Factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp aisladas de

Rodriguez LEC, et al • Factores de virulencia en cepas de Aenomonas spp...
artículo original/artigo original
Factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp
aisladas de pacientes con bacteriemia
Virulence factors in strains of Aeromonas sp isolated of
patients with bacteremia
Luis Enrique Cabrera Rodríguez1
Laura Bravo Fariñas2
Maria Margarita Ramírez2
Alina Llop Hernández2
Anabel Fernández Abreu2
Luis Morier2
Graciela Borrego3
Laboratorio de Microbiología Clínica. Centro
Municipal de Higiene y Epidemiología de Güi­
nes, Ciudad de la Habana, Cuba.
2
Laboratorio Nacional de Referencia de En­
fermedades Diarreicas Agudas. Instituto de
Medicina Tropical “Pedro Kourí”, Ciudad de la
Habana, Cuba.
3
Holguín. Laboratorio de Microbiología Clínica.
Centro Provincial de Higiene y Epidemiología
de Holguín, Ciudad de la Habana, Cuba.
1
Rev Panam Infectol 2007;9(4):19-23
Conflicto de intereses: ninguno
Recibido en 20/4/2007.
Aceptado para publicación en 26/6/2007.
Resumen
Los microorganismos incluidos dentro del género Aeromonas
se aíslan cada vez más frecuentemente en infecciones extraintestinales. En el período comprendido de enero del 2005 hasta
diciembre del 2006, se estudiaron en el Laboratorio Nacional de
Referencia de Enfermedades Diarreicas Agudas del Instituto de
Medicina Tropical “Pedro Kourí” 44 cepas pertenecientes al género Aeromonas, aisladas de muestras de sangre, procedentes de
5 Centros Provinciales de Higiene, Epidemiología y Microbiología
del país. En la totalidad de las cepas se realizó la identificación
en especies y la determinación de la presencia de algunos factores de virulencia como: la producción de enzimas extracelulares
(DNasa, gelatinasa, elastasa, lecitinasa y hemolisina), citotoxicidad en células Vero y presencia de fimbrias. Se identificaron 5
especies, resultando Aeromonas jandaei la especie aislada con
mayor frecuencia. Todas las cepas presentaron al menos un factor
de virulencia de los investigados.
Palabras clave: Bacteriemia, Aeromonas, factores de virulencia.
Abstract
The microorganisms pertaining genus Aeromonas isolated more
and more frequently in the extraintestinal infection. In the period
at from January 2005 to December 2006, have been studied in the
National Reference Laboratory for Acute Diarrhoeal Diseases of the
“Pedro Kourí” Tropical Medicine Institute 44 strains pertaining to
the genus Aeromonas isolated of samples of blood sent by 5 provincial microbiology laboratories of the country. In the total strains
was made the identification in species and the determination of the
presence of some virulence factors like the extracelular production
of enzyme (lecithinase, gelatinase, Dnase, elastase and hemolisin)
citotoxity in Vero cells and fimbria presence. Five species have been
identify, Aeromonas jandaei was the specie most frequently found.
Every strains showed at least one of the virulence factor of the ones
that were investigated.
Key words: Aeromonas, virulence factors, bacteremia.
Introducción
Los microorganismos miembros del género Aeromonas son ba-
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cilos Gram negativos, anaerobios facultativos, oxidasa
positiva, pertenecientes a la familia Aeromonadaceae.(1)
Los mismos tienen una distribución mundial y se han
aislado e identificado en humanos, animales, agua y
alimentos.(2)
La diarrea es la afección clínica que con mayor
frecuencia producen las especies del género Aero­
monas. En individuos sanos o con factores predisponentes como Diabetes Mellitus, Inmunodepresión,
Neoplasias, entre otros, estos microorganismos
pueden pasar al torrente sanguíneo, produciendo
bacteriemias y procesos infecciosos en diferentes
órganos y sistemas, por ejemplo: meningoencefalitis, neumonía, infecciones hepato-biliares, las
que en ocasiones pueden comprometer la vida al
paciente.(3,4)
Estas infecciones se pueden adquirir en la comunidad o en el ambiente hospitalario, a través de
la ingestión de alimentos, agua, contacto con suelo
y por el uso de dispositivos intravenosos.(5)
Se han descrito numerosos factores de virulencia
asociados a la enteropatogenicidad en las especies
del género Aeromonas, entre los que se pueden
mencionar: la producción de enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, proteasas, hemolisinas),
citotoxinas, enterotoxinas, hemaglutininas, entre
otros, haciendo más complejo el cuadro clínico al
paciente.(5,6)
A pesar de los adelantos en el control de las
enfermedades infecciosas, las infecciones extraintestinales y nosocomiales por los microorganismos
antes mencionados son cada día más frecuentes
y constituyen una amenaza grave para la salud de
la población mundial. (3,7,8) Por la antes expuesto
se decidió realizar la identificación en especies
y determinar la presencia de algunos factores de
virulencia en 44 cepas de Aeromonas aisladas de
pacientes con bacteriemias en diferentes centros
de salud del país.
