8 caracterización de cultivos iniciadores en productos

CARACTERIZACIÓN
DE CULTIVOS INICIADORES EN
PRODUCTOS CÁRNICOS.
PARTE 1
Tatiana Beldarraín*, Yamira Cepero, Aster Bruselas, Ramón Santos, Magdalena Ramos,
Yamilé Moya, Margarita Núñez y Norma Vergara
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia
Carretera al Guatao, km 3½, C.P. 19 200, La Habana, Cuba
E-mail: [email protected]
RESUMEN
ABSTRACT
En este trabajo se caracterizaron tecnológicamente, a escala
de laboratorio, 5 cultivos iniciadores. Las propiedades
tecnológicas evaluadas fueron pH en caldo glucosado,
viabilidad del cultivo, tolerancia a elevada concentración
de sal, inactivación a 60 ºC por 30 min, entre otras. Todos
los cultivos, por sus aptitudes acidificantes y población
celular se consideraron aptos para su empleo industrial y
se pudieron categorizar como productores de baja y alta
acidez.
Palabras clave: bacteria ácido-láctica, cultivos iniciadores,
caracterización, medios de cultivo, productos cárnicos.
Meat products starters characterization. Part I
INTRODUCCIÓN
El uso de cultivos iniciadores para dirigir las
fermentaciones industriales está ampliamente
difundido. Esto ha traído como consecuencia que
durante los últimos años hayan aparecido en el
mercado numerosos productos (bioconservadores,
cultivos protectores, iniciadores, probióticos) que
proponen formas de conservación alternativas a las
tradicionales o proporcionan a los alimentos la cualidad
de ejercer un efecto beneficioso para la salud
paralelamente a su aporte nutritivo (1).
*T
atiana Beldarraín Iznaga
*Tatiana
Iznaga: Licenciada en Microbiología (U.H.,
1996). Especialista en Carne y Productos Cárnicos (IIIA, 1999).
Máster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (IFAL, 2006).
Investigador Agregado del grupo de Ciencias de la Vicedirección de
Carne. Labora en la Calidad Microbiológica de Productos Cárnicos e
Higiene de Plantas Procesadoras de Alimentos.
8
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
Five starters were technologically characterized to laboratory
scale. The pH in glucose broth, viability and salt high
concentration tolerance, inactivation to 60ºC by 30 min,
between other properties, were evaluated. All the starters by
their technological properties were considered capable for
their industrial employment and they could be categorized as
low and high acidity producers.
Key words: lactic acid bacteria, starters, media, characterization,
meat products.
Los cultivos iniciadores se definen como microorganismos
que se presentan en estado puro o mixto, seleccionados
de acuerdo con sus propiedades específicas y que al
agregarlo a los alimentos mejoran su aspecto, aroma,
sabor y facilitan la tecnología (2).
El empleo de cultivos iniciadores comerciales en la
industria cárnica ofrece una serie de ventajas al industrial
y al consumidor, por lo que desde hace unos años es una
práctica habitual en la elaboración de productos
fermentados. Entre ellas se encuentran que muchas de
las cepas que forman parte de los cultivos iniciadores
producen diversos factores que inhiben el desarrollo de
otros microorganismos, por lo que al inocular una cantidad
elevada de estas, se asegura un efecto conservador, lo
que incide positivamente sobre el tiempo de fabricación,
ya que no hay que esperar a que se desarrollen las
bacterias lácticas presentes de forma natural pues se
inoculan en la cantidad deseada. Además, se consigue
la homogeneidad del producto y su empleo permite
controlar y dirigir el metabolismo bacteriano con lo que
se mejoran las características sensoriales de los
productos. Los microorganismos que pueden producir
alteraciones en el producto no se desarrollan tan
fácilmente como lo harían con la biota autóctona, lo
que reduce el número de piezas defectuosas y ellas
son de fácil uso tecnológico (3, 4). El objetivo del
presente trabajo fue identificar las especies que
constituyen los cultivos iniciadores y evaluar sus
propiedades tecnológicas a escala de laboratorio.
