remoción de trinitrotolueno (tnt) en agua

REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL
SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON
PRESENCIA DE EXPLOSIVOS.
LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ
DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
BOGOTA D.C
2010
REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL
SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON
PRESENCIA DE EXPLOSIVOS.
LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ
DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR
TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE
INGENIERO AMBIENTAL Y SANITARIO
Director
JOAQUÍN LORENZO BENAVIDES LÓPEZ DE MESA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA
BOGOTA D.C
2010
Nota de aceptación
________________________
________________________
________________________
________________________
______________________
Firma de la directora
______________________
Firma del jurado
______________________
Firma del jurado
Bogotá, Enero de 2010
Tengo que agradecer a todo lo que me rodea, no puedo omitir a nadie ni a ningún
detalle; pese a la lucha el cansancio, los malos días, los compañeros de lucha, sin ellos no
se hubiese podido cumplir un pequeño y a la vez grande sueño, que forma uno de los
primeros escalones para seguir mi vida.
A mi padre y a mi madre pasamos alegría, entusiasmo, satisfacción, pero también
angustias.
A los que me dieron la vida, que sin más remedio dando todo por mí, con su amor
genuino y sincero. A ellos a los que siempre me han sostenido, me vieron crecer y son los
escritores de este sueño. Gracias por este esfuerzo, gracias por ser quien son.
A mi querido hermano, eres un tesoro, gracias por el acompañamiento.
A mí querido amado, mi gran confidente, gracias por tu amor, comprensión, gracias por
compartir este sueño y hacerlo tuyo; por esperarme todos estos años y aun seguir
esperándome… Te AMO.
Y por ultimo y mas importante en mi vida, a ti Dios que te debo todo, te debo mi
gran preciada vida, te debo tu mirada sobre mi, te debo tanto, que ni aun en la
eternidad alcanzaría a pagártelo. Gracias Dios por el conocimiento y sabiduría que
me has dado hasta llegar a este punto, gracias por no dejarme desfallecer y darme
fuerzas cada día aun cuando no quería levantarme. Gracias Eterno por estar
presente en mi vida todos lo días.
‫הנצחי לאל תודה‬
Carolina Bravo
A Dios por ser el que maneja este universo infinito de cosas
maravillosas y ser él quien me permita disfrutarlas, por
enviarme al ser que lógro llenarme de vida y esperanza para
lograr terminar esta carrera, a ese hijo que me levanta en las
mañanas con mil sonrisas, a él esta tesis, mi vida y mis ganas de
seguir adelante.
A mi mamá y hermano que se llenaron de paciencia y amor, y
que sobre todo fueran el piso para que yo pusiera esta nueva base
de mi vida.
A mi familia en general, que siempre estuvieron presentes en la
lucha y siempre esperaron lo mejor de mí.
A mis compañeros de luz y amigos del alma, Gabo, Vanessa y Juli,
porque siempre están ahí.
DIANA ALDANA
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a las siguientes personas por su apoyo en la realización del
presente proyecto de grado:
A Joaquín Benavidez MSc. Director del proyecto.
A Fabio Roldán PhD. Director del grupo y proyectos de Investigación de
Biorremediación en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental, de
la Pontificia Universidad Javeriana, por guiarnos y apórtanos conocimiento
para la realización de este proyecto.
Al Químico Ziv Arbeli. Coordinador de laboratorio.
A Hoover Varón y Ricardo Amaya. Coordinadores de Laboratorio de Ciencias
Básicas de la
Universidad de la Salle y de la Unidad de Saneamiento y
Biotecnología, por tener las respuestas a muchas preguntas.
Al personal de laboratorios de Ciencias Básicas de la Universidad de la Salle.
Al personal del Laboratorio de la Unidad de saneamiento
Ambiental de la PUJ.
y Biotecnología
TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO
1. MARCO DE REFERENCIA
1.1
MARCO TEÓRICO
1.1.1 Explosivos.
1.1.2 Características de los explosivos.
1.1.3 Clasificación de los explosivos.
1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT)
1.1.5 Propiedades químicas del TNT
1.1.6 Biorremediación de explosivos.
1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT
1.1.7.1
Metabolismo con Enterobacter cloacae sp.
1.1.7.2
Metabolismo con Pseudomonas sp.
1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer.
1.1.9 Medio de cultivo.
1.1.10
Características de la colonia.
1.1.11
Agua residual sintética.
1.2
MARCO LEGAL.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1
DISEÑO METODOLOGICO.
2.1.1 Toma de muestras.
2.1.2 Análisis preliminares del suelo.
2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras.
2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras
2.1.5 Aislamiento de cepas.
2.1.6 Criterio de selección de colonias.
2.1.7 Bioensayo.
2.1.8 Análisis estadístico.
2.1.8.1
Modelo.
2.1.8.2
Hipótesis
7
22
22
22
22
23
23
24
25
28
29
29
29
30
31
33
35
38
39
39
41
41
43
46
47
58
62
62
63
3. Análisis de resultados
65
4. CONCLUSIONES
70
5. RECOMENDACIONES
71
6. BIBIOGRAFIA
72
ANEXOS
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Características explosivo TNT. ........................................................... 24
Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación. ............................ 35
Tabla 3. Puntos de toma de muestras. ............................................................. 40
Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos ............................ 41
Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras ................................. 42
Tabla 6. Composición de medio nutritivo. ......................................................... 43
Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio. ......................................... 44
Tabla 8. Composición fuentes de energía. ....................................................... 45
Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica. .................... 48
Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC. ...................................... 54
Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del
TNT seleccionados al azar................................................................................ 57
Tabla 12. Componentes agua residual sintética ............................................... 58
Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo. ................................ 60
Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento
bacteriano. ........................................................................................................ 62
Tabla 15.Análisis de varianza. .......................................................................... 63
Tabla 16.Resultados del análisis de varianza. .................................................. 63
Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo ............................................ 66
Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT. ............ 67
LISTA DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno .............................................. 24
Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes.............................................. 26
Ilustración 3. Metabolismo microbiano .............................................................. 26
Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer. ...................................... 30
Ilustración 5. Toma de muestras. ........................ ¡Error! Marcador no definido.
Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce ................................................. 40
Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento ................................................... 45
Ilustración 8. Población bacteriana caja de petri con T1. ................................. 47
Ilustración 9. Población bacteriana caja de petri con T2. .................................. 47
Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L. ....................................... 68
Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0 ............................... 68
Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3. ................................ 69
LISTA DE CROMATOGRAMAS
Cromatograma. 1. 100 mg/l .............................................................................. 77
Cromatograma. 2. Cero. ................................................................................... 77
Cromatograma. 3 Patrón .................................................................................. 77
Cromatograma. 4 T54A .................................................................................... 77
Cromatograma. 5 T87B .................................................................................... 78
Cromatograma. 6 T88B .................................................................................... 78
Cromatograma. 7 T92B .................................................................................... 78
Cromatograma. 8. T 109 .................................................................................. 78
Cromatograma. 9. T54 A.2 ............................................................................... 79
Cromatograma. 10 T54B2 ................................................................................ 79
Cromatograma. 11. T54C1 ............................................................................... 80
Cromatograma. 12.T 54D2 ............................................................................... 80
GLOSARIO
ACEPTOR DE ELECTRONES: Sustancia que acepta electrones durante una
reacción de oxido reducción.
ACIDÓFILO: Organismo que crece mejor a pH bajos.
AEROBIO: Organismo que crece en presencia del oxigeno.
AISLAMIENTO: El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las
técnicas empleadas normalmente en microbiología.
AGUA RESIDUAL SINTÉTICA: Agua elaborada a nivel de laboratorio que
posee características de un agua residual industrial.
ALCALÓFILOS: Organismo que crece mejor a pH Altos.
BACTERIAS DESNITRIFICANTES: Bacterias con potencial de reducción
nitritos relativamente altos
de manera aeróbica las cuales están muy
ampliamente distribuidas por los suelos y las aguas. Un grupo de organismo
(Nitrosomonas) oxida amoniaco a nitrito y otro grupo (Nitrobacter) oxidan nitrito
a nitrato.
BIODEGRADACIÓN: Es el resultado de los procesos de digestión, asimilación
y metabolismo de un compuesto orgánico llevado a cabo por bacterias, hongos,
protozoos y otros organismos.
BIOENSAYO: Es la evaluación de la actividad biológica de una sustancia
mediante
pruebas
de
su
efecto
sobre
un
organismo
microorganismo.
CEPA: población celular descendiente de una única célula.
en
general.
COLONIA: Población de células que pueden observarse macroscópicamente, y
que crecen en un medio solido, procedentes de una sola célula.
CRECIMIENTO MICROBIANO: Aumento de número de células
de un
microorganismos en la que el numero de estas se dobla en un periodo de
tiempo fijo.
CULTIVO: Cepa particular o tipo de organismo que crece en un medio en el
laboratorio.
CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO: Empleo de medios de cultivo y
condiciones de incubación selectivos para aislar microorganismos directamente
de muestras naturales.
