Inmunofluorescencia directa en pelo como herramienta para el

Trabajos originales
52
Inmunofluorescencia directa
en pelo como herramienta para
el diagnóstico de pénfigo vulgar
Juanita Benedetto1, Natalia Sabatini2, Nicole Chiessa3, Reiner Cid3 y Rodrigo Sepúlveda4
RESUMEN
El pénfigo vulgar es una enfermedad ampollar autoinmune que afecta piel y mucosas, caracterizada por presentar autoanticuerpos
en suero dirigidos contra uniones intercelulares de la epidermis. Para el diagnóstico se realiza el estudio histopatológico
convencional y la técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) en una biopsia de piel perilesional. En la IFD, se observan
depósitos de autoanticuerpos en el espacio intercelular, principalmente de tipo IgG y fracciones del complemento. En este
estudio se describe la utilidad de la IFD en pelos del cuero cabelludo extraídos por pulsión en el diagnóstico de pénfigo vulgar.
Se estudiaron muestras de pelos de 12 pacientes con diagnóstico histopatológico e IFD de pénfigo vulgar y de 12 pacientes
sin la enfermedad como grupo control. Se realizó IFD en pelos anágenos y telógenos extraídos por pulsión. De los 12 pacientes
con pénfigo, 11 presentaron IFD en pelo positiva, y todos los controles mostraron IFD en pelo negativa. La sensibilidad de la
técnica fue 91,6% y la especificidad 100%. Nuestros resultados muestran que el método de IFD en pelo tiene valor diagnóstico
comparable al método de IFD en biopsia de piel y presenta ventajas comparativas en cuanto a costo, facilidad en la obtención
de la muestra y transporte.
Palabras clave: pénfigo vulgar, inmunofluorescencia directa, pelo
ABSTRACT
Hair direct immunofluorescence as a tool for diagnosis of pemphigus vulgaris
Pemphigus vulgaris is an autoimmune blistering disease affecting skin and mucosa. It is characterized by serum autoantibodies
against intercellular junctions of epidermis. Conventional histopathology and direct immunofluorescence (DIF) in perilesional
skin biopsy are performed for diagnosis. In the DIF, autoantibody deposits are seen in the intercellular space, mainly IgG and
complement fractions. In this study the utility of the DIF in scalp hairs extracted for diagnosis of pemphigus vulgaris is described.
Hair samples of 12 patients with histopathological and DIF diagnosis of pemphigus vulgaris and 12 patients without disease as
control group were analyzed. DIF was performed in anagen and telogen hairs taken from each patient. Of the 12 patients with
pemphigus, 11 showed positive DIF in hair, and all patients in control group were negative. Sensitivity of the technique was
91.6% and the specificity 100%. Our results show that DIF method in scalp hairs has diagnostic value comparable to DIF in skin
biopsy and also has comparative advantages in terms of cost, ease of sample collection and transportation.
Key words: pemphigus vulgaris, direct immunofluorescence, hair
► INTRODUCCIÓN
El pénfigo pertenece a un grupo de enfermedades ampollares autoinmunes, que afecta la piel y mucosas. Se
caracteriza por presentar ampollas intraepidérmicas con
acantólisis, e inmunopatológicamente por la unión “in
vivo” de inmunoglobulinas y complemento a la superficie
de los queratinocitos 1.
Dermatóloga, Servicio Dermatología, Clínica Alemana de Santiago, Chile
Interno Medicina Universidad del Desarrollo, Clínica Alemana de Santiago, Chile
3
Tecnólogo Medico Universidad del Desarrollo, Santiago, Chile
4
Docente Tecnología Médica Universidad del Desarrollo, Clínica Alemana de Santiago, Chile
1
2
Recibido: 30-10-2013.
Aceptado para publicación: 17-2-2014.
Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56
Juanita Benedetto y colaboradores
Las variantes más frecuentes son pénfigo vulgar y foliáceo, con reconocidas diferencias clínicas, histológicas y
de inmunofluorescencia.
