Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales
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EVALUACION DEL COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES LETALES MEDIAS DE LOS PROYECTOS DE INVESTIGACION DEL LABORATORIO DE BIOENSAYOS DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE CON ORGANISMOS REPRESENTATIVOS DE LA CADENA TROFICA GINA LORENA PEREZ CORREDOR DIANA CAROLINA BLANCO AVILA Tesis de Grado para Optar al Título de Ingenieras Ambientales y Sanitarias UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C. 2010 1 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO DE LAS CONCENTRACIONES LETALES MEDIAS DE LOS PROYECTOS DE INVESTIGACION DEL LABORATORIO DE BIOENSAYOS DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE CON ORGANISMOS REPRESENTATIVOS DE LA CADENA TROFICA GINA LORENA PEREZ CORREDOR DIANA CAROLINA BLANCO AVILA Tesis de Grado para Optar al Título de Ingenieras Ambientales y Sanitarias Director PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER ING. QUIMICO INDUSTRIAL LIC. QUIMICA Y BIOLOGIA UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C. 2010 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Nota de aceptación: ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ Firma de Director ____________________________________ Firma Jurado ____________________________________ Firma Jurado Bogotá D.C., Febrero de 2010 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Agradezco a Dios quien me guía por el buen camino y siempre me acompaña. A mis Padres por apoyarme en cada una de mis decisiones y estar junto a mí en todos los momentos importantes de mi vida, ya que sin ellos no sería posible lograr tantas satisfacciones. A mi hermano por estar siempre junto a mí y escucharme cuando lo necesito. A Iván Sierra porque gracias a su paciencia, colaboración y comprensión el camino se hizo más corto, y logramos llegar a la meta. GINA LORENA PEREZ CORREDOR Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Gracias a Dios porque me lleno la vida de oportunidades y derramo sus bendiciones para encontrar el hogar donde pude surgir y prepararme para la vida. A la virgen por quien siempre me sentí protegida y fortalecida en este camino. A mi mamita por ser mi amiga, mi confidente, mi compañía y por su apoyo incondicional. A mi papá quien siempre me aconsejo para proyectar con seguridad mi futuro. A mi hermano por su compresión y su amistad. DIANA CAROLINA BLANCO AVILA Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. AGRADECIMIENTOS Las autoras expresan sus agradecimientos por su apoyo, tiempo y colaboración a: Al profesor Pedro Miguel Escobar Malaver, Químico Industrial, director del proyecto de grado, por su colaboración, confianza, paciencia y ayuda durante el desarrollo de este proyecto. Ing. Camilo Hernando Guáqueta Rodríguez, Decano de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de La Salle, por su apoyo incondicional, entusiasmo y consejos apropiados durante toda la carrera. A los profesores Ricardo Campos y Hernando Amado, quienes con su buena disposición hicieron posible que lográramos el objetivo. A Todos nuestros amigos y a las personas que contribuyeron de una u otra manera en el desarrollo de esta investigación. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla de contenido 1. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 21 1.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................................... 21 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS .............................................................................................................. 21 2. JUSTIFICACION........................................................................................................................... 22 3. METODOLOGIA.......................................................................................................................... 23 4. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 27 5. MARCO TEORICO ....................................................................................................................... 30 5.1 LOS BIOENSAYOS ......................................................................................................................... 30 5.2 BIOLOGIA DE ORGANISMOS REPRESENTATIVOS DE LA CADENA TROFICA................................. 33 5.2.1 PULGA DE AGUA (Daphnia Pulex) ............................................................................................ 33 5.2.1.1 Clasificación científica ........................................................................................................... 34 5.2.1.2 Morfología ............................................................................................................................. 34 5.2.1.3 Alimentación ......................................................................................................................... 36 5.2.1.4 Reproducción ........................................................................................................................ 36 5.2.1.5 Respiración ............................................................................................................................ 37 5.2.1.6 Sistema Circulatorio .............................................................................................................. 37 5.2.1.7 Sistema Excretor.................................................................................................................... 38 5.2.1.8 Sistema Nervioso ................................................................................................................... 38 5.2.2 PULGA DE AGUA (Daphnia Magna) ......................................................................................... 38 5.2.2.1 Morfología ............................................................................................................................. 39 5.2.2.2 Alimentación ......................................................................................................................... 40 5.2.2.3 Ciclo de vida .......................................................................................................................... 40 5.2.2.4 Reproducción ........................................................................................................................ 40 5.2.2.5 Condiciones de cultivo ...................................................................................................... 41 5.2.3 TRUCHA ARCO IRIS (Orconhyncus Mykiss). ....................................................................... 43 5.2.3.1 Morfología ............................................................................................................................. 44 5.2.3.2 Alimentación ......................................................................................................................... 44 5.2.3.3 Territorio y jerarquía ............................................................................................................. 45 5.2.3.4 Reproducción ........................................................................................................................ 45 5.2.3.5 Condiciones de cultivo .......................................................................................................... 46 5.2.3.6 Anatomo-fisiología del Oncorhynchus mykiss....................................................................... 48 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2.3.6.1 Morfología interna del Oncorhynchus mykiss con una división abdominal – dorsal ......... 51 5.2.4 LECHUGA (Lactuca sativa) ........................................................................................................ 52 5.2.4.1 Morfología ............................................................................................................................. 54 5.2.4.3 Semillas ................................................................................................................................. 55 5.2.4.4 Estructura de las semillas ...................................................................................................... 56 5.2.4.5 Proceso de germinación ........................................................................................................ 56 5.2.4.6 CONDICIONES DE CULTIVO ................................................................................................... 59 5.2.4.7 Características de la lechuga (lactuca sativa) ....................................................................... 61 6. DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD ..................................................................................... 63 6.1 Prueba de sensibilidad ................................................................................................................ 63 7. METODOLOGÍA PARA LA ELABORACIÓN DE BIOENSAYOS ....................................................... 65 7.1 Procedimiento con Daphnia magna y Daphnia pulex ................................................................. 65 7.1.1 INICIACION DEL CULTIVO ......................................................................................................... 65 7.2 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA CON ONCORHYNCUS MYKISS ................................................. 75 7.3 CULTIVO CON LACTUCA SATIVA .................................................................................................. 77 8. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA REALIZACIÓN DE CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS 80 8.1 EXPRESION DE RESULTADOS ....................................................................................................... 81 8.1.1 METODO PROBIT ...................................................................................................................... 81 8.1.2 METODO ANOVA ...................................................................................................................... 82 9. 10. MARCO LEGAL ........................................................................................................................... 82 RESULTADOS ......................................................................................................................... 83 10.1 PRUEBAS CON DICROMATO DE POTASIO PARA CADA UNA DE LOS ORGANISMOS UTILIZADOS EN LOS BIOENSAYOS REALIZADOS EN LA ULS (GRÁFICA 1-14) ......................................................... 84 10.1.1 Daphnia Magna ...................................................................................................................... 84 10.1.2 Daphnia Pulex......................................................................................................................... 86 10.1.3 Oncorhyncus Mykiss............................................................................................................... 88 10.1.4 Lactuca Sativa ........................................................................................................................ 90 10.1.5 ANALISIS DE RESULTADOS...................................................................................................... 91 10.2 PRUEBAS REALIZADAS CON METALES .................................................................................. 91 10.2.1 ANALISIS DE RESULTADOS...................................................................................................... 99 10.3 CARTA CONTROL GENERAL .................................................................................................... 100 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10.4 CARTAS CONTROL DE SENSIBILIDAD PARA CADA UNO DE LOS ORGANISMOS. (PROMEDIO CL) ......................................................................................................................................................... 101 10.4.1 ANALISIS DE LAS GRAFICAS .................................................................................................. 104 10.4.2 ANALISIS CARTA CONTROL GLOBAL ..................................................................................... 105 10.5 COMPARACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS EN EL EXTERIOR Y LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE. .............................................................................................................................................. 107 10.7 COMPARACIÓN DEL DECRETO 1594 DE 1984 CONTRA LOS PROYECTOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO DE BIOENSAYOS DE LA ULS. ............................................. 115 11. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 118 12. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 119 13. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 120 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Generalidades de la Daphnia Magna. Taxonomía Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 2. Generalidades de la Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss) Tabla 3. Anatomo-fisiología del Oncorhyncus mykiss Tabla 4. Órganos fundamentales de la Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss) Tabla 5. Generalidades De La Lechuga Tabla 6. Bioensayos De Toxicidad Empleando Daphnia Magna Tabla 7. Reactivos Necesarios Para Las Soluciones Puras De Cr Y Cu Tabla 8.Carta Control Para Daphnia Pulex Tabla 9. Carta Control Para Daphnia Magna Tabla 10. Carta Control Para Trucha Arco Iris Tabla 11. Carta Control Para Semillas Tabla12. Comparación De CL50 obtenidas En La ULS, Y otros países Tabla 13. Comparacion De Resultados De CL50 y/o CE50 Obtenidos En La Universidad De La Salle Tabla 14. Comparación Decreto 1594 de 1984 desarrollados en el Laboratorio De Bioensayos De La ULS. LISTA DE FOTOGRAFÌAS Fotografía 1. Morfología De Daphnia Pulex Fotografía 2.Hembra Daphnia pulex Fotografía 3. Macho Daphnia pulex Fotografía 4 y 5 Huevos de Daphnia pulex Fotografía 6. Vista Microscópica Daphnia Magna Fotografía 7 y 8. Huevos de Daphnia Magna Fotografía 9. Morfología D.magna Fotografía 10. Trucha Arcoíris Fotografía 11. Huevos de trucha arcoíris Fotografia 12. Alevinos de trucha arcoiris contra Los proyectos Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fotografía 13. Morfología Externa De La Trucha Arcoíris Fotografía 14. Morfología Externa De La Lechuga Fotografía 15 Y 16. Cama De Lechuga Fotografía 17 Y 18. Lechugas Formadas En Cama De Cultivo LISTA DE FIGURAS Figura 1. Parte Interna De Una Daphnia Pulex Figura 2. Morfología Interna D. magna Figura 3. Morfología Interna de la trucha arcoíris Figura 4. Partes De La Semilla De Lechuga Figura 5. Germinación De La Lechuga Figura 6. Modelo de construcción de la Carta Control para el Tóxico de Referencia. Figura 7 Lectura en la Cámara De Neubauer Figura 8. Metodología para la determinación de la concentración letal media empleando D. magna y D. pulex Figura 9. . Metodología para la determinación de la concentración letal media empleando alevinos de trucha arcoíris. LISTA DE GRAFICAS Gráfica 1. Tesis Plomo Y Plata Grafica 2. Tesis Cadmio Y Zinc Grafica 3. Tesis Cromo Y Cobre Grafica 4. Tesis Cianuro Grafica 5. Tesis Glifosato Grafica 6. Tesis Cloro Grafica 7. Tesis Arsénico Y Níquel Grafica 8. Tesis Detergente Grafica 9. Tesis Fenol Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Grafica 10. Tesis Mercurio Y Cromo Grafica 11. Tesis Glifosato Grafica 12. Tesis Plomo Y Níquel Grafica 13. Tesis Cobre Y Zinc Grafica 14.Tesis Ptar Grafica 15. Pruebas Con Cianuro Para Daphnia Magna Grafica 16. Pruebas Con Plomo Para Daphnia Magna Grafica 17. Pruebas Con Plata Para Daphnia Magna Grafica 18. Pruebas Con Cobre Para Daphnia Magna Grafica 19. Pruebas Con Cromo Para Daphnia Magna Grafica 20. Pruebas Con Cloro Para Daphnia Pulex Graficas 21. Pruebas Con Arsénico Para Daphnia Pulex Graficas 22. Pruebas Con Níquel Para Daphnia Pulex Grafica 23. Prueba Con Detergente Las Para Daphnia Pulex Grafica 24. Prueba Con Fenol Para Daphnia Pulex Grafica 25. Prueba Con Mercurio Para Trucha Arcoíris Grafica 26. Prueba Con Zinc Para Trucha Arcoíris Gráfica 27. Prueba Con Zinc Para Daphnia Magna Grafica 28. Prueba Con Cadmio Para Daphnia Magna Grafica 29. Carta Control R Grafica 30. Carta Control D. Pulex Grafica 31. Carta Control D. Magna Grafica 32. Carta Control Trucha Arcoíris Grafica 33. Carta Control Lactuca Sativa Grafica 34. Carta Control Global D. Pulex Grafica 35. Carta Control Global D. magna Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Grafica 36. Carta Control Global Trucha Arcoris Grafica 37. Carta Control Global Lactuca Sativa LISTA DE ANEXOS ANEXO A: Tablas de las cartas control con dicromato de potasio y tablas de la concentraciónes letales medias para el metal o sustancia utilizada para el oganismo Daphnia pulex. ANEXO B: Tablas de las cartas control con dicromato de potasio y tablas de la concentraciónes letales medias para el metal o sustancia utilizada para el oganismo Daphnia magna. ANEXO C: Tablas de las cartas control con dicromato de potasio y tablas de la concentraciónes letales medias para el metal o sustancia utilizada para el oganismo Lactuca sativa. ANEXO D: Tablas de las cartas control con dicromato de potasio y tablas de la concentraciónes letales medias para el metal o sustancia utilizada para el oganismo oncorhyncus mykiss. ANEXO E: Diagramas de los resultados de toxicidad para cada organismo con la sustancia o metal utilizado. Proyectos de la Universidad de la Salle. ANEXO F: Diagrama del ciclo vital para la pulga de agua. ANEXO G: Proyectos de la Universidad de la Salle, realizados hasta Marzo de 2009. ANEXO H: Cronograma de los proyectos de bioensayos de la Universidad de la Salle, establecidos para los años 2010 y 2011. GLOSARIO Bioensayo: Son herramientas de diagnóstico utilizadas para determinar el efecto de agentes físicos/químicos sobre organismos de prueba, bajo condiciones experimentales Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. específicas y controladas. Estos efectos pueden ser evaluados por la reacción de los organismos (muerte, crecimiento, proliferación, multiplicación, cambios morfológicos, fisiológicos o histológicos). Carta control: Gráfico utilizado para seguir cambios a través del tiempo del punto final medido para un compuesto tóxico de referencia. En el eje X se grafica el número de ensayo, y en el eje Y, la concentración tóxica efectiva. CE50/CL50: Concentración efectiva o de inhibición media. Concentración del material en agua, suelo o sedimento que se estima afecta al 50% de los organismos de ensayo. La CE50 y sus límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis estadístico. Contaminante: Sustancia ajena, presente en un sistema natural en una concentración más elevada de lo normal por causa de actividad antrópica directa o indirecta. En un sentido más amplio se le define como la presencia de cualquier agente físico, químico o biológico, o de combinaciones de los mismos en lugares, formas y concentraciones tales y con tal duración que sean o puedan ser nocivos para la salud, la seguridad o bienestar de la población, o perjudiciales para la vida animal y vegetal, o que impidan el uso y goce de las propiedades y lugares de recreación. Dicromato de Potasio: (K2Cr2O7) es una sal del hipotético ácido dicrómico. Sustancia de color intenso naranja, oxidante fuerte, en contacto con sustancias orgánicas puede provocar incendios. Dosis letal 50 (DL50): Es la dosis única obtenida estadísticamente de una sustancia de la que cabe esperarse que, administrada por vía oral, cause la muerte a la mitad de un grupo de organismos en un tiempo determinado. Ensayo de toxicidad: Determinación del efecto de un material o mezcla sobre un grupo de organismos seleccionados bajo condiciones definidas. Mide las proporciones de organismos afectados o el grado de efecto luego de la exposición a la muestra. Lactuca sativa (Lechuga): Planta herbácea hortícola, propia de las regiones templadas, comestible. Tóxico: Sustancia química que Dependiendo de la concentración y tiempo de exposición produce alteraciones bioquímicas, fisiológicas, estructurales o la muerte a un organismo vivo. Radícula: Extremo basal del eje embrionario, raíz originada en la semilla y que dará la raíz primaria. Tóxico: Sustancia química que Dependiendo de la concentración y tiempo de exposición produce alteraciones bioquímicas, fisiológicas, estructurales o la muerte a un organismo vivo. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Toxicidad aguda: Efecto adverso (letal o subletal) inducido sobre los organismos de ensayo en prueba durante un periodo de exposición del material de ensayo, usualmente de pocos días. Toxicología acuática: Es el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos adversos producidos por productos químicos y materiales antropogénicos sobre los organismos acuáticos. Tóxico de referencia: Compuesto químico orgánico o inorgánico utilizado en pruebas de toxicidad con fines de control de calidad analítica de los organismos a utilizar en las pruebas. Cadena trófica: también llamada cadena alimentaria, es la corriente de energía y nutrientes que se establece entre las distintas especies de un ecosistema en relación con su alimentación. Concentración: cantidad de sustancia aplicada al medio. Dosis: cantidad de sustancia administrada, expresada en términos de: unidad/peso corporal. Tiempo de exposición: tiempo de contacto de los organismos de prueba con la solución estudiada. Tolerancia: es la habilidad de un organismo a tolerar una condición dada por un periodo de tiempo prolongado de exposición, sin que muera. Coeficiente de correlación lineal: es un índice estadístico que mide la relación lineal entre dos variables cuantitativas. A diferencia de la covarianza, la correlación de Pearson es independiente de la escala de medida de las variables. Metales pesados: Son todos aquellos metales que tienen una densidad superior a 5 g/l Plata: es un elemento químico de número atómico 47 situado en el grupo 1b de la tabla periódica de los elementos. Su símbolo es Ag (procede del latín: argentum). Es un metal de transición blanco, brillante, blando, dúctil, maleable. Cromo: es un elemento químico de número atómico 24 que se encuentra en el grupo 6 de la tabla periódica de los elementos. Su símbolo es Cr. Es un metal que se emplea especialmente en metalurgia. Cobre: es el elemento químico de número atómico 29. Se trata de un metal de transición de color rojizo y brillo metálico que, junto con la plata y el oro, forma parte de la llamada familia del cobre. