 0.213 0.308 0.190 0.100 0.258 0.129 0.152 0.190 0.000 24 0.240 0.194 0.194 0.143 0.161 0.162 0.135 0.238 0.152 0.159 0.148 0.153 0.284 0.109 0.167 0.237 0.139 0.147 0.141 0.075 0.095 0.116 0.152 0.000 25 0.278 0.258 0.225 0.177 0.207 0.190 0.173 0.292 0.127 0.157 0.178 0.170 0.325 0.106 0.142 0.256 0.142 0.187 0.198 0.114 0.109 0.117 0.179 0.101 0.000 26 0.256 0.251 0.215 0.134 0.189 0.153 0.106 0.310 0.176 0.127 0.196 0.139 0.285 0.086 0.135 0.245 0.123 0.114 0.209 0.095 0.115 0.114 0.098 0.118 0.124 0.000 27 0.307 0.173 0.183 0.225 0.223 0.163 0.186 0.236 0.192 0.207 0.160 0.128 0.294 0.169 0.215 0.309 0.224 0.179 0.219 0.174 0.160 0.160 0.215 0.159 0.205 0.230 0.000 28 0.294 0.303 0.266 0.211 0.240 0.220 0.224 0.334 0.152 0.130 0.205 0.213 0.366 0.119 0.090 0.220 0.147 0.228 0.225 0.145 0.170 0.112 0.217 0.145 0.079 0.138 0.260 0.000 29 0.163 0.350 0.354 0.315 0.307 0.280 0.317 0.196 0.291 0.152 0.281 0.263 0.238 0.194 0.200 0.104 0.223 0.320 0.258 0.259 0.242 0.194 0.306 0.284 0.288 0.250 0.264 0.273 0.000 30 0.256 0.296 0.262 0.219 0.250 0.239 0.224 0.342 0.104 0.160 0.208 0.225 0.296 0.117 0.161 0.276 0.066 0.236 0.209 0.154 0.171 0.151 0.222 0.164 0.125 0.166 0.253 0.146 0.279 0.000 31 0.300 0.188 0.233 0.208 0.204 0.143 0.176 0.263 0.163 0.243 0.137 0.115 0.318 0.161 0.250 0.265 0.217 0.161 0.268 0.142 0.148 0.144 0.186 0.146 0.145 0.189 0.125 0.185 0.285 0.195 0.000 32 0.152 0.391 0.315 0.265 0.344 0.324 0.282 0.196 0.313 0.292 0.276 0.319 0.183 0.297 0.324 0.190 0.288 0.295 0.301 0.286 0.312 0.291 0.224 0.285 0.301 0.241 0.377 0.296 0.260 0.294 0.339 0.00000 33 0.256 0.305 0.248 0.227 0.245 0.238 0.225 0.316 0.122 0.127 0.170 0.222 0.303 0.113 0.133 0.224 0.064 0.232 0.187 0.158 0.178 0.105 0.220 0.150 0.147 0.145 0.242 0.134 0.226 0.088 0.225 0.27826 0.000 34 0.232 0.264 0.233 0.178 0.204 0.189 0.184 0.319 0.179 0.083 0.194 0.176 0.299 0.055 0.075 0.226 0.084 0.191 0.186 0.107 0.130 0.063 0.176 0.130 0.124 0.091 0.218 0.096 0.206 0.123 0.195 0.29625 0.101 0.000 35 0.124 0.336 0.313 0.253 0.271 0.283 0.277 0.204 0.251 0.137 0.268 0.265 0.204 0.147 0.172 0.109 0.160 0.279 0.195 0.198 0.222 0.159 0.267 0.223 0.218 0.182 0.312 0.194 0.084 0.209 0.293 0.18824 0.173 0.131 0.000 36 0.273 0.354 0.292 0.264 0.276 0.277 0.303 0.338 0.173 0.225 0.246 0.271 0.318 0.165 0.199 0.262 0.177 0.284 0.241 0.246 0.257 0.182 0.264 0.232 0.193 0.244 0.269 0.156 0.300 0.167 0.230 0.30441 0.179 0.185 0.249 0.000 37 0.181 0.343 0.380 0.341 0.315 0.325 0.317 0.231 0.247 0.277 0.315 0.301 0.192 0.253 0.327 0.238 0.249 0.293 0.293 0.270 0.308 0.314 0.296 0.291 0.288 0.308 0.311 0.314 0.211 0.242 0.280 