Materiales y métodos
En el período comprendido de enero del 2005
hasta diciembre del 2006 se estudiaron en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades
Diarreicas Agudas del Instituto de Medicina Tropical
“Pedro Kourí” (IPK) 44 cepas de Aeromonas spp
aisladas de muestras de sangre, procedentes de 5
laboratorios de Microbiología clínica de los Centros
Provinciales de Higiene y Epidemiología del país
que incluyeron Pinar del Río, Ciudad de la Habana,
Camagüey, Holguín y Santiago de Cuba. Estos microorganismos fueron aislados e identificados como
patógenos únicos de hemocultivos.
Las 44 cepas mantenidas en medio de con-
20
servación de Pasteur fueron inoculadas en Caldo
Cerebro-Corazón, e incubadas a 37°C durante 18
a 24 horas en condiciones de aerobiosis. Para la
confirmación de género las cepas fueron sembradas
en placas de Agar Mac Conkey y en Agar Triptona –
Soya suplementado con sangre de carnero al 5%,
e incubadas en las mismas condiciones de temperatura, aireación y tiempo antes mencionadas, al
cabo del cual se seleccionaron al menos 3 colonias
por placas, las cuales fueron inoculadas en los
medios de diferenciación primaria Agar Hierro y
dos azúcares de Kligler (AHK) y Agar Hierro Lisina
(AHL). Se escogieron aquellas colonias que después
del crecimiento durante 18 a 24 horas las cepas
presentaron codificación genética para la enzima
citocromo oxidasa. A las cuales se les realizó el
estudio fisiológico correspondiente para ubicarlas
en el género Aeromonas.(1)
Para la identificación en especies se aplicaron
los esquemas Aerokey ll(9) (hidrólisis de esculina,
producción de indol y fermentación de la sacarosa)
y el Aerosquema(10) (fermentación de la arabinosa,
producción de gas de glucosa y resistencia a la
cefalotina).
A las cepas en estudio se le determinaron los
siguientes factores de virulencia: la producción de
enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, elastasa,
lecitinasa y hemolisina), citotoxicidad en células
Vero y presencia de fimbrias.
La actividad DNasa fue investigada según Blazevic.(11) Un halo rozado alrededor de las colonias en
Agar DNasa con 0.01% de azul de toluidina indico
actividad de nucleasa.
La enzima elastasa se determinó por la metodología establecida por Scharmann.(12) Se inoculó por
punteo en la superficie del medio Agar elastina,
incubándose hasta 7 días a 370C. Un halo transparente alrededor de la colonia indico la presencia de
la enzima elastasa.(12)
El estudio de la enzima gelatinasa se realizó por
la técnica de Blazevic.(11) Se inoculo por punteo en la
superficie del medio Agar gelatina, incubandose 24
horas a 370C. Una opacidad alrededor de la colonia
indico producción de la enzima gelatinasa.
La presencia de la enzima lecitinasa se determino por el protocolo recomendado por Blazevic.(11)
Se inoculó por punteo en la superficie del medio
Agar lecitina, incubandose 48 horas a 370C. Un
halo transparente alrededor de la colonia indico la
presencia de la enzima.
Para la actividad hemolítica (ß hemolisina), se
siguió la técnica descrita por Robinsón.(13) Se tomo
una asada y se inoculó en estría por agotamiento en
Agar Triptona – Soya suplementada con sangre de
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carnero al 5%, incubándose 24 horas a 370C. Un
halo transparente alrededor de la colonia indico la
presencia de la enzima beta hemolisina.
Para la actividad citotóxica, se utilizó la línea
celular Vero ATCC-CCL 81, procedentes del Laboratorio de Cultivo de Células del IPK. Se realizó por la
técnica propuesta por Ljungh.(14) La observación de
redondeamiento, vacuolización y degeneración de
igual o más del 50% de las células indicó citotoxicidad.
Para realizar la determinación de la presencia
de fimbrias se procedió según el método de Nishikawa.(15) Se preparo una suspensión bacteriana y
una de glóbulos rojos humanos grupo O al 3% de
varios donantes. Se mezclo 20µl de ambas en una
lámina portaobjeto. Se agitó durante 5 minutos.