DILUCIÓN: Es una mezcla homogénea, conformadas por un soluto y un
solvente.
DONADOR DE ELECTRONES: Compuesto que proporciona
electrones
durante una reacción de oxido reducción.
ESPECIE: En procariotas colección de cepas estrechamente relacionadas
(> 97% homología en las secuencias del rRNA16s) pero lo bastante distintas
de las otras cepas como para ser reconocidas como una unidad diferente.
EXPLOSIVOS: Son sustancias que mediante una reacción química se
convierten en gases. Al hacerlo liberar presión y calor por igual, en todas las
direcciones. Se clasifican en: alto explosivo y explosivo lento, de acuerdo con la
rapidez con que se lleve a efecto este cambio.
HPLC (CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA): Es un método
para determinar concentraciones cuantitativas exactas de compuestos no
volátiles,
Aminoácidos,
proteínas,
ácidos
nucleícos,
hidrocarburos,
carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc.
INÓCULO: Material biológico usado para hacer un cultivo microbiano.
MEDIO DE CULTIVO: Solución acuosa o solida de varios nutrientes adecuada
para el crecimiento de los microorganismos.
METABOLISMO: Se refiere a la suma de reacciones bioquímicas requeridas
para la generación de energía y el uso de la energía para sintetizar material
celular a partir de moléculas del medio ambiente.
MICROORGANISMOS. Son formas de vida muy pequeñas que sólo pueden
ser observados a través del microscopio.
NUTRIENTE: Substancia que la célula toma de su ambiente y que utiliza en
reacciones catabólicas o anabólicas.
TNT (2, 4,6-TRINITROTOLUENO): Es un sólido amarillo, sin olor, que no
ocurre naturalmente en el ambiente. Comúnmente se le conoce como TNT y es
un explosivo usado en proyectiles militares, bombas y granadas, en la industria,
y en explosiones bajo el agua.
QUIMIOLITÓTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación de
compuestos inorgánicos.
QUIMIOORGANOTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación
de compuestos orgánicos.
REACCIÓN DE OXIDACIÓN- REDUCCIÓN: Reacción en la que un compuesto
se oxida mientras otro se reduce y toma los electrones
oxidación.
liberados en la
RESIDUO PELIGROSO: Es aquel residuo o desecho que por sus
características
corrosivas,
reactivas,
explosivas,
tóxicas,
inflamables,
infecciosas o radiactivas puede causar riesgo o daño para la salud humana y el
ambiente. Así mismo, se considera residuo o desecho peligroso los envases,
empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos.
RESPIRACIÓN: Reacciones catabólicas que producen ATP, cuyos donadores
primarios de electrones son compuestos orgánicos o inorgánicos, 7y cuyos
aceptores finales de electrones son también compuestos orgánicos o
inorgánicos.
SUBSTRATO: Molécula que reacciona con una enzima. También substancia
que utiliza un microorganismo para crecer.
XENOBIOTICO: Son
aquellos compuestos químicos introducidos por el
hombre que no pertenecen a la naturaleza.
RESUMEN
El 2,4,6 Trinitrotolueno (TNT), es un compuesto nitroaromático utilizado como
materia prima para la elaboración de explosivos esenciales como pentolitas;
se caracteriza por ser altamente tóxico al igual que las derivaciones
provenientes de sus transformaciones. Las industrias productoras de esta clase
de explosivos presentan una gran cantidad de desechos, que tienen una alta
incidencia en el medio ambiente; debido a esto se encuentra en la lista de los
contaminantes más importantes de la Agencia de protección Ambiental de los
Estado Unidos(Halasz et al.,2002)
La problemática en Colombia por el uso de este tipo de compuestos radica en
los productos y subproductos que quedan sin detonar en el medio ambiente,
acumulándose en los ecosistemas y microecosistemas; sumado a esto la
carencia de investigaciones
en nuestro país conlleva a una falta de
implementación de mecanismos que apliquen fundamentos de la microbiología
con el fin de desestabilizar la estructura molecular del explosivo sin generar
mayores impactos negativos al medio ambiente.
La presente investigación plantea una alternativa preliminar de reducción del
explosivo TNT en agua residual sintética a partir de aislamientos bacterianos
que posean mayor capacidad degradadora del explosivo.
Este proyecto se llevo a cabo estableciendo en primer lugar las condiciones
fisicoquímicas y microbiológicas para aislar las bacterias que tengan la
capacidad de reducir el compuesto TNT en agua residual sintética, para ello se
tomaron doce puntos de muestreo en ambientes expuestos al explosivo TNT, a
partir de estas muestras se realizó un pre- enriquecimiento, donde hubo un
aumento
de la población bacteriana existente en ellas, para luego ser
sembradas a partir de diluciones seriadas en medio
mineral sólido con
diferentes fuentes de energía. Después de verificar un crecimiento de la
población, se dio paso a la resiembra teniendo como criterio de selección, el
morfotipo de la colonia; estos aislamientos se sembraron en medio mineral
líquido para luego realizar la lectura de las concentraciones de explosivo con
el equipo de Cromatografía Liquida de Alta Eficacia (HPLC), de esta manera
identificar las bacterias con mayor capacidad de degradación del 2,4,6
trinitrotolueno.
Consecutivamente se realizo un bioensayo con las bacterias que presentaron
una mayor capacidad degradadora, las cuales fueron inoculadas en agua
residual sintética que contenía concentraciones específicas de TNT. Para
determinar el porcentaje de remoción del explosivo se realizaron mediciones a
través del tiempo donde se seleccionaron cinco aislamientos que presentaron
mayor capacidad de degradación los cuales se inocularon en agua residual
sintética por un periodo de cuatro días; en este ensayo se obtuvo bajos
porcentajes de remoción en cada una de las lecturas realizadas cada 24 horas
mediante el equipo HPLC, los aislamientos bacterianos
presentaron un
comportamiento homogéneo en la degradación, lo que nos indica que el tiempo
de inoculación de las bacterias en el agua residual sintética y los aislamientos
seleccionados no tuvieron efecto significativo sobre el porcentaje de remoción
esperado.
ABSTRACT
2,4,6 Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound used as raw material
for the manufacture of explosives as pentolite essential and is characterized by
being highly toxic as well as referrals from their transformations. Industries
producing this kind of explosives have a lot of waste, which have a high impact
on the environment, because this is in the list of the major pollutants of the
Environmental Protection Agency of the United States (Halasz et al., 2002)
The problem in Colombia for the use of this compound lies in the products and
byproducts that remain unexploded on the environment and accumulate in
ecosystems and microecosystem, in addition to that the lack of research in our
country leads to a lack of implementation mechanisms involving the
microbiological to destabilize the molecular structure of the explosive without
causing major negative environmental impacts.
This preliminary investigation raises an alternative reduction of the explosive
TNT in synthetic sewage isolates from having more explosive degrading
abilities.
This
project
was
carried
out
by
establishing
physicochemical
and
microbiological conditions to isolate bacteria that are capable of reducing TNT
compound in synthetic sewage for it took twelve points of sampling in exposed
to the explosive TNT, from these samples conducted a pre-enrichment, there
was an increase of the bacterial population existing in them and then be sown
from serial dilutions on solid mineral medium with different substrates, after
checking the growth of population, led to the reseeding each bearing bacteria
isolated as a selection criterion, the morphotype of the colony, these isolates
were inoculated in liquid mineral medium and then doing the reading of
explosive
concentrations
with
the
team
of
high-performance
liquid
chromatography (HPLC ), thereby identifying the bacteria with greater capacity
for degradation of 2,4,6 trinitrotoluene.
Running a bioassay was conducted with the identified bacteria, were inoculated
in
synthetic
wastewater
containing
specific
concentrations
of
TNT.
In determining the rate of removal of explosive measurements were made over
time where five isolates were selected that showed higher degradation capacity
which were inoculated in synthetic sewage for a period of four days in this test
is low removal percentages obtained in each of the readings taken every 24
hours using the HPLC equipment,
the
bacterial isolates
showed a
homogeneous behavior in the breakdown, which indicates that the time of
inoculation of bacteria in the synthetic sewage and the selected isolates had no
effect significant on the percentage of expected removal.
INTRODUCCIÓN
La fabricación y uso de explosivos por la industria militar, la minería y la de
construcción deja grandes áreas de suelo y agua contaminados, debido a los
residuos generados por la manufactura, almacenamiento y disposición de estos
explosivos se han
introducido al ambiente una cantidad de compuestos
nocivos considerados residuos peligrosos por sus características de toxicidad y
volatilidad, ya que interaccionan con el medio ambiente propiciando la
destrucción y desequilibrio de los ecosistemas.1
Los explosivos en su mayoría poseen una estructura molecular compleja ya
que están constituidos por compuestos nitro aromáticos o esteres de nitrato,
en lo que radica su alto poder de detonación y hace complejo el proceso de
degradación natural, acumulándose en el medio ambiente sin llegar a ser
degradado debido a la falta de mecanismos biológicos que contribuyan a su
disminución. Por estas características, los explosivos representan un alto
riesgo a la salud
humana debido a sus propiedades mutagénicas y
carcinogénicas2.