La patogénesis de esta enfermedad aún no está completamente aclarada. Existe una fuerte predisposición genética ligada a una mayor expresión de HLA-DR4 y HLADR62. La acantólisis en el pénfigo vulgar parece ser el resultado de una acción colectiva de autoanticuerpos contra
varios antígenos de un mismo queratinocito, de los cuales
desmogleínas 1 y 3 (Dsg-1 y Dsg-3) son las más importantes. Otros antígenos adicionales, tales como desmocolina
y componentes no desmosomales, como la mitocondria,
también parecen participar en la activación de la enfermedad3.
El pénfigo tiene una prevalencia mundial de 0,5 a 3,2
casos por 100.000 habitantes4 con una incidencia anual
de 0,1 a 0,7 casos por cada 100.000 habitantes5,6, siendo
el pénfigo vulgar el tipo más frecuente5,7. En nuestro país
no hay una cifra clara de las personas afectadas por esta
enfermedad, pero se estima que existirían alrededor de 20
casos nuevos anuales8.
El diagnóstico de pénfigo vulgar se realiza utilizando 4
importantes criterios: clínica, microscopía de luz convencional, inmunofluorescencia directa (IFD) e inmunofluorescencia indirecta9.
Los hallazgos clínicos en piel y mucosas incluyen
vesículas y bullas frágiles, no cicatrizales, con signo de
Nikolski positivo10. La biopsia debe incluir piel lesional y
perilesional. Lesiones recientes no tratadas, son las más
adecuadas, o sea, el borde de una ampolla. El estudio
histopatológico con hematoxilina y eosina (HE) permite
identificar acantólisis y el nivel de formación de la ampolla.
El tipo y la densidad del infiltrado inflamatorio en conjunto
con los hallazgos de inmunofluorescencia directa ayudan
a establecer el diagnóstico de pénfigo vulgar11. El estudio
IFD se realiza en cortes por congelación y la muestra debe
ser transportada en fresco o, en su defecto, en una solución salina o medio de transporte Michel hasta su congelación. A la IFD, el pénfigo vulgar muestra un patrón en red
característico, revelando el depósito de autoanticuerpos
en el espacio intracelular, principalmente de tipo IgG12, en
el 88 a 100% de los casos13,14.
Dado el limitado acceso en nuestro país a microscopio
de fluorescencia, necesario para la lectura de IFD, además
de crióstato para preparar cortes en congelación, es que
resulta difícil al clínico confirmar el diagnóstico de pénfigo
con la detección inmunológica.
Wu y Wilson demostraron similitudes histológicas y
moleculares entre el epitelio folicular y la epidermis interfolicular, caracterizándose ambos por la presencia de Dsg-1
y Dsg-315,16. Posteriormente, Koch y cols. demostraron que
la Dsg-3 era un antígeno importante implicado en el anclaje de la vaina radicular externa al pelo en fase telógena17.
Por otro lado, la acantólisis y las hendiduras suprabasales, hallazgos histopatológicos característicos del pénfigo
vulgar, pueden extenderse al epitelio folicular, a diferencia de otros trastornos acantolíticos. Incluso la acantólisis
puede estar sólo limitada a los folículos del pelo, por lo
que la acantólisis folicular es considerada una pista útil y
sutil para el diagnóstico histopatológico precoz del pénfigo
vulgar18.
Dado que los immunodepósitos se evidenciaron previamente en la vaina radicular externa y la matriz de los
folículos pilosos de las muestras de biopsia de pacientes
con pénfigo16, en el año 2003 Schaerer y Trueb estudiaron la posibilidad de realizar la misma técnica de IFD en
biopsia cutánea, en pelos, para el diagnóstico de pénfigo
vulgar19.
Postulamos que el método de IFD en pelo, tiene un
valor diagnóstico comparable al método de IFD en piel en
pacientes con pénfigo vulgar.
► MATERIAL Y MÉTODOS
Se estudiaron 12 pacientes con diagnóstico histopatológico e IFD de pénfigo vulgar, 7 hombres y 5 mujeres. El rango de edad varió de 35 a 80 años. Además, se incluyeron
12 pacientes sin la enfermedad como grupo control. A la
totalidad de los pacientes se les solicitó consentimiento
informado.