Como resultado positivo se observa aglutinación de
los glóbulos rojos.
Resultados
De las 44 cepas en estudio, en 35 (79.5%) se
identificaron 5 especies, Aeromonas jandaei 12
(27.2%), Aeromonas veronii bv sobria 8 (18.1%),
Aeromonas trota 6 (13.6%), Aeromonas caviae
5 (11.3%), Aeromonas hydrophila 4 (9.0%), 9
(20.3%) no pudieron ser identificadas en especies
por lo que se clasificaron como Aeromonas spp.
En la tabla 1 se observa el resultado de la presencia de los factores de virulencia de las cepas de
Aeromonas estudiadas. Todas las cepas presentaron
al menos un factor de virulencia de los investigados. La enzima lecitinasa estuvo presente en 39
cepas (88.6%), seguido de la enzima gelatinasa
en 37 cepas (84.0%). Aeromonas hydrophila y
Aeromonas jandaei fueron las especies que presentaron mayor positividad a los factores de virulencia
estudiados.
Discusión
Los microorganismos incluidos dentro del género
Aeromonas se aíslan cada vez más frecuentemente
en infecciones extraintestinales. Esto se debe, en
gran medida, a una mayor supervivencia de los pacientes con enfermedades graves y al reconocimiento
de estos agentes como patógenos humanos.(3,6,7)
Desde 1987 han sido reconocidas Aeromonas
veronii, Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei,
Aeromonas trota, Aeromonas allosaccharophila, Aero­
monas encheleia y Aeromonas bestiarum como causa
de infecciones intestinales y extraintestinales.(16,17) En
la actualidad se reconocen cuatro especies del genero
Aeromonas como causa de septicemia: Aeromonas
hydrophila, Aeromonas veronii (ambos biotipos), Ae­
romonas caviae, y Aeromonas jandaei.(18,19,20) Aunque
cuando se revisa la literatura médica Aeromonas hydro­
phila es la especie que con mayor frecuencia es aislada
de hemocultivos.(20,22) Los resultados en relación a la
identificación en especie de la presente investigación
son similares a los obtenidos en los estudios antes
mencionados.
En América Latina y el Caribe son escasos los
estudios sobre factores de virulencia (producción de
enzimas extracelulares, citotoxicidad en células Vero
y presencia de fimbrias) realizados en los microorganismos pertenecientes al género Aeromonas aislados
de muestras de sangre.(23)
En relación a la producción de las enzimas extracelulares, las cepas de Aeromonas hydrophila del
presente estudio evidenciaron la producción de la
enzima ß hemolisina y DNasa. Nuestros datos son
semejantes a los obtenidos en un estudio relacionado
con los posibles factores de virulencia implicados en
la patogenicidad de cepas de Aeromonas hydrophila
aisladas de bacteriemias realizado en Malasia, quienes
encontraron la enzima DNasa en las 18 cepas estudia-
Tabla 1. Presencia de los factores de virulencia estudiados en las cepas de Aeromonas
Producción de enzimas extracelulares
Especies
Aeromonas hydrophila
Aeromonas caviae
Aeromonas trota
Aeromonas veronii bv sobria
Aeromonas sp
Aeromonas jandaei
Total
%
No
Gelatinasa Lecitinasa
Beta
hemolisina
Citotoxicidad
Presencia
en células Vero de fimbrias
DNasa
Elastasa
4
4
4
3
3
4
4
1
5
6
8
9
12
44
100
5
6
6
4
25
56.8
4
8
18.1
4
6
8
8
8
37
84.0
5
6
8
7
10
39
88.6
5
8
1
12
30
68.1
8
5
12
29
65.9
5
5
4
3
10
28
63.6
Fuente: Protocolo de trabajo. IPK. 2002-2003.
