Monitorización de la limpieza y desinfección. Proyecto

Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Monitorización de la limpieza
y desinfección. Proyecto BIOLISME
Zaragoza, 17 de noviembre de 2010
ainia
Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
HIGIENE: “Todas las condiciones y medidas necesarias para
garantizar la seguridad y buena condición de los alimentos a lo
largo de toda la cadena de producción”
(Codex Alimentarius rev. 4/2003)
Sistema de Análisis de Peligros y Puntos Control Crítico (APPCC)
• El R.852/2004 exige que todos los operadores de alimentación
(producción, procesado o distribución de alimentos), deben instaurar,
i
implantar
l t
y mantener
t
un procedimiento
di i t basado
b
d en ell sistema
i t
APPCC
APPCC.
• Uno de los requisitos del sistema APPCC Æ limpieza y desinfección
Evaluación del programa de L+D Æ método de muestreo y
control de superficies en contacto con los alimentos.
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Plan de Control
La Seguridad Microbiológica de los alimentos requiere:
Buenas Prácticas
Diseño efectivo
de Fabricación
Análisis Peligros y
(BPF)
Puntos Control Crítico
(APPCC)
Su aplicación
p
no impide
p
totalmente q
que el alimento
pueda contaminarse cuando queda expuesto al entorno
Establecimiento de PLANES DE CONTROL
para evaluar el control del entorno
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Plan de control
-
Manipulación
Transporte
Almacenamiento
Distribución
Envasado
son oportunidades para la
contaminación del p
producto
Plan de Muestreo y Análisis
• Microbiota presente en superficies y equipos (patógenos, indicadores
de higiene o alteración del producto)
• Efectividad de las prácticas de limpieza y desinfección.
• Resistencia o persistencia de determinados contaminantes.
contaminantes
• Origen de contaminantes (nichos), contaminaciones cruzadas.
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Plan de control
Plan de control en
Planta de producción
Muestreo
Plan de muestreo
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Método Analítico
Interpretación
Resultados
Sensible
y eficiente
Tratamiento estadístico
de datos
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Detección y control de la contaminación en zonas de riesgo
utilizando equipos y técnicas apropiados y según un PLAN.
Suelos y paredes
Vestimenta
(ropas y guantes)
Muestreo
Microbiológico
Agua
Superficies
Aire
Equipos
Detección y Cuantificación
de microorganismos
Estimación de la cantidad microbiana del entorno
Determinación y evaluación de tendencias
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Definir puntos
de muestreo
Diseño del muestreo
Definir métodos
de muestreo
Plan de muestreo
Definir límites
Qué
Dónde
Cuándo
Cómo
Indicadores de calidad (ej. presencia de
Listeria spp en planta)
Fuentes de contaminación (materias primas,
producto final, superficies de máquinas,
suelos,…)
Frecuencia de muestreos.
Métodos de análisis
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Definir
fi i puntos de
d muestreo
La selección de puntos y frecuencia de muestreo depende de:
• diseño de las plantas
• nº líneas producción y productos
• ubicación de equipos de procesado
• flujo de producto.
Puntos muestreo Æ designados a partir del análisis de riesgos (APPCC)
Definir métodos de muestreo
• Su elección dependerá:
- Microorganismo
g
a controlar: Tipo
p de célula ((bacteria,, espora,
p
, hongo),
g ),
sensibilidad, viabilidad.
- Umbral de detección, capacidad, eficacia.
- Tipo de superficie y condiciones del entorno
• Factores que afectan al muestreo: Tipo de superficie,
superficie
contaminación de la muestra, condiciones ambientales, biofilms.
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nivel
de
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Plan de control
• Puntos de muestreo
• Tamaño del área
á
de la muestra
• Frecuencia y momento del muestreo
(Nivel de control, tipo producto, actividad y disponibilidad de la zona)
• Técnica/s
/ de toma de muestras
• Acciones de seguimiento en caso de muestras positivas
-limpieza a fondo de zonas sospechosas y equipo
-intensificación/ampliado de pruebas
Definir límites
• Falta de criterios legales de valoración.
• Cada usuario fijará sus propios límites (según la clasificación de zona
de riesgo, requisitos cliente, etc)
• El establecimiento de los valores límite dependerán de la muestra y
el método utilizado.
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Criterios microbiológicos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Rto.
Rto
Rto.
Rto.
Rto.
Rto.
Rto.
Rto.
de bacterias aerobias mesófilas
de bacterias aerobias psicrotrofas
de enterobacterias
p
aureus
de Staphilococcus
de mohos y levaduras
indicadores fecales (E. Coli) o enterococos
de bacterias esporuladas
Investigación de Salmonella
Investigación
ó o Recuento de
d L. monocytogenes
Investigación de Campylobacter
Legionella,…
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Microorganismos
indicadores de
higiene o alterantes
del producto
Microorganismos
patógenos
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Métodos de muestreo de superficies y ambiente
Muestreo del ambiente
M
Muestreo
t
de
d superficies
fi i
Sedimentación
Placas de contacto
Recogida en medio líquido
Paletas de contacto
Filtración
Impactación
(aereobiocolectores)
Paños estériles
Torundas
Bioluminiscencia
Técnicas de
derramamiento
Técnicas de enjuagado
Muestreador de aire SAS
ISO 18593:2004. Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs.