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Arsenico: es un elemento químico tabla periódica cuyo símbolo es As y el número atómico es 33. En la tabla periódica de los elementos se encuentra en el quinto grupo principal. El arsénico se presenta raramente sólido, principalmente en forma de sulfuros. Niquel: es un elemento químico de número atómico 28 y su símbolo es Ni, situado en el grupo 10 de la tabla periódica de los elementos. Glifosato: es un herbicida no selectivo de amplio espectro, desarrollado para eliminación de hierbas y de arbustos, en especial los perennes. Fenol: en forma pura es un sólido cristalino de color blanco-incoloro a temperatura ambiente. Su fórmula química es C6H5OH, y tiene un punto de fusión de 43ºC y un punto de ebullición de 182ºC. Cloro: es un elemento químico de número atómico 17 situado en el grupo de los halógenos (grupo VII A) de la tabla periódica de los elementos. Su símbolo es Cl. En condiciones normales y en estado puro forma dicloro: un gas tóxico amarillo-verdoso Mercurio: Es un metal pesado plateado que a temperatura ambiente es un líquido inodoro. Es mal conductor del calor comparado con otros metales, aunque no es mal conductor de la electricidad. Se alea fácilmente con muchos otros metales como el oro o la plata produciendo amalgamas, salvo con el hierro. Zinc: es un elemento químico de número atómico 30 y símbolo Zn situado en el grupo 12 de la tabla periódica de los elementos. La etimología de zinc parece que viene del alemán, Zincken o Zacken, para indicar el aspecto con filos dentados del mineral calamina, luego fue asumido para el metal obtenido a partir de él. NOEC: (NON OBSERVED EFFECTS DOSES/CONCENTRATION) Dosis o concentración máxima que no produce un efecto subletal. LOEC: (LOWED OBSERVED EFFECTS CONCENTRATION) Concentración mas baja a la que se observa efecto. Pulgas de agua o daphnias: Pulgas de agua, es el nombre popular que se les da a estos pequeños crustáceos de agua dulce y que deben su calificativo de pulgas, no porque sus hábitos se parezcan a los de los insectos hemotófagos y parásitos de animales, sino por su peculiar modo de nadar, dando pequeños saltos dentro del agua. Taxonómicamente las Daphnias pertenecen a la familia Daphnidae y al suborden Cladócera, las pulgas de agua difieren de las arañas, mosquitos y otros insectos en muchos aspectos; respiran por medio de agallas, poseen un par de antenas y en general tienen cinco pares de patas, que utilizan para alimentarse y para la locomoción. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Oncorhynchus mykiss o trucha arcoiris: Es un pez de agua dulce de la familia de los Salmónidos apreciado en gastronomía y empleada en pesca deportiva, puesto que la especie ha sido introducida en multitud de cursos de agua (de hecho, se la considera especie invasora). Se la considera nativa de Norteamérica. Sus hábitats son sistemas montañosos con ríos, quebradas y lagos. En cuanto a la dieta, es generalista, alimentándose de invertebrados y peces de escaso tamaño. RESUMEN En este trabajo se evaluó el comportamiento de las concentraciones letales medias de los 20 proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la universidad de la Salle Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. por medio de la recopilación de dichas concentraciones y de las sensibilidades de cada uno de los proyectos. Con los resultados de las investigaciones de toxicidad acuática con metales pesados en los dos últimos años, se realizaron comparaciones por medio de tablas, de los rangos de concentraciones letales medias CL50, para cada organismo según la sustancia o metal trabajado, teniendo en cuenta los datos de CL50 de las 20 tesis de la Universidad, el decreto 1594/84 y otros datos investigados en el exterior y en otras entidades Posteriormente se realizó una carta control global, teniendo como base los datos de las sensibilidades generadas en cada uno de los proyectos de investigación, y se generaron otras cartas control para las diferentes pruebas toxicológicas teniendo como ejes, la concentración del dicromato de potasio (Toxico de referencia) o de los metales (en forma pura) que se han trabajado en las diferentes tesis, y el porcentaje de mortalidad para el caso de Daphnia magna, Daphnia pulex y oncorhyncus mykiss y de inhibición para el caso de Lactuca sativa. Así mismo se aplicó un índice estadístico que mide la relación lineal entre dos variables cuantitativas, denominado el coeficiente de correlación de Pearson, con el fin de establecer la confiabilidad de los resultados generados en los 20 proyectos de bioensayos de la Universidad de La Salle y determinar el grado de toxicidad o escala toxicológica para estos organismos consumidores primarios. Por último se genero un cronograma de actividades para la elaboración de los proyectos de investigación de bioensayos en la universidad de la Salle con las sustancias de interés sanitario que faltan por analizar, según el decreto 1594 de 1984. PALABRAS CLAVE: Concentración letal media, Daphnia magna, Daphnia pulex, Oncorhyncus mykiss, Lactuca sativa, metales pesados, toxicidad, carta control, coeficiente de correlación lineal. ABSTRAC Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. In this research, was evaluated the behavior of half lethal concentrations of the 20 projects laboratory bioassays of La Salle University through the compilation of these concentrations and sensitivities of each projects. With the results of aquatic toxicity investigations of heavy metals two years ago, comparisons were made using tables, with CL50 ranges for each organism depending on the substance or metal working, taking into account the information of CL50 of the 20 thesis of the University,1594/84 decree and other datas investigated abroad and in the other entities. Later, was performed a control global chart, based in the information generated in individual research projects, and other control chart were generated for different toxicological tests having as axes the concentration of potassium dichromate (Toxic reference) or metals (in pure form) that worked in different thesis, and the mortality rate for the case of Daphnnia magna, Daphnia pulex and Oncorhynchus mykiss and inhibition in the case of Lactuca sativa. In This part applies to a statistical index that measures the lineal relationship between two quantitative variables, called the Pearson correlation coefficient to establish the reliability of the results generated in the 20 projects of bioassays in the University and determine the degree of toxicity. Finally generate a schedule of activities for the realization of bioassays research projects at the La Salle University , with substances of sanitary interest that missing by analyzing, taking into account 1594/84 decree. KEY WORDS: Half lethal concentration, daphnia magna, daphnia pulex, Oncorhyncus mykiss, Lactuca sativa, heavy metals, toxicity, control chart, lineal correlation coefficient. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. INTRODUCCION Los bioensayos son herramientas ampliamente utilizadas en el campo de la ecotoxicología la cual se ocupa del estudio de efecto y destino de los agentes tóxicos de origen antropogénico a los ecosistemas acuícolas y terrestres (Larrain, 1995). Estos permiten evaluar el grado de afectación que una sustancia química tiene en organismos vivos. Uno de los valores calculados es la concentración letal media CL50 (LC50), este dato representa la concentración de un químico o dilución de una muestra, en la cual el 50% de los organismos muere en un tiempo determinado, generalmente entre 48 y 96 horas. En contraste, las pruebas crónicas estiman la concentración efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado (Rodríguez y Esclapes, 1995) En los diferentes proyectos de bioensayos de toxicidad realizados en la Universidad de la Salle, se han utilizado los siguientes organismos: Daphnia magna, Daphnia pulex, lactuca sativa y orconhyncus mykiss; estos organismos deben ser fáciles de obtener o cultivar, ser abundantes durante todo el año y sensible a los tóxicos. Al efectuar dichas pruebas de toxicidad, se debe realizar su estandarización, estableciendo la sensibilidad de la especie en estudio y la reproducibilidad del experimento, teniendo en cuenta un toxico de referencia. Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de la población expuesta a cierto agente toxico se deba al efecto de este y no a variaciones de la sensibilidad de los organismos (Silva, et al, 2003). El proyecto contemplo una primera fase, la cual comprendió la recolección inicial de información relevante, es decir la consulta de fuentes bibliográficas; en esta parte se incluyen las 20 tesis de bioensayos de la Universidad de La Salle, información de pruebas de toxicidad acuática realizadas en diferentes entidades de país y en el exterior y el decreto 1594 de 1984. La segunda fase comprendió el manejo de información, es decir la clasificación de los proyectos de la Universidad de La Salle de acuerdo con cada organismo utilizado, la recopilación de las concentraciones letales medias y de las sensibilidades con sus respectivos limites. En la tercera fase se verificaron las metodologías de todos los proyectos con el fin de unificarlos; se realizaron tablas comparativas de las diferentes concentraciones letales medias de diferentes fuentes, se realizo la carta control global con las sensibilidades y las cartas control teniendo en cuenta las concentraciones y porcentajes de mortalidad e inhibición para las diferentes pruebas toxicológicas, para determinar el coeficiente de correlación lineal. Por último se realizo el cronograma de actividades para los proyectos de bioensayos que faltan en la Universidad de La Salle. En la última fase se analizaron los resultados del coeficiente de correlación lineal, y se realizaron los análisis de resultados. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar el comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Comparar la sensibilidad de los resultados obtenidos en cada una de los proyectos de Bioensayos de Toxicidad de la Universidad de La Salle. Comparar las Concentraciones Letales (CL50) de los diferentes organismos utilizados en los proyectos realizados en la Universidad de la Salle, con resultados de concentraciones letales (CL50) obtenidos en el exterior (Argentina, Venezuela, Perú, México, E.U.A) Establecer el grado de toxicidad de las sustancias de interés sanitario, con los resultados generados con cada una de las especies de los proyectos de la Universidad de La Salle, con el fin de incorporarlos en el proyecto, Ordenación del recurso hídrico de la cuenca alta del rio Bogotá, basada en el contexto de sus realidades socio ambientales y eco toxicológicas. Aplicar un coeficiente de correlación lineal con los resultados obtenidos en los 20 proyectos del laboratorio de Bioensayos de la Universidad de la Salle, teniendo en cuenta cada una de las especies utilizadas. Generar el cronograma de actividades para la elaboración de los proyectos de investigación de las sustancias de interés sanitario que falta analizar según el decreto 1594 de 1984. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 2. JUSTIFICACION El agua es fundamental para todas las formas de vida, es un bien indispensable para el desarrollo de toda civilización, ya que posibilita la expansión demográfica y los progresos de la producción, que van desde la agricultura hasta la electrónica, por lo cual es en uno de los recursos esenciales de la naturaleza. Para nosotros el agua parecería como un recurso prácticamente ilimitado, sin embargo, de esa enorme masa líquida, sólo el 3% es dulce y la mitad de ella es potable. Las industrias pueden producir el ingreso de las aguas de sustancias altamente tóxicas: cobre, cinc, plomo, mercurio, entre otras. Debido a que estos metales suelen ser acumulativos, la ingesta repetida de pequeñas cantidades determina al cabo del tiempo altas concentraciones de metales en los tejidos de los organismos. Los ensayos de toxicidad con organismos acuáticos son bioensayos empleados para reconocer y evaluar los efectos de los contaminantes sobre la biota, es decir que estudia y analiza los efectos que tienen los gentes físicos y químicos sobre organismos vivos. En ellos se usa un tejido vivo, organismo, o grupo de organismos, como reactivo para evaluar los efectos de cualquier sustancia fisiológicamente activa. La normatividad Colombiana vigente (Dec 1594/84) menciona pruebas de toxicidad y establece estándares en cuanto a la reglamentación de efluentes, pero no se tiene una legislación ambiental que trate de establecer una escala toxicológica para varios metales pesados contaminantes en agua dulce, con los distintos organismos consumidores primarios que hacen parte del ecosistema. Por esto en este proyecto se relacionaron los proyectos de los 20 bioensayos de la Universidad de La Salle, teniendo en cuenta las concentraciones letales medias de cada proyecto, para compararlos con otros resultados de concentraciones letales medias encontrados en otras entidades tanto en Colombia como en el exterior, para así poder establecer la escala toxicológica para cada organismo con los diferentes metales utilizados y sus límites de confianza. Con esto se empezara a establecer los grados de toxicidad para una futura legislación ambiental. También se realizó un cronograma para futuros trabajos de tesis con bioensayos en la Universidad de La Salle, con diferentes sustancias y/o metales de interés sanitario. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 3. METODOLOGIA En la metodología se describirán las cuatro fases efectuadas durante la elaboración de este proyecto de investigación, como lo son: Recopilación de información, compilación de datos, verificación de procedimientos y metodologías, obtención y análisis de resultados. FASE I: En esta fase se realizó la consulta de varias fuentes bibliográficas, tales como artículos, libros, páginas de internet y tesis elaboradas a nivel nacional e internacional. Los puntos clave que se tuvieron en cuenta fueron: los Bioensayos realizados en el laboratorio de la Universidad de la Salle, los organismos representativos utilizados en dichos bioensayos, los protocolos requeridos para las pruebas de toxicidad y finalmente la legislación correspondiente a este tema. FASE II: Con la información recopilada en la fase anterior, se procedió a extraer los datos de Concentración Letal Media y sus límites tanto superior como inferior, las concentraciones nominales obtenidas para cada tesis y sus porcentajes de germinación o mortalidad según fuera el caso, esto teniendo en cuenta los 20 proyectos de investigación realizados en el laboratorio de bioensayos de la Universidad de la Salle. Además se verificó cuales de las sustancias de interés sanitario citadas en el Decreto 1594 de 1984 habían sido evaluadas hasta el momento y con qué organismo de la cadena trófica. Así mismo, se compilaron datos de concentraciones letales medias obtenidas en otras universidades o institutos de Colombia y de otros países. Finalmente se utilizó información secundaria para la realización del análisis del proyecto. FASE III: Con base en los protocolos Lb 01 a 07 se verificó cada una de las 20 tesis realizadas teniendo en cuenta los siguientes aspectos: - Pulga de Agua (Daphnia Pulex y Daphnia Magna)*: Preparación del agua reconstituida. Preparación del medio Bristol. Centrifugación de algas verdes. Conteo de algas. Mantenimiento del cultivo daphnia magna. Pasos para la realización del ensayo. - Trucha (Oncorhincus Mykiss)* Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Variable independiente Variable dependiente Constantes Aclimatación Alimentación Mantenimiento de los peces en su proceso de aclimatación. Fase pruebas de toxicidad Preparación del agua de solución. Montaje de los ensayos de toxicidad Toma de muestras y preservación para pruebas de toxicidad. - Semillas (Lactuca Sativa)* Constantes Preparación de las diluciones Siembra de semillas Mediciones de efecto *Dichos procedimientos se explican en las páginas 45 a 61 FASE IV: Una vez finalizado el compendio de información, se procedió a realizar tablas comparativas de la siguiente forma: datos obtenidos en la universidad de la Salle con datos obtenidos en otras universidades del país, datos obtenidos en la universidad de la Salle comparados con el Decreto 1594 de 1984, datos obtenidos en el exterior comparados con datos obtenidos en Colombia y en la Universidad de La Salle. Haciendo uso de las tablas realizadas anteriormente se hizo el análisis respectivo de cada una de ellas, verificando que datos se encontraban dentro de la legislación ambiental aplicada (Dec 1594/84) Con los datos recopilados se realizaron los siguientes procedimientos: REALIZACIÓN DE CARTA CONTROL GLOBAL: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Selección de datos de concentración Letal media (CL50) y/o Concentración Efectiva según el microorganismo con el que se desee trabajar, de cada una de las pruebas de sensibilidad realizadas con el Dicromato de Potasio (K2Cr2O7). Selección de los límites tanto inferior como superior de cada una de las pruebas realizadas con el Dicromato de Potasio. Los datos nombrados anteriormente deben agruparse según el tipo de microorganismo empleado. Una vez seleccionadas todas las CL50 para cada uno de los microorganismos trabajados en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de La Salle, se procede a obtener promedios de los límites inferior y superior. Haciendo uso de Excel se procede a graficar el número de pruebas compendiadas, contra las CL50 correspondientes a cada microorganismo. Además se debe trazar el promedio obtenido de cada uno de los límites. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE PEARSON Con los 20 proyectos realizados en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de la Salle, se hace la selección de las concentraciones nominales utilizadas tanto en las pruebas realizadas con Dicromato de Potasio como con cada uno de los metales evaluados según sea el caso, y sus respectivos porcentajes de mortalidad o de efectividad (semillas) Para aplicar el coeficiente de correlación lineal de Pearson se utilizó como variable independiente la concentración nominal, y como variable dependiente la CL50 o CE según el microorganismo evaluado. Una vez ubicados respectivamente los valores mencionados, se procede a hallar el valor de r (coeficiente de correlación lineal) y a graficar. En caso de ser necesario se normaliza la grafica y luego se vuelve a sacar su respectiva r. Finalmente se realizaron los análisis de cada una de las graficas obtenidas, y se concluyo teniendo en cuenta la carta control global de cada uno de los microorganismos empleados en las 20 tesis de Bioensayos de la Universidad de la Salle. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FUENTE: LAS AUTORAS Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 4. ANTECEDENTES En las últimas dos décadas se han desarrollado protocolos internacionales estandarizados que cubren las exigencias científicas y prácticas para realizar ensayos de eco toxicidad con micro algas. Estos protocolos son recomendados por la Organización para la Cooperación Económica y Desarrollo (OECD, 1984), legalmente requeridos por la Comunidad Europea, y utilizados rutinariamente por agencias de protección ambiental en países como Estados Unidos, Canadá, Francia y Alemania.1 Otras organizaciones internacionales (ASTM, ISO, EC y USEPA) han estandarizado metodologías para la realización de bioensayos con distintos organismos, en donde además se describen métodos de cultivo, condiciones de los experimentos, aplicabilidades y restricciones. En el Laboratorio de Hidrobiología de la Universidad Nacional de Córdoba (Argetina) han llevado a cabo diversos bioensayos de ecotoxicidad utilizando especies de micro algas aisladas de ambientes naturales de la Provincia y mantenidas en cultivo de laboratorio, a las que se les añadieron distintas dosis de dicromato de potasio, un tóxico de referencia utilizado rutinariamente. En Chile los laboratorios comúnmente mantienen cultivos de D. magna importada, por su mayor tamaño y por ser una especie usada mundialmente. Por estos motivos, el Instituto de Normalización (INN) de Chile ha normado el protocolo de bioensayo con Daphnia considerando ambas especies. La carencia de información eco toxicológica con representantes chilenos de D. pulex llevó a evaluar su sensibilidad ante un tóxico de referencia (bicromato de potasio) calibrando con esta especie la metodología aplicada en el Laboratorio de Bioensayos, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción. En Uruguay existen antecedentes de trabajos independientes donde bioensayos individuales con organismos acuáticos, han sido aplicados para la toxicidad de efluentes industriales, así como para determinar el grado de contaminación de aguas naturales que constituyen cuerpos receptores de dichos efluentes. En tal sentido la DINAMA trabaja en la temática desde 1998 y ha fortalecido esta línea de trabajo mediante la asesoría técnica de expertos del environment Canadá. A partir de entonces el sector de eco toxicología llevó a cabo un trabajo de investigación sobre la evaluación de la toxicidad aguda de efluentes industriales vertidos a ambientes acuáticos en el Uruguay, este proyecto fue elaborado en el marco de la convocatoria que el centro internacional de investigaciones para el desarrollo de Canadá, realizo a los gobiernos municipales de América Latina y el Caribe. 2 1 Articulo. Calibración del bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia pulex. Gayana, Concepción, 2003. 2 Informe final. Los bioensayos como herramienta de evaluación de la toxicidad de los efluentes industriales en Uruguay, 2002. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. En el instituto de ecología de la Universidad de Parma, Italia se realizo un estudio analizando la mortalidad de Daphnia magna con pruebas de toxicidad crónica. Se utilizaron Modelos de regresión lineal para evaluar la posibilidad de predecir las probabilidades de muerte a largo plazo. Los resultados se obtuvieron, realizando ensayos de toxicidad con cadmio y piridina, que dio pautas de mortalidad diferentes en relación con el tiempo.3 En la Universidad de Estocolmo, Suecia; se realizo una investigación por parte del departamento de sistemas ecológicos, la cual tuvo como fin determinar si la especie Daphnia magna es ecológicamente representativa para la realización de pruebas de toxicidad. En esta investigación se menciona que Daphnia magna, se utiliza comúnmente en las pruebas de toxicidad acuática, debido a que es fácil y económica para uso de laboratorio; es relativamente pequeña, tiene un ciclo de vida corto y alta fecundidad. Además se compara a Daphnia con otros cladóceros y se llega a la conclusión de que esta especie tiende a ser menos sensible a sustancias toxicas que otros cladóceros investigados.4 En la Universidad del estado de Washington, se realizo una investigación en el departamento de entomología, que se trataba de la toxicidad aguda en el agua de un estado de Washington, en una región de cultivo de arándano, realizando bioensayos de laboratorio para Daphnia pulex. Las altas concentraciones de insecticidad organofosforados, fueron detectados en Grayland; la preocupación sobre el impacto de estos plaguicidas sobre la salud humana y el medio ambiente, llevo a realizar esta investigación de las posibles repercusiones de una especie como indicador, en este caso Daphnia pulex.5 En la universidad de Wisconsin, Madison se realizo una investigación sobre la variación morfológica de Daphnia pulex y las especies de América del norte. Se aplico un análisis multivariante para identificar la variación morfológica de 18 caracteres para cada 351 organismos en 33 poblaciones. El análisis indicó que actualmente existen diversas especies q no se han reconocido hasta el momento.6 3 Articulo. prediction of mortality in chronic toxicity tests on daphnia magna. Universidad Parma, Italia, 1994. 4 Articulo. Is daphnia magna an ecologically representative zooplankton species in toxicity tests?. Universidad de Estocolmo, Suecia, 1995. 5 Articulo. Acute toxicity of drainage ditch water from a Washington state cranberry-growing region to Daphnia pulex in laboratory bioassays. Universidad del estado de Washington, 2001. 