0.28056 0.272 0.294 0.174 0.263 0.000 1=ECU-13472; 2=ECU-3473; 3=ECU-3789; 4=ECU-5546; 5=ECU-5579; 6=ECU-6690; 7=ECU-12781; 8=ECU-12782; 9=ECU-12871; 10=ECU-12872; 11=ECU-12873; 12=ECU-12874; 13=ECU-12875; 14=ECU-12876; 15=ECU-12877; 16=ECU-12878; 17=ECU-12879; 18=ECU-12880; 19=ECU-12882; 20=ECU-12883; 21=ECU-12884; 22=ECU-12885; 23=ECU-12886; 24=ECU-12887; 25=ECU-12888; 26=ECU-12889; 27=ECU-12890; 28=ECU-12891; 29=ECU-12892; 30=ECU-12893; 31=ECU-12895; 32=ECU-12897; 33=ECU-12898; 34=ECU-12894A; 35=ECU-12894B; 36=ECU-12896A; 37=ECU-12896B 14 ANEXO 4 1 Matriz de similitud generada a partir de datos moleculares, utilizando el coeficiente de Jaccard 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 1 1.000 2 0.444 1.000 3 0.280 0.346 1.000 4 0.280 0.400 0.400 1.000 5 0.291 0.360 0.500 0.421 1.000 6 0.347 0.478 0.227 0.285 0.181 1.000 7 0.400 0.652 0.476 0.347 0.304 0.500 1.000 8 0.370 0.538 0.500 0.320 0.391 0.280 0.500 1.000 9 0.250 0.269 0.368 0.444 0.388 0.315 0.380 0.347 1.000 10 0.304 0.320 0.300 0.238 0.250 0.190 0.318 0.291 0.263 1.000 11 0.478 0.423 0.500 0.363 0.318 0.380 0.500 0.521 0.400 0.400 1.000 12 0.318 0.280 0.388 0.250 0.411 0.090 0.333 0.500 0.210 0.277 0.350 1.000 13 0.434 0.333 0.260 0.260 0.166 0.272 0.391 0.360 0.285 0.227 0.347 0.300 1.000 14 0.360 0.423 0.428 0.363 0.260 0.380 0.500 0.458 0.473 0.333 0.600 0.285 0.409 1.000 15 0.523 0.400 0.217 0.333 0.227 0.285 0.291 0.320 0.238 0.300 0.363 0.315 0.450 0.304 1.000 16 0.391 0.521 0.400 0.400 0.350 0.285 0.476 0.375 0.368 0.300 0.363 0.315 0.380 0.428 0.333 1.000 17 0.320 0.440 0.380 0.450 0.272 0.333 0.454 0.416 0.227 0.173 0.347 0.368 0.250 0.347 0.260 0.450 1.000 18 0.375 0.440 0.318 0.208 0.217 0.272 0.454 0.416 0.285 0.227 0.291 0.300 0.363 0.347 0.450 0.260 0.428 1.000 19 0.545 0.423 0.250 0.250 0.260 0.160 0.320 0.346 0.166 0.400 0.333 0.421 0.476 0.333 0.578 0.363 0.291 0.476 1.000 20 0.363 0.434 0.368 0.368 0.136 0.315 0.526 0.409 0.200 0.263 0.400 0.352 0.421 0.473 0.300 0.368 0.500 0.421 0.473 1.000 21 0.478 0.608 0.428 0.304 0.318 0.318 0.500 0.521 0.272 0.333 0.391 0.350 0.476 0.454 0.428 0.578 0.291 0.347 0.523 0.473 1.000 22 0.375 0.440 0.450 0.380 0.400 0.272 0.454 0.360 0.421 0.421 0.409 0.368 0.363 0.476 0.318 0.450 0.250 0.304 0.409 0.421 0.631 1.000 23 0.304 0.434 0.300 0.238 0.250 0.315 0.450 0.291 0.142 0.263 0.217 0.352 0.350 0.272 0.368 0.529 0.421 0.350 0.400 0.333 0.473 0.421 1.000 24 0.181 0.208 0.375 0.222 0.105 0.235 0.315 0.350 0.333 0.250 0.411 0.266 0.352 0.333 0.222 0.375 0.277 0.277 0.142 0.333 0.263 0.210 0.250 1.000 25 0.407 0.464 0.478 0.360 0.320 0.222 0.480 0.444 0.280 0.333 0.440 