Las técnicas tradicionales de remediación para la eliminación de los explosivos
han sido la incineración y el almacenamiento en depósitos; la primera genera
graves problemas en el ambiente ya que al incinerar estos compuestos se
provoca emisión de gases tóxicos que contribuyen al deterioro de la calidad
del aire, además de la destrucción de los suelos en los que se realizan estas
actividades; y la segunda técnica requiere de la implementación de vertederos
1
Biological degradation of 2, 4, 6 trinitrotoluene Microbioligy and molecular biology reviews
2001.
2
Ibíd. 1 pág. 35.
19
de almacenamiento lo que genera riesgos de infiltración a las aguas
subterráneas contaminando estas importantes fuentes hídricas.3
Por esta razón, se han adelantado investigaciones para buscar métodos
biológicos que permitan disminuir el efecto que los explosivos tienen sobre el
ambiente. El uso de microorganismos como las bacterias ha sido uno de los
métodos que contribuye en procesos naturales de degradación por su
versatilidad metabólica
y su capacidad de adaptarse con gran rapidez a
condiciones en su hábitat natural, siendo estos factores importantes para la
transformación a moléculas más simples y de fácil degradación.
La presente investigación plantea la reducción del explosivo TNT a partir de
bacterias aisladas en laboratorio que tengan un posible potencial degradador
del 2, 4,6 trinitrotolueno, este proceso se evaluará mediante un bioensayo
realizado en agua residual sintética para determinar el porcentaje de remoción
en un periodo de cuatro días en condiciones de laboratorio.
3 BRANCO, S.M: Limnología sanitaria, estudio de la polución de aguas continentales.
Monografía científica No 28, 1984 serie Biología, OEA, 119 p.
20
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL

Determinar la remoción
de trinitrotolueno (TNT) en agua residual
sintética mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de
explosivos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas para el
aislamiento de las bacterias degradadoras de TNT.

Aislar bacterias degradadoras de TNT a partir de muestras de ambientes
(agua, suelo y lodo), con presencia de explosivos.

Identificar las bacterias con mayor capacidad degradadora de TNT con
base en la reducción del sustrato estudiado.

Evaluar de manera preliminar el porcentaje de remoción de TNT en agua
residual sintética mediante cromatografía líquida (HPLC).
21
1. MARCO DE REFERENCIA
1.1
MARCO TEÓRICO
1.1.1 Explosivos.
Son Es todas aquellas sustancias o compuestos de naturaleza química, cuya
reacción de descomposición está determinada por la detonación, concluyendo
en un tiempo muy breve; esta detonación produce una gran cantidad de
energía química (reacción exotérmica).
Se debe tener en cuenta, que todo explosivo debe tener como obligación la
presencia de un agente oxidante, es decir una sustancia con preferencia a
ceder oxígeno, y un agente combustible; Estas dos sustancias anteriores se
pueden encontrar incluidas dentro de la molécula que hacen parte del
explosivo.4
1.1.2 Características de los explosivos.
Estas son las que permiten elegir cuál de los explosivos es idóneo para un fin
determinado, dichas características pueden predecir cuales serán los posibles
efectos que se presentaran en el momento de ser utilizados.
Una de las principales características de los explosivos es la estabilidad, que
define la modificación
del explosivo en sus condiciones normales de
operación, desde el punto de vista de los riesgos que pueden generar, la
variación de sus propiedades o
efectos explosivos. La estabilidad puede
considerarse desde el punto de vista químico y físico. Otras características
importantes son: Temperatura, humedad, potencia explosiva, densidad,
resistencia al agua, resistencia al contacto con el agua, resistencia a la
humedad y resistencia al agua bajo presión de la misma 5.
4
Determinación del impacto ambiental al recurso agua ocasionado por la desactivación de los explosivos
pólvora y anfo con el método de disolución química y valoración del ruido producido por la destrucción de
los explosivos incautados por la Policía Nacional
5
Ibíd. 4. Pág. 24.
22
1.1.3 Clasificación de los explosivos.
Los explosivos se pueden clasificar según su origen en:
Explosivos artesanales. Como su nombre lo indica son
sustancias o
mezclas fabricadas artesanalmente, son muy peligrosos por no tener
normas de fabricación específicas y son generalmente usados por grupos al
margen de la ley. Ejemplo: Amonal, R1, BENCLO, ANFO, Amatol.
Explosivos industriales. A diferencia de los anteriores estos se fabrican
bajo normas y pautas comúnmente señaladas en tratados o leyes
internacionales, debiendo llevar el mismo patrón de fabricación.
Explosivos comerciales: son utilizados en actividades cotidianas como en
industria, minería, obras civiles, se deben trabajar bajo todas las normas de
seguridad, por ser altamente peligrosos. Ejemplos: ANFO, Pentofex,
Indugel, entre otros.6
1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT)
El TNT es un explosivo fabricado mediante una nitración secuencial
tolueno, empleando ácido nítrico y sulfúrico (C
6
H
2
(NO
2) 3
CH
del
3),
generalmente es un procedimiento realizado en lotes, tanto para la producción
de mono-, di-, y, finalmente, trinitrotolueno.
Este explosivo sirve para la detonación directa o como materia prima para la
elaboración de otros explosivos esenciales como la Pentolita, lo que lo hace un
elemento importante para la Industria militar.
El TNT tiene una velocidad de detonación de 6900m/s, solo basta dejarlo caer
a 35cm de altura del suelo para que este detone; esta reacción proveniente de
6
Manual técnico de explosivos. España: Dirección General de Armamento y Material, 1984.
450 p.
23
la detonación es exotérmica lo que produce la destrucción total alrededor de un
radio de 12 metros, es insoluble en agua pero soluble en acetona y benceno,
este explosivo 2,4,6 trinitrotolueno no produce vapores, pero si genera un polvo
toxico en el momento de la detonación.
Este explosivo es un compuesto altamente tóxico al igual que sus derivaciones
provenientes de sus posibles transformaciones, debido a esto se encuentra en
la lista de los contaminantes más importantes de la Agencia de protección
Ambiental de los Estado Unidos.
Tabla 1. Características explosivo TNT.
Compuesto
explosivo
TNT
Formula
empírica
C7H5N3O6
Peso
Densidad
3
Velocidad
Estructura
Presión de
molecular
(g/cm ) a
de
de
vapor (Pa)
(g/mol)
20°c
detonación
explosivo
a 20°c
227.1
1.654
6900
1.46X10-4
CH3
Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno
Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001.
1.1.5 Propiedades químicas del TNT
El 2, 4,6 TRINITROTOLUENO presenta una estructura aromática tipo bencillo
distribuida simétricamente con tres grupos nitro, la electronegatividad de estos
grupos ejerce una atracción sobre los electrones beta del anillo aromático,
confiriendo a este cierto carácter electrófilo. Este referente será fundamental
para el metabolismo microbiano.
24
El grupo nitro está conformado por dos elementos diferentes, estos dos muy
electronegativos los cuales compiten por los electrones disponibles, debido a
que la electronegatividad del oxígeno es mayor que la del nitrógeno se origina
una polarización del enlace entre estos dos elementos. La carga positiva sobre
el átomo de nitrógeno, combinada con la electronegatividad del elemento hace
que el grupo nitro sea fácilmente reducible.
En la molécula de TNT la velocidad con la que se reduce el primer grupo nitro
es mucho mayor que los restantes, esto se debe a que la conversión de grupo
nitro a grupo amino disminuya la deficiencia electrónica del anillo, haciendo
más difícil la reducción del el otro grupo nitro.
1.1.6 Biorremediación de explosivos.
La biorremediación comprende cualquier proceso que utilice microorganismos
para retornar a su estado natural un recurso alterado por contaminación. Esta
técnica de remediación consiste en que los microorganismos transforman un
contaminante en compuestos menos tóxicos o inicuos, eliminado o removiendo
de manera eficiente y controlada el contaminante presente en el suelo, agua o
aire sin transferirlo de un ambiente a otro (Kulkarni y Chaudhari, 2007; Bar et
al., 2006). Este proceso se favorece debido a que los microorganismos son
ubicuos y poseen una amplia versatilidad metabólica para degradar y utilizar
diferentes compuestos como fuente de carbono y energía para su crecimiento.
Las actividades microbianas en el proceso de biorremediación se pueden
resumir en el siguiente esquema:
25
Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes.
Para que pueda ocurrir la biorremediación del explosivo (TNT), se debe tener
en cuenta que la biodegradación es parte fundamental en ello, por eso el
metabolismo en cada una de las bacterias va estar sujeto a diferentes
variables, según sus requerimientos. Los microorganismos muestran una
impresionante variedad de procesos metabólicos, para ello se puede establecer
dos grandes categorías, aquellos que la fuente de energía es un compuesto
químico y aquellas que la fuente de energía es la luz, como lo podemos ver en
el siguiente gráfico.
