Anti-Transglutaminasa tisular IgG BINDAZYMETM Kit de

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•
INSTRUCCIONES DE USO
Anti-Transglutaminasa tisular IgG BINDAZYMETM
Kit de Enzimoinmunoensayo
MK019
Kit para diagnóstico in vitro únicamente
The Binding Site sucursal en España,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
e-mail: [email protected]
web: www.bindingsite.es
1
UTILIZACIÓN
Este kit está preparado para la medición in vitro de anticuerpos antitransglutaminasa tisular (tTG) IgG específicos presentes en el suero humano,
como ayuda en el diagnóstico de la enfermedad celíaca.
Se suministra material suficiente para analizar un máximo de 41 muestras por
duplicado o bien 89 en un único ensayo, con una curva de calibración y 2
controles.
2
INFORMACIÓN GENERAL
La enfermedad celíaca se caracteriza por una intolerancia al gluten que
conduce a un desorden crónico de malabsorción debido a la inflamación de la
mucosa intestinal y a que el epitelio intestinal se vuelve plano1.
Los criterios revisados para el diagnóstico de la enfermedad celíaca, según la
ESPGAN (European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition)
1990, requieren la identificación de una biopsia intestinal positiva junto con la
presencia de al menos dos de los siguientes anticuerpos IgA: anticuerpos antiendomisio IgA3, anticuerpos anti-gliadina IgA e IgG4 y anticuerpos antireticulina.
INHIBIDOR
CONCENTRACIÓN
Kathon
Azida sódica
ProClin™ 300
Bromonitrodioxano
Metilisotiazona
0.02%
0.099%
0.045%
0.002%
0.002%
ProClin™ es marca registrada de of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
Spanish
Producto fabricado por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
cabo dichos procedimientos.
La azida sódica puede provocar la formación de azidas explosivas en contacto
con el cobre y plomo de los desagües. Al eliminar los reactivos dejar correr
abundantes cantidades de agua para evitar la formación de dichos compuestos.
Los tampones y suero suministrado con este kit contienen diversos inhibidores
enzimáticos, como se indica a continuación. Deben manipularse con precaución.
•
Kathon es irritante y puede causar sensibilización por contacto con la piel.
La solución de parada contiene ácido fosfórico 3M, que es irritante. Evite el
contacto con la piel y los ojos para evitar quemaduras.
Derrames de reactivo deben limpiarse adecuadamente, según las normativas
locales y medioambientales.
4.2 ADVERTENCIAS
• Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente
entrenadas.
• Se recomienda seguir el protocolo de forma estricta. Cualquier desviación puede
afectar a la funcionalidad de este ensayo y a los resultados obtenidos. Ponga
especial atención a los avisos y “Notas” que encontrará en estas instrucciones
de uso.
• NO se pueden intercambiar calibradores, controles, conjugados y placas de
distintos lotes. La sustitución de estos componentes con lotes que difieran de
los incluidos en el kit puede conducir a resultados inconsistentes e imprecisos.
Deben tomarse todas las tiras del mismo envoltorio..
• Utilice únicamente material plástico o de vidrio limpio para evitar la
contaminación de los reactivos. Nunca devuelva reactivos no utilizados a los
viales.
• No deje viales de reactivo abiertos; cualquier posible contaminación o
evaporación dará resultados inconsistentes.
• El sustrato TMB no debe ser expuesto a la luz o al agua.
• Muestras hemolizadas, lipémicas, con material particulado o contaminación
microbiana no deben ser utilizadas.
• No se puede comprobar una posible dilución de muestra incorrecta ya que los
controles están listos para su uso. Se recomienda la utilización de pipetas
calibradas y muestras CQ internas apropiadas.
• La utilización de sistemas automáticos, dilutores de muestra u otro equipo
automatizado puede llevar a diferencias en los resultados cuando se compara
con el procedimiento manual. Cada laboratorio es responsable de validar el
sistema completo y asegurar que los resultados entran dentro de los límites
indicados en esta hoja de instrucciones y el certificado QC asociado.
• Todo el equipamiento ha de ser calibrado y mantenido según las instrucciones
del fabricante.