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Técnicas análisis
Técnicas clásicas
EXTRACCIÓN
CULTIVO
PREENRIQUECIMIENTO
(no selectivo)
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
AISLAMIENTO EN PLACA
CONFIRMACIÓN
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Métodos rápidos
• Pruebas bioquímicas
q
• Pruebas inmunológicas
• Pruebas enzimáticas
• Microscopía
• Métodos eléctricos
• Amplificación molecular
• Citometría
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Técnicas análisis
• Pruebas bioquímicas
• Pruebas inmunológicas
Reacción antígeno-anticuerpo
• Pruebas enzimáticas
Sistemas miniaturizados,
tiras catalasa, oxidasa...
•
•
•
•
ELISA
S
Separación
ió inmunomagnética
i
éti
Inmunoensayo en fase sólida
Sistemas inmunológicos en latex
Determinación ATP
• Microscopía
105
SEÑAL
104
103
• Métodos eléctricos: Impedancia
p
TIEMPO DE DETECCIÓN
• Técnicas base genética
• Citometría
Cit
t í
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- Hibridación con sondas
- Técnicas PCR: PCR-RT, rep-PCR.
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Interpretación de resultados
Puntos críticos de contaminación
100%
100%
16
80%
60%
23
13
26
23
0%
4
9
60%
2
13
40%
40%
20%
PRESENC.
19%
2
80%
19
PROC ESADO
L. monocytogenes
2
2
AUSENCIA
81%
0%
ENVASADO
Listeria spp
3
20%
SUELO
No detectado
PUERTAS
L. monocytogenes
Tendencias
OPERARIOS
Listeria spp
CONDENSADOS
No detectado
Evolucion Presencia de Listeria spp en maquinas en
funcionamiento
Valor Puntual
Acumulado
% Presenc
cia Listeria spp
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
01 03 05 07 09 11 13 15 17 19 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52
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Herramientas
H
i t
Actuales
A t l
para la interpretación de resultados
Caracterización genética mediante REP
REP-PCR
PCR
Interpretación de los resultados mediante un potente software de
análisis vía web (Diversilab System v.3)
Tipificación: permite el análisis
comparativo entre cepas para
ver similitudes y diferencias.
Clasificación: identificación de cepas
mediante la comparación de los perfiles
genéticos con una base de datos.
Aplicaciones
• Estudios epidemiológicos (comparación de muestras procedentes de
diferentes pacientes, lugares y/o fechas).
• Trazabilidad de microorganismos patógenos
ó
y alterantes en la
cadena alimentaria.
• Autentificación de microorganismos de interés y estudio evolutivo.
• Confirmación de resultados analíticos.
• Identificación de especies y serotipos (Salmonella, Listeria…).
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Herramientas
H
i t
Actuales
A t l
para la interpretación de resultados
Gel de Agarosa, muestra la talla de los fragmentos
Técnica
Té
i
d
de electroforesis
l t f
i d
de ADN en gradiente
di t
(DGGE)
• Técnica de separación de ácidos nucleicos.
(“
(“molecular
l
l fi
fingerprinting”)
i ti ”)
• Estudio de la evolución de la diversidad microbiana
de una instalación, equipo o proceso.
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1000bp
p
500
250bp
Gel de gradiente, permite separar las
bandas en base a su secuencia.
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Limitaciones de los métodos de control
• Tipo de superficie
• Sensibilidad de las técnicas
• Especificidad de las técnicas
• Adhesión microbiana
• Otros factores
Las células pueden crecer en capas,
formando biopelículas (biofilms)
Generalmente,, las técnicas utilizadas
subestiman el nºmicroorganismos
en una superficie.
Problemas de repetibilidad y
reproducibilidad
Es necesario el desarrollo de nuevos métodos de control
- Rápidos
- fiables
- con una sensibilidad similar (o mayor) que los métodos convencionales
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P
Proyecto
Europeo
E
Bi
BioliSME
liSME
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ainia
i i
Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Proyecto financiado por la Comisión Europea (7º programa Marco)
htt //
http://www.biolisme.eu
bi li
BIOLISME es el acrónimo del proyecto "Speedy system for sampling and
de ec
detecting
g Listeria
s e a monocytogenes
o ocy oge es in ag
agri-food
ood a
and
d related
e a ed European
u opea
industries".
Objetivo del proyecto: Sistema de monitorización de los niveles de Listeria
monocytogenes
y g
en superficies
p
en contacto con alimentos.
Consorcio del proyecto: 7 socios de 5 países de la EU (especializados en el
campo de la bioquímica, microbiología de alimentos, biosensores, óptica, higiene
y desinfección industrial))
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Esquema del proyecto:
Preparación de
superficies
contaminadas
Desarrollo del
sistema de
muestreo y
recuperación de
Listeria
Desarrollo del
inmuno-ensayo
Desarrollo del
Immunosensor
Integración y
Pruebas
piloto
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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME
Beneficios que aportará el sistema:
Mayor tasa de recuperación de microorganismos en el muestreo de superficies.
Mejora de los niveles de detección del microorganismo.
Integración de las etapas de análisis (muestreo, procesamiento de la muestra y
detección).
Facilidad de uso Sistema semi-automatizado, mínima manipulación.
Reducción de la duración y el coste por análisis.
Aumento del nivel de seguridad alimentaria para el consumidor.
consumidor
Ventaja competitiva para las empresas usuarias.
Con este sistema, las empresas podrán realizar sus propias determinaciones,
analizando
li
d más
á muestras iin situ
i yd
de una fforma rápida,
á id sencilla
ill y fi
fiable.
bl
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Gracias por su atención
atención.
Sonia Porta
L b
Laboratorio
t i de
d Bi
Bioensayos
ainia Centro Tecnológico
[email protected]
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