Ilustración 3. Metabolismo microbiano
TODOS LOS
MICROORGANISMOS
Quimiótrofos (Compuestos químicos
como fuente primaria de energía)
Quimiólitotrofos
(Compuestos
Fotótrofos (Luz como fuente
principal de energía)
Quimioorganotrofos
(Compuestos orgánicos)
inorgánicos)
26
Fuente: Brock, Biología de los
microorganismos
Los explosivos como el 2-4-6 TRINITROTOLUENO, contienen compuestos
nitrogenados,
que
requieren
para
su
degradación
microorganismos
quimiótrofos, específicamente las llamadas bacterias nitrificantes. Estas
bacterias oxidan el amoniaco y el nitrito (compuestos nitrogenados más
comunes como donadores de electrones),
y lo transforman en nitrato, la
oxidación completa del compuesto implica la pérdida de ocho (8) electrones y
se realiza por dos grupos de consorcios actuando secuencialmente. La
nitrificación del amoniaco es el resultado de la acción secuencial de dos grupos
separados de organismos; las bacterias oxidantes de amoniaco, que producen
acido nitroso es decir nitritos y las bacterias oxidantes de nitrito que son las
verdaderas bacterias nitrificantes; estas bacterias a su vez trabajan de la mano
de enzimas para que ocurra la oxidación y dirigir la síntesis del ATP energía
7
.Hasta ahora no se conoce la primera bacteria nitrificante que realice por si
sola la oxidación completa de amoniaco a nitrato.
Las bacterias nitrificantes están ampliamente distribuidas en el suelo y en el
agua, estas se encuentran en gran cantidad en hábitats donde abunda el
amoniaco, tales como lagos y corrientes de agua que reciben aportes de agua
residual no tratada.8
En diferentes investigaciones, se han encontrado diversos microorganismos en
suelos contaminados por explosivos, donde utilizan el TNT en este caso, como
sustrato respiratorio y como fuente de energía, ya que este explosivo resulta
ser una buena fuente de nitrógeno que las bacterias pueden utilizar, sin
embargo la biodegradación de este compuesto resulta ser diferente a otros
compuestos tóxicos, por la complejidad de la estructura y la localización del
grupo amonio y nitrito.
Para ello se han aislados microorganismos de muestras de suelos específicos,
con el fin de proporcionar la información requerida para encontrar o establecer
7
MANDIGAN Michel T., MARTINKO Jhon M., PARQUER Jack Brock,:Biología de los
microorganismos; Prentice Hall, octava edición 2001.
8
Ibíd 7 pág. 502
27
rutas metabólicas que sigan el patrón de degradación, estos estudios se han
realizado en EE.UU y España9
1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT10
Las
rutas metabólicas para reducir este compuesto, consisten en una
degradación donde los microorganismos pueden romper la molécula y
reducirla. El 2,4,6-trinitrotolueno, consta de un anillo de benceno, un grupo
metilo, y tres grupos nitro); Cuando se produce mediante la reducción de la
degradación de estos grupos nitro en un forma gradual, se va dejando el anillo
aromático de manera cada vez más reducido. La degradación de estos
intermediarios, son Am-DNT (Dinitrotolueno), 2,4-DA-6-NT (Di-amino 6,
nitrotolueno), 2-6-DA-4-NT(Di-amino,4 nitrotolueno), 2,4-DNT(Dinitrotolueno),
4-A-2-NT(Amino,2 nitrotolueno), 2-A-4 – NT(Amino ,4 nitrotolueno), y 2,4DAT(Di-amino-tolueno.
Sin embargo se ha demostrado (ejurnal.vudat.msu.edu, Robert Weise) que
muchos de los microorganismos que trabajan en esta degradación no
necesariamente pasan por todas las sustancias intermedias peligrosas,
dependiente tanto la bacteria como las condiciones anaerobias y aerobias del
medio.
Las especies de bacterias encontradas en la degradación del TNT son:
9

Enterobacter cloacae

Pseudomonas putida11

Clostridium sp.
SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk et al., 1996.
10
Bases Genéticas y Bioquímicas .
ESTEVE NUÑEZ, Abraham , DUQUE MARTIN DE Oliva, Estrella pseudomona putida y su
empleo en la eliminación biológica de TNT.
11
28
1.1.7.1 Metabolismo con Enterobacter cloacae sp.
La Bacteria Enterobacter cloacae, del genero Escherichia, hace parte de los
bacilos facultativos Gram negativos, estos se caracterizan por ser aerobios
facultativos, con requerimientos nutritivos muy sencillos ya que pueden crecer a
partir de una gran variedad de fuentes de carbono y energía.
En investigaciones realizadas (SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk
et al., 1996), esta cepa fue aislada directamente de focos contaminados con
TNT, para confirmar la capacidad de utilizar el nitrato de esteres (base para la
fabricación del TNT) como única fuente de energía para el crecimiento.
1.1.7.2 Metabolismo con Pseudomonas sp.
Las pseudomonas
son bacilos rectos o ligeramente curvados; GRAM
negativos, que utilizan los
compuestos orgánicos como fuente de energía
(quimioorganotrofo) y a su vez utilizan el H2 y CO, como únicos donadores de
electrones; algunos usan nitrato como aceptor de electrones anaeróbicamente
(Brock, Biología de los microorganismos Cap. 16). Las pseudomonas tienen
requerimientos nutritivos muy sencillos, crecen a pH neutro y temperaturas en
la zona mesófila, una de las propiedades más importante de este grupo es la
gran variedad de compuestos orgánicos que usan como fuente de carbono y
como donadores de electrones para la producción de energía, en el caso
particular de de la degradación de TNT, las pseudomonas utilizan el mismo
explosivo como fuente de carbono.
1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer.
La formación del complejo Meisenheimer consiste en una sustitución
nucleofílica al anillo aromático de TNT, debido a la alta densidad de electrones
que presenta el benceno, los tres grupos nitro presentes en el TNT, son los
atrayentes de electrones haciendo que los electrones del anillo sean atacados
reductivamente.
29
Estos compuestos presentan una intensa coloración rojo- anaranjada en
solución y una carga negativa deslocalizada sobre el anillo y los grupos nitro.
Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer.
Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001.
1.1.9 Medio de cultivo.
Para conocer mejor las características de los microorganismos es necesario
estudiarlas en un medio puro. Un cultivo puro es aquel formado por células
que provienen un solo
microorganismo perteneciente a la misma especie y
cepa. Por eso es de gran importancia evitar la contaminación en los medios de
cultivo, para esto se debe cultivar con la cantidad de nutrientes y los medios
necesarios12.
Las condiciones adecuadas en que se debe preparar un medio de cultivo son la
disponibilidad de nutrientes apropiados, consistencia del medio, presencia o
ausencia de oxigeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz
ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio.
La solución acuosa con los nutrientes necesarios se llama medio de cultivo. Un
medio de cultivo requiere de una fuente de carbono, nitrógeno y otros
nutrientes.
La célula requiere de dos tipos de nutrientes: macro y
micronutrientes. El carbono es muy importante porque a partir de éste la célula
fabrica material celular. El siguiente elemento más abundante es el nitrógeno
12
Op. Cit. 230.Biología de los microorganismos 1999.
30
ya que forma parte de proteínas, ácidos nucléicos y otros constituyentes
celulares. Algunos otros macronutrientes son el fósforo, el azúfre, el potasio,
magnesio, calcio, sodio y hierro.
Entre los micronutrientes se encuentran
metales que forman parte de enzimas, trazas,sales etc.
Los factores de
crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas.
En el medio de cultivo se emplea un elemento solidificante, el agar se licua
con agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40°C
1.1.10 Características de la colonia.
Tras un periodo de incubación a una temperatura apropiada en el medio de
cultivo solido donde previamente se ha realizado la siembra, se espera es que
aparezcan unas
pequeñas masas visibles a simple vista que han sido
formadas por el crecimiento de una célula bacteriana. La multiplicación de esa
bacteria en el medio de cultivo sólido es conocida como colonias.13
Estas colonias presentan morfología
propia de las bacterias que
esta
constituida por una serie de características fundamentales entre las que se
encuentra: el tamaño, forma, estructura y tipo o modo de agrupación.
Tamaño: Característica de cada tipo bacteriano, se observa muchas veces
con mayor exactitud a través del microscopio, por las dimensiones
microscópicas de las bacterias.
Forma: Puede presentarse formas: esféricas, cocoides, cilíndricas o
bacilares, de espirales o helicoidales, formas coco bacilares, de coma, etc.
Agrupación: Se pueden agrupar macroscópicamente y microscópicamente,
la primera puede visualizarse a simple vista estas corresponden al
crecimiento en un punto medio de la colonia en el medio de cultivo, puede
visualizarse a simple vista, estas presentaran características distintas para
cada tipo bacteriano. Por otra parte las segundas son visualizables por
microscopia pudiendo observar los distintos tipos bacterianos que se
asocian entre sí formando pequeños grupos de 2 o más bacterias, por
13
GRANADOR PEREZ Raquel, Villaverde María del Carmen: Bacteriología, características y
clasificación bacteriana. Microbiología tomo 1, pág.249-261.