0.409 0.458 0.440 0.307 0.360 0.346 0.458 0.500 0.454 0.500 0.590 0.454 0.272 1.000 26 0.222 0.565 0.318 0.450 0.272 0.400 0.523 0.307 0.285 0.350 0.291 0.238 0.428 0.347 0.318 0.450 0.363 0.363 0.291 0.421 0.409 0.428 0.421 0.277 0.458 1.000 27 0.166 0.291 0.142 0.200 0.277 0.150 0.285 0.318 0.294 0.157 0.181 0.235 0.250 0.368 0.200 0.142 0.136 0.315 0.238 0.222 0.238 0.250 0.157 0.125 0.250 0.315 1.000 28 0.421 0.363 0.277 0.210 0.294 0.157 0.238 0.333 0.166 0.235 0.388 0.428 0.200 0.250 0.352 0.277 0.263 0.263 0.315 0.235 0.250 0.200 0.235 0.214 0.318 0.142 0.055 1.000 29 0.333 0.250 0.333 0.333 0.350 0.285 0.291 0.320 0.444 0.300 0.500 0.190 0.208 0.363 0.217 0.217 0.260 0.208 0.111 0.130 0.250 0.380 0.181 0.222 0.307 0.260 0.263 0.150 1.000 30 0.400 0.476 0.333 0.333 0.277 0.210 0.421 0.450 0.222 0.222 0.368 0.400 0.315 0.300 0.333 0.500 0.470 0.315 0.368 0.466 0.368 0.315 0.375 0.285 0.363 0.250 0.111 0.461 0.142 1.000 31 0.375 0.384 0.380 0.318 0.473 0.272 0.391 0.478 0.285 0.350 0.550 0.368 0.200 0.347 0.318 0.260 0.428 0.363 0.409 0.350 0.291 0.304 0.285 0.210 0.400 0.250 0.190 0.333 0.318 0.388 1.000 32 0.450 0.333 0.190 0.250 0.333 0.142 0.217 0.428 0.150 0.210 0.350 0.375 0.238 0.227 0.250 0.250 0.238 0.181 0.350 0.210 0.285 0.181 0.150 0.187 0.240 0.130 0.235 0.333 0.190 0.400 0.368 1.000 33 0.166 0.240 0.263 0.263 0.150 0.095 0.350 0.318 0.222 0.222 0.238 0.235 0.315 0.238 0.200 0.200 0.136 0.136 0.181 0.222 0.238 0.190 0.157 0.200 0.250 0.190 0.111 0.266 0.090 0.250 0.136 0.166 1.000 34 0.227 0.363 0.210 0.277 0.222 0.294 0.300 0.217 0.166 0.400 0.250 0.250 0.333 0.250 0.437 0.210 0.200 0.333 0.388 0.312 0.315 0.333 0.400 0.214 0.318 0.333 0.187 0.285 0.150 0.266 0.263 0.111 0.187 1.000 35 0.500 0.375 0.181 0.238 0.250 0.190 0.318 0.291 0.142 0.411 0.333 0.352 0.421 0.400 0.444 0.238 0.173 0.350 0.555 0.333 0.333 0.285 0.263 0.176 0.391 0.285 0.294 0.400 0.130 0.294 0.350 0.437 0.222 0.400 1.000 1=ECU-13472; 2=ECU-3473; 3=ECU-3789; 4=ECU-5546; 5=ECU-5579; 6=ECU-6690; 7=ECU-12781; 8=ECU-12782; 9=ECU-12871; 10=ECU-12872; 11=ECU-12873; 12=ECU-12874; 13=ECU-12875; 36 0.250 0.166 0.105 0.235 0.250 0.250 0.142 0.238 0.187 0.187 0.277 0.200 0.100 0.210 0.105 0.105 0.222 0.047 0.095 0.117 0.150 0.157 0.117 0.153 0.125 0.100 0.214 0.142 0.400 0.133 0.294 0.384 0.062 0.142 0.187 1.000 37 0.500 0.500 0.280 0.333 0.409 0.291 0.458 0.480 0.250 0.304 0.478 0.450 0.269 0.416 0.333 0.391 0.434 0.375 0.545 0.363 0.416 0.320 0.363 0.181 0.461 0.320 0.333 0.285 0.280 0.333 0.650 0.526 0.120 0.227 0.500 0.315 1.000 14 ANEXO 5. Base de datos morfoagronómica de la colección de tomate de árbol (Cyphomandra betacea Sendt) ECU 3472 3473 3789 5546 5579 6690 12781 12782 12871 12872 12873 12874 12875 12876 12877 12878 12879 12880 12882 12883 12884 12885 12886 12887 12888 12889 12890 12891 12892 12893 12895 12897 12898 12894A 12894B 12896A 12896B d1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 118,50 2 2 1 7,51 4 2 94,00 3 1 1 4,76 4 2 80,00 1 1 1 8,50 4 2 107,57 2 2 1 9,81 4 2 103,50 2 2 1 9,00 4 2 122,80 3 2 1 8,55 4 2 82,75 2 2 1 7,25 4 2 98,20 1 1 1 7,95 4 2 107,33 1 1 1 9,01 4 2 118,56 2 2 1 10,10 4 2 102,36 1 2 1 8,42 4 2 109,06 2 2 1 8,26 4 2 103,80 2 3 1 6,67 4 2 117,36 2 2 1 9,56 4 2 117,76 2 2 1 9,24 4 2 114,22 1 2 1 9,64 4 2 116,16 2 2 1 9,81 4 2 100,66 3 2 1 7,88 4 2 84,16 1 1 1 8,01 4 2 96,62 2 2 1 9,96 4 2 96,50 2 2 1 8,58 4 2 110,14 1 2 1 9,52 4 2 105,01 2 2 1 7,83 4 2 100,66 1 2 1 8,72 4 2 101,57 1 2 1 7,87 4 2 119,16 2 2 1 9,20 4 2 89,05 1 1 1 8,64 4 2 123,33 1 2 1 10,16 4 2 105,09 2 2 1 9,46 4 2 113,75 2 2 1 8,21 4 2 102,86 1 2 1 9,06 4 2 115,16 1 2 1 10,50 4 2 106,00 1 2 1 7,78 4 2 122,50 2 2 1 8,87 4 2 113,50 2 2 1 9,48 4 2 116,75 1 2 1 8,65 4 2 84,20 2 2 1 6,44 4 2 d8 20,90 13,33 19,62 22,62 20,30 18,42 17,80 21,50 21,20 22,45 25,56 18,75 18,78 20,38 23,31 21,92 21,98 20,35 20,83 20,63 19,18 24,21 17,66 21,28 18,84 19,10 19,78 23,98 22,18 21,38 20,37 23,96 21,90 24,00 24,00 23,30 17,62 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d15 d16 d17 d18 d19 d20 d21 d22 d23 d24 16,47 2 2 2 2 7,10 1 10,55 2 2 3 40 27 3 2 5,72 9,53 3 2 3 3 5,83 1 9,33 2 2 3 11 7 2 2 5,46 15,98 3 2 3 3 6,00 1 10,71 2 2 3 44 27 1 1 4,77 15,95 3 2 3 3 5,57 1 10,28 2 2 3 41 25 3 1 6,07 15,25 3 2 3 3 6,12 1 10,87 2 2 3 34 23 3 2 5,48 14,04 3 2 3 3 6,00 1 10,57 2 2 3 35 24 2 2 5,42 13,87 3 2 3 3 5,18 1 10,87 2 2 3 33 22 1 1 5,10 15,95 2 2 2 2 5,31 1 10,50 2 2 3 31 20 2 2 6,13 18,06 3 2 3 3 6,08 1 10,25 1 2 3 33 25 3 2 6,60 18,73 3 2 3 3 5,41 1 10,33 2 2 3 42 28 3 2 7,25 17,21 3 2 3 3 6,12 1 9,87 2 2 3 42 18 2 2 6,35 16,01 3 2 3 3 5,55 1 11,11 2 2 3 29 22 2 2 5,74 14,64 2 2 2 2 4,85 1 9,28 2 2 3 32 18 3 2 6,61 18,12 3 2 3 3 5,54 1 11,27 2 2 3 39 25 3 2 7,02 18,93 3 2 3 3 5,50 1 11,77 2 2 3 50 33 3 2 7,27 19,31 2 2 2 2 6,05 1 11,33 2 2 3 46 33 2 2 7,03 18,98 3 2 3 3 5,41 1 9,25 2 2 3 40 25 3 2 7,17 16,05 3 2 3 3 6,00 1 11,33 2 2 3 27 16 3 1 5,10 16,83 3 2 3 3 5,00 1 9,50 2 3 3 37 25 3 2 7,41 17,26 3 2 3 3 5,87 1 9,75 2 2 3 28 19 3 2 5,56 16,85 3 2 3 3 6,00 1 10,16 2 2 3 33 23 2 2 5,96 19,54 3 2 3 3 5,85 1 11,14 2 2 3 37 27 2 2 7,37 15,55 3 2 3 3 5,50 1 11,00 2 2 3 29 22 3 1 6,00 17,28 3 2 3 3 5,00 1 10,77 2 2 3 30 18 3 2 5,95 17,11 3 2 3 3 5,42 1 11,00 1 2 3 38 26 3 2 6,58 17,68 3 2 3 3 