6 Articulo. Morphological variation of Daphnia pulex Leydig (Crustacea: Cladocera) and related species from North America. Universidad de Wisconsin, Madison, 1998. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. En Colombia se empezaron a implementar los Bioensayos de toxicidad en 1988, con la bióloga Clara Inés Ortiz, quien hizo el primer curso regional de Bioensayos en el Pacifico Sudeste. A partir de ahí se emprendieron trabajos de bioensayos en la Corporación Autónoma Regional de Cundinamarca CAR con ayuda de la Universidad Nacional de Colombia mediante el proyecto CAR – BID, por medio del contrato interinstitucional para la realización de trabajos a nivel investigativo, en el año 2001. Luego estas investigaciones se iniciaron en otras universidades como la Nacional, UDCA, Javeriana y Andes. En la Universidad Javeriana se realizó un artículo sobre bioensayos llamado “Evaluación de Lactuca sativa y selenastrum capricornutum como indicadores de toxicidad en aguas”, el cual tenía como objetivo comparar la sensibilidad de S. capricornutum con el ensayo de Lactuca sativa y seleccionar el mejor indicador de toxicidad. Para este fin, se determinaron como puntos finales, efectos de estimulación o inhibición sobre el crecimiento de las células algales y las semillas de lechuga. Se determinó la sensibilidad de cada organismo frente a Zn (II) como tóxico de referencia para homologar los resultados entre S. capricornutum y L. sativa.7 En la Universidad de la Salle fue fundado el laboratorio de bioensayos en enero de 2008 y a partir de ahí, se han trabajado 20 tesis con diferentes organismos y metales, y en este momento se están realizando otras investigaciones y se tiene programado empezar a trabajar con bacterias. 7 Articulo. Assessment of lactuca sativa and selenastrum capricornutum like indicators of water toxicity. Universidad Javeriana, revista de la facultad de ciencias, 2000. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5. MARCO TEORICO 5.1 LOS BIOENSAYOS Desde la posguerra se intensificó el uso de bioensayos para el control de la calidad del agua, utilizándose una amplia variedad de organismos, desde bacterias hasta peces, pasando por casi todos los animales y vegetales8. Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad se desconoce (FAO, 1981). Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies 9 y permiten evaluar el grado de toxicidad de una sustancia química, un efluente, un cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos10. Puede determinarse la influencia relativa de cada factor sobre los parámetros biológicos estudiados. Los rangos de variación de los factores considerados pueden ser mayores que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio de su modo de acción. También pueden estudiarse combinaciones de dos o más factores, lo que permite revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a cabo. 11 Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en organismos vivos bajo condiciones de laboratorio, se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y subletales (CL50) que afectan negativamente organismos vivos en los ambientes marinos, estuarinos y dulceacuícolas. 12 8 Juan.C, Daphnia magna el canario de las aguas, consejo Nacional de investigaciones científicas y técnicas- Instituto Nacional de limnologia. 9 Reish, D. Manual of methods in aquatic environment research.. FAO. Roma, Italia, 1987. 10 Esclapés, M. Protocolos estándares para bioensayos de toxicidad con especies acuáticas. Gerencia General de Tecnología. Departamento de Ecología y Ambiente. INTEVEP. PDVSA. Venezuela, 1995. 11 Rodríguez, M. Bioensayos con organismos del microplancton. Ecosistemas de Aguas Continentales. La Plata, Argentina, 1995. 12 Villamar, F. Bioensayo de toxicidad (CL50) del dispersante de petróleo BP 1100 WD, con fitoplancton marino (Tetraselmis sp). Acta Oceanográfica del Pacífico. INDOCAR, Ecuador, 1996. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Para proteger el medio acuático es necesario fijar límites superiores a las descargas de contaminantes perjudiciales químicos y físicos, además de vigilar y regular las descargas que se realicen posteriormente. Los límites superiores de las descargas se derivan de la consideración de los criterios apropiados de calidad de agua formulados a partir de datos de respuestas para sistemas biológicos13 (bioensayos crónicos o agudos) Las pruebas pueden durar varios periodos, pero las de 96 horas son las más comunes. Los individuos son expuestos a concentraciones crecientes del tóxico para determinar cambios en el organismo. En general la muerte es el criterio más utilizado en la prueba de 96 horas. Uno o más controles son utilizados en organismos expuestos a similares condiciones excepto cuando existe falta de disponibilidad del tóxico. Los bioensayos toxicológicos tienen por finalidad determinar las concentraciones de un tóxico dado que ocasionen efectos dañinos o nocivos en un organismo modelo. Estos efectos pueden incluirse en las siguientes categorías14: Afectación del término de vida Alteración de la tasa de crecimiento Cambios de los parámetros reproductivos Se pueden realizar bioensayos en el laboratorio bajo condiciones controladas o en el campo directamente en el medio natural. Los bioensayos de laboratorio pueden ser mono o multiespecíficos. Los monoespecíficos son diseñados para obtener información acerca de los efectos de la calidad de agua sobre la supervivencia y aspectos de la estructura y dinámica de una población dada. Los multiespecíficos pueden ofrecer información sobre el impacto a nivel de una comunidad determinada Los bioensayos de campo consisten en la exposición de una o más poblaciones a la acción directa del cuerpo de agua, para ello se utilizan contenedores que permiten mantener la población en estudio en un espacio adecuado, sin afectar su relación con el medio. Estos proponen, principalmente, estudiar los efectos sobre comunidades o poblaciones, sin prestar atención a los mecanismos de acción de los contaminantes a nivel de los individuos en particular15. El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores propios de los ambientes 13 FAO. Manual de métodos de investigación del medio ambiente acuático. Bases para la elección de ensayos biológicos para evaluar la contaminación marina, 1981. 14 15 Reish, D. Manual of methods in aquatic environment research. FAO. Roma, Italia, 1987. Tortorelli, M. Calidad de agua de un ambiente acuático sometido a efluentes contaminantes. Ecosistemas de Aguas Continentales. La Plata, Argentina, 1995. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. evaluados, lo cual favorece indirectamente la preservación de la biodiversidad local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de las técnicas experimentales para el mantenimiento de organismos silvestres afecta la interpretación y comparación de los resultados entre laboratorios, por lo que se hace necesario desarrollar metodologías estandarizadas para establecer condiciones controladas Al usar organismos provenientes directamente del hábitat natural, los resultados pueden verse distorsionados por fuentes de variabilidad no previstas, como nutrición y dinámica de la población, estrés por depredación, etc. Estas variables pueden ser controladas o eliminadas en las poblaciones de laboratorio; además, el entrecruzamiento consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una considerable reducción de la variabilidad genética Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros, también llamados pulgas de agua, son crustáceos pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda. Debido a su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se les considera especies indicadoras de condiciones ambientales adversas. Además, por ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas. En nuestro país existen numerosas especies de cladóceros que habitan los lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas temporales16. 16 Palacios, M. Estudio sobre el cultivo de Metacyclops mendocinus (Crustacea, Copepoda) y su utilización en ensayos toxicológicos acuáticos. Venezuela, 1997. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2 BIOLOGIA DE ORGANISMOS REPRESENTATIVOS DE LA CADENA TROFICA 5.2.1 PULGA DE AGUA (Daphnia Pulex) La Daphnia pulex es un tipo de crustáceo del orden cladócero normalmente llamada pulga de agua, esto se debe a la forma en que se impulsa con las dos antenas ubicadas en la cabeza. Tiene un tamaño que varía entre 0,2 y 0,5 milímetros, habitan en medios acuáticos desde charcos hasta ríos se alimentan de plancton y de organismos de menor tamaño tales como las protistas y bacterias. La fotografía 1 muestra detalladamente la forma de una daphnia pulex: Fotografía 1. MORFOLOGIA DE Daphnia Pulex Fuente: http://newsinfo.iu.edu/pub/libs/images/usr/1279_h.jpg Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2.1.1 Clasificación científica A continuación se observan las generalidades taxonómicas de la Daphnia pulex: Fuente: http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Daphnia.jpg 5.2.1.2 Morfología Estos organismos se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado; no se distinguen segmentos como en otros crustáceos. Presentan dimorfismo sexual marcado, la hembra es más grande que el macho. Presenta una caparazón de quitina transparente, las antenas o apéndices con numerosas setas; ojos compuestos y simples (ojo nauplio). Una cavidad embriónica con huevos y embriones situados en la parte dorsal, entre el caparazón y el dorso del cuerpo. A continuación se pueden ver las partes internas de la Daphnia pulex: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FIGURA 1. PARTE INTERNA DE UNA Daphnia Pulex Fuente: http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Daphnia.jpg En las fotografías 2 y 3, se puede detallar las diferencias de una hembra y de un macho daphnia pulex: Fotografía 2.Hembra Daphnia pulex Fotografía 3. Macho daphnia pulex Fuente: http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S06.htm#chVI Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2.1.3 Alimentación Son normalmente fitófagos, alimentándose por filtración. Filtran continuamente el agua en la cual viven, deteniendo las partículas suspendidas en ésta a través de sedas situadas en los apéndices toráxicos; el tamaño promedio de las partículas ingeridas se sitúa entre 0,5 y 50 μm. Mediante diversos mecanismos de gran complejidad, las corrientes de alimento pasan al interior de una cámara sencilla precedente de la dirección anteroventral; esta cámara está cerrada dorsalmente por la pared del cuerpo, lateralmente por las valvas y los cinco pares del tronco y centralmente por el tercer y cuarto par de los mismos cuando se encuentran juntos. El primer y segundo par de apéndices crean una corriente de agua y así, un movimiento de partículas suspendidas; el quinto par se encarga de la succión del agua, mientras el tercer y cuarto para realizar la filtración de las partículas17. 5.2.1.4 Reproducción La Daphnia tiene dos maneras distintas de reproducción: Una asexual y otra sexual. La asexual se produce por partenogénesis (Parthenos=Virgen) y las poblaciones ordinariamente están constituidas íntegramente de hembras que, según la edad y el tipo de alimentación, puede llegar a dar entre 5-6 hasta los 100 ejemplares. Si la ingesta sólo es suficiente para balancear los requerimientos energéticos de ellas, no habrá producción de huevos. A partir del quinto estadío producen una nueva camada después de cada muda. Los huevos se depositan y desarrollan dentro de la cámara de cría; de aquí las crías se liberan como versiones en miniatura de los adultos. En la reproducción sexual la hembra produce óvulos que luego de ser fertilizados por el macho, se alojan en el epifio (saco que soporta los huevos) y estos son llamados epifidos. La producción de estos huevos se debe a la sabiduría de la Naturaleza, ya que de esta manera se asegura la subsistencia de la especie cuando las condiciones de vida no son favorables. Un ejemplo es en casos de sequía relativamente prolongada, los huevos depositados por la hembra son resistentes a la sequía y quedan enterrados en el fango o en la superficie del terreno cuando el agua se evapora. En algunos casos el viento se encarga de dispersar esos huevos, razón por la cual al llegar las lluvias son arrastrados hacia las depresiones del terreno donde se forman charcos más estables y con las condiciones necesarias para la vida. Estos huevos pueden ser mantenidos por más de 50 años. 17 Ardila, L. Alarcon, J. Determinación de la concentración letal media (cl50-48) de daphnia pulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata. julie andrea alarcon orjuela. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la Salle. 2008. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. En todas las especies de Daphnia las efipias juegan un importante rol tanto en la colonización de nuevos hábitat como en el repoblamiento del mismo hábitat luego que las condiciones desfavorables que les dieron origen han desaparecido. En las fotografías 4 y 5, se pueden observar los huevos de daphnia pulex: Fotografía 4 y 5 Huevos de Daphnia pulex Fuente: http://enciclopediaanimal.files.wordpress.com 5.2.1.5 Respiración La respiración es aerobia en su totalidad. El intercambio de gases en estos individuos se efectúa vía epipodito de los apéndices toráxicos que están transformados en las branquias. Un intercambio normal de gases entre la sangre y el medio se lleva a cabo por el constante movimiento de los apéndices toráxicos que crean una corriente continua de agua fresca (Universidad Jorge Tadeo Lozano, 1974, citado por Matuk 1996). Cuando se encuentran en un medio aireado son incoloros, pero cuando el mismo presenta deficiencia de oxígeno, se tornan de color rojo debido a que poseen hemoglobina (González y Gutiérrez, 1995). 5.2.1.6 Sistema Circulatorio Es abierto como en todos los crustáceos, y la hemoglobina es impulsada por un corazón pequeño (saco globuloso con solamente dos ostiolos), ovalado o redondeado, que se encuentra en la parte anterior del tronco, colocado dorsalmente. La hemoglobina entra por los ostíolos laterales y fluye a través del extremo anterior en el hemocele. (González y Gutiérrez, 1995). Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2.1.7 Sistema Excretor Las funciones excretoras se realizan mediante una glándula especial de posición anterior denominada glándula de la concha, que consiste en un tubo contorneado que se encuentra en la parte anteroventral a cada lado del corazón. (González y Gutiérrez, 1995). 5.2.1.8 Sistema Nervioso El sistema nervioso consiste en un cordón vertical, doble, con unos pocos ganglios, dos pares de nervios laterales y un ganglio cerebral o cefálico ubicado frente al esófago. Los órganos sensitivos están representados por un par de ojos compuestos, un par de ocelos y sedas sensoriales antenales y post-abdominales. Desde el ojo parte un haz de nervios ópticos que se dirigen a un gran ganglio óptico unido a un cerebro aún más grande. Rara vez son visibles los cordones conectivos circunesofágicos, el ganglio subesofagico y algunos ganglios ventrales18 5.2.2 PULGA DE AGUA (Daphnia Magna) Las Daphnia magna conocidas comúnmente como “pulgas de agua” pertenecen al orden cladócera, son un ejemplo de crustáceo pequeño, que mide aproximadamente de 1 a 3 mm de longitud, son tranparentes y se pueden observar con facilidad, Habitan principalmente en cuerpos de agua dulce y hacen parte del plancton. La Daphnia magna vive en aquellas zonas donde el agua tiene una gran cantidad de minerales debido a la eutrofización. A continuación se muestra la Fotografía (6) Microscópica De Una Daphnia Magna: 18 Holguin, J. Barbier, A. Determinación de la concentración letal media (CL 50-48) del cromo y el cobre por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre daphnia pulex. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la Salle. 2007 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fotografía 6. Vista Microscópica Daphnia magna FUENTE: http://www.mblaquaculture.com En la tabla 1 se describe en forma general la taxonomía de la daphnia magna: Tabla 1. Generalidades de la Daphnia Magna. Taxonomía CLASE Branchiopoda ORDEN Cladocera SUB ORDEN Anomopoda FAMILIA Daphniidae GENERO Daphnia ESPECIA Daphnia Magna 5.2.2.1 Morfología La cabeza de la daphnia tiene unas primeras antenas diminutas similares a cerdas con quimiorreceptores y unas segundas antenas muy grandes y birrameas, que actúan como órganos locomotores. En el caparazón se encuentran ubicados partes bucales y los apéndices del tronco. También se evidencian pequeñas mandíbulas romas seguidas de dos pares de maxilas diminutas y cinco pares de apéndices birrameos aplanados, que son esenciales en la respiración y en la filtración de partículas alimenticias microscópicas procedentes del agua. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tiene un corto esófago que se extiende dorsalmente y desemboca en el intestino medio. Desde la parte anterior del intestino medio, se extienden un par de bolsas digestivas hacia la cabeza. El ojo único esta conformado por una fusión de estructuras pareadas que embriológicamente originan varios ojos compuestos. En el borde anteroventral del cerebro destaca la presencia del ojo medio e impar, este ojo persiste con frecuencia en los crustáceos adultos19. 5.2.2.2 Alimentación Las Daphnias son crustáceos depredadores, se pueden alimentar de bacterias, algas, detritus y de zooplancton de menor tamaño. En su pequeño mundo son ávidos devoradores de infusorios, que en algunos casos constituye su única fuente de alimentación. 5.2.2.3 Ciclo de vida Pueden vivir por varias semanas durante el verano y hasta cien días si no son depredadas. El periodo de huevo se desarrolla completamente dentro de la cámara de cría de la madre. El periodo juvenil presenta entre cuatro y cinco estadios. El adolescente es breve y varia entre 1 o 2 estadios; es en este periodo donde se desarrollan la primera camada de huevos dentro del ovario. El adulto en cambio presenta mayor número de estadios. La aparición de la función reproductiva es la que marca el comienzo de este ultimo periodo. (Alberdi, 1990). 5.2.2.4 Reproducción Las daphnias se reproducen durante todo el año, por partenogénesis. No obstante, también tienen reproducción sexual. Las pulgas de agua se reproducen por reproducción sexual (aquella en la que hay fecundación y la participación de ambos sexos) como sistema de defensa frente a las condiciones adversas del medio, por ejemplo cuando la cantidad de comida disminuye o 19 Pacheco, L. Hincapie, M. Implementación a nivel piloto de un sistema de remoción fotocatalitica de cianuro para una industria galvánica por debajo de la concentración letal media (CL 50-48) para daphnia magna. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la Salle, 2009. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. cuando la charca donde viven está demasiado poblada, y como método para su dispersión hacia otros puntos de agua. La reproducción por partenogénesis, un tipo de reproducción asexual, permite formar hasta un centenar de nuevas pulgas de agua, aunque a veces no nacen más de una decena de pulgas de agua mediante partenogénesis. Este tipo de reproducción se lleva a cabo cuando las condiciones del medio son las más adecuadas para la vida de las pulgas de agua y es la responsable de la formación de grandes números de Daphnias agrupados en enjambres. Los huevos de Daphnia se almacenan en su cámara de incubación hasta que están las crías totalmente formadas. Cuando las condiciones del medio se torna desfavorables (cambio de temperatura del agua, disminución del alimento, aumento de la población, entre otras.), algunas de las crías maduran como machos mientras las hembras producen “huevos durmientes” o efipidos20. En las siguientes imágenes se pueden detallar los huevos dentro de la daphnia magna: Fotografía 7y 8 Huevos de Daphnia Magna FUENTE: http://www.monografias.com 5.2.2.5 Condiciones de cultivo 20 Alvarez, M. Monge. L. Determinación de la concentración letal media (CL 50-48) de cromo y cobre en daphnia magna para el vertimiento de una industria de galvanotecnia y propuesta de pretratamiento para la disminución de la toxicidad de dicho vertimiento. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la Salle, 2008. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. No suelen ser muy exigentes con las condiciones del agua aceptando muy variados rangos. Estos crustáceos aguantan una gran variedad de temperaturas que van desde los 10 grados Cº hasta los 30 grados Cº. Es tolerante en cuanto a la proporción de oxígeno disuelto en agua, pudiendo vivir con bajos niveles de este, debido a su capacidad de sintetizar la hemoglobina, esta se puede promover por las altas temperaturas o por una densidad alta de población. De todos modos si tenemos un recipiente con una alta concentración de pulgas podemos poner una aireación leve sin difusor, ya que las burbujas pequeñas de aire pueden hacer que mueran las daphnias al quedarse enganchadas con alguna de las burbujas. El nivel de nitrógeno tampoco nos debe preocupar pues aguantan niveles de hasta 20mg/l. El pH no es crítico soportando niveles ácidos y básicos, siendo lo adecuado valores más centrados. La salinidad del agua no es determinante para la proliferación de las pulgas, habiéndolas que se reproducen en aguas casi salobres. Por otro lado son muy sensibles a las variaciones en la composición iónica del agua (sales de potasio, magnesio o calcio) Pudiendo causar inmovilidad y muerte en concentraciones crecientes o cambios bruscos. Son extremadamente sensibles a los iones de metales como el cobre y el cinc, los pesticidas, los detergentes y otras toxinas disueltas21. En la figura 2 y foto 9 se observa la imagen de la Daphnia magna y sus partes internas: 21 Htpp:/www.acuariogallego.com Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Figura 2. Morfología Interna D. magna Fotografía 9. Morfología D.magna Fuente: http://www.asturnatura.com/articulos/artropodos/branquio.php 5.2.3 TRUCHA ARCO IRIS (Orconhyncus Mykiss). La trucha Arcoíris (Fotografía 10) es una variedad lacustre autóctona de los lagos de la región sub central de la Columbia Británica, provincia situada en la costa del Pacífico, en el suroeste de Canadá. Esta especie tiene una gran importancia en el mundo industrial de la piscicultura, está ampliamente diseminada y es objeto de cría intensiva en todos los continentes. Son peces de agua fría, aunque el grado de tolerancia a la temperatura es amplio, subsiste en temperaturas mantenidas de 23ºC, durante varios días. La temperatura interviene en el grado de actividad metabólica de las truchas y por ello en invierno las truchas apenas ingieren alimento y su crecimiento es lento, mientras que en verano este animal es muy voraz. FOTOGRAFIA 10. TRUCHA ARCOIRIS Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FUENTE: http://www.oscasullos.com En la tabla 2 se observan las características de la Trucha arcoíris: Tabla 2. Generalidades de la Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss) NOMBRE CIENTÍFICO Oncorhynchus mykiss FAMILIA Salmonidae/Salmoninae ORDEN Salmoniformes CLASE Actinopterígios (peces con aletas radiadas) PESO MÁX 10 kg LONGITUD MÁX 70 cm LONGEVIDAD 10 años Fuente: Investigación de campo. México: Escuela José María Morelos. Michoacán, 2002. 