4.3 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Diversos estudios demuestran que el ensayo anti-endomisio IgA tiene una
especificidad superior al 99% para enfermedad celíaca y una sensibilidad
superior a los ensayos de anticuerpos anti-gliadina y anti-reticulina5,6. Es
importante incluir un ensayo para anticuerpos IgG ya que es común la
deficiencia de IgA entre los pacientes celíacos, lo que puede provocar la
aparición de resultados falsos negativos en individuos con biopsia intestinal
confirmada7,8.
La utilización de transglutaminasa tisular recombinante como fuente de
antígeno se revisa en las referencias 9 y 10, y la evaluación de
transglutaminasa tisular como antígeno de elección se revisa en las
referencias 11 y 12.
3
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Los pocillos se encuentran sensibilizados con transglutaminasa tisular
recombinante tTG. El antígeno ha sido expresado en células de Baculovirus a
partir de un ADN complementario que codifica para una isoforma larga de la tTG
humana.
Los calibradores, controles y muestras diluidas de pacientes se añaden a los
pocillos y los autoanticuerpos que reconocen el antígeno tTG se unen durante la
primera incubación. Tras el lavado de los pocillos para eliminar las proteínas no
unidas, se añade un conjugado de conejo purificado anti-IgG (específico de
cadena γ) humana marcado con peroxidasa. El conjugado se une al anticuerpo
humano capturado y el exceso de conjugado no unido se elimina mediante un
lavado posterior.
El conjugado unido se visualiza con el sustrato 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina
(TMB) que da un producto de color azul cuya intensidad es proporcional a la
concentración de anticuerpo en la muestra. Se añade ácido fosfórico a cada
pocillo para parar la reacción, lo que produce un color amarillo final que se lee a
450 nm.
4
PRECAUCIONES
4.1 AVISOS
• Todos los donantes de suero humano suministrado en este kit han sido
analizados para la presencia de HBsAg, HIV1 y HIV2 y HCV, con resultados
negativos. De todos modos dichos ensayos no pueden asegurar la ausencia de
dichos agentes infecciosos, por tanto deben establecerse procedimientos
adecuados para la manipulación y eliminación de material potencialmente
infeccioso, y únicamente personal con entrenamiento adecuado debe llevar a
•
•
•
5
•
•
•
•
6
El kit debe conservarse a 2-8ºC y no debe congelarse. Temperaturas de
conservación no adecuadas afectarán a los resultados.
El tampón de lavado diluido puede conservarse a 2-8ºC durante un máximo de
4 semanas y puede utilizarse directamente de la nevera sin que las
características del ensayo se vean afectadas.
La fecha de caducidad de este kit se muestra en la etiqueta exterior.
OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las muestras de sangre se han de obtener por venopunción, dejar que
coagule de modo natural y separar el suero.
El suero puede conservarse a 2-8ºC hasta 7 horas antes del ensayo13, o para
periodos superiores, ha de alicuotarse y conservarse a -20ºC.
Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.
Las muestras de suero no deben ser inactivadas por calor ya que esto puede
ocasionar resultados falsos positivos.
MATERIALES
6.1 MATERIAL SUMINISTRADO
•
Hoja de instrucciones: Indica todos los detalles del ensayo.
•
Certificado QC: Indica la funcionalidad esperada del lote.
•
Pocillos sensibilizados con Transglutaminasa humana: 12 tiras de 8
pocillos separables, sensibilizados con tTG recombinante. La placa se
suministra en una bolsa que puede volver a cerrarse y que contiene dos bolsas
de desecante.
•
Diluyente de muestra tipo lll: 2 botellas con 50mL de tampón para dilución
de la muestra. Listo para uso. Coloreado en amarillo.
•
Tampón de lavado tipo lll: 1 botella con 50mL de tampón concentrado 20 x
para el lavado de los pocillos.
•
Calibradores de Transglutaminasa IgG: 5 viales cada uno con 1mL de suero
humano diluido, con las siguientes concentraciones de autoanticuerpo antitTG: 100, 33, 11.1, 3.7, 1.23 U/mL. Listo para uso.