Una vez reestablecida la morfología celular en caldo
de mantenimiento apropiado, se realizaron siembras en
medio agar para conteo en placas (ACP) para el
aislamiento de las colonias. Para ello se empleó el método
de diluciones seriadas en agua peptonada a 0,1 % y
siembra por inoculación profunda en placa con doble
nivel. Las diluciones se realizaron hasta 109 y se escogió
este medio de cultivo teniendo en cuenta el crecimiento
obtenido en los diferentes caldos analizados.
MATERIALES Y MÉTODOS
La Tabla 1 refleja que se utilizaron 5 cultivos que han
sido empleados en la elaboración de embutidos
fermentados (5, 6). Todos los cultivos se recibieron en
medio Agar Leche y se reactivaron mediante siembra
en los medios de cultivo caldo MRS y caldo APT con
el objetivo de conocer el caldo de establecimiento
celular apropiado, se incubaron a 30 ºC durante un
espacio de tiempo de 16 a 24 h y se conservaron en
refrigeración entre resiembras consecutivas. Además,
para garantizar el control de la composición de los
cultivos, se realizaron exámenes microscópicos
mediante tinción simple en azul de metileno (7).
Para la identificación de las cepas que constituyen los
cultivos iniciadores 1, 2 y 3, se realizaron las pruebas
bioquímicas y fisiológicas empleadas en la descripción
taxonómica y se utilizó la metodología que incluye las
pruebas de catalasa, oxidasa, ácido de la glucosa,
fermentación de carbohidratos y respuesta ante la
tinción de Gram (8). La Tabla 2 muestra las pruebas
que se hicieron para identificar las especies. Para cada
cultivo se realizaron 4 réplicas.
Tabla 1. Composición microbiológica de los cultivos empleados
No
1
2
3
4
5
Composición
Desconocida
Desconocida
Desconocida
Lactobacillus casei
Lactobacillus acidophillus
Procedencia
Banco de cepas del
Banco de cepas del
Banco de cepas del
Banco de cepas del
Banco de cepas del
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
IIIA
Tabla 2. Principales propiedades tecnológicas estudiadas
Propiedad evaluada
Tolerancia a la sal 5 %
Tolerancia a la sal 10 %
Crecimiento a 5 ºC
Crecimiento a 15 ºC
Crecimiento a 30 ºC
Crecimiento a 45 ºC
Inactivación a 60 ºC por 30 min
Producción de peróxido
Prueba de la oxidasa
Tinción de Gram
Ácido de la glucosa
Licuefacción de las grasas
Medio empleado o prueba realizada
Caldo ATP + 5 % de NaCl
Caldo ATP + 10 % de NaCl
Caldo ATP, incubación a 5 ºC
Caldo ATP, incubación a 15 ºC
Caldo ATP, incubación a 30 ºC
Caldo ATP, incubación a 45 ºC
Caldo ATP
Prueba de la catalasa
Producción de acetoína
Caldo glucosado (Oxoid, 1980)
ACP
100 g
grasa a estudiar
5 mL
Tween 80
1 mL
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
9
Para la evaluación de las principales propiedades
tecnológicas, los cultivos se reactivaron durante dos
semanas en el caldo apropiado, resembrándose cada
72 h. Posteriormente se procedió a evaluar los cultivos
según las propiedades tecnológicas de importancia
(Tabla 2) como son la morfología celular y pureza,
capacidad acidificante, viabilidad celular, tolerancia a
5 y 10 % de sal, catalasa, crecimiento a 5, 15, 30 y 45 ºC,
licuefacción de la grasa e inactivación a 60 ºC por
30 min (9). Para cada cultivo se realizaron 4 réplicas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
en caldo MRS todas las cepas analizadas tenían un débil
crecimiento y esto podría atribuirse a la ausencia de
algunas sales en este medio que sí están presentes en
caldo APT (donde se obtuvo más turbidez luego de las
resiembras sucesivas) y que son importantes para el
desarrollo de cepas empleadas como cultivos iniciadores
en productos cárnicos.