31
ejemplo: tétradas, diplococos, racimos, cadenas, etc. Las anteriores
también conforman parte de la morfología de una colonia.
Es importante considerar las diferentes formas, tamaños y aspectos de las
colonias ya que esto puede servir como:
Un dato para identificar el tipo de colonia y poderla clasificar
taxonómicamente.
Medida de control apara una siembra correcta. Lo ideal es que las
colonias estén separadas y que el medio no presente contaminación.
Estas características son diferentes para cada uno de los tipos bacterianos,
aunque
algunas
especies
presenten
otras
características
de
las
ya
mencionadas.
Tamaño de las colonias: El tamaño de la colonia se considera un factor
importante que suele ser uniforme para cada género y especies bacterianos.
El tamaño de las colonias puede variar y ser clasificado en:
Tamaño pequeño, de 1-2 mm de diámetro.
Tamaño grande, de 4 -6 mm de diámetro.
Extendidas en forma de velo invadiendo todo el medio de cultivo (tamaño
muy grande).
Puntiformes con aproximadamente 0.5 mm de diámetro o inferiores.
Forma de las colonias: La forma de la colonia depende de su espesor y
borde, en la primera cuando el espesor
es mucho mayor en el centro
disminuye uniformemente hacia el borde se dice que la colonia es elevada,
también pueden haber planas, semiconvexas, cóncavas, semiconcavas,
semiesféricas, en meseta, etc. El borde puede ser liso o irregular y aserrado en
mayor o menor grado. (Wolin, et al. 1973)
32
Superficie de la colonia: Corresponde al aspecto de la colonia y se divide en:
lisa, rugosa, plana, acuminada, umbilicada, seca, etc.
Consistencia de la colonia: las colonias pueden ser duras, viscosas,
mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. Por ejemplo las colonias mucosas
son típicas en levaduras y menos frecuentes en bacterias.
Estas características de las colonias son un criterio importante para su
posterior aislamiento tanto en medio sólido como en medio líquido.14
1.1.11 Agua residual sintética.
El agua residual sintética es una composición de compuestos orgánicos e
inorgánicos basada en aguas residuales, esta es utilizada en estudios de
pequeña escala ya que muchas veces
se hace difícil trabajar con aguas
residuales industriales o domesticas, ya sea por el tipo de tratamiento o el
contaminante. Este tipo de agua tiene la ventaja de ser plenamente controlada
tanto en composiciones como en concentraciones, de forma que se evita todos
los problemas inherentes al agua residual real tanto por su composición y
estado,
adaptándose
el
efluente
al
requerimiento
marcado
por
la
experimentación.15
1.1.12 Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución
de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido
que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija y líquida para
separar los compuestos que se encuentran disueltos en solución. Con el objeto
de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de
14
Ibíd 13. Pág.251- 252
Torres Lozada Patricia, Foresti Eugenio, Vazoller Rosana F Composición y uso de agua
residual doméstica en reactores a escala de laboratorio Univalle.Fac.Ing. Pág, 2.
15
33
fase fija va disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genera la
necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil.
16
Los instrumentos del HPLC consisten en un depósito de la fase móvil, una
bomba, un inyector, una columna de separación, y un detector. Los
compuestos están separados por la inyección de la mezcla de la muestra en la
columna. Los diferentes componentes de la mezcla pasa a través de la
columna a diferentes velocidades debido a diferencias en su comportamiento
de partición entre la fase líquida móvil y la fase estacionaria.
El método EPA 8330B para Nitroaromáticos, nitraminas, y ésteres de nitrato es
aplicable para análisis de trazas de explosivos y residuos de carburante por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un doble longitud de onda
ultravioleta (UV) en un detector de agua, suelo, o de la matriz de sedimentos. 17
16
www.quiminet.com . Cromatografía liquida. Consultado Ene 10 de 2010
Método 8330 A para nitroaromáticos y nitraminas, HPLC planteado por la Agencia de
Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) del año 2007.
17
34
1.2
MARCO LEGAL.
La Legislación Ambiental Colombiana
hace referencia al conjunto de
normatividad que definen objetivos principios, criterios y orientaciones
generales para la protección del Ambiente de nuestro país.
En Colombia la normatividad ambiental se ha fortalecido en las tres últimas
décadas, en especial desde la llamada Constitución ecológica y la Ley 99 de
1993, donde se estableció la organización y principios para
propender por el
buen manejo y uso de nuestros Recursos Naturales.
Para la ejecución de este proyecto se contempla la siguiente legislación.
Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación.
NORMA
Constitución Política de
Colombia.
Ley 99 de 1993
Ley 61 de1993
Decreto 2811 de 1974
Ley 525 de1999
Ley 540 de 1999
Ley 554 de 2000
CORRESPONDE A
Art. 7, 79, 80.
Art. 83, 84 sanciones y medidas de policía ART
85 sanciones y medidas de policía.
por lo cual se reviste al presidente al presidente
de la república de facultades extraordinarias
sobre armas municiones y explosivos y para
reglamentar la vigilancia y seguridad privada
Por el cual se expide el Código Nacional de los
Recursos Renovables y de Protección del
Medio Ambiente
Por medio de la cual se aprueba la "Convención
sobre la prohibición del desarrollo, la
producción, el almacenamiento y el empleo de
armas químicas y sobre su destrucción" hecha
en París el trece (13) de enero de mil
novecientos noventa y tres (1993).
Por medio de la cual se aprueba la "Convención
Interamericana contra la fabricación y el tráfico
ilícito de armas de fuego, municiones,
explosivos y otros materiales relacionados".
Por medio de la cual se aprueba la "Convención
sobre
la
prohibición
del
empleo,
almacenamiento, producción y transferencia de
minas antipersonal y sobre su destrucción",
hecha el dieciocho (18) de septiembre de mil
35
Ley 670 de 2001
Ley 737 de 2002
Decreto 2003 de 1982
Decreto 695 de 1983
Decreto 1594 de 1.984
Decreto1335 de 1987
Decreto 2535 de 1993
Decreto 334 de 2002
Decreto 1609 de 2002
novecientos noventa y siete (1997).
Por medio de la cual se desarrolla parcialmente
el artículo 44 de la Constitución Política para
garantizar la vida, la integridad física y la
recreación del niño expuesto al riesgo por el
manejo de artículos pirotécnicos o explosivos.
del 5 de Marzo Diario Oficial No 44.734, de 9 de
marzo de 2002 por medio de la cual se aprueba
la "Convención Interamericana contra la
fabricación y el tráfico ilícitos de armas de
fuego, municiones, explosivos y otros materiales
relacionados".
Por el cual se modifica parcialmente el Decreto
No. 1663 del 06 de Julio de 1979. Modifica el
Estatuto Nacional para el control comercio
armas, municiones y explosivos.
Por el cual se determina el material de Guerra o
reservado de las fuerzas militares y la Policía
Nacional. Clasifica sistemas de armas,
armamento mayor y menor de todos los tipos,
modelos o calibres usado por las Fuerzas
militares y la Policía Nacional.
Este decreto reglamenta el uso del agua y los
residuos líquidos a nivel nacional. En este
decreto se establecen los parámetros y las
concentraciones máximas admisibles, que
pueden estar presentes en un residuo líquido
según el uso que se quiera dar a este.
Reglamento de seguridad en las labores
subterráneas Regula aspectos relacionados con
productos explosivos los cuales son vendidos
por Indumil.
Por el cual se expiden normas sobre armas,
municiones y explosivos. En este decreto se
fijan normas y requisitos que se deben tener en
cuenta para la tenencia y el porte de armas,
municiones, explosivos y sus accesorios.
Además establece algunas condiciones para la
importación y exportación de armas, municiones
y explosivos.
Por el cual se establecen normas en materia de
explosivos. Mecanismos de control relacionados
con
la
producción,
importación,
comercialización, distribución, venta directa,
almacenamiento de explosivos.
Por el cual se reglamenta el manejo y transporte
terrestre de mercancías peligrosas por
carretera. Tiene por objeto establecer los
36
Decreto 4741 de 2005
Resolución número 02400
Mayo 22 de1979
Resolución 081 de 2002
requisitos técnicos y de seguridad para el
manejo y transporte de mercancías peligrosas
por carretera en vehículos automotores en todo
el territorio nacional.
Por el cual se reglamenta parcialmente la
prevención y el manejo
de los residuos
peligrosos en el marco de la gestión integral.
Disposiciones sobre vivienda, higiene y
seguridad industrial en establecimientos de
trabajo. En esta resolución se establecen
algunas consideraciones relacionadas con la
manipulación, transporte y almacenamiento de
explosivos.
Por la cual se clasifican como explosivos para
todos los efectos legales, las materias primas o
insumos que sin ser explosivos individualmente,
en conjunto conforman una sustancia explosiva
Fuente. Adaptado por las autoras, 2010.