•
Control positivo Transglutaminasa IgG: 1 vial con 1mL de suero humano
diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso.
•
Control negativo Transglutaminasa IgG: 1 vial con 1mL de suero humano
diluido. El valor esperado se indica en el certificado QC. Listo para uso.
Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 1 of 4
•
Conjugado Transglutaminasa IgG: 1 vial con 12 mL de anticuerpo humano
purificado IgG marcado con peroxidasa. Color rojo. Listo para uso.
4.
Lavado
Repita el paso 2.
•
SustratoTMB: 1 botella con 14mL de sustrato TMB. Listo para uso.
5.
•
Solución de parada: 1 botella con 14 mL de ácido fosfórico 3M. Listo para
uso.
Adición del sustrato (TMB)
Dispense 100µL de sustrato TMB en cada pocillo, seque la parte superior de
los pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: Nunca devuelva cantidades sobrantes de TMB a la botella de reactivo,
para evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
6.
Parada
Dispense 100µL de solución de parada en cada pocillo. De este modo se
produce un cambio de color de azul a amarillo.
7.
Medición de la densidad óptica
Lea la densidad óptica (OD) de cada pocillo a 450nm en un lector de
microplacas, dentro de los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción.
6.2 MATERIAL ADICIONAL Y EQUIPO NO SUMINISTRADO
•
•
•
•
•
•
7
Lavador automático de microplacas: Su uso es recomendable, aunque las
placas pueden lavarse manualmente.
Lector de microplacas: Capaz de medir densidades ópticas a 450nm en
referencia al aire.
Agua destilada o desionizada: Ha de ser de la calidad más alta disponible.
Micropipetas calibradas: Para dispensar 1000, 100 y 10µL.
Pipeta multicanal: Recomendada para dispensar volúmenes de 100µL de
conjugado, solución sustrato y solución de parada.
Tubos de vidrio/plástico: Para dilución de la muestra.
METODOLOGÍA DE ENSAYO
7.1 PASOS PRE-ENSAYO
1.
•
•
Lleve el kit a temperatura ambiente
Los kits están diseñados para su uso a temperatura ambiente (20-24°C).
Retire el kit de la cámara frigorífica y déjelo a temperatura ambiente durante
aproximadamente 60 minutos. Los pocillos no deben sacarse de su envoltorio
hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente.
NOTA: los kits pueden mantenerse a temperatura ambiente hasta una
semana.
2.
Componentes del kit
Mezcle cuidadosamente cada componente del kit antes de su uso.
3.
Dilución del tampón de lavado
Añada 50mL del tampón de lavado concentrado a 950mL de agua destilada
(dilución 1 a 20) en un recipiente limpio y mezcle.
NOTA: El tampón de lavado diluido puede conservarse hasta 4 semanas a
2-8ºC, por tanto diluya únicamente la cantidad necesaria. Si el tampón muestra
signos de contaminación microbiana o se vuelve turbio, elimínelo y prepare
solución fresca.
4.
5.
Dilución de la muestra
Diluya 10µL de cada muestra con 1000µL de diluyente de muestra (1:100) y
mezcle bien. NOTA: La muestra diluida debe utilizarse dentro de las 8 horas
siguientes a la dilución.
Manipulación de tira y marco
Coloque el número de pocillos necesarios en el soporte de las tiras. Posicione
a partir del pocillo A1, rellenando las columnas de izquierda a derecha a través
de la placa. Cuando manipule la placa, apriete los bordes largos del marco
para evitar que los pocillos caigan fuera.
NOTA: Vuelva a colocar inmediatamente los pocillos no utilizados en su
envoltorio junto a las dos bolsitas de desecante, y séllelo fuertemente para
minimizar su exposición a la humedad.
Tenga cuidado de no perforar o rasgar el envoltorio, ver más abajo.
ATENCIÓN: La exposición de los pocillos a la humedad o a
contaminación por polvo u otro material particulado provocará la
degradación del antígeno, dando como resultado una precisión pobre del
método y potencialmente resultados falsos.
8
1.