El estudio se realizó en el Servicio de Dermatología de
Clínica Alemana de Santiago, y los pacientes fueron reclutados de distintos centros del país.
Se le extrajeron 20 pelos del cuero cabelludo de áreas
con lesión y sin lesión a cada paciente del estudio. La
muestra se refrigeró a 4°C hasta la realización de la técnica. Se adhirieron los pelos a un portaobjetos con cinta adhesiva y se delimitó con esmalte de uñas una zona
de prueba. Se lavó en PBS (Phosphate Buffered Saline)
pH 7.4 por 10 minutos. Se añadió 100 µl de anticuerpo
IgG (ImmuGlotmantibody, código 1104) conjugado con
isotiocianato de fluoresceína, cuidando de cubrir completamente los bulbos pilosos. Se incubó en oscuridad
durante 30 minutos, a temperatura ambiente y en cámara
húmeda. Luego de 3 lavados sucesivos en buffer fosfato,
pH 7.4, se cubrió con glicerina tamponada como medio
de montaje y finalmente se observó al microscopio de
fluorescencia.
La comparación entre ambos métodos empleados se
realizó mediante curvas ROC adoptando como “variable
estado” al método de histopatología e IFD en biopsia de
piel perilesional. El nivel de significancia utilizado fue de
alfa = 0,05 en todos los casos. Esta curva asigna a los
pacientes en estudio valores, que son expresados en un
gráfico y ordenados en una tabla, e indica un área bajo la
curva de 0.958 que hace referencia a un 5% de originar
falsos positivos y a un 95.8% de obtener verdaderos positivos, aproximadamente.
Se calculó: a) sensibilidad, porcentaje de pacientes
con IFD en piel positiva que tienen IFD en pelo positiva;
b) especificidad, porcentaje de pacientes con IFD en piel
negativa con IFD en pelo negativa; c) valor predictivo positivo, porcentaje de pacientes con IFD en pelo positiva con
IFD en piel positiva; y d) valor predictivo negativo, porcentaje de pacientes con IFD en pelo negativo con IFD en piel
negativo.
Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56
53
54
Trabajos originales
► Inmunofluorescencia directa en pelo
► RESULTADOS
De los 12 pacientes con diagnóstico de pénfigo vulgar, 11
mostraron fluorescencia positiva con patrón intercelular,
tanto en pelos anágenos (Fig. 1), específicamente en la
vaina radicular externa, como en el remanente epitelial de
los pelos telógenos (Fig. 2).
Los 12 controles a los que se les realizó el test fueron
negativos (Fig. 3) (Tabla I).
El valor predictivo positivo de la IFD en pelo es del 100%,
mientras que el valor predictivo negativo es del 92.3%.
La sensibilidad de la técnica de IFD en pelo resultó de un
91.6% y una especificidad del 100%, versus un 91,7% y
100%, respectivamente, calculados por la curva ROC.
► DISCUSIÓN
El pénfigo vulgar es una enfermedad autoinmune de la piel
que se caracteriza por presentar autoanticuerpos séricos
dirigidos contra las uniones intercelulares de la epidermis,
específicamente contra la Dsg-1 y Dsg-3 y que se unen “in
vivo” produciendo el cuadro clínico característico. Estos
autoanticuerpos se detectan mediante la técnica de IFD en
biopsia de piel perilesional.
La técnica de inmunofluorescencia (IF) se basa en el
trabajo pionero de Coons y Kaplan20,21, y más tarde por
Weber y cols.22. Ha sido ampliamente utilizada tanto en la
investigación como en el diagnóstico clínico. En la técnica
de inmunofluorescencia, un anticuerpo es químicamente
conjugado con colorantes fluorescentes, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC) o isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC). Estos anticuerpos marcados se
unen (directa o indirectamente) con el antígeno de interés,
lo que permite la detección de antígeno a través de técnicas de fluorescencia. La fluorescencia a continuación, se
puede visualizar utilizando microscopio de fluorescencia o
microscopio confocal. La IF ha sido usada por casi 5 décadas en el diagnóstico dermatopatológico, especialmente
en enfermedades bullosas autoinmunes y enfermedades
del tejido conectivo. La IFD ha demostrado ser una poderosa herramienta para determinar la presencia, distribución
y/o localización de antígenos o inmunorreactantes, tales
como inmunoglobulinas o fracciones del complemento, en
biopsias de tejido congelado. Sus ventajas y desventajas
han sido ampliamente descritas y reconocidas23.