4,66 1 10,33 2 2 3 36 26 3 1 6,33 15,29 3 2 3 3 5,22 1 10,18 2 2 3 24 16 2 2 6,44 21,51 3 2 3 3 5,83 1 11,66 1 2 3 45 31 3 2 7,86 19,11 2 2 2 2 5,55 1 8,40 2 2 3 40 24 2 2 7,37 18,51 3 2 3 3 5,75 1 11,12 1 2 3 42 29 3 2 6,33 16,56 3 2 3 3 5,72 1 9,36 1 2 3 27 16 2 2 6,45 20,50 2 2 2 2 6,08 1 11,16 2 2 3 49 32 3 1 5,83 18,90 3 2 3 3 5,60 1 11,40 2 2 3 41 30 3 2 7,96 21,25 3 2 3 3 5,62 1 11,25 2 2 3 41 28 3 2 7,25 19,82 2 2 2 2 5,60 1 11,40 2 2 3 38 25 3 2 7,48 19,35 3 2 3 3 6,00 1 11,50 1 2 3 48 33 3 2 8,05 13,34 2 2 2 2 5,20 1 10,40 1 2 3 24 17 3 2 5,82 14 Continuación Anexo 5… ECU 3472 3473 3789 5546 5579 6690 12781 12782 12871 12872 12873 12874 12875 12876 12877 12878 12879 12880 12882 12883 12884 12885 12886 12887 12888 12889 12890 12891 12892 12893 12895 12897 12898 12894A 12894B 12896A 12896B d25 4,62 4,06 4,64 4,94 4,33 4,40 4,80 4,81 4,96 5,23 4,55 4,50 4,78 5,43 5,51 5,24 5,64 4,01 5,28 4,41 4,46 5,64 4,83 4,85 5,28 5,20 4,72 5,56 5,05 5,07 4,74 4,53 5,10 5,62 5,42 5,90 4,70 d26 d27 d28 3,50 4 2 3,13 2 1 3,54 2 1 3,34 2 1 3,11 2 1 2,94 2 1 3,55 2 1 3,53 4 2 3,50 3 1 3,98 3 1 3,33 2 1 3,26 2 1 3,55 4 2 3,70 3 1 4,11 3 1 4,06 3 1 4,08 3 1 2,81 2 1 4,23 3 1 3,12 3 1 3,03 3 1 4,11 3 1 3,43 3 2 3,61 3 1 3,98 3 1 3,86 3 1 3,26 2 1 4,28 3 1 4,06 3 1 3,80 3 1 3,52 2 1 3,15 4 2 3,82 3 1 4,27 3 1 4,20 3 1 4,25 5 1 3,52 5 1 d29 d30 d31 d32 d33 d34 d35 d36 d37 d38 d39 d40 d41 d42 d43 d44 d45 d46 d47 d48 2 2 3,97 2 1 5 3 24 298 4,10 3,50 4 177,33 204 59 407 1 2 2 1 2 2 3,66 2 1 3 3 4 183 4,16 3,50 3 139,66 204 59 407 2 2 2 2 2 2 4,64 2 1 3 2 25 185 3,92 3,61 3 160,35 203 59 407 2 2 2 1 2 2 4,50 2 1 3 2 23 206 4,07 3,58 3 201,85 203 59 407 2 2 2 3 2 2 4,25 2 1 3 2 21 259 3,87 3,46 3 174,62 215 62 434 1 2 2 3 2 2 3,78 3 1 3 2 22 171 4,14 3,57 2 208,85 230 66 434 1 2 2 3 2 2 4,31 3 1 3 2 20 211 4,03 3,52 2 163,62 227 66 424 2 2 2 2 2 2 5,32 2 1 5 2 17 283 4,03 3,68 4 180,68 220 64 407 1 2 2 3 2 1 5,50 2 1 2 3 22 270 4,34 3,68 2 175,83 236 55 404 1 2 2 2 2 2 6,58 2 1 3 3 25 306 4,05 3,57 2 194,16 252 57 450 2 3 2 1 2 3 5,06 2 1 4 2 16 155 4,25 3,84 2 175,87 248 57 433 2 2 2 2 2 2 4,66 3 1 3 1 21 164 3,90 3,55 2 183,11 236 55 437 1 2 2 3 2 3 5,00 3 1 5 3 16 266 3,85 3,54 4 149,28 235 54 390 1 2 2 1 2 2 6,00 2 1 3 3 22 304 3,74 3,23 2 181,63 235 54 409 1 2 2 1 2 2 7,44 1 1 3 3 30 367 4,00 3,55 2 186,11 243 55 448 2 3 2 1 2 2 6,55 2 1 5 4 29 309 3,82 3,31 4 189,00 198 57 494 1 2 2 2 2 1 6,62 2 1 2 3 21 286 4,01 3,57 2 183,00 235 54 399 2 2 2 1 2 2 4,75 3 1 3 2 14 250 3,59 3,35 2 170,83 236 55 434 1 2 2 3 2 2 3,75 2 1 2 3 22 272 4,47 3,81 2 137,00 197 69 390 2 2 2 1 2 2 3,87 2 1 3 3 16 219 3,96 3,36 2 