21
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das y con los de una investigación realizada en España
en el año 2003, sobre determinación y expresión de
genes de virulencia, que incluyo las siguientes especie:
Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, y Aeromonas
jandaei donde los autores demostraron la presencia
de estas enzimas en la totalidad de las cepas antes
citadas aisladas de muestras clínicas.(21,24)
En las cepas de Aeromonas veronii bv sobria, se
observó la presencia de la enzima beta hemolisina y
gelatinasa. Resultado que coincide con el publicado
por Mayoral, quien demostró la presencia de estas
enzimas, en la misma especie aislada de un paciente
con celulitis con gran secreción de pus, y diseminación
al torrente sanguíneo.(4)
Varios autores han propuesto la existencia de
complejos mecanismos de patogenicidad en el género
Aeromonas, que pueden ser usados como marcadores
de virulencia, entre los que se pueden mencionar:
fosfolipasas, proteasas, hemolisina, enterotoxina y
citotoxina favoreciendo la invasividad, la actividad
citolítica y la adherencia.(25,27)
Las cepas de Aeromonas hydrophila de la presente
investigación presentaron signos de citotoxicidad. Resultado que esta acorde con el obtenido por Vadivelu
J y cols., 1995, los cuales encontraron la presencia
de este marcador de virulencia en la cepas que fueron
objetos de estudio, además Bauab TM y cols., 2003,
de las 39 cepas de Aeromonas hydrophila aislada de
muestras extraintestinales el (43.6%) de las cepas presentaron citotoxicidad en la línea celular Vero.(16,21)
En un estudio realizado por Wilcox relacionado
con la presencia de citotoxinas en células Vero por
Aeromonas caviae encontró que esta especie no resultó
citotoxica.(25) Resultado similar fue obtenido en este
trabajo. Sin embargo en una investigación realizada
por Krzyminska en Polonia relacionada con la actividad
enteropatogénica de Aeromonas caviae aisladas en
muestras de diarreas encontró que la mayoría de las
cepas fueron citotoxicas en células Vero.(26) Resultado
que discrepa con el nuestro.
La adherencia bacteriana a las células del huésped
susceptible representa un paso importante para la
colonización tisular y es mediada por moléculas llamadas adhesinas. Numerosas investigaciones sugieren
que la adhesión es probablemente mediada por una
variedad de pilis u otros factores de colonización los
cuales pueden estar o no relacionados con la hemaglutinación.(27,28)
Analizando la presencia de fimbrias a través de la
técnica de hemaglutinación, se observa baja positividad en las cepas de Aeromonas hydrophila a este
factor, coincidiendo con los resultados de un estudio
relacionado sobre patrones de adherencia realizado
en la República de Eslovaquia, donde los autores no
22
encontraron la presencia de fimbrias en las cepas de
Aeromonas hydrophila estudiadas. Sin embargo en
un investigación sobre prevalencia y propiedades de
virulencia en cepas de Aeromonas llevada a cabo en
Brazil, los autores encontraron la presencia de fimbrias
en todas las cepas de Aeromonas hydrophila aisladas
de muestras intestinales y extraintestinales.(27,28)
La identificación en especies del género Aero­
monas, así como sus atributos de patogenicidad
demostrados en los aislamientos que formaron parte
de este estudio, pusieron en evidencia la circulación
en Cuba de este microorganismo aislado de pacientes
con bacteriemias.
Referencias
1. Garrity GM, Bell JA, Lilburm TG. Taxonomic outline
of the prokaryotes. En: Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology. 2nd ed. Release 4.0;Oct 2003. [Citado el
10 de febrero del 2004]. Disponible en: URL:http://
dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline200310
2. Sharon LA, Wendy K, Cheung W, Janda JM. The Genus
Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. J Clin
Microbiol. 2003;79(6):2348-57.
3. Clark NM, Chenoweth CE. Aeromonas infection of the
hepatobiliary system: Report of 15 cases and review of
the literature. Clin Infect Dis. 2003;37:506-13.
4. Mayoral C, Gómez M, Schmeling MF, Peirano S.
Celulitis y bacteriemia por Aeromonas veronii biovar
sobria, presentación de un caso. Infect Microbiol Clin.
2000;12(2):71-3.
5. Soler L, Figueras MJ, Chacón MR, Vila J, Marco F,
Martínez–Murcia A J et al. Potential virulence and antimicrobial susceptibility of Aeromonas popoffi recovered
from freshwater and seawater. FEMS Immunol Med
Microbiol. 2002;32(3):243-7.
6. Sechi LA, Deriu A, Falchi MP, Fadda G, Zanetti S. Distribution of virulence genes in Aeromonas spp. Isolated
from Sardinian waters and from patients with diarrhoea.
J Appl Microbiol. 2002;92(2):221-7
7. Bravo Fariñas L, Morier L, Castañeda N, Ramírez M,
Silva M, Castro- Escarpulli G. Aeromonas: an emerging
pathogen associated with extraintestinal infection in
Cuba. Rev Cubana Med Trop. 2003;55(3):208-9.
8. Castro-Escarpulli G, Aguilera Arreola GM, Giono Cerezo S, Hernández-Rodríguez C, Rodríguez Chacon
M, Soler Falgás L. El género Aeromonas: ¿Un patógeno importante en México? Enf Infecc Microbiol.
2002;22(4):206-16.
9. .Carnahan A, Behran S, Joseph S. Aerokey ll: a flexible
key for identifying clinical Aeromonas species. J Clin
Microbiol. 1991;29:2843-9.