37
2.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para realizar esta investigación se tomaron doce muestras de diferentes
ambientes donde la presencia del explosivo es relevante en cuanto a tiempo de
exposición y fabricación del producto. Las muestras se obtuvieron de suelo,
lodos y agua, tomando parámetros físicos en términos de pH y conductividad,
para determinar en que condiciones se encontraban las muestras y de este
modo adaptarlas a los medios de aumentación microbiana.
Se realizo un pre-enriquecimiento en medio mineral líquido con una
concentración de 50 mg/l de TNT, durante 45 días, con el fin de aumentar la
población bacteriana en las muestras tomadas. Para determinar donde
se
presenta más población y diversidad bacteriana se utilizaron tres tipos de
tratamientos: explosivo como única fuente, explosivo más fuente de Carbono y
explosivo más fuente de Nitrógeno.
Los pre-enriquecimientos fueron sembrados en medio mineral sólido
por
triplicado, mediante diluciones seriadas base 10; el cultivo se incubó a 26 ºC
durante 20 días, realizando monitoreo diario.
Las colonias obtenidas en cada uno de los tratamientos, fueron repicadas en
medio mineral liquido con fuente de carbono y en medio mineral sólido con las
fuentes de nitrógeno, carbono y solo explosivo, aumentando la concentración
de explosivo de 50 mg/L a 100 mg/L, y usando como criterio la diversidad
morfotípica en cuanto a su color, borde, tamaño y forma (selección de las
colonias).
A los aislamientos bacterianos obtenidos bajo esta nueva condición, se les
determinó su capacidad de degradación del explosivo TNT, mediante
monitoreo por HPLC Cromatografía Liquida de Alta Eficacia aplicando el
método de la EPA 8330B para la extracción y filtración.
Con el área de cada curva obtenida durante la corrida se estableció el límite
mínimo de TNT que registra el equipo, con esta información se establecieron
los cinco aislamientos bacterianos que presentaron mayor degradación.
38
Finalmente se realizó un bioensayo con agua residual sintética a la cual se le
agrego explosivo TNT; los cinco aislamientos bacterianos fueron inoculados en
esta agua y se realizaron mediciones a través del
tiempo (cuatro días),
tomando un blanco de referencia (tiempo cero)
para establecer la
concentración
inicial del explosivo; posteriormente se realizó una medición
diaria para determinar la degradación de este a través del tiempo; estos
ensayos se hicieron por triplicado.
Se llevo a cabo un total de 78 análisis en HPLC para el caso de la selección de
las cinco cepas con mayor capacidad degradadora y se realizaron un total de
45 análisis de HPLC durante el periodo de experimentación de bioensayo con
el agua residual sintética.
Las etapas desarrolladas para ejecutar la investigación se describen a
continuación en el diseño metodológico.
2.1
DISEÑO METODOLOGICO.
Para la realización del proyecto de grado es de importancia resaltar que se
hizo bajo un contrato de confidencialidad con la parte interesada donde no se
podía mencionar, el nombre de la entidad financiadora y la
ubicación
geográfica de donde se obtuvieron la muestras con las que se desarrollo la
investigación.
2.1.1 Toma de muestras.
Para la realización de este proyecto se trabajó con doce muestras extraídas de
diferentes puntos de muestreo (agua, suelo y lodo) los cuales presentaban
exposición directa al explosivo ya sea por el proceso de fabricación o el tiempo
de exposición a este. Primero se limpió el terreno superficial sobre los puntos
de muestreo y se procedió a introducir un barreno recto para tomar una
muestra de suelo.
39
Ilustración 5. Toma de muestras
Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce
puntos de muestreo.
La siguiente tabla menciona los puntos de la toma de muestras.
Tabla 3. Puntos de toma de muestras.
MUESTRA
PUNTO DE MUESTREO
1
Exterior, frente a la planta de cristalización.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Canal exterior.
Trampa taller multiplicador.
Canal trampa producción.
Caneca residuos de lavado.
Tanque de transporte.
Tanque exterior caja de captación
Tanque concentración de tenso activo
Campo de prueba
Lodos de la PTAR
Fitorremediación
Caño PTAR
Fuente: las autoras
40
2.1.2 Análisis preliminares del suelo.
Inicialmente se le realizó un análisis a las doce muestras recolectadas. Estas
muestras se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos por la EPA
en los métodos 9050 A y 9045 C del año 2000.
Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos
Ensayo
pH
Conductividad
Norma /especificación
ICE -131/203-092
Método valido base de referencia
EPA 9045C
Potenciometría
Equipo
utilizado
potenciómetro
Fisher Accumet® pH-meter model
600
ICE -131/203-096
Método valido base de referencia
EPA 9050ª
Producto al que se le
aplica
Suelos, lodos.
Suelos, lodos
Fuente.www.cesmec.cl
2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras.
Estas mediciones se realizaron con el fin de establecer las condiciones
fisicoquímicas iniciales de las muestras obtenidas, para de esta manera
estandarizar estas condiciones a los medios de cultivo. Para desarrollar este
análisis se pesan 20 g de muestra de suelo, se le adicionan 20 ml de agua
destilada y se agita a 200 rpm durante 5 minutos. Luego la muestra se deja en
suspensión por una hora. Para la medición de conductividad se utilizo una
celda conductimétrica que consta de dos electrodos del mismo tipo. Finalmente
se inserta el electrodo en el sobrenadante acuoso y se reporta el resultado de
pH y conductividad.
41
Los resultados de conductividad y pH para las doce muestras se muestran en
la siguiente tabla:
Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras
MUESTRA
PUNTO DE MUESTREO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Exterior, frente a la planta de cristalización.
Canal exterior.
Trampa taller multiplicador.
Canal trampa producción.
Caneca residuos de lavado.
Tanque de transporte.
Tanque exterior caja de captación
Tanque concentración de tenso activo
Campo de prueba
Lodos de la PTAR
Fitorremediación
Caño PTAR
CONDUCTIVIDAD
(g/l)
0.34
0.22
0.17
1.15
1.47
0.70
0.44
14.96
0.63
1.57
0.47
0.44
pH
7.11
7.34
6.58
3.68
2.11
7.10
7.54
9.20
6.72
8.73
7.42
8.95
Fuente: Pontificia Universidad Javeriana. Sonia Villegas 2009.
La tabla 5 muestra los valores de conductividad los cuales presentan
uniformidad a diferencia del punto 8, donde hay una concentración de sales
iónicas
por tenso activos
haciendo que los valores de conductividad se
eleven.
Así mismo se evidencia un rango de valores de pH entre 2.11 y 9.20, lo que
indica que las muestras proviene de diferentes ambientes, por lo tanto se hace
necesario estandarizar el pH con una solución buffer en los medios utilizados
para el pre- enriquecimiento, siembra y replica.
42
2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras
A partir de las muestras tomadas en los doce puntos de muestreo, se realizó el
pre enriquecimiento el cual consiste en adicionar
dichas muestras en
un
medio mineral líquido para aumentar la población microbiana existente en las
muestras dicho medio contiene las condiciones necesarias para el crecimiento
de las bacterias a aislar teniendo en cuenta reportes hechos por diferentes
investigaciones donde se mencionan los componentes necesarios de
macronutrientes y micronutrientes, condiciones ambientales, concentración del
explosivo y tiempo de crecimiento de las bacterias en los medios de cultivo.
Con base a lo anterior se obtuvieron componentes y concentraciones para la
elaboración del medio mineral tanto líquido como sólido.
Tabla 6. Composición de medio nutritivo.
Sustancias
Sales
Buffer
Vitaminas
Trazas
Tipo y Cantidad
Concentración
HCl (3 ml)
NaCl (12.5 g)
MgSO4 – 7H2O (5 g)
CaCl2 2H2O (1g)
K2HPO4 (17,5 g)
K2H2PO4 (7,5 g)
Clorhidrato de piridoxina
(0,05 g)
Ácido p-aminobenzoico
(0,025 g)
Ácido nicotínico (0,025g)
Pantotenato de calico
(0,025 g)
Riboflavina (0,025 g)
Vitamina B12 (0,025 g)
Tiamina-HCl (0,025 g)
Biotina (0,01 g)
Ácido fólico (0,01 g)
α-lipoico (0,01 g)
HCl (20 ml)
MnSO4 H2O (0,2 g)
H3BO3 (0,1g)
ZnSO4 7H2O (0,1 g)
1M
8,5 mM
0,81 mM
0,27 mM
4,02 mM
2,2 mM
43
18 -19%
CaSO4 5H2O (0,05 g)
CoCl2 H2O (0,05 g)
CuSO4 5H2O ( 0,01 g)
Na2MoO4 2H2O (0,01 g)
NiSO4 6H2O
Explosivo
TNT (2,5 ml)
HCl (3 ml)
FeSO4 7H2O ( 0,3 g)
Hierro
1M
10, 8 µM
Fuente: las autoras
Las cantidades para la elaboración del medio se mencionan en la tabla 7.
Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio.