176,12 235 54 421 2 2 2 3 2 2 4,33 2 1 3 2 21 274 3,98 3,25 2 172,00 236 55 391 3 2 2 3 2 2 5,92 2 1 3 4 22 312 4,22 3,67 2 179,00 242 54 404 2 2 2 1 2 2 3,08 3 1 3 3 19 276 3,93 3,25 2 172,83 236 55 409 1 2 2 2 2 2 4,50 2 1 3 2 14 260 4,11 3,53 2 170,33 198 69 391 2 2 2 2 2 2 6,28 1 1 3 2 23 226 3,66 3,06 2 184,57 236 55 406 3 2 2 2 2 2 4,91 3 1 3 4 21 297 3,85 3,09 2 189,66 236 55 434 2 2 2 2 2 2 4,95 2 1 3 1 14 198 4,33 3,89 2 164,63 235 54 390 1 3 2 1 2 2 7,91 1 1 3 3 29 333 4,00 3,57 2 212,16 240 56 446 2 2 2 2 2 2 6,70 2 1 5 4 21 347 3,91 3,28 4 181,30 260 58 466 1 3 2 1 2 1 6,42 2 1 2 3 26 241 3,55 3,12 2 167,25 226 41 382 2 2 2 1 2 2 4,72 2 1 3 4 12 164 3,96 3,38 2 170,18 235 31 403 1 2 2 2 2 3 4,66 3 1 5 4 28 216 3,79 3,05 4 193,00 226 57 391 2 2 2 2 2 1 6,40 2 1 2 4 26 293 3,80 3,36 2 172,60 261 59 442 2 2 2 1 2 2 6,62 2 1 3 5 23 340 3,96 3,62 2 183,87 241 49 426 2 2 2 1 2 2 7,10 2 1 5 4 22 326 3,82 3,29 4 177,16 240 55 445 2 2 2 1 2 4 6,00 2 1 6 3 30 326 5,00 4,25 5 212,50 235 54 390 1 2 2 1 2 1 6,30 2 2 5 3 14 274 4,13 3,62 4 131,00 235 54 441 1 2 2 1 14 ANEXO 6 Entradas del Grupo 1 y el registro de sus estados para los caracteres cualitativos de mayor poder discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Color lámina foliar Color nervadura Color brotes apicales Color primario epidermis del fruto Color del mucílago adherido a la semilla Color de la semilla ECU-6690 ECU-12874 ECU-12781 ECU-18880 Carchi Carchi Azuay Imbabura A A A A 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 2 ECU-12883 ECU-12884 ECU-12887 ECU-12886 ECU-12889 Loja Loja Azuay Azuay Azuay B B B B B 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 ECU-5546 ECU-5579 ECU-3789 Tungurahua Loja Pichincha C C C 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 ECU-12890 ECU-12895 ECU-12873 ECU-3473 Azuay Chimborazo Carchi Cañar D D D D 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 2 3 14 ANEXO 7 Entradas del Grupo 2 y el registro de sus estados para los caracteres cualitativos de mayor poder discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Color lámina foliar Color nervadura Color brotes apicales Color primario epidermis del fruto Color del mucílago adherido a la semilla Color de la semilla ECU-12879 ECU-12898 ECU-12893 ECU-12871 ECU-12896A ECU-12882 Imbabura Tungurahua Tungurahua Imbabura Tungurahua Imbabura A A A A A A 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 3 2 2 2 2 6 2 2 2 2 2 5 2 ECU-12872 ECU-12877 ECU-12876 ECU-12894A ECU-12885 ECU-12888 ECU-12891 Carchi Imbabura Imbabura Tungurahua Loja Azuay Tungurahua B B B B B B B 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 