•
•
•
Cálculo de densidades ópticas medias (Solo para ensayos que se lleven a
cabo en duplicado)
Calcule la media de DO de las lecturas duplicadas para cada calibrador,
control y muestra. El %CV para cada duplicado de DO ha de ser inferior al
15%.
3.
Trazado de la curva de calibración
Se puede trazar la curva de calibración de modo manual o automático, con los
valores de concentración de autoanticuerpo anti-tTG IgG en la escala log
frente a la DO en la escala lineal, para cada calibrador:
Automático – utilice un software adecuado y validado y el ajuste de curva que
mejor se adapte a los datos.
Manual – utilice papel gráfico log/lineal y dibuje una curva suave a través de
los puntos (no una línea recta o punto a punto).
•
•
4.
Tratamiento de puntos anómalos
Si alguno de los puntos no entra en la curva, puede eliminarse. Si la ausencia
de dicho punto implica que la forma de la curva es distinta a la curva de
calibración de muestra, o más de un punto parece ser anómalo, el ensayo
debe repetirse.
5.
Cálculo de los valores de control
Lea el nivel de autoanticuerpo anti-tTG IgG de la curva de calibración. El valor
debe entrar dentro del rango indicado en el certificado QC.
6.
Cálculo del nivel de autoanticuerpo en las muestras diluidas
Lea el nivel de autoanticuerpo anti-tTG IgG en las muestras diluidas
directamente de la curva de calibración.
Nota: Los valores de calibrador han sido ajustados en un factor de 100 para
tener en cuenta la dilución de la muestra 1:100. Por tanto, no hace falta
ninguna corrección posterior.
7.
Calibración del ensayo
El ensayo se encuentra calibrado en U/mL frente a un calibrador de referencia
arbitrario, ya que no existe en la actualidad una preparación de referencia
reconocida internacionalmente.
8.
•
Limitaciones
Este kit se utiliza únicamente como ayuda en el diagnóstico. Un resultado
positivo sugiere la presencia de ciertas enfermedades, que deben confirmarse
mediante otros resultados serológicos y la historia clínica del paciente.
Los resultados de este ensayo no son una prueba diagnóstica de la presencia
o ausencia de enfermedad.
No se ha establecido el uso de este ensayo y el rango normal (interpretación
de resultados) para muestras pediátricas.
Un resultado negativo no descarta la enfermedad celíaca y las muestras deben
ensayarse también para anti-tTG tipo IgA.
Mantenga la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso.
2.
Adición de la muestra
Dispense 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida (1:100) en los
pocillos adecuados de la placa.
Nota: Las muestras deben añadirse lo más rápidamente posible a la placa
para minimizar la deriva del ensayo, y conectar el timer tras la adición de la
última muestra.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lavado
El procedimiento de lavado es crítico y requiere una atención especial. Un
lavado inadecuado de la placa dará resultados inexactos, con una precisión
pobre y fondos elevados.
Tras la incubación retire la placa y lave 3 veces con 250-350µL de tampón de
lavado por pocillo. Puede lavar la placa con un lavador de placas automático o
manualmente como se indica a continuación. Después del último lavado
automático, invierta la placa y golpee los pocillos sobre papel secante.
Las placas pueden lavarse de modo manual como sigue:
a.
Sacuda el contenido de la placa en un fregadero
b.
Golpee los pocillos sobre papel secante
c.
Pipetee 250-350µL de tampón de lavado en cada pocillo con una
pipeta multicanal
d.
Agite la placa suavemente en una superficie plana
e.
Repita a-d dos veces.
f.
Repita a y b.
3.
Control de calidad
Para que un ensayo sea válido se han de cumplir los siguientes requisitos:
Se han de incluir calibradores y controles positivo y negativo en cada ensayo.
El valor obtenido para el control positivo y negativo ha de entrar en el rango
especificado en el certificado QC.
La forma de la curva ha de ser similar a la curva de calibración que se muestra
en el certificado QC.
Si estos requisitos no se cumplen el ensayo no es válido y debe
repetirse.
2.
7.2 METODOLOGÍA DE ENSAYO
1.
RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
•
•
•
9
VALORES ESPERADOS
Se determinó el rango normal a partir de sueros de 200 donantes de sangre
adultos normales. Estos rangos se indican únicamente como una guía. Los
ensayos ELISA son muy sensibles y capaces de detectar pequeñas
diferencias en muestras de poblaciones. Por tanto es recomendable que cada
laboratorio determine sus propios rangos de normalidad, basado en la
población, técnicas y equipo utilizado.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Negativo
<6 U/mL
Positivo débil
6 - 9 U/mL
Positivo
>9 U/mL
Adición del conjugado
Dispense 100µL de conjugado en cada pocillo, seque la parte superior de los
pocillos con un pañuelo de papel para eliminar salpicaduras.
Nota: No devuelva cantidades que sobren de conjugado al vial original del
reactivo, con el fin de evitar su contaminación.
Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 2 of 4
10
CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO
10.1
10.6
PRECISIÓN
Se añadió una serie de sustancias interferentes a muestras anti-tTG IgG
negativas y positivas, y se analizaron posteriormente. El método utilizado para
comprobar dichas sustancias se basó en el kit Interference Check A plus Kokusai Shiyaku, Japón.
Se midió la precisión intra-ensayo utilizando 6 muestras en el rango de la
curva de calibración. Se muestra a continuación el %CV para cada una:
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
Concentración (U/mL)
4,5
7,5
13,5
21,9
29,3
87,9
n=20
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
% CV
5,7
5,3
5,2
3,5
4,3
5,2
Se midió la precisión inter-ensayo utilizando 6 muestras ensayadas en
duplicado seis veces durante tres días. El %CV para cada muestra se indica a
continuación:
PRECISIÓN INTER-ENSAYO
Concentración (U/mL)
4,3
7,8
14,4
23,7
31,9
82,2
n=6
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
10.2
% CV
10,1
8,8
6,9
11,0
7,6
9,3
10.7
RANGO DE MEDIDA
10.4
10.8
2.
tTG IgG normal sample distribution
3.
4.
5.
6.
No. of samples
200
150
7.
100
8.
50
9.
0
<1.23
1.23 - 1.9
1.9 - 3.0
3.1 - 4.0
tTG IgG U/mL
10.
11.
Además, se ensayaron 40 muestras de pacientes con enfermedad de Crohn (n=21)
y colitis ulcerosa (n=19). Todos fueron negativos para autoanticuerpos anti-tTG IgG.
10.5
ESPECIFICIDAD, SENSIBILIDAD Y CORRELACIÓN RELATIVA
La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente al
resultado de la biopsia, utilizando 35 sueros de pacientes de enfermedad
celíaca.
Biopsia
+
BINDAZYME
+
26
2a
b
Anti-IgG tTG EIA
0
7
Sensibilidad relativa
78.8%
Correlación relativa
74.3%
a.
b.
1 de 2 se clasificaron como positivo débil.
2/7 también negativos para IFA endomisio, 5/7 fueron negativos en un
kit ELISA alternativo.
La especificidad, sensibilidad y correlación relativa se determinaron frente a los
ensayos anti-IgA y anti-IgG utilizando 56 muestras de biopsia de celíacos
confirmados y de muestras de donantes de sangre normales.
BINDAZYME
Anti-IgG tTG EIA
Sensibilidad relativa
Especificidad relativa
Correlación relativa
+
-
BINDAZYME
Anti-IgA tTG EIA
+
31
2a
b
14
9
77.5%
87.5%
80.4%
a.
Positivo IgG, negativo IgA, una muestra fue de un paciente con
deficiencia de IgA conocida, el estatus IgA de la otra muestra era desconocido.
La utilización del ensayo tTG IgG permite la detección de estas muestras.
b.
8/9 muestras fueron positivos fuertes IgA tTG y 1/9 fue positiva débil,
confirmando que una proporción de pacientes solo produce anticuerpos IgA.