Preparación del medio mineral
para 1L de medio
Solución de Buffer
10 ml
Solución de Sales
10 ml
Fuente de carbono
10 ml
Fuente de nitrógeno
10 ml
Después del Autoclave se
adicionará
Solución de Hierro
1 ml
Elementos de trazas
1 ml
Solución de vitaminas
1 ml
Solución de explosivo
2,5 ml
Fuente: las autoras
Del medio mineral
se toma 45 mL
y se lleva a frascos tapas azul
debidamente marcadas según la procedencia del punto de muestreo, al cual
se le agrega 5gr/mL de la muestra (agua, suelo, lodo). Este procedimiento se
hace con tres tipos de tratamientos: explosivo como única fuente de energía,
explosivo más fuente de carbono y explosivo mas fuente de nitrógeno.
Los componentes de cada fuente de energía se muestran a continuación en la
tabla 8.
44
Tabla 8. Composición fuentes de energía.
FUENTE DE ENERGIA
COMPOSICIÓN Y CANTIDAD
Fuente de Carbono
Glucosa Citrato Glicerol Acetato
2,5 g
Fuente de Nitrógeno
2,5 g
NH4NO3
2 ml
2,5 g
1g
Fuente: Las autoras
A continuación se menciona la composición de cada uno de los tres
tratamientos.
T1: Medio de cultivo mineral liquido (MML)+ Fuente de Nitrógeno (FN)+
Explosivo (EXP). (MML+FN+EXP).
T2: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Fuente de Carbono (FC) +
Explosivo (EXP). (MML+FC+EXP).
T3: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Explosivo. (EXP)
(MML+EXP).
Se realizaron dos pre-enriquecimientos, el primero para las muestras de
uno a seis, y el segundo para las muestras siete a la doce con un tiempo
diferencia de 45 días18 estos dos pre-enriquecimientos se mantuvieron a
temperatura ambiente, con una agitación de 120 rpm, como se muestra en
la siguiente ilustración:
Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento
18
El pre-enriquecimiento fue necesario hacerlo en dos partes, por las grandes cantidades de material
que se requerían.
45
2.1.5 Aislamiento de cepas.
Luego de los cuarenta y cinco días de
pre- enriquecimiento donde se
bioaumento la población bacteriana, fue necesario hacer diluciones seriadas
base 10, ya que se parte del supuesto que estas presentan un alto grado de
diversidad y cantidad de heterótrofos totales, por lo tanto se hicieron diluciones
de 10-2 a 10-7, en solución salina (0.86%); para esto se tomo de cada uno de
los pre enriquecimientos una cantidad de 0.5 mL y se agregó en los tubos de
ensayo que contenían 10 mL de solución salina.
Las tres diluciones más altas fueron sembradas en medio mineral solido, en los
tratamientos mencionados anteriormente: explosivo como única fuente,
explosivo más fuente de Carbono y explosivo mas fuente de Nitrógeno,
partiendo de una concentración inicial del explosivo TNT de 50mg/L. Cada
siembra se realizo por triplicado, en condiciones asépticas y fueron incubadas
a 21 ºC durante 20 días.
Después de un monitoreo continuo se evidencio
presentaban un crecimiento lento y
una diversidad
que las bacterias
en morfología, a
continuación se muestran dos ilustraciones donde se evidencia algunas de las
bacterias encontradas, en los diferentes tratamientos.
46
Ilustración 9. Población
bacteriana caja de petri con T1.
Fuente: las autoras
Ilustración 8. Población
bacteriana caja de petri con T2.
Fuente: las autoras
2.1.6 Criterio de selección de colonias.
Para la selección de las bacterias se tomaron como criterios de los morfotipos
(color, forma, tamaño, borde, textura).
Las bacterias seleccionadas se sembraron en cajas de petri divididas con
cuadriculas de igual de igual tamaño 1.5 X 1.5 mm para así colocar cada
aislamiento esta siembra se realizo mediante capilares de vidrio sellados,
limados y esterilizados. Simultáneamente, las bacterias aisladas
fueron
inoculadas en medio mineral liquido con fuente de carbono y 100 ppm de TNT
con el fin de inhibir el crecimiento de las colonias que tengan menor capacidad
degradadora. Los aislamientos fueron incubados a 21°C durante 20 días.
Los aislamientos bacterianos obtenidos fueron en total setenta y ocho. A
continuación se presenta la tabla 9 donde se describe la morfología bacteriana,
la nomenclatura y el origen.
47
Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica.
MUESTRA
TRATAMIENTO
AISLAMIENTO
COLOR
TEXTURA
TAMAÑO
ELEVACIÓN
FORMA
BORDE
T2 + 10-
6
T1
Amarillo
Cremosa
Pequeño
Convexa
Irregular
Ondulado
T2 + 10-
6
T2
Transparente
cremosa
Grande
Convexa
Irregular
Irregular
T2 + 10-
7
T3
Amarilla
viscosa
grande
Convexa
Circular
Redondo
7
T4
Transparente
viscosa
pequeño
Plana
Circular
Ovalado
7
T5
Lechosa blanca
mucosa
grande
Convexa
Circular
Redondo
-7
T6
cremosa
grande
Plana
Papilada
Irregular
-7
T7
Amarillo
viscosa
pequeño
Fusiforme
Irregular
-7
T8
Amarillo transparentoso
Mucosa
Pequeño
Plano convexa
Plana
Irregular
Irregular
-7
T9
Blanca
Mucosa
Pequeño
Plana
Fusiforme
Alargado
-7
T10
Transparente
viscosa
Pequeño
Convexa
Circular
Lobulado
-7
T11
Blanca centro amarillo
Mucosa
Pequeño
Plana
Circular
Ondulado
-7
T12
Tranparente
viscosa
grande
Papilada
Ondulado
-7
T13
Transparente
viscosa
Pequeño
Plano convexa
Convexa
Circular
Redondo
-7
T14
Naranja
dura
grande
Convexa
Circular
Redondo
T2 + 10-
5
T15
Amarilla oscuro
cremosa
grande
Plana
Circular
Redondo
T3 + 10-
6
T16
Blanca con centro amarillo
cremosa
Pequeño
Convexa
Rizoide
Rizoide
-5
T17
Transparente
Dura
grande
Plana
Circular
Redondo
T2 + 10T1 + 10T1 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T2 + 10
N°1
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T3 + 10
Trasparente con centro amarillo
48
-6
T23
Amarilla
cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
-6
T24
Blanca
viscosa
grande
Convexa
Circular
Redondo
-6
T25
Blanca
Dura
Pequeño
Plana
Rizoide
Irregular
T1 + 10
T1 + 10
T1 + 10
N°2
6
T26
Amarilla
cremosa
Pequeño
Plana
Circular
Redondo
-6
T27
Rosado claro
cremosa
Pequeño
Plana
Circular
Redondo
-6
T28
Rosado intenso
cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
T2 + 10-
6
T29
Amarillo claro
Dura
Pequeño
Plana
Irregular
Ondulado
T2 + 10-
6
T30
Rosado claro
Dura
Mediano
Plana
Circular
Redondo
T2 + 10-
6
T31
Transparente centro amarillo
cremosa
Mediano
Convexa
Circular
Redondo
-6
T45
cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
-6
T46
Transparente
Mucosa
Pequeño
Convexa
Irregular
Ondulado
4
T47
Transparente
Mucosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
-6
T48
Transparente
Mucosa
Mediano
Plana
Circular
Redondo
-4
T49
Transparente
cremosa
Pequeño
Plana
Rizoide
Irregular
-6
T50
Transparente
cremosa
Pequeño
Plana
Rizoide
Irregular
6
T51
Blanca
cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
-5
T52
Amarillo quemado
Dura
Mediano
Plana
Circular
Redondo
-5
T53
Blanca centro amarillo
Cremosa
Mediano
Plana
Circular
Irregular
-4
T54
Amarilla
Cremosa
Grande
Plana
Circular
Redondo
-5
T55
Amarilla
Dura
Grande
Plana
Circular
Redondo
-5
T67
Amarilla centro quemado amarillo
Dura
Pequeño
Convexa
Irregular
Ondulado
-6
T68
Transparente
Mucosa
Pequeño
Plana
Irregular
Ondulado
-4
T69
Transparente
Cremosa
Mediano
Plana
Circular
Redondo
-4
T70
Transparente
Mucosa
Pequeño
Acuminada
Circular
Redondo
T1 + 10T1 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T2 + 10T1 + 10
T2 + 10
N°3
T3 + 10