En estos resultados se observa que el poco crecimiento
de los iniciadores en el medio MRS corrobora el hecho
de las exigencias nutricionales en cuanto a sales minerales
y la idoneidad del caldo APT para las especies implicadas
en la fermentación de embutidos cárnicos (10).
La Tabla 3 presenta los resultados del crecimiento de
los 5 cultivos en los caldos MRS y APT. Los cultivos 4
y 5 tuvieron un crecimiento abundante en caldo MRS,
no así el 1, 2 y 3 que presentaron una ligera turbidez en
el medio a las 16 h de incubación, esto se atribuye a
que las cepas que constituyen los cultivos 4 y 5 son
lactobacilos, los cuales tienen sus requerimientos
nutricionales cubiertos con el medio MRS, lo que no
sucede con los otros cultivos. Luego de las resiembras
Tabla 3. Reactivación y crecimiento de los cultivos iniciadores en diferentes medios de cultivo
(incubación a 30 ºC por 16 a 24 h)
Cultivo
Caldo MRS
1
-
2
3
d
4
++
5
++
Caldo APT
Morfología celular
Bacilos cortos y cocobacilos, agrupados en duplas
++
abundantes y cocos en racimos
++
Cocos en parejas y tétradas y cocos en racimos.
++
Mezcla de bacilos largos y cortos y cocos en racimos.
Bacilos alargados, típicos de bacterias ácido lácticas
++
aislados
Bacilos alargados y filamentosos, típicos de bacterias
+
acidolácticas.
+: crecimiento positivo ++: crecimiento abundante.
d: crecimiento débil
Tabla 4. Resultados de las características evaluadas para la identificación hasta género de los
cultivos 1, 2 y 3
Código
1
2
3
Leyenda:
10
Gram
Catalasa
+
+
+
+
+
+
-: negativo
Oxidasa
+
+
+
+
+
+
+
+: positivo
Ácido de
glucosa
Ferment.
Carboh.
+
+
+
+
+
+
F: Fermenta la glucosa
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
Género identificado
Staphylococcus spp
F
Leuconostoc spp
F
Pediococus spp
O
Staphylococcus spp
F
Lactobacillus spp
Staphylococcus spp
F
O: Oxida la glucosa.
La Tabla 4 muestra los resultados de las características
evaluadas para la identificación de género de los
cultivos 1, 2 y 3. Todas las cepas analizadas fueron
grampositivas y si se toman en consideración, además,
las características evaluadas, así como que son cocos
agrupados en racimos, los cultivos iniciadores 1, 2 y 3
contenían estafilococos.
La Tabla 5 presenta que la fermentación anaerobia de
la glucosa, así como el crecimiento a 45 ºC y la tolerancia
a concentraciones de sal de hasta 10 % permitió
identificar la especie del género Staphylococcus sp.,
que se encontraban presentes en los cultivos 1, 2 y 3.
De acuerdo a los resultados positivos en la
fermentación de lactosa, galactosa y glucosa pero no
de maltosa y sacarosa, la especie presente en los
cultivos 1, 2 y 3 es St. carnosus. Este género ha
adquirido gran importancia como cultivo iniciador en
productos cárnicos, debido a que son catalasa y
nitratoreductasa positivos, lo que posibilita su
intervención en los procesos de formación y
mantenimiento de la estabilidad del color típico de los
productos curados ligeramente fermentados. Además,
su capacidad de crecer y metabolizar distintos
compuestos en condiciones de anaerobiosis, lo que lo
ha convertido en el género más empleado como cultivo
iniciador en productos cárnicos (2, 11, 12).