Schaerer y Trueb demostraron en el año 2003 por primera vez la factibilidad de realizar la IFD en pelos, y observaron que se mantenía el patrón en “red de pesca” con el
100% de sus casos al igual que en la piel19. Posteriormente, en un seguimiento a 2 años de sus pacientes, 14 de los
15 pacientes estudiados presentaban una IFD positiva en
pelo y el resto una IFD negativa además de una remisión
clínica de la enfermedad, lo que sugiere también aplicación en el seguimiento de éstos24.
En otros estudios las sensibilidades encontradas varían de 85% 25, 91% 26 a 100% 27, 28. Estas diferencias se
pueden explicar por los distintos métodos de preservación
utilizados, entre otros factores.
Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56
Fig. 1: Pelo anágeno con patrón intercelular, tipo red de pesca,
característico de pénfigo vulgar.
Fig. 2: Pelo telógeno positivo en remanente folicular.
Fig. 3: Control negativo.
Juanita Benedetto y colaboradores
Tabla I: Tabla de Resultados.
IFD y HE piel +
IFD y HE piel -
Total
IFD pelo +
11 (91,6%)
0 (0%)
11 (45,8%)
IFD pelo -
1 (8,4%)
12 (100%)
13 (54,2%)
Total
12 (100%)
12 (100%)
24 (100%)
IFD: Inmunofluorescencia directa, HE: Estudio histopatológico con hematoxilina y eosina.
Nuestros resultados muestran que el método de IFD
en pelo tiene valor diagnóstico comparable al método de
IFD en biopsia de piel y, además, presenta ventajas comparativas en cuanto a costo, facilidad en la obtención de la
muestra y transporte.
Contrariamente a lo comunicado por Alexandru y cols.28,
en que demostraron falsos negativos en pelos en fase telógena, nuestros resultados demostraron que también hubo
inmunorreactividad de pelos telógenos (Fig. 2) lo que concuerda con el estudio realizado por Kumaresan y cols.27 y
lo descrito previamente por Koch, el cual demuestra que
la Dsg-3 es un antígeno importante implicado en el anclaje
de la vaina radicular externa al pelo en fase telógena17, por
lo que es posible detectarla en pelos telógenos que aun
conservan su vaina. Por otra parte, en estudios en que no
se ha incluido pelos telógenos, como en el realizado por
Rao y cols.25, se encontró una sensibilidad menor a 100%,
por lo que no es posible atribuir este factor a la menor
sensibilidad encontrada. Nuestro planteamiento inicial fue
observar sólo pelos anágenos. Sin embargo, el procedimiento utilizado incluía estudiar al menos 10 pelos por lámina, lo que evidentemente nos llevó a incluir algunos pelos telógenos. Frente a la posibilidad de utilizar tanto pelos
anágenos como telógenos en este examen, es necesario
realizar más estudios prospectivos y precisar dentro del
diseño del método el tipo y número de pelos que se estudiará para cada etapa de maduración.
De los 12 casos estudiados, solo uno fue negativo. En
este caso, los pelos extraídos correspondieron en su totalidad a pelos displásticos, lo que nos impidió identificar
microscópicamente queratinocitos de la vaina folicular.
Es importante utilizar una buena técnica de extracción
de pelos, similar a la del tricograma, con folículos pilosos
completos. Utilizar una lámina con varios pelos, disminuye
la posibilidad de falsos negativos, porque la probabilidad
de incluir pelos anágenos es mayor.