19.3mg/dL
Bilirrubina C (Conjugada)
19.9mg/dL
Hemoglobina Hemolizada
485mg/dL
Quilo
1550 Unidades
Factor reumatoide
45 UI/mL
LINEARIDAD DEL ENSAYO
ESTUDIOS DE PROZONA
Para estudiar un posible efecto prozona se diluyeron tres muestras positivas
1:6.25 (dilución normal 1:100) en diluyente de muestra. No se observaron
resultados falsos negativos a las diluciones de muestra inferiores, por lo que
no se observó efecto prozona.
11
RANGO NORMAL
Se ensayaron autoanticuerpos anti-tTG IgG en suero de 200 donantes de
sangre adultos normales. En base a la guía de interpretación de resultados,
0/200 fueron positivos para autoanticuerpos anti-tTG IgG.
Concentración
Se ensayo la linearidad con tres muestras distribuidas en el rango de
calibración. El coeficiente de regresión R2 fue superior a 0.995 comparando el
valor observado con el esperado en U/mL, con una recuperación media del
92%.
1.
El rango de medida del ensayo es 1,23 - 100 U/mL.
Sustancia
Bilirrubina L (Libre)
No se observaron interferencias en ninguna de las muestras ensayadas.
SENSIBILIDAD ANALÍTICA
La sensibilidad del ensayo es de 1,23 U/mL se confirmó ensayando dos
muestras en múltiples replicados con valores 1.4 y 2.2 veces el punto inferior
de calibración (1,23 U/mL). El análisis estadístico con la t de Student confirmó
que dichas muestras eran significativamente diferentes una de otra (p<0.0001).
10.3
SUSTANCIAS INTERFERENTES
12.
13.
REFERENCIAS
Trier, JS. Celiac Sprue. The New England Journal of Medicine 1991; 24: 17091719.
Walker Smith J A et al. Revised criteria for the diagnosis of celiac disease:
Report of working group of European Society of Pediatric Gastroenterology and
Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood. 1990; 65: 909-911.
Valdermarsson T et al. Is small bowel biopsy necessary in adults with
suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive
predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science.
1996; 41:83-87.
Bürgin-Wolff et al. Antigliadin and antiendomysium antibody determination for
coeliac disease. Archives of Disease in Childhood 1991; 66: 941-947
Volta U et al. IgA anti-endomysial antibody test: A step forward in celiac
disease screening. Digestive Diseases and Science. 1991; 36:752-756.
Grodzinsky E. Hed J, Skogh T. IgA anti-endomysial antibodies have a high
predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy. 1994;
49:593-597.
Collin P et al. Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand J.
Gastroenterol 1992; 27(5), 367-371.
Cataldo F. et al. IgG1 antiendomysium and IgG anti-tissue Transglutaminase
(anti-tTG) antibodies in coeliac patients with selective IgA deficiency. Gut.
2000; 47:366-369.
Sulkane S et al. Tissue Transglutaminase Autoantibody Enzyme linked
Immunosorbent Assay in detecting Celiac Disease. Gastroenterology. 1998;
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Sollid LM and Scott H. New tool to predict Celiac Disease on its Way to the
Clinics. Gastroenterology. 1998; 115:1584-1594.
Dieterich W et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of
Celiac Disease. Nature Medicine. 1997; 3:797-801.
Dieterich W et al. Autoantibodies to Tissue Transglutaminase as Predictors of
Celiac Disease. Gastroenterology. 1998; 115:1317-1321.
Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A
Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
12
PLANTILLA DE PLACA
Vea la parte posterior de la hoja de instrucciones.
Resumen del procedimiento
1.
Añada 100µL de cada calibrador, control y muestra diluida 1:100 en los
pocillos correspondientes.
Incube durante 30 minutos.
Lave.
2.
Añada100µL de conjugado a cada pocillo.
Incube durante 30 minutos.
Lave.
3.
Añada 100µL de sustrato a cada pocillo.
Incube durante 30 minutos.
4.
Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo.
Mida la absorbancia a 450 nm.
BINDAZYME™ es marca registrada de
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P.O. Box 11712, Birmingham
B14 4ZB. England
Insert Code: E019.E, Version: 5 December 2006, Page 3 of 4
Plantilla de placa
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2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
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