5.2.3.1 Morfología Es muy similar a la trucha común, son una especie con boca grande, el hueso post orbital no alcanza el preopérculo, el hocico es cartilaginoso y puntiagudo, tiene dientes en el hueso lingual en dos hileras. Presenta varias pintas negras no aureoladas en el dorso, flanco y región cefálica. Las Truchas Arco Iris se distinguen de los demás salmónidos por una banda púrpura en uno de sus flancos, desde el opérculo hasta la cola. Los lados son plateados y la espalda verde oliva, el vientre es un poco más claro tornándose casi blanco. 5.2.3.2 Alimentación La dieta de este salmónido comprende en su mayoría insectos y organismos pequeños que se alimentan de la riqueza mineral de las aguas alcalinas. También se alimentan de Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. pequeños crustáceos, huevos y pequeños peces. En cautiverio estos organismos se alimentan de comida artificial que satisface las necesidades nutricionales para el buen desarrollo de la especie. 5.2.3.3 Territorio y jerarquía La trucha como carnívoro predador es territorial es decir vive en un área o espacio que defiende, el territorio ideal, es aquel donde no hay corrientes excesivas, donde el alimento se obtiene con el mínimo esfuerzo, donde se encuentra a cubierto de enemigos y existe poca intromisión de otras truchas. A medida que va adquiriendo mayor tamaño tiene mayor agresividad y poder y trata de ensanchar su territorio, obligando al pequeño a emigrar y colonizar en otra parte del río. Las trucha predominantes, ocupan los lugares más idóneos, es decir aquellas partes del estanque que ofrecen mejores condiciones en cuanto a corriente, oxigeno, etc.; y especialmente de las áreas de alimentación, relegando a los subordinados a otros espacios menos favorables. 5.2.3.4 Reproducción Es ovíparo de reproducción externa, en el momento del desove busca un lugar adecuado en los cursos de agua, estos lugares principalmente son agua de poca profundidad con fondo de grava y arena donde pueda hacer un nido donde deposita entre 2500 y 7000 huevos. En este nido la hembra deposita sus óvulos, al tiempo que los machos liberan la esperma, para fecundar los óvulos, la hembra cubre los huevos con grava y abandona el nido. La duración total del ciclo gonadal para la trucha arco iris es de aproximadamente un año, período que puede variar de acuerdo a las razas, condiciones climáticas y alimentación (Tyler et al., 1991). A continuación, se observan los huevos y los alevinos de trucha, respectivamente (Fotografías 11y 12): Fotografía 11. Huevos de trucha arco iris Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: http://www.fcmp.es/images/navegacion/huevos.jpg Fotografia 12. Alevinos de trucha arco iris FUENTE: http://www.aquagen.no/Viviendo+con+el+Virus+IPN.9UFRrSWo.ips 5.2.3.5 Condiciones de cultivo Propiedades físicas: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Temperatura: la Trucha Arco Iris, como todos los peces no tienen capacidad propia para regular su temperatura corporal, pues esta depende totalmente del medio acuático en que viva, ya que es un animal poiquilotermo. Tiene una incidencia directa sobre la biología de los salmónidos, condiciona la maduración de los huevo, influye en el ritmo mensual de crecimiento de los peces, sobre el grado de actividad metabólica. Indirectamente influye de forma fundamental en el agua por la concentración de oxigeno disuelto, la concentración de productos metabólicos y el tiempo o grado de descomposición de la materia. La trucha en condiciones naturales vive en aguas comprendidas entre los 0oC y los 25oC. Sin embargo los límites que se manejan en cultivo en los cuales su desarrollo es adecuado corresponden entre 9oC y 17oC. Oxígeno disuelto: El oxigeno disuelto en el agua es para la trucha como para todos los seres acuáticos, un elemento esencial para la vida. El agua es capaz de absorber oxigeno del aire hasta su presión parcial este en equilibrio con la del oxigeno del aire en las interfaces aire-agua. Los salmónidos tienen unas exigencias bastantes estrictas frente a este factor. Con cifras menores a 5.5 mg/l de oxigeno la trucha tiene una gran dificultad para extraer el oxigeno y transportarlo a través del sistema circulatorio. pH: El potencial de hidrógeno nos muestra la concentración de hidrogeniones (H+) en el agua. Es una escala que va de 0 a 14. Si el nivel es de 7 se dice que el agua es neutra si el nivel es por debajo de 7 es Ácido y si es por encima se dice que es básica. En piscicultura los niveles de acides son nocivos más que los niveles de basicidad, pero para el cultivo y mantenimiento de truchas se desea un pH de 6,5 a 7 ya que uno de los producto finales del metabolismo proteico de las truchas es el amoniaco. Materias en suspensión: Las materias en suspensión que pueden encontrarse en las aguas, bien sean de naturaleza mineral u orgánica, don las responsables de la turbidez del agua en distintos grados. Las agua destinadas a salmónidos deben ser claras y transparentes admitiéndose como cifras normales, concentraciones menores a 30 mg/l, si la concentración tiene valores mayores a 70 mg/l aunque no produce la mortalidad inmediata son motivo de patología secundaria (Sabaut, 1976). Conductividad: La conductividad eléctrica es la capacidad que el agua tiene de conducir la corriente eléctrica. Este parámetro tiene relación con la existencia de iones disueltos en el agua, que son partículas con cargas eléctricas. Cuanto mayor sea la concentración de iones disueltos, mayor será la conductividad eléctrica de la agua. En las aguas continentales, los iones que son directamente responsables de los valores de la conductividad son, entre otros, el Calcio, el Magnesio, el Potasio, el Sodio, los Carbonatos, los Sulfatos y los Cloratos. La mayoría de las especies acuáticas soportan diferentes concentraciones de sales disueltas en el agua, encontrando para la Trucha Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. cifras de conductividad equivalentes a 560 µs/ cm que son perfectamente toleradas, adquiriendo carácter peligros con cifras superiores a 600µ s/cm.22 5.2.3.6 Anatomo-fisiología del Oncorhynchus mykiss En la tabla 3 se describe la anatomía y fisiología de la Trucha arcoíris de una manera general con las principales características. Tabla 3. Anatomo-fisiología del Oncorhyncus mykiss ANATOMIA Y FISIOLOGIA Esqueleto Respiración 22 CARACTERISTICA La trucha tiene un esqueleto óseo, siendo la columna vertebral el eje del cuerpo presentando de 28 a 29 vértebras firmemente unidas mediante tejido conectivo; así la columna puede ser fácilmente curvada. Los peces poseen unas costillas intramusculares falsas, y minúsculos huesecillos en forma de “Y” que son las que nos causan dificultad al comer pescado. El agua contiene solamente alrededor del 5% de la cantidad de oxígeno que hay disponible en el aire. Por lo tanto el aparato respiratorio de los peces se ha adaptado para ser más eficiente. El órgano principal son las branquias o agallas. Están formadas por unas laminillas cubiertas por un fino epitelio por el cual se produce el intercambio gaseoso; la toma de oxigeno y la eliminación de dióxido de carbono. Las branquias de la trucha consisten en dos conjuntos de cuatro arcos branquiales protegidas por el opérculo. El flujo de agua a las branquias es continuo y unidireccional, establecido por un sistema de bombeo. El resultado es que agua entra por la boca y sale por el opérculo pasando a través de las branquias, donde se produce el intercambio gaseoso. Agudelo,A. Ortiz, P. Determinación de la concentración letal media (CL 50-96) del Plomo y el Níquel, por medio de bioensayos sobre alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss). Tesis. Facultad de Ingeniería ambiental. Universidad de la Salle, 2008. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. El corazón bombea sangre hacia las branquias para su oxigenación y de ahí va por los capilares a los tejidos. La sangre venosa retorna al corazón el cual consta de tres cámaras, el seno, la aurícula y el ventrículo8. Sistema circulatorio El principal producto residual de la trucha es el amoniaco, que es eliminado por las branquias así como el anhídrido carbónico (CO2). Otras partes más pequeñas de sustancias nitrogenadas y otros productos degradados son filtrados por el riñón8. El riñón es un órgano oscuro alargado, colocado por debajo de la espina dorsal y por encima de la vejiga natatoria. Del riñón salen los uréteres por lo que es conducida la orina hacia la vejiga urinaria y de ahí al seno urogenital. Para los peces de agua dulce el riñón es muy importante, ya que por ellos se elimina el exceso de agua. Sistema nervioso El cerebro y la medula espinal están encerrados dentro del cráneo y de la columna vertebral, respectivamente. La organización del sistema nervioso es similar a la de los mamíferos: con un sistema central, periférico y autónomo. Fuente: http://www.revistaaquatic.com/asociaciones/PirineosPesca/docs/anatomia.pdf En la tabla 4 se realiza la descripción de cada uno de los órganos de la Trucha arcoiris: Tabla 4. Órganos fundamentales de la Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss) ÓRGANO Vista CARACTERÍSTICAS Órgano sensorial más importante. La trucha tiene los ojos a los lados de la cabeza facilitando la detección de los depredadores en un amplio radio. El enfoque esta producido por un mas o menos acercamiento del cristalino a la retina. Los pescadores se interesan, por la extensión en la cual los objetos aéreos y terrestres pueden ser vistos por el pez cuando se encuentran bajo el agua. El grado de distorsión aumenta conforme el horizonte se acerca8. Visión y colorido El pigmento oscuro de las células de la piel de la trucha se halla bajo el Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. control de la vista, de manera que la trucha es capaz de cambiarlo en cierta medida y fabricar su propio matiz. Estas variaciones de coloración, dependen de diferentes cantidades de pigmentos negros, rojos y blancos. Los peces ciegos sin importar su localización son siempre oscuros. Las pintas rojas, así como la coloración asalmonada de la carne son características de truchas que tienen en su dieta crustáceos y caracoles en gran proporción, ya que tienen un alto contenido en carotenos. Oído El oído de la trucha se encuentra completamente en el interior del cráneo conectado con el órgano del equilibrio. Gracias a las propiedades del agua como un gran medio de transmisión del sonido, hace que los salmónidos puedan oír sin necesidad de que el oído este conectado con el medio exterior como ocurre con las orejas de los mamíferos. Así como este pez escucha los sonidos, también los emite. Línea lateral Es un sentido exclusivo de los peces. Sirve para detectar pequeños cambios de la presión del agua causada por los objetos circundantes. La línea lateral es un sistema de poros unidos entre si por una red de pequeños canales situados bajo la superficie del cuerpo a lo largo del costado. Cuando el pez se desplaza, el agua se mueve. La ola de presión refleja la ausencia de obstáculos y retorna al pez. Es una manera que tiene el pez para evitar obstáculos y encontrar comida. Es un sentido muy importante cuando el agua esta turbia y la visión es imposible. Olfato La trucha posee dos orificios nasales en el morro, a través de los cuales posee un olfato muy fino. El agua tiene en disolución multitud de sustancias, que gracias a los movimientos de natación y respiración pasan a través de dichos orificios. Se estimula el epitelio olfativo, pasando este impulso al cerebro. Gusto Estos peces son capaces de distinguir los cuatro sabores básicos; dulce, salado, ácido y amargo. Se han encontrado células gustativas en la boca y sus alrededores aunque hay especies que tienen incluso en la piel y pueden percibir la composición química del agua. Esto es muy importante para los peces migradores como el salmón que sigue los gradientes de olor, reconociendo el de su río natal a donde se dirige para desovar. FUENTE: http://www.revistaaquatic.com/asociaciones/PirineosPesca/docs/anatomia.pdf Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. En las imágenes que se muestran a continuación, (Figura 3, Fotografia 13) se pueden ver en forma detallada, las partes internas de la trucha arco iris23: 5.2.3.6.1 Morfología interna del Oncorhynchus mykiss con una división abdominal – dorsal Figura 3. Morfología Interna de la trucha arcoíris Fuente: Hernanadez, A. Manejos en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en piscicultura Manantiales, Puerto Nuevo. México: Centro de Formación Técnica Zipter, 1996. 1. Riñón 2. Vértebras 3. Vejiga natatoria 4. Ovarios 5. Bulbo 6. Ventrículo 7. Aurícula 8. Cavidad pericárdica 9. Vesícula 23 10. Esófago 11. Hígado 12. Estómago 13. Ciegospilóricos 14. Vaso 15. Intestino 16. Gonoporo 17. Ano 18. Costillas Barros, C. Gomez, E. Determinación de la concentración letal media (cl50-96) del glifosato, por medio de bioensayos utilizando alevinos de trucha arco iris (oncorhynchus mykiss), Tesis. Facultad de Ingeniería ambiental. Universidad de la Salle, 2008. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FOTOGRAFIA 13. MORFOLOGIA EXTERNA DE LA TRUCHA ARCOIRIS Fuente: Hernanadez, A. Manejos en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en piscicultura Manantiales, Puerto Nuevo. México: Centro de Formación Técnica Zipter, 1996. Longitud: de hasta 70 cm Envergadura: entre 20 y 30 cm. Peso: 15-17 kg. 5.2.4 LECHUGA (Lactuca sativa) La lechuga (Lactuca sativa L.) es una planta anual, propia de las regiones semitempladas, que se cultiva con fines alimentarios. Debido a las muchas variedades que existen, y a su cultivo cada vez mayor en invernaderos, se puede consumir durante todo el año. Normalmente se toma cruda, como ingrediente de ensaladas y otros platos, pero ciertas variedades, sobre todo las de origen chino, poseen una textura más robusta y por ello se emplean cocidas. El nombre genérico Lactuca procede del latín lac, -tis (leche). Tal etimología refiere al líquido lechoso (o seaq, de apariencia "láctea") que es la savia que exudan los tallos de esta planta al ser cortados. El adjetivo específico sativa hace referencia a su carácter de especie cultivada24. En la foto 14 se observa la morfología externa de una lechuga (lactuca sativa): FOTOGRAFIA 14. MORFOLOGIA EXTERNA DE LA LECHUGA 24 Lactuca Sativa. 10 mayo. 2009. http://es.wikipedia.org/wiki/Lechuga Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FUENTE: http://upload.wikimedia.org La lechuga es una planta anual y autógama. En su estado silvestre son plantas pequeñas y de sabor amargo, pero la selección del hombre a lo largo del tiempo ha propiciado gran variedad de sabrosas lechugas. El valor nutritivo de la lechuga es diferente dependiendo de su variedad. La lechuga en general provee una pequeña cantidad de fibra, algunos carbohidratos, un poco de proteína, y una mínima cantidad de grasa. Sus nutrientes más importantes son la vitamina A y el potasio. Además, es un cultivo de clima fresco, debe ser plantada a inicios de primavera o finales de verano. En altas temperaturas, se impide el crecimiento, las hojas pueden ser amargas y se forma el tallo donde se producen flores, el cual se alarga rápidamente. Durante el verano las lechugas espigan muy rápido si no se tiene cura de ellas. Algunos tipos y variedades de lechuga soportan el calor mejor que otras25. En la tabla 5, se describen las generalidades de la lechuga: TABLA 5. GENERALIDADES DE LA LECHUGA NOMBRE 25 Lactuca Sativa Lechuga. 10 mayo. 2009. http://urbanext.illinois.edu/veggies_sp/lettuce1.html Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. CIENTÍFICO FAMILIA Asteraceae(compuestas) ORDEN Asterales CLASE Magnoliopsida PESO MÁX 300 g aprox LONGITUD MÁX 30 cm LONGEVIDAD 2 a 3 semanas FUENTE: http://verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/lechuga/intro.php 5.2.4.1 Morfología .Raíz: No llega nunca a sobrepasar los 25 cm. de profundidad, es pivotante, corta y con ramificaciones. Hojas: Están colocadas en roseta, desplegadas al principio; en unos casos siguen así durante todo su desarrollo (variedades romanas), y en otros se acogollan más tarde. El borde de los limbos puede ser liso, ondulado o aserrado. Tallo: Cilíndrico y ramificado. Inflorescencia: Son capítulos florales amarillos dispuestos en racimos o corimbos. Semillas: están provistas de un vilano plumoso.26 5.2.4.2 Reproducción Las lechugas se reproducen por semilla. En épocas frías o templadas se recurre a semillero protegido o a cubiertas plásticas. Una mezcla adecuada para semillero es la formada con dos tercios de tierra de jardín y un tercio de arena; una vez sembradas se cubren ligeramente con un poco de arena. Si el clima lo permite se pueden sembrar directamente al aire libre en un suelo preparado de forma similar al del semillero protegido, para su posterior trasplante al terreno definitivo. Aquellas variedades de invierno y primavera se siembran al aire libre a principios del otoño y se cubren con plásticos para protegerlas de las heladas. 26 El cultivo de la lechuga. 10 mayo. 2009. http://www.infoagro.com/hortalizas/lechuga.asp Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. La plantación puede ser realizada tanto en superficies llanas como en caballones, poniendo las plántulas separadas unos 40 cm. entre sí, sobre todo si son variedades repolladas que desarrollan mucho lateralmente. A las lechugas le conviene un suelo neutro pero fresco y bien estercolado, por eso es posible que tras el abonado sea necesario corregir la acidez añadiendo cal. Conviene igualmente una cierta humedad, pero con buen drenaje (no debe encharcar el agua). La exposición no debe ser totalmente soleada, pues la lechuga tiende a espigar y florecer, endureciéndose las hojas y haciéndolas inservibles para el consumo humano; este problema puede solucionarse colocando unas pantallas construidas con diferentes materiales (pajas, cañas, etc.) que impidan la acción directa del sol. Atando las hojas se evita que se pongan demasiado verdes El riego debe ser frecuente pero no copioso27. 5.2.4.3 Semillas A medida que el huevo del óvulo fertilizado se va desarrollando para formar un embrión, las paredes del óvulo van evolucionando para finalizar en una envoltura seminal, dentro de las cuales se encuentra la semilla. La semilla es la unidad de diseminación necesaria para la formación de la nueva planta, aporta protección contra los factores adversos y contra la desecación y además, suministra alimentos para que esta planta joven puede crecer hasta que pueda elaborar por si misma su propio alimento. Las semillas están formadas por una capa externa o cubierta, generalmente dura, sólida y leñosa, dentro de la cual se encuentra ubicado el embrión, aunque normalmente disponen de un embrión, existen algunas semillas que pueden llegar a tener mas de uno. Esto da lugar a dos o más plantas originadas de una sola semilla. Por norma general, las semillas presentan una forma oval o globular, y su tamaño puede variar; pero no solo varían en tamaño, también en olor, textura, forma de propagación, modificaciones estructurales (espinas, alas o arilos) y en el tipo y cantidad de alimento que almacenan en su interior; esto último es lo que explica el valor tan alto que se le da para la alimentación humana y animal, dado el hecho de que todas las semillas dispongan de un suministro tan importante de nutrientes almacenados28. 27 28 Horticultura. Mayo 10. 2009. http://www.natureduca.com/agro_hort_lechuga.php Pinto, L. Determinación de la Concentración de Inhibición Media (CE50) de Cromo para la Semilla Lactuca sativa Mediante Ensayos de Toxicidad. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la Salle. 2009 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 5.2.4.4 Estructura de las semillas Las semillas están formadas por una capa externa o cubierta, generalmente dura, sólida y leñosa, dentro de la cual se encuentra ubicado el embrión. Las semillas normalmente disponen de un único embrión, aunque a veces pueden tener más de uno. Las semillas se desarrollan a partir de la fertilización del huevo en el óvulo del ovario floral. Por norma general, las semillas presentan una forma oval o globular, y su tamaño puede variar. También varían enormemente en cuanto a olor, textura, longevidad, formas de propagación y cantidad de alimento que almacenan en su interior. Las semillas sirven como vehículo para la reproducción sexual de las plantas angiospermas. La semilla presenta una planta en miniatura (embrión) que a su vez se divide en epicotilo e hipocotilo. La figura 4 muestra las partes de la semilla de la lechuga y su estructura: FIGURA 4. PARTES DE LA SEMILLA DE LECHUGA Fuente:http://www.canariculturacolor.com/foros/showthread.php?t=20543 El epicotilo formara todas las partes de una planta que se sitúan sobre el primer nudo del tallo, y el hipocotilo formara todas las partes inferiores del tallo y las raíces. El embrión se rodea de alimento almacenado y de una cubierta envolvente final denominada envoltura seminal. Las semillas al disponer de gran suministro tan importante de nutrientes almacenados, explica el valor tan alto que se le da para la alimentación humana y animal. La dura cubierta de la semilla protege a la diminuta planta que hay en el interior para hacer frente a las adversidades físicas y a la pérdida de la humedad. 5.2.4.5 Proceso de germinación La germinación de una semilla se define como la emergencia y el desarrollo, a partir del embrión, de todas aquellas estructuras esenciales que son indicativas de su habilidad para producir una planta normal bajo condiciones favorables. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. En la figura 5 se puede ver detalladamente, como es el proceso de germinación de la lechuga: FIGURA 5. GERMINACIÓN DE LA LECHUGA Fuente: http://www.educa.aragob.es Este proceso de germinación en plantas tiene lugar cuando la envoltura seminal se reblandece por acción del agua, en un momento en que la temperatura se hace favorable. El embrión recibe nutrientes para su crecimiento a partir del alimento almacenado dentro de la semilla. El hipocotilo crece en sentido ascendente, fuera del suelo, para formar los tallos y las hojas, mientras que las porciones inferiores del hipocotilo crecen profundamente hacia dentro del suelo, para formar las raíces. El hipocotilo responde negativamente a la gravedad y crece en sentido contrario a ella, mientras que el hipocotilo crece siguiendo el sentido de la atracción gravitacional. El cotiledón, u hoja de la semilla es la hoja primaria del embrión. En las plantas monocotiledóneas, el embrión presenta una sola hoja seminal; mientras que en las plantas dicotiledóneas, como es el caso de las gramíneas, el único cotiledón permanece Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. dentro de las semillas actuando como órgano digestivo para el embrión. Los cotiledones de las dicotiledóneas se encuentran normalmente desalojadas fuera de las semillas en el momento de la germinación y alcanzan la superficie del suelo cuando adquieren un color verde actuando ya como hojas verdaderas. En algunas dicotiledóneas permanecen por debajo de la superficie y simplemente se limitan a suministrar alimento almacenado para la planta joven29. Las fotografías 14 a 16, muestran cómo se van desarrollando las semillas de la lechuga, y como se ven ya cultivadas en una cama y en proceso de germinación: Fotografía 14. Semillas de lechuga Fuente: http://wikimedia.org Fotografía 15 y 16. Cama de lechuga 29 Bayona, A. Lopez, J. Ensayo de toxicidad aguda al efluente de la ptar de la calera mediante la utilización de semillas de lactuca satival l. y propuesta para su utilización como agua de riego para cultivos. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la salle. 2006 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: http://wikimedia.org 5.2.4.6 CONDICIONES DE CULTIVO Semillero: La multiplicación de la lechuga suele hacerse con planta en cepellón obtenida en semillero. Se recomienda el uso de bandejas de poliestireno de 294 alveolos, sembrando en cada alveolo una semilla a 5 mm de profundidad. Una vez transcurridos 30-40 días después de la siembra, la lechuga será plantada cuando tenga 5-6 hojas verdaderas y una altura de 8 cm., desde el cuello del tallo hasta las puntas de las hojas. Preparación del terreno: En primer lugar se procederá a la nivelación del terreno, especialmente en el caso de zonas encharcadizas, seguidamente se procederá al asurcado y por último la acaballonadora, formará varios bancos, para marcar la ubicación de las plantas así como realizar pequeños surcos donde alojar la tubería portagoteros. Se recomienda cultivar lechuga después de leguminosas, cereal o barbecho, no deben cultivarse como precedentes crucíferas o compuestas, manteniendo las parcelas libre de malas hierbas y restos del cultivo anterior. No deberán utilizarse el mismo terreno para más de dos campañas con dos cultivos a lo largo de cuatro años, salvo que se realice una sola plantación por campaña, alternando el resto del año con barbecho, cereal o leguminoso. La desinfección química del suelo no es recomendable, ya que se trata de un cultivo de ciclo corto y muy sensible a productos químicos, pero si se recomienda utilizar la solarización en verano. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Se recomienda el acolchado durante los meses invernales empleando láminas de polietileno negro o transparente. Además también se emplean en las lechugas de pequeño tamaño y las que no forman cogollos cuyas hojas permanecen muy abiertas, para evitar que se ensucien de tierra procedentes del agua de lluvia. Plantación: La plantación se realiza en caballones o en banquetas a una altura de 25 cm. para que las plantas no estén en contacto con la humedad, además de evitar los ataques producidos por hongos. La plantación debe hacerse de forma que la parte superior del cepellón quede a nivel del suelo, para evitar podredumbres al nivel del cuello y la desecación de las raíces. La densidad de plantación depende de la variedad: Variedad Romana Iceberg Baby Nºplantas/ha 60.000 80.000 130.000 Riego: Los mejores sistemas de riego, que actualmente se están utilizando para el cultivo de la lechuga son, el riego por goteo (cuando se cultiva en invernadero), y las cintas de exudación (cuando el cultivo se realiza al aire libre), como es el caso del sudeste de España. Existen otras maneras de regar la lechuga como el riego por gravedad y el riego por aspersión, pero cada vez están más en recesión, aunque el riego por surcos permite incrementar el nitrógeno en un 20%. Los riegos se darán de manera frecuente y con poca cantidad de agua, procurando que el suelo quede aparentemente seco en la parte superficial, para evitar podredumbres del cuello y de la vegetación que toma contacto con el suelo. Se recomienda el riego por aspersión en los primeros días post-trasplante, para conseguir que las plantas agarren bien. Blanqueo: Las técnicas de blanqueo empleadas en lechugas de hoja alargada (tipo Romana), consisten en atar el conjunto de hojas con una goma. Actualmente la mayoría de las variedades cultivadas acogollan por sí solas. En caso de lechugas para hojas sueltas, el blanqueo se realiza con campanas de poliestireno invertidas. Si el cultivo es de inviernoprimavera para evitar el espigado, se suele emplear la manta térmica, con el fin de que la Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. planta se desarrolle más rápidamente, no se endurezca y no acumule horas de frío que le hagan subirse a flor. El blanqueo se realiza entre 5 y 7 días antes de la recolección30. 5.2.4.7 Características de la lechuga (lactuca sativa) La lechuga es una planta anual, que cuando se encuentra en su etapa juvenil contiene en sus tejidos un jugo lechoso de látex, cuya cantidad disminuye con la edad de la planta. Se reporta que las raíces principales de absorción se encuentran a una profundidad de 5 a 30 cm. La raíz principal llega a medir hasta 1.80 m por lo cual se explica su resistencia a la sequía. Las hojas de la lechuga son lisas, sin pecíolos (sésiles); el extremo puede ser redondo o rizado. Su color va del verde amarillo hasta el morado claro, dependiendo del tipo y el cultivar. El tallo es pequeño y no se ramifica; sin embargo cuando existen altas temperaturas (mayor de 26°C) y días largos ( >12 hr) el tallo se alarga hasta 1.20 m de longitud, ramificándose el extremo y presentando cada punta de las ramillas terminales una inflorescencia. En lo que se refiere a la inflorescencia, ésta se constituye de grupos de 15 a 25 flores, las cuales están ramificadas y son de color amarillo. Las semillas son largas (4-5 mm), su color generalmente es blanco crema, aunque también las hay pardas y castañas; cabe mencionar que las semillas recién cosechadas por lo general no germinan, debido a la impermeabilidad que la semilla muestra en presencia del oxígeno, por lo que se han utilizado temperaturas ligeramente elevadas (20 a 30°C) para inducir la germinación. Los cultivares se clasifican de acuerdo a su forma en: capitata Cabeza o longifolia Romana31. Las partes más importantes de la lechuga son las hojas, dispuestas en roseta; éstas aparecen repartidas en racimos que van desde tonos amarillos hasta verdes; el tallo, ramificado y en forma de cilindro; la raíz, que no sobrepasa los 25 cm, y las semillas. En las fotografías 17 y 18 se pueden ver las lechugas formadas en la cama de cultivo: Fotografía 17 y 18 LECHUGAS FORMADAS EN CAMA DE CULTIVO 30 http://agriculturaurbana.galeon.com/productos1359683.html 31 Hortalizas. Mayo 10. 2009. http://www.faxsa.com.mx/semhort1 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: http://www.amacosl.es/Imagenes En la etapa inicial del montaje de un método de prueba debe seleccionarse un compuesto soluble, de pureza ≥ 99%, al cual se le realicen pruebas de toxicidad para una especie determinada, con el fin de establecer el intervalo de concentración del compuesto seleccionado que produce el efecto esperado. Una vez definido el patrón de la relación dosis-respuesta para el compuesto elegido, puede ser empleado como tóxico de referencia. A continuación se explica la determinación de la sensibilidad a partir del dicromato de potasio: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 6. DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD 6.1 Prueba de sensibilidad Los cambios en el estado fisiológico del cultivo pueden ser detectados mediante la evaluación periódica de la respuesta de los individuos a un determinado tóxico de referencia. Aunque existen varios tóxicos recomendados, uno de los más utilizados es el cromo (Cr VI) a partir de dicromato de potasio (K2Cr2O7). Para determinar si la sensibilidad del cultivo es adecuada es necesario, previo a iniciar las pruebas rutinarias, evaluar la respuesta de los organismos ante la exposición al tóxico de referencia. La concentración en la cual se produce la muerte del 50% de la población de neonatos (concentración letal media o CL50) deberá encontrarse dentro del intervalo anteriormente establecido. Para definir este intervalo es necesario realizar por lo menos cinco pruebas con el tóxico de referencia, con estos datos se inicia la construcción de la carta control que deberá complementarse con la información generada en nuevas evaluaciones, las cuales se recomienda, se realicen de forma rutinaria una vez por mes hasta alcanzar un número de veinte. Esta carta se debe mantener actualizada con los veinte datos más recientes (US EPA, 1991). A partir de estos resultados, se determina la CL50 promedio para la sustancia, así como la desviación estándar (σ) de la CL50. Los límites superior (promedio + 2σ) e inferior (promedio – 2σ), corresponderán al intervalo de concentración en el cual varía la respuesta de los organismos al tóxico seleccionado (Ver figura 6). Figura 6. Modelo de construcción de la carta control para el tóxico de referencia. Para estimaciones de punto como la CL50 con un nivel de probabilidad P0,05, se espera que sólo una de veinte pruebas esté fuera de los límites del intervalo por azar. Si se produce más de un valor fuera de los límites de control, los resultados de las pruebas de toxicidad llevadas a cabo durante el mes que se produjo el valor fuera de los límites Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. deberán considerarse provisionales y debe llevarse a cabo una cuidadosa revisión. Estos valores por fuera del control estarían indicando anomalías en la sensibilidad de los organismos de prueba. En caso que se presenten variaciones anómalas de la sensibilidad, se deben verificar las condiciones de cultivo y eliminar las posibles causas que están alterando la respuesta de los individuos32. A continuación se explican los pasos con su respectiva imagen, de las metodologías para las pruebas de toxicidad con cada uno de los organismos utilizados en la Universidad de la Salle, los cuales son representativos de la cadena trófica: 32 Castillo, G. Editora. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. México: Instituto mexicano de tecnología del agua, 2004. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 7. METODOLOGÍA PARA LA ELABORACIÓN DE BIOENSAYOS 7.1 Procedimiento con Daphnia magna y Daphnia pulex 7.1.1 INICIACION DEL CULTIVO Preparación del agua reconstituida Foto 19 El agua reconstituida se preparo según la siguiente tabla: Agua reconstituida aireada Se realizo un test de viabilidad: antes de usar el agua reconstituida, se comprobó que los parámetros fisicoquímicos eran optimos para el desarrollo de daphnia magna, por ello se realizo un test de viabilidad. Se tomaron 5 neonatos en un recipiente con agua reconstituida. A las 24 horas se realizaba un conteo de organismos, si la cantidad de organismos vivos era mayor al 90%, el agua era apta, si el porcentaje de organismos vivos era menor el agua se descartaba. Foto 20 Prueba de viabilidad después de preparada el agua Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Preparación del medio Bristol Foto 21 Beaker de 2000ml con 1500ml de agua destilada. Diferentes alícuotas de macro y micro nutriente. Foto 22 Se esteriliza en autoclave por un periodo de 15 min. a 121ºC y 15 libras de presión Foto 23 Luz y aireación permanente durante máximo 15 días. Centrifugación de algas verdes Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Foto 24 Durante 15 min. en la centrifuga “DINAC II (Brand)”, con 2000 a 2500 rpm, Foto 25 Se retiro el sobrenadante y se extrajo el concentrado de algas Foto 26 Se rotula registrando la fecha de extracción. y se refrigera a 4 +/-2 °C. Foto 27 Conteo del alga mediante la cámara Neubauer Conteo de algas Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Para el conteo de algas se utiliza la Cámara Neubauer con una capacidad de 1 x 10-4 ml. utilizada para realizar el conteo de glóbulos, en una cantidad fija de líquido. Se toma una alícuota de 0.1 ml del concentrado de algas más 2.9 ml de agua destilada en un tubo de ensayo para tener una dilución de 3 ml. Con ayuda de una micropipeta Brand o pipeta Pasteur se toma una alícuota de 0.1 ml de esta dilución y se coloca en el borde del cubreobjetos. Se deja ingresar la solución a la cámara por capilaridad en un tiempo de 2 minutos sin que pase a los canales laterales, no se puede dejar burbujas dentro de la cámara. Se Coloca la cámara de Neubauer en la platina del microscopio trinocular y enfocar con el objetivo 10X. Se localiza el cuadro central de la rejilla, el cual esta dividido en 25 cuadros, teniendo cada uno un área de 0.04 mm2. Se cambia de lente al objetivo de 40x y realizar 5 lecturas de forma diagonal, teniendo presente que las células que se encuentren sobre las líneas de la cuadricula deben ser descartadas; la lectura se realiza en el orden señalado como se observa en la figura 7 FIGURA 7 LECTURA EN LA CAMARA DE NEUBAUER Lectura en la Cámara de Neubauer 1 2 5 Figura Nº 6 4 3 Fuente: LB03 Conteo de algas con la Camara Neubauer Laboratorio Bioensayos UNISALLE De las células contadas en cada cuadro en forma diagonal se multiplica por 4 o 5 dependiendo de la cuadricula; se suman los valores obtenidos hallando su promedio. Se determina la cantidad de células que existen en un 1 ml, partiendo que la cámara tiene una capacidad de 1 x 10-4 ml, de la siguiente manera: XCelulas 1 10 4 ml No.celulas 1ml Este valor se multiplica posteriormente por el factor de dilución, dado así el valor real de células que existe en 1 ml. Se calcular el volumen de alimento que necesita cada pecera que contiene 20 Daphnia magna con la siguiente fórmula: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. V A B C Donde: V = Volumen del concentrado de algas A = Número de Daphnia magna por acuario. B = Dosis óptima recomendada (4.5 x 10 6 células por Daphnia C = Concentración (número de células/ml) de la suspensión de algas descritas y halladas anteriormente. Mantenimiento del cultivo Daphnia magna Foto 28 20 organismos por pecera en 2 L de agua reconstituida, según edad reproductiva. Foto 29 Limpieza con agua destilada eliminando exuvias. Foto 30 Renovación del cultivo C/ 8-12 días. magna/día). Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Cambio de ½ agua reconstituida cada 8 días. Foto 31 Extracción de neonatos <24horas mediante una pipeta pasteur Pruebas de toxicidad Los ensayos de toxicidad aguda empleando Daphnia magna, se llevaron a cabo teniendo como guía los protocolos de la universidad de la Salle con Daphnia pulex suministrados por el Ingeniero Pedro Miguel Escobar. Los resultados se expresan como concentración letal media luego de un periodo de exposición de 48 horas en condiciones controladas de laboratorio. Previo a la realización de los ensayos, se evaluó la sensibilidad de los organismos empleando dicromato de potasio (K2Cr2O7) como sustancia tóxica de referencia. Las condiciones generales de exposición se resumen en la Tabla 6 TABLA 6. BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EMPLEANDO Daphnia magna Condiciones generales de exposición Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Temperatura 20 ± 0,5 ºC Iluminación No Agua de dilución Agua dura entre 160 y 180 mg CaCO3/l Unidad experimental Copas blancas Capacidad 1 onza Volumen de solución test 10 ml Edad de los organismos 6 - 24 horas Nº de organismos/copa 5 Nº de réplicas por concentración 4 Alimentación No Duración del test 48 horas Estimación de CL 50 Método Probit FUENTE: LAS AUTORAS Preparación de soluciones para la prueba de sensibilidad y sustancias puras A la hora de preparar las soluciones para realizar las pruebas es necesario conocer el peso molecular de cada elemento que se a de utilizar. Para que realmente se evalúe la afectación que tiene el metal, es necesario utilizar una sal ya que en la vida real los encontramos de esta forma. A continuación se muestra los pasos a seguir para la preparación de las soluciones Calcular la cantidad necesaria de cada uno de los reactivos para preparar las soluciones de dicromato de potasio (K2Cr2O7) para la prueba de sensibilidad, dicromato de potasio (K2Cr2O7) para las pruebas de cromo, y sulfato de cobre Cu SO4 para las pruebas de cobre, teniendo en cuenta su peso molecular. La tabla 6 se observa las cantidades empleadas. A continuación de muestran las cantidades necesarias de reactivos para las soluciones puras de cromo y cobre: Tabla 7. REACTIVOS NECESARIOS PARA LAS SOLUCIONES PURAS DE Cr Y Cu Reactivo Elemento o compuesto a Peso molecular Cantidad empleada Cantidad de agua Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. utilizar en gramos destilada K2Cr2O7 Analítico Merck, Nº k25331164-828 UN3288 K2Cr2O7 Dicromato de potasio 294.188 gramos/mol 0.5 g 500 ml Cromo 103.992 gramos/mol 1.414 g 500 ml 1.99 g 500 ml Analítico Merck, Nº k25331164-828 UN3288 Cu SO4.6H2O Analítico Merck, Nº A354691-223 UN3077 Cr2 Sulfato de cobre hexáhidratado gramos/mol Cobre 63.546 Cu SO4. 6H2O 253.612 FUNETE: LAS AUTORAS Preparar soluciones de dicromato de potasio (K2Cr2O7) para pruebas de sensibilidad y sustancias puras para cromo con K2Cr2O7 y cobre con Cu SO4 en concentraciones de 0.001ppm, 0.01ppm, 0.1ppm, 1.0ppm, 10ppm con agua reconstituida de 160-180mg/L CaCO3 para realizar la prueba preliminar, teniendo en cuenta la formula de [ ]1V1 = [ ]2V2 con base a la solución madre de 1000ppm de K2Cr2O7., CuSO4 donde: [ ]1 = Concentración de Solución madre V1 = Volumen a utilizar de la solución madre [ ]2 = Concentración que deseo trabajar V2 = Volumen del Balón de aforo a utilizar Al despejar la ecuación queda: V1 = [ ]2 V2 / [ ]1 Una vez preparadas las soluciones estas se refrigeran a 4ºC. Pasos para la realización del ensayo Foto 32 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Se preparó soluciones para prueba. Se adicionó 10 ml de solución en cada recipiente según concentración. Se colocó 5 organismos por recipiente. Foto 33 Se ubicó la batería de ensayo en una bandeja foto 34 Se tapó la bandeja con papel kraf, bolsa plástica y bolsa de tela. Foto 35 Se ubicó la bandeja en el mismo sitio del cultivo, por un tiempo de 48 horas. Se hizo la lectura de pruebas. La figura 8 explica en una forma abreviada la metodología para llevar a cabo la determinación de la concentración letal media para el organismo daphnia magna: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FIGURA 8. METODOLOGIA PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION LETAL MEDIA EMPLEANDO DAPHNIA MAGNA Y DAPHNIA PULEX Cultivos de mantenimiento Sustancias toxicas/ muestra Preparación de diluciones Neonatos 24h Num diluciones: 5 Num replicas: 3 Bioensayos Incubación 48 h Toma de datos Diseño experimental Cl 50-48 Análisis estadístico probit Limites al 95% Fuente: Pacheco, H. Hincapié, S. Implementación a nivel piloto de un sistema de remoción foto catalítica de cianuro para una industria galvánica por debajo de la concentración letal media (CL 50-48) para daphnia magna. Tesis. Facultad de Ingeniería ambiental. Universidad de la Salle, 2009. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 7.2 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA CON ONCORHYNCUS MYKISS 1. Preparación del agua de aclimatación de los alevinos. Foto 35 Ocho días antes de la llegada de los alevinos se llenaron los acuarios con agua de la llave, se pusieron 10 aireadores en cada acuario, esto con el fin de declorinar el agua y segundo, aumentar la cantidad de oxigeno disuelto de la misma, asimilando las características del cuerpo de agua de donde provenían los alevinos, para ayudarlos en el proceso de aclimatización y así evitar su muerte durante el proceso de aclimatación. Foto 36 2. Aclimatación El tamaño de los alevinos Utilizados oscilaba entre los 3 y 4 cm, dimensiones características de Truchas Arco Iris con quince días de nacidas. Fueron transportadas en bolsas de polietileno de baja densidad (PEBD) calibre 3 inyectadas con Oxigeno, donde generalmente se introducían un promedio de 120 a 150 organismos. Al llegar los alevinos al laboratorio, las bolsas se sumergieron en los acuarios de 100 litros respectivamente acondicionados con anterioridad. 3. Preparación del agua de dilución: Foto 37 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. El agua utilizada para la ejecución de la pruebas de toxicidad se preparó con anticipación en tanques de 250 L, se aireó con una bomba sumergible con el fin de alcanzar el rango de Oxigeno disuelto adecuado para la realización de las pruebas, dicho valor variaba entre 5.5 y 7.5 mg/L de O2, se controló su temperatura que osciló entre 14 y 16 oC y su pH que debía estar entre 6 y 8 unidades, cumpliendo con los valores establecidos en los protocolos de CETESB. Foto 38 3. Pruebas de toxicidad: Se realizaron pruebas preliminares utilizando rangos entre 0.01 y 1 ppm para cadmio y aluminio, teniendo en cuenta el decreto 1594 de 1984, donde establece los criterios de calidad admisibles, para la destinación del recurso para preservación de flora y fauna en aguas dulces. Posteriormente con los datos obtenidos en el ensayo preliminar, se realizaron las diez (10) pruebas definitivas, empleando 5 alevinos de trucha arco iris Oncorhynchus mykiss por pecera, baterías de cinco concentraciones más el control y cuatro réplicas por ensayo con un total de 24 peceras por prueba toxicológica, 120 organismos por montaje, todo teniendo en cuenta la metodología CETESB En la figura 9, se observa la metodologia empleada para la determinacion de la concentracion letal media de la trucha arco iris: FIGURA 9. METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE x METAL PESADO EMPLEANDO ALEVINOS DE TRUCHA ARCO IRIS. DISENO EXPERIMENTAL ACLIMATACIÓN PRUEBAS DE TOXICIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Agudelo, J. Ortiz, P. Determinación de la concentración letal media (cl50-96) del plomo y el níquel, por medio de bioensayos sobre alevinos de trucha arco iris (orconhyncus mykiss. Tesis. Facultad de ingeniería ambiental. Universidad de la salle, 2008. 7.3 CULTIVO CON LACTUCA SATIVA Preparación de las diluciones Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Foto 39 Agregar a un crisol 3g de K2Cr2O7 y llevarlo a la estufa a 100ºC (1 hora) Llevar el crisol a un desecador Medir 1g de K2Cr2O7 y agregarlo en 500ml de agua destilada y agitar. Foto 40 Llevar los 500ml de K2Cr2O7 a un balón aforado de 1L para obtener una concentración de 1000ppm. Medir en balones aforados las respectivas concentraciones elegidas: 100ppm, 80ppm, 60ppm, 40ppm, 20ppm Siembra de Semillas Foto 41 En las cajas de petri con el respectivo papel filtro, se adicionaron 2ml de cada una de las diluciones evitando que quedaran Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. bolsas de aire en el papel. Foto 42 Agregar 20 semillas en cada una de las cajas con ayuda de pinzas Foto 43 Después de sembrar las semillas con las respectivas diluciones (100, 10, 1, 0.1, 0.001) y el blanco (agua destilada), poner las cajas de petri en la caja hermética. Cubrir las cajas herméticas con plástico negro y ponerlas en un sitio oscuro. Mediciones de efecto Foto 44 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Se determinó el crecimiento de la radícula y el hipocótilo de cada una de las semillas, Foto 45 Se estableció el número de semillas germinadas y no germinadas. 8. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA REALIZACIÓN DE CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS A continuación se explica brevemente, los métodos comúnmente utilizados para los cálculos y expresión de resultados, en la determinación de la concentración letal media y la concentración efectiva: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 8.1 EXPRESION DE RESULTADOS 8.1.1 METODO PROBIT Para el cálculo de los CL50/CE50/CL50 generalmente se usa el análisis Probit (con o sin ajuste). En un experimento típico de pruebas de toxicidad aguda se tiene la siguiente situación: • Concentración de la sustancia o dosis (d). • Número de individuos (n). • Número de organismos muertos o afectados (r). • Porcentaje de efecto (p). La representación gráfica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que muchas veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal. Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X = log10(d), lo cual mostrará una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal, como se muestra en la figura 5.1); de esta manera la distribución de p vs. X será de tipo normal. Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades probit (buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una probabilidad acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una distribución de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan según un análisis de regresión típico. Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la ecuación generada es de la forma: Donde: Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el suministrado por la US Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión 1.5. En el anexo 5.2 se presenta un ejemplo para el cálculo de la CL50/CE50/CI50 por el método Probit. El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos cuantales, analizando porcentajes de efecto vs. dosis dentro del marco de la regresión. Adicionalmente, hacen dos pruebas de bondad de ajuste: Pearson y Log-Likelihood Ratio. Estas pruebas son importantes, porque si los datos no se ajustan a la línea recta generada, es necesario llevar a cabo un análisis Probit ponderado o aplicar métodos no paramétricos o gráficos para poder determinar la CL50/CE50/CI5033. 8.1.2 METODO ANOVA Se conoce como la iniciación presentada de una explicación lógica de un procedimiento y como su nombre lo indica, el análisis de varianza trata de analizar la variación de una respuesta y de asignar porciones (componentes) de esta variación a cada una de las variables de un conjunto de variables independientes. El razonamiento se basa en que las variables de una respuesta se modifican por la variación de algún conjunto de variables independientes desconocidas. El objetivo del análisis de varianza es identificar variables independientes importantes en un estudio y determinar cómo interactúan y afectan la respuesta34. 9. MARCO LEGAL Decreto 1594 de 1984 (Uso del agua y Residuos Líquidos) 33 34 http://www.idrc.ca/en/ev-84468-201-1-DO_TOPIC.html Mendenhall, W. Estadística Matemática con Aplicaciones, el análisis de varianza. 2 ed. México D.F.: Grupo Editorial Iberoamericana, 1994. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Artículo 15: Denomínase bioensayo acuático al procedimiento por el cual la presencia o efectos de una o más sustancias, elementos, compuestos, desechos o factores ambientales solos o en combinación. Artículo 16: Denomínase toxicidad la propiedad que tiene una sustancia, elemento o compuesto. de causar daños en la salud humana o la muerte de un organismo vivo. Artículo 17: Denomínase toxicidad aguda la propiedad de una sustancia, elemento, compuesto, desecho, o factor ambiental, de causar efecto letal u otro efecto nocivo en cuatro (4) días o menos a los organismos utilizados para el bioensayo acuático. Artículo 18: Denomínase toxicidad crónica la propiedad de una sustancia, elemento, compuesto, desecho o factor ambiental, de causar cambios en el apetito, crecimiento, metabolismo, reproducción, movilidad o la muerte o producir mutaciones después de cuatro (4) días a los organismos utilizados por el bioensayo acuático. Artículo 19: Denomínese CL50 a la concentración de una sustancia, elemento o compuesto, solos o en combinación, que produce la muerte al cincuenta por ciento (50%) de los organismos sometidos a bioensayos en un período de noventa y seis (96) horas. Artículo 20: Considérense sustancias de interés sanitario las siguientes: Arsénico, Plomo, Bario, Selenio, Cadmio, Acenafteno, Cianuro, Acroleína, Cobre, Acrilonitrilo, Cromo, Benceno. Código de Recursos Naturales (Decreto-Ley 2811 de 1974) Establece el Código Nacional de Recursos Naturales Renovables y de Protección al Medio Ambiente. En su capítulo II define la regulación desde el punto de vista de prevención y control de contaminación del recurso hídrico. Ley 142 de 1994 Expide el régimen de los servicios públicos domiciliarios; establece que es competencia de los municipios asegurar que se preste de manera eficiente el servicio domiciliario de alcantarillado, el cual incluye el tratamiento y la disposición final de las aguas residuales (Art. 5). Además el artículo 11 establece que las entidades prestadoras deberán cumplir con una función ecológica relacionada con la protección del ambiente cuando las actividades los afecten, como es el caso de las descargas de aguas residuales a un cuerpo de agua. 10. RESULTADOS Las gráficas que se muestran a continuación pertenecen a las pruebas con dicromato de potasio para cada uno de los organismos utilizados en las tesis de la Universidad de la Salle; estas gráficas se obtuvieron con el porcentaje de mortalidad contra la concentración Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. del dicromato de potasio. Con estos datos se estimo r (coeficiente de correlación lineal) que se muestra en cada una de las gráficas. 10.1 PRUEBAS CON DICROMATO DE POTASIO PARA CADA UNA DE LOS ORGANISMOS UTILIZADOS EN LOS BIOENSAYOS REALIZADOS EN LA ULS (GRÁFICA 1-14) 10.1.1 Daphnia Magna Gráfica 1. TESIS plomo y plata (Proyecto 11- anexo G) M O R % T A D D L E I D A PRUEBAS DICROMATO DE POTASIO 120 100 80 60 40 20 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9370 Grafica 2. TESIS cadmio y zinc (Proyecto 12- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA CON DICROMATO M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r=0.9978 Grafica 3. TESIS cromo y cobre (proyecto 9- anexo G) PRUEBAS DICROMATO DE POTASIO M O R % T A D D L E I D A 150 100 50 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9954 Grafica 4. Tesis cianuro (Proyecto 10- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D D L E I D A PRUEBAS DICROMATO DE POTASIO 120 100 80 60 40 20 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9718 10.1.2 Daphnia Pulex Grafica 5. Tesis Glifosato (Proyecto 5- anexo G) M O R % T A D D L E I D A PRUEBAS CON DICROMATO 150 100 50 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9892 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Grafica 6. Tesis cloro (Proyecto 2-anexo G) PRUEBAS CON DICROMATO M O R % T A D D L E I D A 150 100 50 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9901 Grafica 7. Tesis arsénico y níquel M O R % T A D D L E I D A PRUEBA CON DICROMATO 120 100 80 60 40 20 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9569 Grafica 8. Tesis Detergente (Proyecto 3. Anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA CON DETERGENTE PULEX 150 M O % R T A D A D E L I D 100 50 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.7214 Grafica 9. Tesis Fenol (Proyecto 7- anexo G) PRUEBA CON DICROMATO M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.7597 10.1.3 Oncorhyncus Mykiss Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Grafica 10. Tesis mercurio y cromo (Proyecto 16- anexo G) PRUEBA CON DICROMATO M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9981 Grafica 11. TESIS Glifosato (Proyecto 15- anexo G) PRUEBAS DICROMATO DE POTASIO 1000 M O % R T A D A D E L I D 500 0 0 20 40 60 80 100 120 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9939 Grafica 12. Tesis Plomo y Níquel (Proyecto 14- Anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D D L E I D A PRUEBA CON DICROMATO 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9981 Grafica 13. Tesis cobre y zinc PRUEBA CON DICROMATO M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9974 10.1.4 Lactuca Sativa Grafica 14.Tesis PTAR (proyecto 20- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D L E I D A D PRUEBA CON DICROMATO 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9979 10.1.5 ANALISIS DE RESULTADOS Teniendo en cuenta las gráficas 1 a 14 se puede analizar que en todos los ensayos realizados con dicromato de potasio, con los organismos daphnia magna, daphnia pulex, lactuca sativa y trucha arco iris, el coeficiente r cumple con una lineabilidad, ya que la mayoría de los resultados tienen un valor que tiende a 1 y están entre 0.93 y 0.99, exceptuando las tesis: Diseño de un sistema a nivel piloto para la remoción de detergentes aniónicos de una solución preparada con características de una lavandería tipo con el fin de reducir la CL50 de detergentes” y Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del fenol en los vertimientos de la clínica veterinaria de la universidad de la Salle – sede floresta, por medio de bioensayos con daphnia pulex”. Estas dos tesis tienen valores de 0.72 y 0.75 respectivamente, con esto se demuestra que están por fuera del rango y que puede haber errores en ellas. Además en todas se observa que a medida que aumenta la concentración, aumenta el porcentaje de mortalidad, esto quiere decir que los resultados de las pruebas de las diferentes tesis de la Universidad de la Salle, son representativos y confiables. 10.2 PRUEBAS REALIZADAS CON METALES En las gráficas mostradas a continuación se representan las pruebas con los metales o sustancias trabajadas en la Universidad de la Salle, las cuales se obtuvieron de los datos arrojados del porcentaje de mortalidad de los organismos y las diferentes concentraciones para cada una de la sustancia o metal utilizado. Al igual que en las anteriores graficas, se estimo el coeficiente de correlación lineal para cada una. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. GRAFICA 15. PRUEBAS CON CIANURO PARA Daphnia magna (Proyecto 10- anexo G) PRUEBAS CON CIANURO (CN) M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.8520 GRAFICA 16. PRUEBAS CON PLOMO PARA Daphnia magna(Proyecto 14- anexo G) M O R % T A D D L E I D A PRUEBAS CON PLOMO (Pb) 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9930 GRAFICA 17. PRUEBAS CON PLATA PARA Daphnia magna (Proyecto 11- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D L E I D A D PRUEBAS CON PLATA (Ag) 120 100 80 60 40 20 0 0 5E-08 0,000000 1,5E-07 0,000000 2,5E-07 0,000000 3,5E-07 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9116 GRAFICA 18. PRUEBAS CON COBRE PARA Daphnia magna (Proyecto 9- anexo G) PRUEBAS CON COBRE (Cu) M O R % T A D D L E I D A 150 100 50 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9837 GRAFICA 19. PRUEBAS CON CROMO PARA Daphnia magna ( proyecto 9- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D L E I D A D PRUEBA CON CROMO 120 100 80 60 40 20 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9807 GRAFICA 20. PRUEBAS CON CLORO PARA Daphnia pulex (Proyecto 2- anexo G) M O R % T A D D L E I D A PRUEBA CLORO PULEX (Cl) 150 100 50 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9859 GRAFICAS 21. PRUEBAS CON ARSENICO PARA Daphnia pulex Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA CON Ar PULEX M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9616 GRAFICAS 22. PRUEBAS CON NIQUEL PARA Daphnia pulex PRUEBA CON Ni PULEX M O R % T A D D L E I D A 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.8903 GRAFICA 23. PRUEBA CON DETERGENTE LAS PARA Daphnia pulex(Proyecto 3anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. M O R % T A D D L E I D A PRUEBA CON DETERGENTE LAS LAURIL SULFATO PULEX 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 CONCENTRACION 20 25 FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9917 GRAFICA 24. PRUEBA CON FENOL PARA Daphnia pulex (Proyecto 7- anexo G) PRUEBA CON FENOL PULEX M O R % T A D D L E I D A 120 100 80 60 40 20 0 0 5 10 15 CONCENTRACION 20 25 30 FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9881 GRAFICA 25. PRUEBA CON MERCURIO PARA Trucha arco iris (Proyecto 16-anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA CON Hg M O R % T A D L E I D A D 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9777 GRAFICA 26. PRUEBA CON ZINC PARA Trucha arco iris M O R % T A D D L E I D A PRUEBA CON Zn 120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9817 GRÁFICA 27. PRUEBA CON ZINC PARA Daphnia magna (Proyecto 12- anexo G) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA CON Zn M O R % T A D D L E I D A 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.9856 GRAFICA 28. PRUEBA CON CADMIO PARA Daphnia magna (Proyecto 12- anexo G) M O R % T A D L E I D A D PRUEBA CON Cd 120 100 80 60 40 20 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CONCENTRACION FUENTE: LAS AUTORAS r= 0.8384 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10.2.1 ANALISIS DE RESULTADOS De acuerdo a las anteriores gráficas, se obtuvo un coeficiente de correlación lineal entre 0.83 y 0.99, esto indica que la mayoría de los resultados está cumpliendo con la lineabilidad y que las pruebas realizadas son confiables. Además comparándolas con las Gráficas realizadas con Dicromato de Potasio se puede concluir que a medida que aumenta la concentración de cada uno de los metales o sustancias, aumenta el porcentaje de mortalidad del organismo expuesto. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10.3 CARTA CONTROL GENERAL La carta control general que se muestra a continuación (GRÁFICA 29), se obtuvo con los resultados r (coeficientes de correlación lineal), obtenidos para las pruebas con dicromato de potasio, de cada uno de los organismos (Daphnia Pulex y Magna, Oncorhyncus mykiss y lactuca Sativa): GRAFICA 29. CARTA CONTROL r FUENTE: LAS AUTORAS En la gráfica 29, se observa que todas las tesis están dentro de los límites de confianza; además se muestra que el valor medio es de 0.96 mg/L y los limites superior e inferior son 1.1mg/L y 0.83 mg/L respectivamente. Se obtuvieron resultados dentro de los limites de confianza, excepto la tesis que muestra un valor de concentración letal media igual a 0.72 mg/L que pertenece al proyecto denominado: Diseño de un sistema a nivel piloto para la remoción de detergentes aniónicos de una solución preparada con características de una lavandería tipo con el fin de reducir la CL50 de detergentes”, el cual es el único que se desfasa de todos los valores, Lo que quiere decir que esta tesis no es confiable y se recomienda hacer un nuevo proyecto de tesis de este tema. Todos los resultados de concentraciones letales medias, excepto el dicho anteriormente, son representativos, reproducibles y confiables.En las tablas 8 a 11 se presentan los valores obtenidos (CL50, Limite inferior y limite superior) de cada una de las tesis realizadas con los organismos empleados en la Universidad de la Salle. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10.4 CARTAS CONTROL DE SENSIBILIDAD PARA CADA UNO DE LOS ORGANISMOS. (PROMEDIO CL) TABLA 8.CARTA CONTROL PARA Daphnia Pulex CL50 Límite Inf. Límite Sup. PRUEBA mg/L mg/L mg/L 1 0,140 0,125 0,154 2 0,083 0,07 0,0980 3 0,232 0,179 0,310 4 0,394 0,225 0,563 5 0,295 0,255 0,336 6 0,097 0,068 0,121 7 0,159 0,122 0,218 8 0,089 0,069 0,127 9 0,248 0,198 0,327 1,311 2,254 ∑ Promedio 0,193 0,14566667 0,25044444 FUENTE: LAS AUTORAS GRAFICA 30. CARTA CONTROL Daphnia Pulex C L 5 0 ( m g / L 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ) Número de Réplicas FUENTE: LAS AUTORAS TABLA 9. CARTA CONTROL PARA DAPHNIA Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. MAGNA CL 50 PRUEBA mg/L Límite Inf. mg/L Límite Sup. mg/L 1 1,297 1,138 1,487 2 1,054 0,941 1,172 3 1,372 1,149 1,502 4 1,054 0,941 1,172 4,169 5,333 1,6676 2,1332 ∑ promedio 1,11 FUENTE: LAS AUTORAS GRAFICA 31. CARTA CONTROL Daphnia Magna 1,4 C L 5 0 ( m g / L 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 1,05 1 0 1 2 3 4 5 ) Número de Réplicas FUENTE: LAS AUTORAS TABLA 10. CARTA CONTROL PARA TRUCHA ARCO IRIS CL50 Límite Inf. Límite Sup. PRUEBA mg/L mg/L mg/L 1 54,053 66,044 42,101 2 52,218 62,381 42,093 3 56,43 63,66 49,1 4 56,43 63,66 49,1 255,745 182,394 63,93625 45,5985 ∑ Promedio 54,78 FUENTE: LAS AUTORAS GRAFICA 32. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. CARTA CONTROL Oncorhyncus Mykiss C L 5 0 ( m g / L 57 56,5 56 55,5 55 54,5 54 53,5 53 52,5 52 ) 0 1 2 3 4 5 Número de Réplicas FUENTE: LAS AUTORAS TABLA 11. CARTA CONTROL PARA SEMILLAS CE 50 Límite Inf. Límite Sup. PRUEBA mg/L mg/L mg/L 1 31,733 24,581 37,916 2 35,463 28,019 42,258 3 32,196 21,571 42,281 74,171 122,455 ∑ Promedio 33,12 24,72366667 40,8183333 FUENTE: LAS AUTORAS GRAFICA 33. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. CARTA CONTROL Lactuca Sativa C E 5 0 ( m g / L 36 35,5 35 34,5 34 33,5 33 32,5 32 31,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 ) Número de Replicas FUENTE: LAS AUTORAS 10.4.1 ANALISIS DE LAS GRAFICAS GRAFICA realizada con Daphnia pulex Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Al comparar la grafica 30 con la grafica 34, En los 9 resultados se observa un límite inferior de 0.14 mg/L y superior de 0.25 mg/L, con una media de 0.193; estos resultados concuerdan teniendo en cuenta el valor del límite inferior de 0.16 mg/L y el superior de 0.203 mg/L de la grafica 34 con una media de 0.16, esto indica que todos los resultados de los proyectos con daphnia pulex están dentro de los limites de confianza y demuestra que son representativos. GRAFICA realizada con Daphnia magna La grafica 35 presenta una media de 1.16 y sus límites superior e inferior 1.3 y 1.02 respectivamente; para la grafica 31 se obtuvo una media de 1.11 y el rango de límites entre 1.3 y 1.04. Con lo anterior se concluye, que los proyectos realizados con daphnia magna arrojan resultados confiables. GRAFICA realizada con TRUCHA ARCO IRIS Comparando las gráficas 32 y 36, se obtiene que en la gráfica 32 las Concentraciones letales medias son muy parecidas y que a pesar de los escasos datos de esta grafica, los rangos son similares. En la grafica 36, se obtuvo una media de 54.95 mg/L y sus límites entre 46.55 mg/L y 63.40 mg/L, y en la grafica 32 se presenta un rango entre 45,5 mg/L y 63.9 mg/L y una media de 54.78 mg/L; lo cual indica que si hay confiabilidad en las tesis realizadas y que los datos concuerdan. GRAFICA realizada con SEMILLAS DE LECHUGA Para las semillas la concentración efectiva está entre un rango de limite inferior y superior de 24.7 mg/L y 40.8 mg/L con una media de 33.12 mg/L, como se observa en la gráfica 33, es decir que los resultados de las CL50 de las tres tesis se encuentra cercanos a la media a pesar de los pocos datos obtenidos actualmente con este organismo en la Universidad de la Salle. No fue posible realizar una carta control global con todos los resultados de las sensibilidades de los 3 proyectos, ya que están incompletos y algunas tesis no las tienen, por esto no se compararon. 10.4.2 ANALISIS CARTA CONTROL GLOBAL GRAFICA 34. Para la construcción de la gráfica 34 se utilizaron 148 datos, los cuales fueron extraídos de los 7 proyectos de Bioensayos (Anexo G) realizados en la Universidad de La Salle, Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. esto con el fin de observar la tendencia que se presenta y la relación que puede existir entre estos. Los límites se encuentran entre 0,16 mg/L y 0,21 mg/L, y la media es de 0,16 mg/L; se observa que solo el punto 47 sobrepasa el límite superior, lo cual indica que los datos son confiables. Entre esa nube de datos tenemos una media de 0,17. GRAFICA 36. De acuerdo a la gráfica 36 podemos observar que de 75 datos, los puntos 1,5,11,24,38,40,45,48 y 62 no se encuentran dentro de los límites superior e inferior, esto significa el 12 %.; Así mismo existe una gran variación de los datos por encima y por debajo de la media obtenida (0,168 mg/L) Además se puede concluir que la CL50 promedio del organismo utilizado (Oncorhyncus Mikyss) es de 54,95 mg/L y sus límites inferior y superior son 0,161 mg/L y 0,203 mg/L respectivamente. Teniendo en cuenta que la gráfica fué construida utilizando los valores de Concentración letal media, límite inferior y límite superior de las 4 tesis realizadas hasta el momento con trucha arcoíris (Oncorhyncus Mikyss) se puede decir que estos valores son muy similares, lo cual indica que los procedimientos son confiables y por lo tanto son reproducibles. Finalmente podemos decir que el ensayo es apto y preciso a la vez. GRAFICA 35 De los 70 datos utilizados en la gráfica 35 se observan tendencias hacia los dos límites (superior e inferior); de igual forma podemos observar que un valor se encuentra por fuera del límite superior, esto nos indica que los datos obtenidos son confiables, ya que se encuentran dentro de un rango de confiabilidad. La tendencia es muy parecida entre los resultados, lo cual indica que la repetibilidad de los datos es similar y está entre el rango. Además podemos concluir que el 59 % de los datos tiende hacia el límite inferior y el 31 % hacia el límite superior. En esta nube de datos se presenta una media de 1,16 mg/L GRAFICA 37 De acuerdo a la gráfica 37 se observa que los puntos 1, 23, 25, 31 y 34 se encuentran por fuera de los límites de confiabilidad. El valor de CE50 promedio es de 33,09 mg/L, y el de sus límites inferior y superior 26,30 mg/L y 40,08 mg/L respectivamente. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10.5 COMPARACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS EN EL EXTERIOR Y LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE. La siguiente tabla comparativa, se realizo con varios datos de concentraciones letales medias obtenidas en investigaciones de diferentes paises y las obtenidas en la universidad de la Salle. Se muestran los resultados de las concentraciones para varias Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. sustancias con organismos representativos de la cadena trofica y los valores establecidos en el decreto 1594/84. TABLA12. COMPARACIÓN DE CL50 OBTENIDAS EN LA ULS, Y OTROS PAISES ORGANISMO DAPHNIA MAGNA DAPHNIA PULEX SUSTANCIA MERCURIO ARCOIRIS CROMO TRUCHA ALEVINOS (VARIAS ESPECIES) PAIS DECRETO 0.01 1.5 E03 - 3.2 E-03 ROSSINI & ROMO (1996) LIMA- PERU 9.2 E03 BRKOVIC – POPOVIC (1990) LIMA- PERU 0.03 REYES (1996) COLOMBIA 9.9 E03 RODRÍGUEZ APONTE (1999) COLOMBIA 2.2 ROSSINI & ROMO (1996) LIMA- PERU 0.333 MELGAREJO, J. 1999 0.020.12 0.200.35 ULS 0.01 0.1 13 FAO CORPORATEDOCUME NT REPOSITORE. 