La posibilidad de resultados falsos negativos para IFD
en piel o mucosa en pacientes con pénfigo vulgar es hasta
de un 12%13. Esto se explicaría mayormente por una mala
conservación de la muestra. Al utilizar la técnica de IFD en
pelos para el diagnóstico de pénfigo vulgar, puede reducirse aún más el porcentaje de falsos negativos, ya que se
conservaría de mejor manera y por más tiempo el inmuno-
rreactante que se fijó “in vivo”. Ante esta hipótesis, es necesario realizar estudios prospectivos para determinar en
el tiempo la inmunorreactividad en estos pelos con vaina
radicular. Esto puede facilitar el estudio de pacientes que
habitan a grandes distancias de los centros especializados y no sería necesario usar cadena de frío en el traslado
de muestras de pelo ni una fijación inmediata, como en el
caso de la piel, traduciéndose en un transporte más fácil o
menos complicado de la muestra.
Este método también se puede usar para monitorizar
remisión inmunológica, aunque la sensibilidad es baja según lo estudiado por Daneshpazhooh y cols.26. Para ello
sugerimos realizar estudios longitudinales adicionales aplicando ambos métodos de IFD, tanto en piel como en pelos.
Los estudios publicados a la fecha plantean la posibilidad de que esta técnica se sume a la IFD en piel o mucosa
para el diagnóstico de pénfigo. Nuestra experiencia es limitada por el tamaño de la muestra, pero es una alternativa para aquellas muestras que provienen de sitios remotos
y que requieren diagnóstico y/o seguimiento en centros
especializados.
Agradecimientos: Agradecemos a la Dra. Marcela Le Bert
del CRS Peñalolen, a la Dra. María Fernanda Martin del
Hospital San José, y a la Dra. Virginia Rodríguez M. de la
Clínica Alemana de Valdivia, por facilitarnos las muestras
de los pacientes pertenecientes a sus centros.
► BIBLIOGRAFÍA
1. Stanley, J.: Pemphigus. En: Wolff, K.; Goldsmith, L.; Katz, S.; Gilchrest, B.A.; Paller, A.S.; Leffell, D.J. Fitzpatrick´s Dermatology in
General Medicine, 7th Ed, Mc Graw Hill, 2008, págs.: 459-468.
2. Todd, J.; Acha-Orbea, H.; Bell, J.; Chao, N.; Fronek, Z.; Jacob,
C.; McDermott, M.; Sinha, A.A.; Timmerman, L.; Steinman, L.; et
al.: A molecular basis for MHC class II–associated autoimmunity.
Science 1988; 240:1003-1009.
3. Pan, M.; Liu, X.; Zheng, J.: The pathogenic role of autoantibodies
in pemphigus vulgaris. Clin Exp Dermatol 2011; 36:703–707.
4. Uzun, S.; Durdu, M.; Akman, A.; Gunasti, S.; Uslular, C.; Memisoglu, H.; Alpsoy, E.: Pemphigus in the Mediterranean region of
Turkey: a study of 148 cases. Int J Dermatol 2006; 45:523-528.
5. Langan, S.; Smeeth, L.; Hubbard, R.; Fleming, K.; Smith, C.; West,
J.: Bullous pemphigoid and pemphigus vulgaris—incidence and
mortality in the UK: population based cohort study. BMJ 2008;
337: a180.
Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56
55
56
Trabajos originales
► Inmunofluorescencia directa en pelo
6. Salmanpour, R.; Shahkar, H.; Namazi, M.; Rahman-Shenas, M.:
Epidemiology of pemphigus in south-western Iran: a 10-year retrospective study (1991-2000). Int J Dermatol 2006; 45:103-105.
7. Wohl, Y.; Brenner, S.: Pemphigus in Israel – an epidemiologic
analysis of cases in search of risk factors. Isr Med Assoc J 2003;
5:410-412.
8. Domínguez Espinosa, A.; Mercadillo Pérez, P.; León Dorantes, G.;
Andrade Malabehar, R.: Correlación clínico-patológica en pénfigos. Dermatología Rev Mex 2001; 45:117-125.
9. Hertl, M.: Humoral and cellular autoimmunity in autoimmune bullous skin disorders. Int Arch Allergy Immunol 2000; 122: 91–100.
10. Uzun, S.; Durdu, M.: The specificity and sensitivity of Nikolsky
sign in the diagnosis of pemphigus. J Am Acad Dermatol 2006;
54:411–415.