El cultivo 1 contenía diplococos pequeñitos, los que
podrían ser del género Leuconostoc spp. Este
microorganismo se caracterizó por fermentar la glucosa
en condiciones de anaerobiosis, así como los
carbohidratos estudiados, creció a 5 % de sal, no licuó
la grasa y se inactivó a 60 ºC. Con todas estas
características, así como por la morfología
microscópica, se trata de Leuconostoc pentosus, por
lo cual se pudo concluir que el cultivo 1 estaba integrado
por las cepas St. carnosus y L. pentosus.
Al identificar el cultivo 2, se comprobó que se trataba
de St. carnosus y Pediococcus spp. El hecho de que
no crecieran a 5 ºC y fermentaran la maltosa y la
lactosa, permitió identificar la especie como
Pediococcus pentasaceus. Esta especie microbiana
se ha empleado como cultivo iniciador para la
elaboración de embutidos fermentados con buenos
resultados y que, además, inhibían la acción de cepas
patógenas como St. aureus, Salmonella spp y
Escherichia coli (13).
El pH final alcanzado por la cepa P. pentasaceus (3,8)
fue el más bajo logrado por todas las cepas evaluadas,
por lo que se le puede considerar como de elevado
valor tecnológico para la elaboración de productos
cárnicos fermentados. Además, como fue capaz de
crecer a temperaturas de 45 ºC podría ser importante
si se deseara elaborar un producto a alta temperatura
de fermentación.
El cultivo 3 estuvo formado por St. carnosus y
Lactobacillus spp que por su morfología microscópica
son formas bacilares pequeñas, que no crecen a 45 ºC
y fermentan los carbohidratos presentados y toleran
hasta 10 % de sal, lo que permitió identificar al cultivo
3 como una mezcla de St. carnosus y Lactobacillus
plantarum.
En la Tabla 6 se presentan los resultados de las
principales propiedades tecnológicas evaluadas, así
como las respuestas obtenidas de cada cultivo. Todos
los cultivos corresponden con las características de
morfología microscópica esperada. En ninguno de ellos
se observó presencia de células ajenas al cultivo.
Además, todos los cultivos fueron catalasa negativos,
lo cual es importante pues la habilidad de algunas cepas
de producir peróxido en presencia de oxígeno del aire
es una propiedad indeseable ya que cuando hay oxígeno
en la masa del embutido, la grasa es susceptible a la
oxidación y el peróxido puede, además, causar
decoloración (10).
Por su parte, todos los cultivos crecieron a temperaturas
de 5, 15 y 30 ºC. El crecimiento a temperaturas
superiores a 15 ºC es beneficioso en algunos tipos de
tecnología donde se prefieren temperaturas bajas de
fermentación por largos períodos de tiempo y cuyas
temperaturas varían entre 15 y 35 ºC.
Todos los cultivos crecieron en caldo APT con 5 % de
sal, lo que se considera un prerrequisito importante ya
que la mezcla de embutidos contiene NaCl en el rango
de 5 a 8 %. Se aprecia que los cultivos 1 y 3 fueron
capaces de crecer a concentraciones de sal de hasta
10 %, lo cual no sucede con los cultivos 2, 4 y 5.
En la Tabla 6 se observa, también, que todas las cepas
se inactivaron al someterlo a condiciones de 60 ºC
durante 30 min. Esta propiedad es muy ventajosa en el
caso que se deseara detener la fermentación.
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
11
12
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
Catalasa
Crecimiento 5 ºC
Crecimiento 15 ºC
Crecimiento 30 ºC
Crecimiento 5 % NaCl
Crecimiento 10 % NaCl
Inactivación a 60 ºC, 30 min
Leyenda:
-: negativo
Morfología celular
Pruebas realizadas
1
Bacilos cortos y
cocobacilos
agrupados en
duplas abundantes
y cocos en racimos
+
+
+
+
+
+
+: positivo.
+
+
+
+
+
Cocos en parejas y
tétradas y cocos en
racimos.