10.Furuwatari CH, Kawakami Y, Akahame T, Hidaka E, Okimura Y, Nakayama J et al. Proposal for an Aeroscheme
(modified Aerokey ll) for the identification of clinical
Aeromonas species. Med Sci Res. 1994;22:617-9.
11.Blazevic DJ, Ederer GM. Principles of biochemical test
in diagnostic microbiology. New York, J. Wiley. 1975.
Rodriguez LEC, et al • Factores de virulencia en cepas de Aenomonas spp...
12.Scharmann W. Elastase in Pseudomonas and Aeromonas
Zentralbl Bakteriol 1972;220(1):435-42.
13.Robinson J. Comparison of direct plating with the use of
enrichment culture of isolating of Aeromonas spp from
faeces. J Med Microbiol. 1986;22:315-7.
14.Ljung A, Eneroth P, Wadstrom T. Cytotonic enterotoxin
from Aeromonas hydrophila. Toxin 1982;20:787-94.
15.Nishikawa Y, Kimiura T, Kishi T. Mannose-resistant
adhesion of motile Aeromonas to INT 407 cells and the
differences among isolates from humans food and water.
Epidemiol Infect. 1991;107:171-9.
16. Hickman-Brenner FW, MacDonald KL, Steigerwalt
AG, Fanning GR, Brenner DJ, Farmer JJ III. Aeromo­
nas veronii, a new ornithine decarboxylase-positive
species that may cause diarrhea. J Med Microbiol.
1987;25:900-6.
17.Carnahan AM, Chakraborty T, Fanning, GR. Aeromo­
nas trota sp. nov., an ampicillin-susceptible species
isolated from clinical specimens. J Med Microbiol.
1991;29:1206-10.
18.Janda JM, Guthertz LS, Kokka RP, Shimada T. Aeromo­
nas species in septicemia: laboratory characteristics and
clinical observations. Clin Infect Dis. 1994;19:77-83.
19.Duthie R, Ling TW, Cheng, AFB, French GL. Aeromonas
septicaemia in Hong Kong: species distribution and
associated diseases. J Infect. 1995;30:241-4.
20.Cigni A, Tomasi PA, Pais A, Cossellu S, Faedda R, Satta
AE. Fatal Aeromonas hydrophila septicemia in a 16-yearold patient with thalassemia. J Pediatr Hematol Oncol.
2003;25(8):674-5.
21.Vadivelu J, Puthucheary SD, Phipps M, Chee YW.
Possible virulence factors involved in bacteraemia
caused by Aeromonas hydrophila. J Med Microbiol.
1995;42(3):171-4.
22.Pérez Peña S, Tamayo Curro E, Díaz García ME, Pérez
Rodríguez JM. Primer reporte en Cuba de aislamiento de
Aeromonas en muestras extraintestinales. Rev Cubana
Med Milit. 1997;26(1):50-4.
23.Bauab TM, Levy CE, Rodríguez J, Pasetto Falcao D.
Niche-specific association of Aeromonas ribotypes from
human and environmental origen. Microbiol Immunol.
2003;47(1):7-16.
24.Chacon MR, Figueras MJ, Castro-Escarpulli G, Soler L,
Guarro J. Distribution of virulence genes in clinical and
environmental isolates of Aeromonas spp. Antonie Van
Leeuwenhoek 2003;84(4):269-78.
25.Wilcox MH, Cook A, Geary I, Eley A. Toxin production,
adherence and protein expression by clinical Aeromonas
spp. Isolates in broth and human pooled ileostomy fluid.
Epidemiol Infect. 1994;113(2):235-45.
26.Krzyminska S, Kaznowski A, Lindner K, Mnichowska M.
Enteropathogenic activity and invasion of Hep-2 cells by
Aeromonas caviae clinicl isolates. Acta Microbiol Pol.
2003;52(3):277-83
27.Bartkova G, Ciznar I. Adherence pattern of non-pilated
Aeromonas hydrophila strains to tissue cultures. Microbios 1994;77(310):47-55.
28.Gibotti A, Saridakis HO, Pelayo JS, Tagliari KC, Paseto
Falcão D. Prevalence and virulence properties of Vibrio
cholerae non-01, Aeromonas spp. and Plesiomonas shi­
gelloides isolated from Cambé Stream (State of Paraná,
Brazil). J Appl Microbiol. 2000;89:70-5.
Correspondencia:
Dra. Laura Bravo Fariñas
Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí.
Autopista Novia del Mediodía km 6. La Lisa.
Ciudad de La Habana, Cuba.
e-mail: [email protected]
23