0.01 0.3 7 DVGW, 1988 0.01 0.8 6 0.01 3.1 3 MERCURIO TRUCHA ARCOIRIS REFERENCIA MERCURIO TRUCHA ARCOIRIS CL50 15.0 GENDUSA AND BEITINGERG, 1993 0.118 REID ET AL. (1991) 0.3 FREEMAN Y EVERHART (1971) CADMIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. MYSTUS VITTATUS 11.99 CIPRINUS CARPIO 10.72 C. MACROPOM UM X P. BRACHYPO MUS ALUMINIO RAO Y MANJULA (1997) 5.0 JAMES (2000) 0.2 2 9.72 ASMINE BASTARDO2 VENEZUEL A DAPHNIA PULEX 0.03 CROMO 0.04 MOUNT (1982) MOUNT AND NORBERG ARGENTIN A 0.0 8 ARGENTIN A (1984) 0.024 DAPHNIA MAGNA CROMO 0.022 MOUNT (1982) MOUNT AND NORBERG ARGENTIN A ARGENTIN A 0.0 5 (1984) DAPHNIA PULEX 3.5 E04 REYES (1997) COLOMBIA 0.029 HOYOS (1995) COLOMBIA 5 E-03 INGERSOLL AND WINNER ARGENTIN A COBRE 0.1 1.3 9 (1982) DAPHNIA MAGNA COBRE 0.013 CHAPMAN ET AL ARGENTIN A 9.5 E03 CHAPMAN ET AL ARGENTIN A 5 E-05 – 7 E- 0.5 18 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PLATA DAPHNIA MAGNA PLATA 03 HOYOS (1995) COLOMBIA 2 E-05 RATE (1999) ARGENTIN A 4 E-06 CALL ET AL. (1999) 2 E-06 US EPA (1980) ARGENTIN A 5 E-05 UNIVERSIDAD COLOMBIA 0.01 8.9 E08 JAVERIANA 2004 DAPHNIA PULEX 2 E-04 INGERSOLL AND WINNER (1982) ALUMINIO 2 E-04 OBREGÓN ARGENTIN A COLOMBIA (1995) 3 E-04 CHAPMAN ET AL., MANUSCRIPT DAPHNIA MAGNA ALUMINIO LACTUCA SATIVA ZINC TRUCHA ARCOIRIS NIQUEL 4 E -04 HOYOS (1995) 2 E-04 MOLANO 2.9 8 ARGENTIN A COLOMBIA (1993) CE 24.48 28.13 UNIVERSIDAD JAVERIANA COLOMBIA MARTINEZ L Y GOMEZ L (2002) DAPHNIA MAGNA ZINC 0.49 3.3 5 SATIZABAL A. ALUMINIO 5.51 FUENTE: LAS AUTORAS Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Según los datos obtenidos en la tabla 12, en las concentraciones letales medias del mercurio sobre daphnia magna todos los resultados se encuentran por debajo de los valores establecidos en el decreto 1594/84 expresada en el artículo 45, menos el valor que se hizo en la investigación de 1996 en Colombia, la cual tiene un valor de 0.03 mg/L. Es de anotar que la concentración que está en la norma es de 96 horas para peces y tiene un valor de 0.01 mg/L, mientras que las halladas en las investigaciones de Perú y de Colombia, son de 48 horas para daphnia magna. Para el mercurio sobre daphnia pulex, los valores encontrados en las investigaciones realizadas en la universidad de la Salle y de Perú en 1996, presentan valores por encima de la norma la cual establece un valor de 0.01 mg/L. Para este mismo metal tóxico sobre trucha arco iris, se observa que el valor de la concentración letal media en la investigación de la universidad de la Salle (proyecto 16-Anexo G) también se encuentra por encima de la norma, mostrando un valor de 0.12 mg/L . La concentración letal media del cromo sobre daphnia magna en la investigación hecha en Colombia en 1997 es la única que cumple con la norma presentando una concentración letal media de 0.0035 mg/L; se observa que esta por debajo del valor establecido en el decreto 1594/84 (0.01 mg/L). El resto de investigaciones en Argentina y Colombia están por encima de este valor, encontrándose un rango de valores entre 0.022 y 0.029 mg/L. El proyecto de la Universidad de la Salle (Proyecto 9-anexo G) tiene un valor de 0.05 mg/L. Para el cromo con daphnia pulex, todas las investigaciones están por encima de la norma y se presenta un rango de 0.03 a 0.08 mg/L, incluyendo el proyecto de la Universidad de la Salle (proyecto 6- anexo G), en el cual se obtuvo el valor mas alto. Los valores de concentraciones letales medias para el cadmio sobre trucha arco iris están por encima de la norma (0.01mg/L) y el que mayor valor presenta es el de la investigación de la universidad de la Salle (proyecto 17- anexo G), con una concentración letal media de 3.13 mg/L. En la tabla se observa otra investigación que se hizo en 1971, la cual arroja un valor de 0.3 mg/L. Según los datos de concentraciones letales medias para el Aluminio sobre diferentes especies de organismos que se han investigado en Argentina y Venezuela, se puede notar que se alcanzan rangos superiores al de la norma, la cual establece un valor de 5 mg/L. En cuanto al aluminio sobre daphnia pulex para las investigación de Argentina y Colombia y el proyecto de la Universidad de la de la Salle (proyecto 1- Anexo G), los valores presentan rangos por debajo de la norma presentando concentraciones de 0.002mg/L para las dos investigaciones. Para los valores de concentraciones del cobre sobre daphnia pulex, se observa que los datos de CL50 en la investigación realizada en Argentina en 1982, está por debajo de la norma (0.005mg/L), pero la realizada en la universidad de la Salle (proyecto 6- anexo G) presenta un valor de 1.39 mg/L, el cual es mayor al de la norma (0.1mg/L). Sobre daphnia magna para el mismo metal, el único resultado que se establece por encima de la norma Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. es el del proyecto de la Universidad de la Salle (proyecto 9- anexo G) en el cual se observa un valor de 0.518 mg/L. Las otras investigaciones realizadas en Argentina y en Colombia, presentan concentraciones entre los rangos 0.009 y 0.01 mg/L. Las concentraciones letales medias de la plata sobre daphnia magna, se presentan dentro del valor establecido en el decreto 1594/84, que es de 0.01 mg/L. En la investigación de la Universidad Javeriana que se realizo en 2004, se observa un valor de 5*10-5 y el valor de la Universidad de la Salle (proyecto 11. Anexo G) es de 8.9*10-8. En el decreto 1594/84 no se encuentran valores de concentraciones letales medias establecidos para el zinc, pero el valor que se presenta para daphnia magna en el proyecto de la Universidad de la Salle (proyecto 8- anexo G) es de 3.35 mg/L. El valor de concentración efectiva del zinc para lactuca sativa, en el proyecto realizado en Colombia por la Universidad Javeriana, es de 24.48 mg/L. En la Universidad de la Salle no se ha realizado el proyecto de Lactuca sativa con este metal. 10.6 COMPARACION DE RESULTADOS DE CL50 Y/O CE50 OBTENIDOS EN LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE A continuacion se muestran los valores de concentraciones letales medias y concentraciones efectivas, obtenidas en cada una de las tesis de la Universidad de la Salle: TABLA 13. COMPARACION DE RESULTADOS DE CL50 Y/O CE50 OBTENIDOS EN LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. SUSTANCIA Zn Cd Fenol As Ni Glifosato Cl Pb Ag Cr Cu Al Hg CN DAPHNIA PULEX CL50 (mg/L) 0,0903 0,0468 11,6175 1,14 3,548 86,642 0,127 0,08207 1,3954 2,98 1,13X10-4 DAPHNIA MAGNA CL50 (mg/L) 3,351 0,22 TRUCHA CL50 (mg/L) 3,136 3,2084 1,006 9,49 8,925E-08 0,0503 0,518 SEMILLAS CE50 (mg/L) 7,511 0,0226 0,86 31,733 4,119 0,225 0,37 0,011 FUENTE: LAS AUTORAS Al realizar las comparaciones de los proyectos realizados en la Universidad de la Salle acerca del valor de la concentración letal media (CL50-48) del cromo y cobre; estas nos muestran que el organismo Daphnia Pulex presenta mayor sensibilidad a estos metales que la especie daphnia Magna. En Dapnhia Pulex, el valor encontrado de cromo es de 0.082 y del cobre 1.39 mientras que para daphnia magna los valores son 0.05 y 0.51 para cromo y cobre respectivamente. Lo cual indica que la especie Magna es más resistente y posee un mayor tiempo de respuesta frente a los metales, debido a que esta posee características morfológicas diferentes y habita en aguas duras. Otro factor que interviene para que la sensibilidad de la Daphnia pulex sea mayor que la de Daphnia magna es el tamaño, ya que la Daphnia pulex es mucho más pequeña por lo que su proceso de intoxicación es más rápido. La (CL50 -48) para Plata, registra valores menores a 1 X 10 -12 mg/L, lo que indica que la Daphnia pulex posee una gran sensibilidad y poca asimilación de este metal ya que se acumula; muriéndose toda la población en un periodo de tiempo de 1 hora. La norma determina una (50 -48 CL) de 0,01 mg/l, en la Universidad de la Salle se registro un valor alto por lo cual no se pudo determinar. Para daphnia magna se registra una sensibilidad de 8.9 X 10 -8 mg/L, que comparado con la norma es alta. Analizando el valor de la (CL 50-48) del fenol de 11.61, se demuestra su gran efecto tóxico, lo cual causa un gran impacto a ecosistemas acuáticos y que en un rango tan alto ocasiona efectos mortales al 50% de organismos existentes en una batería de ensayo. La concentración letal media del (CL 50-96) de Cadmio y Aluminio para Oncorhynchus Mykiss, se encuentra por encima de los valores establecidos en el decreto-ley 1594 de 1984 ya que la en el caso del cadmio los valores de toxicidad oscilan entre un rango de 3.1311 – 3.1418 mg/l y una (CL 50-96) de 3,1365 mg/l. Así mismo la concentración letal media del aluminio se encontró en un rango de 0.233 mg/L y 0,240 mg/L teniéndose una Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. (CL 50-96) de 0.225 mg/L. Cabe anotar que estos datos son relativamente similares a algunos de normas internacionales ya citadas en el marco legal. Al revisar los resultados con Daphnia pulex, se concluye que la especie es más tolerante al Cadmio que al Zinc, ya que se necesita de una concentración mayor de cadmio afectar al organismo. Para daphnia magna se observa un comportamiento igual, ya que para el cadmio tiene una mayor tolerancia y el zinc tiene un concentración letal alta de 3.351, lo cual indica que sobrepasa la norma. La concentración letal media (CL 50-96) de Níquel exponiendo alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss) a pruebas de toxicidad fue de 3.2084 mg/L, el valor encontrado es mayor al límite establecido en el decreto 1594 de 1984 en el artículo 45, donde el valor es de 0.01, confirmando que los valores de CL50-96 expuestos en el decreto preservan la flora y la fauna. La CL 50-96 del Plomo exponiendo alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss) a pruebas de toxicidad fue de 0.0226 mg/L, el valor encontrado es mayor al límite establecido en el decreto 1594 de 1984 en el artículo 15, donde el valor es de 0.01, confirmando que los valores de CL50-96 expuestos en el decreto preservan la flora y la fauna. Comparando las (Cl 50-96) de Daphnia pulex y Orconhyncus Mykiss observamos que es más resistente para el aluminio Orconhyncus Mykiss con un valor de 0,22 y para el mercurio es más resistente Daphnia pulex, presentando un valor por debajo del decreto 1594. Las toxicidades agudas en términos de la CL50 para el glifosato oscilan entre 3.2 a 52 ppm, lo cual significa toxicidad moderada. Pero el Roundup es unas 30 veces más tóxico a peces que el glifosato solo, o sea que es desde extremada a altamente tóxico a éstos organismos acuáticos. Efectos subletales sobre peces también pueden ser significativos y ocurren a bajas concentraciones en el agua. Por ejemplo, en varios estudios con trucha arco iris, concentraciones equivalentes a la mitad y a la tercera parte de la CL50 causan nado errático y la trucha también muestra dificultad para respirar. Los cambios de comportamiento alteran su capacidad de alimentación, migración y reproducción y pierden capacidad de defensa. El fenol también presenta un alto valor de Cl 50, para daphnia pulex, comparándolo con las otras sustancias o metales tóxicos. Esto se debe a que el fenol es muy toxico para organismos acuáticos y puede provocar a largo plazo efectos negativos sobre el medio ambiente acuático. Las sales solubles en agua de los metales pesados como el plomo, son muy tóxicas y acumulables por los organismos que los absorben, los cuales a su vez son fuente de contaminación de las cadenas alimenticias al ser ingeridos por alguno de sus eslabones. Desde hace mucho tiempo se sabe que el plomo es venenoso, tiene efectos tóxicos para Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. las plantas, el plancton y demás organismos acuáticos. Los compuestos de plomo en los peces les origina la formación de una película coagulante y les provoca alteraciones hematológicas. Por esto se observa en la tabla que los valores de Cl 50 para daphnia magna, son más altos para este metal toxico. En Orconhyncus Mykiss el cadmio presenta el mayor valor de Cl 50, esto de puede deber a que el cadmio es un metal pesado que reacciona con grupos biológicos activos (carbosil, fenol, sulfhidril y otros) y causa variados efectos subletales en peces, como fracturas y deformidad vertebral, daños testiculares, desarrollo defectuoso de óvulos, reducción del consumo de oxígeno por los tejidos branquiales, cambios patológicos en los tejidos renal e intestinal, efectos hematológicos y disturbios en el metabolismo de carbohidratos. 10.7 COMPARACIÓN DEL DECRETO 1594 DE 1984 CONTRA LOS PROYECTOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO DE BIOENSAYOS DE LA ULS. La siguiente tabla muestran los valores de concentraciones letales medias y efectivas, de los proyectos de la Universidad de La Salle y los valores que indica el decreto 1594/84. TABLA 14. COMPARACIÓN DECRETO 1594 DE 1984 CONTRA LOS PROYECTOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO DE BIOENSAYOS DE LA ULS. SUSTANCIA CL 9650 DEC 1594 DE 1984 Daphnia Pulex (CL50)mg/l Daphnia Magna (CL50) mg/l Lactuca Sativa (CE) mg/l Oncorhinchus Mykiss (CL50) mg/l Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Aluminio (Al) Amoniaco (NH3) Arsénico (Ar) Bario (Ba) Berilio (Be) Cadmio (Cd) Cianuro Libre (CN-) Zinc (Zn) Cloro Total Residual (Cl2) Cobre (Cu) Cromo hexavalente (Cr+6) Fenoles mono hídricos Grasas y Aceites Hierro (Fe) Manganeso (Mn) Mercurio (Hg) Níquel (Ni) Plaguicidas Organoclorados Plaguicidas organofosforados Plata (Ag) Plomo (Pb) Selenio (Se) Tensoactivos mg/l 5.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01 0.05 2.98 0.22 1.14 0.04 0.22 0.01 0,01 0.1 0.09 0.12 3.35 0.1 0.01 1.39 0.08 0.51 0.05 1.0 11.61 0.01 0.1 0.1 0.01 0.01 0.001 0.05 0.01 0.01 0.01 0.143 0.11 3.54 86.642 3.13 4.11 11.22 0.86 7.51 0.37 3.20 1.00 8.92E-08 9.49 0.02 FUENTE: LAS AUTORAS Según la tabla 14 se concluyó que: Al realizar las comparaciones del valor de la concentración letal media (CL50-48) del cromo y cobre (anexo G); de los proyectos realizados en la Universidad de La Salle se observa que el organismo Daphnia Pulex presenta mayor sensibilidad a estos metales que la especie daphnia Magna. En Dapnhia Pulex, el valor encontrado de cromo es de 0.082 mg/L y del cobre 1.39 mg /L; mientras que para daphnia magna los valores son 0.05 y 0.51mg/L, para cromo y cobre respectivamente. Esto indica indica que la especie Magna es más resistente y posee un mayor tiempo de respuesta frente a los metales, debido a que esta especie posee características morfológicas diferentes y habita en aguas duras. Otro factor que interviene para que la sensibilidad de la Daphnia pulex sea mayor que la de Daphnia magna es el tamaño, ya que la Daphnia pulex es mucho más pequeña por lo que su proceso de intoxicación es más rápido. La (CL50-48) para Plata, registra valores menores a 1* 10-12 mg/L, lo que indica que la especie Daphnia pulex posee una gran sensibilidad y poca asimilación de este metal ya Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. que este se acumula; y se presenta un alto grado de mortalidad. La norma determina una CL50 de 0,01 mg/L y para daphnia magna se registra una concentración letal media de 8.9*10-8 mg/L, que comparadolo con la norma se puede notar que es mucho menor. Al observar el valor de la (Cl 50-48) sobre Daphnia pulex del fenol, este es de 11.61mg/L, lo cual demuestra su gran efecto tóxico e indica un gran impacto a ecosistemas acuáticos ya que en un rango tan alto ocasiona efectos mortales al 50% de organismos existentes en una batería de ensayo. La concentración letal media (CL 50-96) del de Cadmio y Aluminio para Oncorhynchus Mykis, se encuentra por encima de los valores establecidos en el decreto-ley 1594 de 1984; en el caso del cadmio los valores de toxicidad oscilan entre un rango de 3.1311 – 3.1418 mg/l y una (CL 50-96) de 3,1365 mg/l. Así mismo la concentración letal media del aluminio se encontró en un rango de 0.233 mg/L y 0,240 mg/L teniéndose una (CL 50-96) de 0.225 mg/L. De acuerdo a los resultados para Daphnia pulex, se concluye que la especie es mas tolerante al Cadmio que al Zinc, es necesaria una mayor concentración de cadmio para afectar al organismo. Para daphnia magna se observa un comportamiento igual, ya que para el cadmio se tiene una mayor tolerancia y el zinc tiene un concentración letal de 3.351 mg/L, la cual no es posible compararla con la norma ya que de este metal no existe un valor de concentracion letal media establecido. La concentración letal media (CL 50-96) de Níquel exponiendo alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss) a pruebas de toxicidad, fue de 3.2084 mg/L, el cual es mayor al límite establecido en el decreto 1594 de 1984 cuyo valor es de 0.01. Asi mismo, el valor de la (CL 50-96) del Plomo exponiendo alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss) fue de 0.0226 mg/L; este valor es mayor al límite establecido en el decreto 1594/84 de 0.01mg/L. Comparando las (Cl 50-96) de Daphnia pulex y Orconhyncus Mykiss observamos que es más resistente para el aluminio Orconhyncus Mykiss con un valor de 0,22 y para el mercurio es mas resistente daphnia pulex, presentando un valor por debajo del decreto 1594. Las toxicidades agudas en términos de la CL50 para el glifosato oscilan entre 32 y 52 mg/L, lo cual significa toxicidad moderada. Pero el glifosato Roundup es unas 30 veces más tóxico a peces que el glifosato solo, o sea que es desde extremada a altamente tóxico a éstos organismos acuáticos. Efectos subletales sobre peces también pueden ser significativos y ocurren a bajas concentraciones en el agua. Por ejemplo, en varios estudios con trucha arco iris, concentraciones equivalentes a la mitad y a la tercera parte de la CL50 causan nado errático y la trucha también muestra dificultad para respirar. Los cambios de comportamiento alteran su capacidad de alimentación, migración y reproducción y pierden capacidad de defensa. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. El fenol presenta un valor de Cl 50 de 11.61mg/L, para daphnia pulex. Esto se debe a que el fenol es muy toxico para organismos acuáticos y puede provocar a largo plazo efectos negativos sobre el medio ambiente acuático. Las sales solubles en agua de los metales pesados como el plomo, son muy tóxicas y acumulables por los organismos que los absorben, los cuales a su vez son fuente de contaminación de las cadenas alimenticias al ser ingeridos por alguno de sus eslabones. Desde hace mucho tiempo se sabe que el plomo es venenoso, tiene efectos tóxicos para las plantas, el plancton y demás organismos acuáticos. Los compuestos de plomo en los peces les origina la formación de una película coagulante y les provoca alteraciones hematológicas. Por esto se observa en la tabla que el valor de Cl 50 para daphnia magna (9.49 mg/L), es más alto para este metal toxico. En Orconhyncus Mykiss el cadmio presenta el mayor valor de Cl 50 (3.13 mg/L), esto de puede deber a que el cadmio es un metal pesado que reacciona con grupos biológicos activos (carbosil, fenol, sulfhidril y otros) y causa variados efectos subletales en peces, como fracturas y deformidad vertebral, daños testiculares, desarrollo defectuoso de óvulos, reducción del consumo de oxígeno por los tejidos branquiales, cambios patológicos en los tejidos renal e intestinal, efectos hematológicos y disturbios en el metabolismo de carbohidratos. De acuerdo con los valores obtenidos en las 20 tesis realizadas en el laboratorio de Bioensayos de la Universidad de la Salle y expresados en la tabla anterior se puede decir que solo tres proyectos (proyecto 1, 11, 17- anexo G) de estos cumplen con el Decreto 1598 de 1984. 11. CONCLUSIONES Una vez realizadas las comparaciones de todos los proyectos de Bioensayos de toxicidad realizados en la Universidad de la Salle podemos concluir que los resultados de las pruebas con dicromato de potasio para los organismos representativos de la cadena trófica (D. Pulex, D. magna, Lactuca Sativa, Oncorhyncus Mykiss), son confiables, a excepción de los obtenidos en la tesis realizada con detergentes para daphnia pulex (Anexo G, proyecto 3). Al analizar los resultados de las concentraciones letales medias y concentraciones efectivas de los organismos empleados en el Laboratorio de la Universidad de la Salle, se observa que estos se encuentran en un rango de toxicidad similar, obteniendo un valor en el coeficiente de correlación lineal, entre 0.83 y 0.99 mg/L De acuerdo con los organismos que se utilizaron en la pruebas de bioensayos en la Universidad de La Salle, se observa que la especie Daphnia pulex presenta mayor sensibilidad para los metales Zinc, Cadmio, Plata y Cobre; Daphnia magna es más Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. sensible al cromo que los otros organismos; la trucha arco iris es más sensible al glifosato y al aluminio comparándola con Daphnia pulex y al plomo comparándola con Daphnia magna; y las semillas de lechuga presentan mayor inhibición de crecimiento al ser expuestas al cobre. Para las pruebas de concentraciones letales medias, las sensibilidad encontrada para daphnia pulex es de 0.16mg/L, para daphnia magna es de 1.16mg/L, para trucha arco iris es de 54.95mg/L y en las pruebas de concentraciones efectivas la sensibilidad para las semillas de lechuga es de 33.12 mg/L. El metal mas toxico para el organismo daphnia pulex es el mercurio, presentando una concentración letal media de 1.12 x 10-4 mg/L , para daphnia magna es la plata, con una concentración letal media de 8.925 x 10-8 mg/L , para trucha arco iris se observa un valor de concentración letal media de 0.0226 mg/L el cual es el más bajo y se presento en las pruebas con el plomo; y por último la concentración de inhibición media más baja se obtuvo con el cobre, con un valor de 4.11 mg/L. El cronograma estimado para las investigaciones de Bioensayos en la Universidad de La Salle entre el año 2010 y el 2011, requieren de aproximadamente 25 proyectos. El cronograma se elaboró proyectando un trabajo con los mismos organismos con los cuales se han realizado bioensayos en la Universidad pero asegurándose de tener en cuenta todas las sustancias de interés sanitario, que se encuentran en el decreto 1594/84. 12. RECOMENDACIONES Para los próximos proyectos de Bioensayos, se recomienda, determinar y dejar evidencia por escrito de: Concentraciones Letales y/ efectivas según sea el caso (del metal en estudio y de la prueba con el Dicromato) y límite superior e inferior. Contar con este trabajo como referencia para futuras investigaciones acerca de Bioensayos de Toxicidad acuátia. Realizar las pruebas de toxicidad con diferentes concentraciones, hasta encontrar la más apropiada. Una vez hallada la concentración correcta, proceder a efectuar varias pruebas con esta misma concentración. Se sugiere realizar las siguientes investigaciones: Zinc con alevinos de trucha y semillas de lechuga, Cadmio con semillas de lechuga, fenol con daphnia magna, alevinos de trucha y semillas de lechuga, Arsénico con daphnia magna, alevinos de trucha y semillas de lechuga, Níquel con daphnia magna, Glifosato con daphnia magna y semillas de lechuga, Cloro con daphnia magna, alevinos de trucha y semillas de lechuga, Plomo con daphnia pulex y semillas de lechuga, Plata para daphnia pulex, semillas de lechuga y alevinos de trucha, Cobre con alevinos de trucha, Aluminio con daphnia magna y semilla de lechuga, Mercurio con daphnia Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. magna y semillas de lechuga y Cianuro con daphnia pulex, alevinos de trucha y semillas de lechuga. Una vez finalizados los proyectos mencionados, será de suma importancia realizar Bioensayos con Bacterias. Los bioensayos se deben realizar con todas las sustancias de interés sanitario, para garantizar la supervivencia de los ecosistemas acuáticos en el país. Tener en cuenta los resultados de toxicidad acuática obtenidos de las diferentes especies utilizadas en la nueva legislación ambiental, para considerar de una forma real el impacto sobre los ecosistemas acuáticos. Es importante seguir llevando a cabo pruebas de toxicidad con organismos representativos de la cadena trófica para luego aplicarlos a normas restrictivas en el control de vertimientos y protección de la fauna y flora. Se sugiere realizar nuevamente los proyectos de Bioensayos con: detergentes, (Anexo G, Proyecto 3) fenol, (Anexo G, Proyecto 7) y Glifosato Roundup (Anexo G, Proyecto 5) 13. BIBLIOGRAFIA Guía técnica Colombiana GTC 31. Guía para la realización de ensayos de toxicidad (Bioensayos) en organismos acuáticos. CETESB. Procedimientos para la utilización de test de toxicidad. Decreto 1594 de 1984 Por el cual se reglamenta parcialmente el título I de la Ley 9 de 1979, así como el capítulo II del título VI - parte III - libro II y el título III de la parte III - libro I - del Decreto 2811 de 1974 en cuanto a usos del agua y residuos líquidos. Junio 26 de 1984. Bogotá D.C. CPPS/PNUMA/COI. Curso Regional sobre Bioensayos y pruebas de toxicidad en organismos marinos del pacifico Sudeste. Documento guía. Castillo, M, Eds. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas, conceptos generales. México, 2004. Mendenhall, W. Estadística Matemática con Aplicaciones, el análisis de varianza. 2 ed. México D.F.: Grupo Editorial Iberoamericana, 1994. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Echave, D. 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Htpp://www.infoagro.com/hortalizas/lechuga.asp Htpp://www.faxsa.com.mx/semhort1 http://es.wikipedia.org/wiki/Lechuga http://urbanext.illinois.edu/veggies_sp/lettuce1.html ANEXOS Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. ANEXO A Tabla 1. CONCENTRACIÓN DE INHIBICIÓN MEDIA OBTENIDA DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Límite Inferior Límite Superior ppm ppm 25,9002 20,4044 30,6397 28/07/2008 35,6498 28,6767 41,7849 28/07/2008 32,2068 25,3318 38,2249 28/07/2008 31,0692 23,707 37,4003 28/07/2008 32,9076 21,0995 42,5483 06/08/2008 30,1042 21,6613 37,2357 06/08/2008 31,2891 25,8425 36,1599 06/08/2008 29,8217 23,0949 35,636 Fecha CE50 28/07/2008 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 06/08/2008 31,0302 25,984 35,5806 06/08/2008 38,022 31,0496 44,2525 13/08/2008 35,3648 28,544 41,4983 13/08/2008 31,5043 22,8076 38,8942 13/08/2008 31,7227 24,7672 37,7556 13/08/2008 32,6914 25,4576 39,0068 13/08/2008 33,8467 23,9739 42,1278 20/08/2008 30,6452 23,5812 36,7029 20/08/2008 32,1873 25,1214 38,3437 20/08/2008 27,9017 20,3869 34,2242 20/08/2008 27,6855 22,4415 32,2847 20/08/2008 33,1166 27,6912 38,0343 Promedio 31,7334 24,5812 37,9168 Fuente: Determinación de la Concentración de Inhibición Media (CE 50) de Cromo para la Semilla Lactuca sativa Mediante Ensayos de Toxicidad. Tesis universidad de la salle . Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 2. CONCENTRACION DE INHIBICION MEDIA OBTENIDA EN LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinación de la concentración de inhibición media de níquel y cobre para la semilla Lactuca sativa mediante ensayos de toxicidad. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 3. RESULTADOS DE CE50 DE LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. BIOENSAYO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Promedio Desviación Media + 2Desviación Media - 2Desviación CE50 26,715 33,197 38,817 37,325 42,104 40,57 30,486 40,73 35,794 25,395 26,647 29,023 27,502 30,901 28,796 28,718 30,606 33,639 27,744 29,221 32,1965 5,312333221 42,82116644 21,57183356 Fuente: ensayo de toxicidad aguda al efluente de la ptar de la calera mediante la utilización de semillas de lactuca satival l. y propuesta para su utilización como agua de riego para cultivos. Tesis Universidad de la salle. ANEXO B Tabla 1. CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE DICROMATO DE POTASIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 2. CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE ALUMINIO Fuente: determinación de la concentración letal media (cl50-48) de daphniapulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata. Tesis Universidad de la salle. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 3. CARTA CONTROL DE SENSIBILIDAD Tabla 4. CARTA CONTROL PARA EL CLORO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinación de la concentración letal media del cloro en el efluente de una industria tipo mediante bioensayos de toxicidad acuatica utilizando Daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle Tabla 4. CARTA CONTROL DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Diseño de un sistema a nivel piloto para la remoción de detergentes anionicos de una solucionpreparada con características de una lavandería tipo con el fin de reducir la concentración letal media para Daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 5. CARTA CONTROL DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Evaluación del tratamiento realizado al vertimiento de la industria galvanica “Nicrozinc ltda”, teniendo como referencia la concentración letal media de cianuro sobre Daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 6. CARTA CONTROL DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinación de la concentración letal media del glifosato Rounduo 747 por medio de bioensayos de toxicidad acuática. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 7. CARTA DE CONTROL DE SENSIBILIDAD DEL CULTIVO DE DAPHNIA PULEX. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 8. PROMEDIO DE LA (CL50-48) DE CROMO Tabla 9. PROMEDIO DE LA (CL 50-48 ) DE COBRE Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: determinación de la concentración letal media ( CL50-48 ) del cromo y el cobre por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 10. PROMEDIO CL 50-48 FENOL Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: determinación de la concentración letal media (cl50-48) del fenol en los vertimientos de la clínica veterinaria de la universidad de la salle – sede floresta, por medio de bioensayos con Daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 11. CARTA DE CONTROL PARA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE POTASIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 12. CARTA DE CONTROL DE LAS PRUEBAS CON SUSTANCIA PURA ZINC Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 13. CARTA DE CONTROL DE LAS PRUEBAS CON SUSTANCIA PURA PLOMO Fuente: Diseño de un sistema a nivel piloto para la remoción de plomo y zinc por debajo de la concentración letal media (cl50-48) para Daphnia pulex. Tesis Universidad de la Salle. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. ANEXO C Tabla 1. CARTA DE CONTROL DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE POTASIO K2CR2O7 Carta de control sensibilidad FECHA CL 50 - 96 (mg/L) Límite inferior (mg/L) 01/10/2007 46,0041 31,0239 58,6144 01/10/2007 43,0190 25,6637 47,1322 16/10/2007 60,2373 39,7412 93,5596 29/10/2007 54,6811 43,2141 64,2487 13/11/2007 54,1092 38,1926 68,8373 14/01/2008 50,9009 43,3051 58,8893 28/01/2008 46,6607 39,8538 53,6640 28/01/2008 45,1073 37,4158 52,3955 11/02/2008 62,1803 48,0550 84,5474 11/02/2008 57,2751 44,9790 70,6041 25/02/2008 44,7000 35,7600 50,7700 03/03/2008 49,7930 43,3130 55,5500 17/03/2008 48,8690 41,2970 55,9950 31/03/2008 53,3600 48,3680 61,7960 07/04/2008 53,2780 46,3060 59,6120 21/04/2008 51,4540 43,9400 58,3970 05/05/2008 54,2790 46,4410 61,6980 19/05/2008 52,8540 44,0350 61,8850 límite superior (mg/L) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 02/06/2008 58,1030 51,0230 64,7660 16/06/2008 57,5000 49,9430 64,6590 PROMEDIO 52,2183 42,0935 62,3810 Tabla 2. PROMEDIO DE LA (CL50-96) DEL PLOMO Promedio de la CL 50 - 96 (mg/L) Plomo FECHA CL 50- 96 (mg/L) 25/02/2008 0,0182 0,000 0,0953 13/03/2008 0,0164 0,0001 0,0325 25/03/2008 0,0136 0,0059 0,0315 25/03/2008 0,0272 0,0116 0,0700 07/04/2008 0,0268 0,0010 0,0642 07/04/2008 0,0201 0,0000 0,0424 21/04/2008 0,0341 0,0112 0,71900 06/05/2008 0,0272 0,0116 0,0700 19/05/2008 0,0164 0,0001 0,0325 03/062008 0,0268 0,0010 0,0642 Promedio 0,0226 0,0040 0,0574 Límite Inferior (mg/L) Limite Superior (mg/L) Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 3. PROMEDIO DE LA CONCENTRACIÓN LETAL (CL 50-96) DE NÍQUEL Promedio de la CL 50 - 96 (mg/L) Níquel FECHA CL 50- 96 (mg/L) límite inferior (mg/L) límite superior (mg/L) 06/05/2008 2,3243 0,5862 6,4569 06/05/2008 2,5097 1,9010 5,1764 19/05/2008 3,5549 0,0000 5,1141 19/05/2008 3,2265 0,0000 4,6416 03/06/2008 3,9718 0,0000 5,7138 03/06/2008 3,4975 1,6567 5,5148 16/06/2008 2,8021 0,0000 3,9976 16/06/2008 3,1455 1,8706 4,7507 07/07/2008 3,5549 0,0000 5,1141 21/07/2008 3,4975 1,6567 5,5148 Promedio 3,2084 0,7671 5,1995 Fuente: Determinación de la concentración letal media (CL50-96) del Plomo y el Níquel, por medio de bioensayos sobre alevinos de Trucha Arco Iris (Orconhyncus Mykiss). Tesis Universidad de la Salle. Tabla 4. CARTA DE CONTROL DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE POTASIO FECHA CL50 (mg/L) LIMITE INFERIOR (mg/L) LIMITE SUPERIOR (mg/L) 05/11/2007 63.06 54.00 73.15 21/11/2007 58.94 50.72 67.15 01/12/2008 53.27 46.30 59.61 01/18/2008 53.36 48.37 61.79 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 01/25/2008 64.65 58.08 70.92 02/08/2008 60.25 52.45 67.89 02/15/2008 57.50 49.94 64.65 02/29/2008 51.45 43.94 58.39 03/07/2008 62.62 54.92 70.29 03/14/2008 59.70 52.21 66.91 03/28/2008 60.19 52.20 68.10 04/04/2008 54.27 46.44 61.69 04/11/2008 56.08 48.15 63.69 04/18/2008 52.85 44.03 61.88 04/25/2008 49.79 43.31 55.55 05/02/2008 48.86 41.24 55.99 05/09/2008 58.10 51.02 64.76 05/16/2008 59.89 53.05 66.39 PROMEDIO 56.43 49.10 63.66 Tabla 5. CARTA CONTROL PARA EL GLIFOSATO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinación de la concentración letal media del glifosato utilizando alevinos de trucha arco iris. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 6. CARTA DE CONTROL PARA EL MERCURIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FECHA CL50 LIMITE INFERIOR LIMITE SUPERIOR (mg/L) (mg/L) (mg/L) 12/01/2008 0,13 0,12 0,14 27/01/2008 0,13 0,11 0,14 08/02/2008 0,12 0,11 0,13 15/02/2008 0,12 0,10 0,13 29/02/2008 0,12 0,11 0,14 07/03/2008 0,12 0,11 0,13 14/03/2008 0,12 0,11 0,13 29/03/2008 0,12 0,11 0,13 11/04/2008 0,12 0,11 0,13 18/04/2008 0,12 0,11 0,13 PROMEDIO 0,12 0,11 0,13 Tabla 7. CARTA CONTROL PARA EL CROMO FECHA CL50 LIMITE INFERIOR LIMITE SUPERIOR (mg/L) (mg/L) (mg/L) 25/01/2008 8.71 6.09 11.22 15/02/8008 10.24 7.32 13.15 07/03/2008 13.37 10.25 16.73 14/03/2008 11.68 0.00 32.27 04/04/2008 9.12 6.60 11.59 11/04/2008 12.13 9.50 14.91 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 18/04/2008 9.28 6.47 12.00 10/05/2008 12.69 10.16 15.38 16/05/2008 10.89 8.23 13.63 23/05/2008 6.38 4.14 8.34 PROMEDIO 10.45 6.87 14.92 Fuente: determinación de la concentración letal media (cl50-96) del mercurio y el cromo utilizando alevinos de trucha arco iris (oncorhyuncus mykiss). Tesis Universidad de la Salle. Tabla 8. CARTA DE CONTROL DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE POTASIO. FECHA CL50 LIMITE INFERIOR LIMITE SUPERIOR Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. (mg/L) (mg/L) (mg/L) 05/11/2007 63.06 54.00 73.15 21/11/2007 58.94 50.72 67.15 01/12/2008 53.27 46.30 59.61 01/18/2008 53.36 48.37 61.79 01/25/2008 64.65 58.08 70.92 02/08/2008 60.25 52.45 67.89 02/15/2008 57.50 49.94 64.65 02/29/2008 51.45 43.94 58.39 03/07/2008 62.62 54.92 70.29 03/14/2008 59.70 52.21 66.91 03/28/2008 60.19 52.20 68.10 04/04/2008 54.27 46.44 61.69 04/11/2008 56.08 48.15 63.69 04/18/2008 52.85 44.03 61.88 04/25/2008 49.79 43.31 55.55 05/02/2008 48.86 41.24 55.99 05/09/2008 58.10 51.02 64.76 05/16/2008 59.89 53.05 66.39 PROMEDIO 56.43 49.10 63.66 Tabla 9. CARTA DE CONTROL DEL CADMIO Nº DE FECHA CL50 LIM inf LIM sup Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PRUEBA (mg/Lt) 1 27/11/2007 2,934 2,925 2,993 2 29/01/2008 3,177 2,928 3,309 3 05/02/2008 3,178 2,928 3,319 4 19/02/2008 2,934 2,925 2,993 5 04/03/2008 3,287 3,033 3,331 6 18/03/2008 3,521 3,118 3,624 7 08/04/2008 3,178 2,928 3,319 8 22/04/2008 2,934 2,925 2,993 9 06/05/2008 3,287 3,033 3,331 10 20/05/2008 2,934 2,925 2,993 3,136 2,967 3,221 PROMEDIO Tabla 10. CARTA DE CONTROL PARA EL ALUMINIO Nº DE PRUEBA FECHA CL50 (mg/Lt) LIM inf LIM sup 1 08/04/2008 0,284 0,205 0,312 2 22/04/2008 0,225 0,203 0,227 3 06/05/2008 0,224 0,213 0,225 4 20/05/2008 0,126 0,104 0,326 5 03/06/2008 0,212 0,163 0,296 6 17/06/2008 0,223 0,182 0,235 7 24/06/2008 0,285 0,243 0,315 8 08/07/2008 0,177 0,152 0,210 9 22/07/2008 0,212 0,163 0,296 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 10 PROMEDIO 29/07/2008 0,284 0,205 0,312 0,225 0,183 0,275 Fuente: determinación de la concentración letal media (CL 50-96) de cadmio y aluminio mediante bioensayos con trucha arco iris “alevinos de oncorhynchus mykiss”. Tesis Universidad de la Salle ANEXO D Tabla 1. CARTA DE CONTROL DE PRUEBA DE SENSIBILIDAD DEFINITIVA CON DAPHNIA MAGNA Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. FECHA CL50-48 LIMITE INFERIOR LÍMITE SUPERIOR 04/02/08 1.3494 1.1963 1.4841 04/02/08 1.4232 1.2770 1.5538 04/02/08 1.3811 1.2250 1.5203 08/03/08 1.2114 1.0772 1.3535 11/03/08 1.2432 1.0863 1.3807 09/04/08 1.3651 1.2039 1.5623 12/04/08 1.2139 1.0613 1.3853 14/04/08 1.3405 1.1772 1.5401 15/04/08 1.3667 1.2067 1.5614 15/04/08 1.2432 1.0863 1.3807 15/04/08 0.9839 0.5520 1.3418 21/04/08 1.3404 1.1668 1.5632 21/04/08 1.4671 1.2910 1.6543 22/04/08 1.3385 1.1926 1.5024 22/04/08 1.5165 1.3380 1.7118 22/04/08 1.4225 1.2523 1.5931 23/04/08 1.3542 1.1973 1.4947 24/04/08 1.2879 1.1379 1.4576 24/04/08 1.3370 1.1508 1.5892 24/084/08 1.2618 1.1173 1.4205 PROMEDIO 1.3723 1.1496 1.5025 Tabla 2. PROMEDIO DE LA CL50-48 PARA PRUEBA DEFINITIVA DE SUSTANCIA PURA DEL COBRE CON DAPHNIA MAGNA FECHA CL50-48 LIMITE INFERIOR LÍMITE SUPERIOR Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 08/01/08 0.0626 0.0502 0.0787 09/01/08 0.0738 0.0686 0.0799 14/01/08 0.0705 0.0654 0.0764 15/01/08 0.0732 0.0651 0.0818 27/02/08 0.0619 0.0508 0.0789 03/04/08 0.0478 0.0405 0.0548 03/04/08 0.0259 0.0201 0.0319 03/04/08 0.0401 0.0329 0.0469 03/04/08 0.0376 0.0312 0.0441 05/04/08 0.0367 0.0304 0.0425 PROMEDIO 0.05030 0.0455 0.0616 Tabla 3. PROMEDIO DE LA CL50-48 PARA PRUEBA DEFINITIVA DE SUSTANCIA PURA DEL CROMO CON DAPHNIA MAGNA FECHA CL50-48 LIMITE INFERIOR LÍMITE SUPERIOR 02/04/08 0.572 0.508 0.631 02/04/08 0.496 0.432 0.556 02/04/08 0.525 0.463 0.581 03/04/08 0.562 0.497 0.621 03/04/08 0.496 0.432 0.556 03/04/08 0.506 0.434 0.575 05/04/08 0.481 0.405 0.553 07/04/08 0.533 0.470 0.591 07/04/08 0.522 0.453 0.587 07/04/08 0.488 0.426 0.546 PROMEDIO 0.518 0.452 0.580 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinación de la concentración letal media (cl50-48) de cromo y cobre en Daphnia magna para el vertimiento de una industria de galvanotecnia y propuesta de pre-tratamiento para la disminución de la toxicidad de dicho vertimiento. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 4. CARTA CONTROL DE SENSIBILIDAD Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Implementación a nivel piloto de un sistema de remoción foto catalítica de cianuro para una industria galvanica por debajo de la concentración letal media para Daphnia magna. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 5. CARTA DE CONTROL DE PRUEBA DE SENSIBILIDAD DEFINITIVA CON DAPHNIA MAGNA Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: Determinacion de la concentración letal media del plomo y la plata en los vertimientos de una industria galvanica, mediante ensayos toxicológicos sobre Daphnia magna. Tesis Universidad de la Salle. Tabla 6. CARTA DE CONTROL PARA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE POTASIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 7. CARTA CONTROL PARA LAS PRUEBAS CON ZINC Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Tabla 8. CARTA CONTROL PARA LAS PRUEBAS CON CADMIO Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: determinación de la concentración letal media (cl50-48) de los vertimientos de cadmio y cinc de una industria galvánica mediante pruebas toxicológicas para magna. ANEXO E Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Diagrama 1. Resultados de toxicidad para Lactuca sativa y sus respectivos valores de sensibilidad SEMILLAS (Lactuca Sativa) CE50 (mg/L) CROMO COBRE NIQUEL EFLUENTE AFLUENTE (Cr) (Cu) (Ni) PTAR CALERA PTAR CALERA 9.454 12.855 1457,52 77,863 7.134 10.129 323,320 52,684 12.112 14.936 3238,369 103,041 11.22 SENSIBILIDAD (mg/L) 31.733 24.581 37.916 35.463 28.019 42.258 32,196 21,571 42.821 Fuente: Las autoras Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Diagrama 2. Resultados de toxicidad para Oncorhyncus mykiss y sus respectivos valores de sensibilidad TRUCHA ARCOIRIS (ONCORHYNCUS MYKISS) CL50 (mg/L) MERCURIO CROMO NIQUEL PLOMO CADMIO ALUMINIO (Hg) (Cr) (Ni) (Pl) (Cd) (Al) 1.006 0.12 10.45 3.208 0.022 3.136 0.225 0.625 0.11 6.87 0.767 0.004 2.967 0.183 1.388 0.13 14.92 5.199 0.057 3.221 0.275 GLIFOSATO SENSIBILIDAD (mg/L) 54.07 42.10 66.04 54.63 49.10 63.66 52.21 42.09 62.38 56.43 49.10 63.66 Fuente: Las Autoras Diagrama 3. Resultados de toxicidad para Daphnia pulex y sus respectivos valores de sensibilidad Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PULGA DE AGUA (DAPHNIA PULEX) CL50 (mg/L) GLIFOSATO ROUNDUP 747 CIANURO (CN) CADMIO (Cd) FENOL (Ar) NIQUEL (Ni) CLORO (Cl) CROMO (Cr) COBRE (Cu) ARSENICO ALUMINIO PLATA (Al) (Ag) MERCURI O (Hg) 86.642 0.090 0.046 11.617 1.14 3.54 0.127 0.082 1.395 2.8 4.5 E-08 1.13 E-04 70.745 0.075 0.04 7.306 1.68 3.2 0.065 0.066 1.195 1.18 4,9 E-08 7.8 E -05 101.179 0.104 0.05 17.825 1.05 3.8 0.229 0.096 1.583 5.58 5,4 x10-7 1.6 E-04 SENSIBILIDAD (mg/L) 0.295 0.255 0.336 0.140 0.125 0.154 0.089 0.069 0.127 0.394 0.225 0.563 0.232 0.17 0.31 0.0971 0.068 0.121 0.159 0.122 0.218 Fuente: Las Autoras Diagrama 4. Resultados de toxicidad para Daphnia magna y sus respectivos valores de sensibilidad 0.394 0.225 0.563 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. PULGA DE AGUA (DAPHNIA MAGNA) CL50 (mg/L) PLOMO (Pl) PLATA (Ag) CROMO (Cr) COBRE (Cu) CADMIO (Cd) ZINC (Zn) CIANURO (CN-) 9.49 8.51 8.925 E -08 6.728 E-08 0.518 0.452 0.050 0.045 0.22 0.17 3.35 2.53 0.011 0.004 10.41 1.154 E-07 0.580 0.061 0.26 4.39 0.028 SENSIBILIDAD (mg/L) 1.054 0.941 1.172 1.372 1.149 1.502 1.054 0.941 1.172 Fuente: Las Autoras ANEXO F Ciclo vital de la pulga de agua 1.297 1.138 1.187 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Fuente: www.slideshare.net Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. ANEXO G Proyectos de bioensayos de la universidad de la Salle CL 50 O CE mg/L PROMEDI O LIM. INFERIOR LIM. SUPERIOR mg/L mg/L mg/L PROYEC TO No TITULO DEL PROYECTO 1 Determinación de la concentración letal media de Daphnia pulex por medio de bioensayos de toxicidad acuática con aluminio y plata. Sensibilidad 0.1591 0.1227 0.2183 Aluminio 2.98 1.8969 5.1109 Determinación de la concentración letal media del cloro en el efluente de una industria tipo mediante bioensayos de toxicidad acuática utilizando daphnia pulex. Sensibilidad 0.232 0.179 0.310 cloro 0.127 0.065 0.229 3 Diseño de un sistema para la remoción de detergentes aniònicos de una solución preparada con características de una lavandería tipo con el fin de reducir la concentración letal media para daphnia pulex. Sensibilidad 0.0837 0.070 0.098 4 Evaluación del tratamiento realizado al vertimiento de la industria galvánica “Nitrozinc”, teniendo como referencia la concentración letal media de cianuro y cadmio sobre Daphnia pulex. Sensibilidad 0.1402 0.1251 0.1544 5 Determinación de la concentración de la concentración letal media del glifosato Roundup 747 por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex. Sensibilidad 0.2958 0.2559 0.3369 2 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 6 Determinación de la concentración letal media del cromo y el cobre por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre daphnia pulex. Sensibilidad 0.09712 0.0688 0.1213 Cobre 1.3954 1.1955 1.5836 Cromo 0.08209 0.066 0.09648 7 Determinación de la concentración letal media del fenol en los vertimientos de la clínica veterinaria de la U. de la Sallesede la floresta, por medio de bioensayos con Daphnia pulex. Fenol 11.6175 7.306 17.825 8 Diseño de un sistema a nivel piloto para la remoción de plomo y zinc por debajo de la concentración letal media para Daphnia pulex. Sensibilidad 0.2487 0.1984 0.3277 Zinc 1.2199 0.9071 1.6288 Plomo 4.3630 2.5953 7.8128 Determinación de la concentración letal media de cromo y cobre en Daphnia magna para el vertimiento de una industria de galvanotecnia y propuesta de pre tratamiento para la disminución de la toxicidad de dicho vertimiento. Sensibilidad 1.3723 1.1496 1.5025 Cobre 0.0503 0.0455 0.0616 Cromo 0.518 0.452 0.580 10 Implementación a nivel piloto de un sistema de remoción foto catalítica de cianuro para una industria galvánica por debajo de la concentración letal media para Daphnia magna. Sensibilidad 1.2976 1.1388 1.4879 11 Determinación de la concentración letal media de plomo y plata en los vertimientos de una industria galvánica mediante ensayos toxicológicos sobre Daphnia magna. Sensibilidad 1.05425 0.9410 1.172 9 Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 12 13 Determinación de la concentración letal madia de los vertimientos de cadmio y zinc de una industria galvánica mediante pruebas toxicológicas para Daphnia magna. Sensibilidad 1.054 0.941 1.172 Zinc 3.351 2.53 4.396 Cadmio 0.22 0.173 0.267 Cianuro 1.297 1.138 1.487 Sensibilidad 52.218 42.093 62.381 Plomo 0.226 0.004 0.057 Níquel 3.2084 0.7671 5.1995 Determinación de la concentración letal media del glifosato por medio de bioensayos utilizando alevinos de trucha arco iris. Sensibilidad 56.43 49.10 63.66 glifosato 54.073 66.044 42.103 Determinación de la concentración letal media del mercurio y el cromo utilizando alevinos de trucha arco iris. Mercurio 0.12 0.11 63.66 Cromo 10.45 6.87 42.101 Determinación de la concentración letal media de cadmio y aluminio mediante bioensayos con trucha arco iris “alevinos oncorhyncus mykiss” Sensibilidad 56.43 49.10 63.66 Cadmio 3.136 2.967 3.221 aluminio 0.225 0.183 0.275 sensibilidad 31.7334 24.581 37.916 Determinación de la concentración letal media del cianuro mediante bioensayos de toxicidad acuática con Daphnia magna. 14 Determinación de la concentración letal media de plomo y níquel por medio de bioensayos sobre alevinos de trucha arco iris. 15 16 17 18 Determinación de la concentración de inhibición media de cromo para Lactuca sativa mediante ensayos de toxicidad. Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. 19 Determinación de la concentración de inhibición media de níquel y cobre para la semilla Lactuca sativa mediante ensayos de toxicidad. sensibilidad 32.544 25.722 38.538 20 Ensayo de toxicidad aguda al efluente de la PTAR de la calera mediante la utilización de semillas de Lactuca sativa y propuesta para la utilización como agua de riego en cultivos. Sensibilidad 32.196 42.821 21.571 Fuente: Las autoras Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. ANEXO H CRONOGRAMA DE LOS PROYECTOS DE BIOENSAYOS ESTIMADOS PARA AÑOS 2010 Y 2011 METAL O SUSTANCIA ORGANISMOS Meses año 2010 Meses año 2011 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Zinc (Zn) Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Cadmio (cd) Semillas de lechuga Daphnia magna Fenol Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Daphnia magna Arsenico (Ar) Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Niquel (Ni) Daphnia magna Glifosato Daphnia magna Semillas de lechuga Daphnia magna Cloro (Cl) Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Plomo (Pb) Daphnia pulex Semillas de lechuga Daphnia pulex Plata (Ag) Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Cobre (Cu) Alevinos de Trucha Aluminio (Al) Daphnia magna Semillas de lechuga Mercurio (hg) Daphnia magna Semillas de lechuga Evaluación del comportamiento de las concentraciones letales medias de los proyectos de investigación del laboratorio de bioensayos de la Universidad de La Salle con organismos representativos de la cadena trófica. Daphnia pulex Cianuro (CN) Alevinos de Trucha Semillas de lechuga Fuente: Las autoras