2
+
+
+
+
+
+
Mezcla de bacilos
largos y cortos y
cocos en racimos.
Cultivos
3
4
+
+
+
d
+
+
+
+
+
Bacilos alargados y
filamentosos,
típicos de bacterias
acidolácticas.
5
+
+
+
+
+
4,4
F
+
+
+
+
+
+
+
Lactobacillus plantarum
3
Bacilos alargados,
típicos de bacterias
ácido lácticas
aislados
Respuesta
+
+
+
+
+
+
+
+
4,4
3,8
F
O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Leuconostoc pentosus
Pediococcus pentasaceus
1
2
Tabla 6. Principales propiedades tecnológicas estudiadas
Pruebas
Tinción de Gram
+
Catalasa
+
Crecimiento 5 ºC
+
Crecimiento 15 ºC
+
Crecimiento 30 ºC
+
Crecimiento 45 ºC
+
pH final en caldo glucosado
4,5
Fermentación carbohidratos
F
Glucosa
+
Sacarosa
Maltosa
Lactosa
+
Galactosa
+
Crecimiento 5 % NaCl
+
Crecimiento 10 % NaCl
+
Licuefacción de la grasa
+
Inactivación a 60 ºC, 30 min
+
Staphylococcus carnosus
Cepas
Cultivos
1, 2, 3
Leyenda:
-: negativo
+: positivo.
Tabla 5. Características fisiológicas y bioquímicas de las cepas que componen los cultivos 1, 2 y 3
Los cultivos que producen un decrecimiento drástico
del pH entre el primero y el cuarto día de fermentación,
con valores por debajo de 3,5, son beneficiosos desde
el punto de vista higiénico, ya que provocan la inhibición
de la flora contaminante e indeseable, incluyendo
patógenos (14). Como se puede observar, a las 96 h
de incubación, los cultivos alcanzaron valores de pH
entre 3,5 y 4,5.
El pH y la producción de acidez alcanzados por los
diferentes cultivos se aprecia en las Fig. 1 y 2,
respectivamente. En las primeras 24 h, la disminución
del pH en medio caldo glucosado de los 5 cultivos en
estudio fue notable, estando todos los valores entre 4 y
4,5. Esta disminución del pH podría atribuirse a la
producción de ácido láctico que se forma producto de
la fermentación de la glucosa presente en el medio.
7,00
6,50
1
2
3
4
5
6,00
p
5,50
5,00
4,50
4,00
3,50
0
24
48
72
Tiempo (horas)
96
Fig. 1. Comportamiento del pH alcanzado por los diferentes cultivos hasta las 96 h de incubación.
Valores medios de las cantidades de ácido
láctico (%)
2
1
2
3
4
5
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
24
48
Tiempo (h)
72
96
Fig. 2. Valores medios de la acidez alcanzados por los diferentes cultivos hasta las 96 h de incubación.
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
13
Por los valores de pH alcanzados en caldo glucosado a
los 4 días, los cultivos 1 y 4 se consideran débilmente
acidificantes ya que a las 96 h poseen valores de pH
de 4,15 y 4, lo cual se corresponde con valores de acidez
de 0,56 y 0,65 %, respectivamente. Los cultivos 3, 2 y
5 se consideran productores de alta acidez al presentar
valores de pH de 3,95; 3,82 y 3,75; los que se
corresponden con una acidez de 0,98; 1,73 y 1,87 % de
ácido láctico, respectivamente.
El hecho de que el cultivo 2 tenga un pH final de 3,82
en caldo glucosado podría deberse a la presencia de P.
pentasaceus, que como cepa individual alcanzó el pH
más bajo en ese mismo medio. La elección de una cepa
más o menos acidificante dependerá de las
características del embutido a obtener, así como de la
tecnología a emplear.