11. Venugopal, S.; Murrell, D.: Diagnosis and clinical features of pemphigus vulgaris. Dermatol Clin 2011; 29: 373–380.
12. Vodegel, R.M.; de Jong, M.J.; Meijer, H.J.; Weytingh, M.B.; Pas,
H.H.; Jonkman, M.F.: Enhanced diagnostic immunofluorescence
using biopsies transported in saline. BMC Dermatol 2004; 4: 10.
13. Inchara, Y.; Rajalakshmi, T.: Direct inmunofluorescence in cutaneus vesiculobullous lesions. Indian J Pathol Microbiol 2007; 50:
730-732.
14. Sano, S.; Quarracino, M.; Aguas, S.; González, E.; Harada, L.; Krupitzki, H.; Mordoh, A.: Sensivity of direct inmunofluorescence in
oral disease. Study of 125 cases. Med Oral Patol Oral Cir Bucal
2008; 13:287-291.
15. Wu, H.; Stanley, J.; Cotsarelis, G.: Desmoglein isotype expression
in the hair follicle and its cysts correlates with type of keratinization and degree of differentiation. J Invest Dermatol 2003; 120:
1052–1057.
16. Wilson, C.L.; Dean, D.; Wojnarowska, F.: Pemphigus and the terminal hair follicle. J Cutan Pathol 1991; 18: 428–431.
17. Koch, P.; Mahoney, M.; Cotsarelis, G.; Rothenberger, K.; Lavker,
R.; Stanley, J.: Desmoglein 3 anchors telogen hair in the follicle. J
Cell Sci 1998; 11: 2529-2537.
18. Mahalingam, M.: Follicular acantholysis: a subtle clue to the early
diagnosis of pemphigus vulgaris. Am J Dermatopathol 2005; 27:
237–239.
19. Schaerer, L.; Trüeb, R.: Direct immunoflueorescence of plucked
Arch. Argent. Dermatol. 2014; 64 (2): 52-56
hair in pemphigus. Arch Dermatol 2003; 139: 228-229.
20. Coons, A.; Kaplan, M.: Localization of antigen in tissue cells. II.
Improvements in a method for the detection of antigen by means
of fluorescent antibody. J Exp Med 1950; 91: 1–13.
21. Coons, A.; Creech, H.; Jones, R.: Immunological properties of an
antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med
1941; 47: 200-202.
22. Weber, K.; Bibring, T.; Osborn, M.: Specific visualization of tubulincontaining structures in tissue culture cells by immunofluorescence. Cytoplasmic microtubules, vinblastine-induced paracrystals,
and mitotic figures. Exp Cell Res 1975; 95: 111-120.
23. Mutasin, D.; Adams, B.: Inmunofluorescence in dermatology. J
Am Acad Dermatol 2001; 45:803-822.
24. Trüeb, RM.; Shaerer, L.: A tricologist´s view of direct immunofluorescence in pemphigus. Presented at: 10th Meeting of the European Hair Research Society Conference; Barcelona, Spain; June
26-28, 2003.
25. Rao, R.; Dasari, K.; Shenoi, S.; Balachandran, B.: Demonstration
of pemphigus-specific immunofluorenscence pattern by direct
immunofluorescence of plucked hair. Int J Dermatol 2009; 48:
1187-1189.
26. Daneshpazohooh, M.; Asgari, M.; Naraghi, ZS.; Barzgar, MR.;
Akhyani, M.; Balighi, K.; Chams-Davatchi, C.: A study on plucked
hair as a substrate for direct inmunofluorescence in pemphigus
vulgaris. J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23: 129-131.
27. Kumaresan, M.; Rai, R.; Sandhya, V.: Inmunofluorescence of the
outer root sheath: an aid to diagnosis in pemphigus. Clin Exp Dermatol 2011; 36: 298-301.
28. Alexandru, A.; Zurac, S.; Salavastru, C.; Andrei, R.; Tebeica, T.;
Staniceanu, F.; Tiplica, G.S.: Direct Inmunofluorescence on hair
follicles – Present and future perspectives. Am J Dermatopathol
2013; 54:472-476.
R. Sepúlveda E.
Av. Las Condes12438, Lo Barnechea
7710162-Santiago
Chile
[email protected]