14 ANEXO 8 Entradas del Grupo 3 y el registro de sus estados para los caracteres cualitativos de mayor poder discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Color lámina foliar Color nervadura Color brotes apicales Color primario epidermis del fruto Color del mucílago adherido a la semilla Color de la semilla ECU-3242 ECU-12782 ECU-12875 ECU-12897 Cañar Azuay Carchi Tungurahua A A A A 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 4 4 5 5 5 5 4 4 4 4 ECU-12892 ECU-12894B ECU-12878 ECU-12896B Tungurahua Tungurahua Imbabura Tungurahua B B B B 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 5 5 5 5 5 4 4 4 4 15 ANEXO 9 Entradas del Grupo 1 y su promedio para los caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Tamaño eje longitudinal del fruto Tamaño eje transversal mayor del fruto Tamaño eje transversal menor del fruto ECU-6690 ECU-12874 ECU-12781 ECU-18880 Carchi Carchi Azuay Imbabura A A A A 5,42 5,74 5,10 5,10 4,40 4,50 4,80 4,01 2,94 3,26 3,55 2,81 ECU-12883 ECU-12884 ECU-12887 ECU-12886 ECU-12889 Loja Loja Azuay Azuay Azuay B B B B B 5,56 5,96 5,95 6,00 6,33 4,41 4,46 4,85 4,83 5,20 3,12 3,03 3,61 3,43 3,86 ECU-5546 ECU-5579 ECU-3789 Tungurahua Loja Pichincha C C C 6,07 5,48 4,77 4,94 4,33 4,64 3,34 3,11 3,54 ECU-12890 ECU-12895 ECU-12873 ECU-3473 Azuay Chimborazo Carchi Cañar D D D D 6,44 6,45 6,35 5,46 4,72 4,74 4,55 4,06 3,26 3,52 3,33 3,13 15 ANEXO 10 Entradas del Grupo 2 y su promedio para los caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Tamaño eje longitudinal del fruto Tamaño eje transversal mayor del fruto Tamaño eje transversal menor del fruto ECU-12879 ECU-12898 ECU-12893 ECU-12871 ECU-12896A ECU-12882 Imbabura Tungurahua Tungurahua Imbabura Tungurahua Imbabura A A A A A A 7,17 7,96 6,36 6,60 8,05 7,41 5,64 5,10 5,07 4,96 5,90 5,28 4,08 3,82 3,80 3,50 4,25 4,23 ECU-12872 ECU-12877 ECU-12876 ECU-12894A ECU-12885 ECU-12888 ECU-12891 Carchi Imbabura Imbabura Tungurahua Loja Azuay Tungurahua B B B B B B B 7,25 7,27 7,02 7,25 7,37 6,58 7,88 5,23 5,51 5,43 5,62 5,64 5,28 5,56 3,98 4,11 3,70 4,27 4,11 3,98 4,28 15 ANEXO 11 Entradas del Grupo 3 y su promedio para los caracteres cuantitativos de mayor valor discriminante. ENTRADA SUBGRUPO Tamaño eje longitudinal del fruto Tamaño eje transversal mayor del fruto Tamaño eje transversal menor del fruto ECU-3242 ECU-12782 ECU-12875 ECU-12897 Cañar Azuay Carchi Tungurahua A A A A 5,72 6,13 6,61 5,83 4,62 4,81 4,78 4,53 3,50 3,53 3,55 3,15 ECU-12892 ECU-12894B ECU-12878 ECU-12896B Tungurahua Tungurahua Imbabura Tungurahua B B B B 7,37 7,48 7,03 5,82 5,05 5,42 5,24 4,70 4,06 4,20 4,06 3,52 15