La obtención de valores de pH de hasta 3,5 se debe a
pruebas realizadas en medio de cultivo con alta
concentración de carbohidratos. En un medio cárnico
la capacidad de buffer y el pH inicial influirán en la
capacidad en la caída del pH y se necesitará más
producción de ácido por las bacterias para bajar el pH
del producto (9).
Se destaca que de los 5 cultivos, 3 son mixtos y en 1 de
ellos, el cultivo 3, estaba presente L. plantarum,
especie que se considera efectiva y abundante en la
fermentación de embutidos tanto controlada como
espontánea (9).
CONCLUSIONES
La caracterización de las cepas de acuerdo a su
morfología microscópica y a sus propiedades
fisiológicas y bioquímicas, permitió su identificación con
vistas a la aplicación industrial.
El cultivo 1 estuvo integrado por las cepas
Staphylococcus carnosus y Leuconostoc pentosus,
el cultivo 2 por Staphylococccus carnosus y
Pediococcus pentasaceus, mientras que el 3 estuvo
formado por una mezcla de Staphylcoccus carnosus
y Lactobacillus plantarum.
Todos los cultivos, por sus aptitudes acidificantes y
población celular se consideraron aptos para su empleo
industrial como cultivos iniciadores. La elección de una
cepa más o menos acidificante dependerá de las
características del embutido a obtener así como de la
tecnología a emplear.
La Tabla 7 refleja que al comportamiento frente a las
grasas ninguno de los cultivos en las primeras 72 h
presentan actividad lipolítica, pero a las 96 h, los cultivos
1, 2, 3 y 5 son capaces de licuar la grasa, lo cual los
hace atractivos para ser empleados como cultivo
iniciador para los productos cárnicos. La actividad lipolítica
de St. carnosus (presente en los cultivos 1, 2 y 3) podría
favorecer la adquisición del color, sabor y aroma deseado
en los productos crudos fermentados (12).
Tabla 7. Resultados del comportamiento frente a grasas
Cultivo
1
2
3
4
5
Leyenda:
14
Tiempo (h)
0
24
48
72
96
+
+
+
+
+
+
+
+
-: negativo
+: positivo.
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
REFERENCIAS
1. Garriga, M. Eurocarne 23: 68-72, 1994.
2. Leistner, F. Stable and safe fermented sausages world-wide. Fermented Meats. Campbell Platt G. y Cook P.E. (eds.).
Chapman & Hall, London, 1995.
3. Rovira, J. Profiles on Biotechnology, 50:589-601, 1992.
4. Buckenhüskes, H. Fems Microbiology Reviews 12: 253-272, 1993.
5. Sutic, M. y Milovanovic, R. A new type of starter culture for fermented sausages. (Proceedings 35th International
Congress of Meat Science and Technology, Copenague), 35 (3): 819-824, 1989.
6. Zhang, H.; Min, L. y Ni, C. Food Science China 17 (8): 25-29, 1996.
7. García, J.; Romay, Z.; Rojas, T. y Guerra, G. Manual Práctico de Microbiología. Ed. Universidad de la Habana, La
Habana, 1981, p 83.
8. Cowan, S. Manual for the identification of medical bacteria. Cambridge University Press, Cambridge, 1993, 212 pp.
9. Bacus, H. y Brown, H. Food Tech (1): 74-77, 1981.
10. Espinosa, C.; Fernández, M.; Valladares, C. y Roca, M. Monografía. Centro de Documentación e Información, La Habana,
Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia, 1992.
11. Jessen B. Starter cultures for meat fermentations. En Fermented Meats. Campbell-Platt G. y Cook P.E. (eds.). Chapman &
Hall, London, 1995.
12. Hugas, M. y Roca, M. Eurocarne 54: 1-5, 1997
13. Balduino, R.; Oliveira, A. y Hauly, M. Ciencia y Tecnología de Alimentos 19 (3): , 356-362, 1999.
14. Vignolo, G.; Pesce, A. y Oliver, G. J. Food Prot. 51: 481-484, 1998.
Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 2, 2008
15