T3 + 10T1 + 10
T1 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T1 + 10
N°4
T1 + 10
T2 + 10
T2 + 10
Amarilla
49
-4
T71
Blanca centro amarillo
Cremosa
Mediano
Plana
Rizoide
Filamentoso
-5
T72
Transparente
Cremosa
Pequeño
Acuminada
Circular
Redondo
-6
T73
Amarilla
Mucosa
Pequeño
Papilada
Circular
Redondo
-6
T74
Blanca
Mucosa
Mediano
Acuminada
Circular
Redondo
-6
T75
Naranja
Cremosa
Pequeño
Convexa
Irregular
ondulado
-5
T76
Transparente
Mucosa
Mediano
Convexa
Filamentoso
Filamentoso
-6
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T3 + 10
T77
Transparente
Mucosa
Mediano
Papilada
Irregular
Filamentoso
-4
T89
Rosada
Dura
Pequeño
Plana
Circular
Irregular
-5
T90
Rosada
Cremosa
Pequeño
Plana
Circular
Redondo
-6
T91
Naranja
Mucosa
Pequeño
Convexa
Circular
Redondo
-6
T109
Naranja con centro amarillo
Viscosa
Pequeña
Convexa
Irregular
Ondulado
-6
T110
Amarilla
Mucosa
Pequeño
Plana
Circular
redondo
-6
T111
Café
Dura
Pequeño
Plana
Irregular
Ondulado
-4
T112
Blanca
Mucosa
Mediano
Papilada
Circular
redondo
-6
T113
Transparente con centro blanco
Cremosa
Grande
Papilada
Circular
redondo
-6
T114
Blanca
Cremosa
Mediano
Papilada
Irregular
Ondulado
-6
T115
Amarilla
Cremosa
Pequeño
Umbilicada
Irregular
Ondulado
-2
T1B
Blanca
Cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
redondo
-6
T2B
Transparente
Cremosa
Pequeño
Convexa
Irregular
Ondulado
-6
T3B
Rosada
Cremosa
Grande
Papilada
Circular
redondo
-5
T4B
Blanco en el centro un circulo
amarillo
Cremosa
Grande
Papilada
Circular
redondo
-6
T23B
Café
Cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
redondo
-6
T24B
Café borde transparente
Mucosa
Grande
Convexa
Irregular
Ondulado
-6
T25 B
Rosada
Cremosa
Pequeño
Convexa
Circular
redondo
T2+ 10
N°5
T1 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T1 + 10
T1 + 10
N°6
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T1 + 10
T1 + 10
T1 + 10
T1 + 10
N° 7
T1 + 10
T2 + 10
T1 + 10
50
-6
T26 B
Transparente
Mucosa
Pequeño
Plana
Circular
redondo
-4
T27B
Café
Dura
Pequeño
Plana
Circular
redondo
-4
T28B
Café
Mucosa
Grande
Papilada
Irregular
Ondulado
-4
T29B
Amarillo quemado
Cremosa
Pequeño
Papilada
Circular
redondo
-6
T30B
Café
Mucosa
Pequeño
Convexa
Circular
redondo
-6
T45 B
Café
Dura
Pequeño
Plana
Circular
redondo
-5
T87B
Blanco
Dura
Mediana
Plana
Irregular
Ondulado
-5
T88B
Café
Dura
Mediana
Plana
Irregular
Ondulado
-5
T89B
Naranja en el centro punto blanco
Mucosa
Pequeño
Papilada
Circular
redondo
-5
T90B
Blanca
Cremosa
Mediano
Convexa
Circular
redondo
-5
T91B
Transparente
Mucosa
Grande
Convexa
Circular
redondo
-5
T92B
Blanco
Mucosa
Pequeña
Convexa
Irregular
Ondulado
-5
T110B
T111B
Blanca con borde café
Café
Cremosa
Dura
Grande
Mediana
Papilada
Convexa
Circular
Circular
redondo
redondo
T1 + 10
T2 + 10
T2 + 10
N°8
T2 + 10
T2 + 10
T1 + 10
N°9
T2 + 10
T2 + 10
T2 + 10
T1 + 10
N°11
T2 + 10
T2 + 10
N°12
T1 + 10
-5
T1 + 10
Fuente: Las autoras
51
En la tabla anterior se evidencia un mayor crecimiento en la muestra 1 frente a la
planta de cristalización, así mismo en las diluciones 10- 5 y 10-6. El tratamiento que
presento mayor crecimiento fue tratamiento con fuente de carbono con 54%,
seguido el tratamiento con fuente nitrógeno con 40%, por ultimo se puede ver un
menor crecimiento en el tratamiento que tenía como única fuente explosivo con un
6%. Como se puede observar en la gráfica 1.
Grafica 1. Porcentajes de aislamientos en los tratamientos.
Porcentajes de aislamientos en los
tratamientos
54%
40%
% de
aislamientos
6%
Explosivo T1
Fuente de carbono
+Explosivo T2
Fuente. Las autoras.
52
Fuente de
Nitrógeno
+Explosivo T3
2.2.3 Selección de los aislamientos bacterianos con mayor capacidad de
degradación.
Para determinar cuáles de los setenta y ocho aislamientos bacterianos tenían
mayor capacidad de degradación del explosivo TNT, fue necesario realizar una
extracción y filtración para separar la biomasa (células bacterianas) del
sobrenadante (MML+ Explosivo). Este proceso consistió en homogenizar con
vortex durante 1 min los aislamientos inoculados en MML; posterior a esto se
realizo el lavado de las células en un nuevo tubo de ensayo, se centrifugo a 6000
rpm por veinte minutos, luego se tomaron 650 µl del sobrenadante y se
adicionaron 650 µL de acetonitrilo grado HPLC, en un eppendorf, esto se
homogenizo en vortex por 1 min. Por otro lado el tubo donde se hizo el lavado de
las células se unifico con el contenido del eppendorf ya homogenizado en un
frasco de vidrio cerum, este último se pasa por vortex 30 segundos; del volumen
unificado se toma 1 mL y es filtrado con filtros membrana 11mm x 0.22µ tipo
HPLC, se tomar con una jeringa 0,5 mL de acetonitrilo y se pasa por el filtro, para
realizar el lavado de este, depositando el volumen en el mismo vial para un
volumen total de 1.5 ml. Por último el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) se
pasa por
HPLC para
método 8330 A
cuantificar la concentración de explosivo. Se siguió el
de cromatografía líquida de Alta Eficacia (HPLC) para
nitroaromáticos y nitraminas. Se utilizo una columna C-18 fase de fase reversa,
25 cm X4.6 mm (Shimadzu) y un HPLC marca Shimadzu; prominence LC 20AT,
equipo que fue prestado por la Unidad de Saneamiento Ambiental (USBA) de la
Pontificia Universidad Javeriana. Las condiciones de cromatografía se ajustaron a
las recomendaciones del fabricante, estas fueron: un flujo de 1 ml /min con un
volumen de inyección de 20 µl, detector UV a 254 nm. Para la corrida de las
muestras se empleo una fase móvil 54:10:34 (Metanol: acetonitrilo: agua tipo1).
La tabla 10 muestra los valores de concentración, tiempo de retención y área para
el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) para cada uno de los setenta y ocho
aislamientos. Con el área de cada cromatograma que se obtuvo durante la corrida
53
por HPLC, se establecieron las concentraciones más bajas que se registraron de
TNT en el equipo; con esta información se seleccionaron las cinco muestras que
presentaron mayor degradación por el aislamiento bacteriano contenido en cada
uno de ellas.
Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC.
MUESTRA
EXPLOSIVO
CONCENTRACIÓN
DEL EXPLOSIVO
(PPM)
96,56
CONCENTRACIÓN
FINAL (PPM)
TNT
TIEMPO DE
RETENCIÓN
(MIN)
6,35
PATRON
T1A
TNT
6,34
1,75
2,62
T2A
TNT
6,33
2,38
3,56
T6A
TNT
6,34
1,73
2,60
T7A
TNT
6,36
1,68
2,52
T8A
TNT
6,33
1,69
2,53
T10A
TNT
6,36
1,72
2,58
T11A
TNT
6,35
1,69
2,53
T12A
TNT
6,35
1,68
2,52
T13A
TNT
6,33
1,86
2,79
T14A
TNT
6,34
1,75
2,63
T15A
TNT
0,00
0,00
T16A
TNT
No peak is
detected.
6,32
1,68
2,51
T17A
TNT
0,00
0,00
T23A
TNT
No peak is
detected.
6,35
1,98
2,96
T24A
TNT
6,33
1,83
2,74
T30A
TNT
6,35
1,69
2,54
T45A
TNT
6,35
1,70
2,55
T47A
TNT
6,35
1,69
2,53
T48A
TNT
6,36
1,70
2,55
T49A
TNT
6,33
1,71
2,56
T50A
TNT
0,00
0,00
T51A
TNT
No peak is
detected.
6,58
1,71
2,56
T52A
TNT
6,60
1,80
2,71
T53A
TNT
6,73
1,70
2,55
T54A
TNT
6,57
1,70
2,55
T70A
TNT
6,64
1,72
2,58
54
144,84
T71A
TNT
6,54
1,71
2,56
T74A
TNT
0,00
0,00
T1B
TNT
0,00
0,00
T2B
TNT
No peak is
detected.
No peak is
detected.
6,71
1,72
2,57
T3B
TNT
6,74
1,71
2,56
T4B
TNT
6,74
1,70
2,55
T25B
TNT
6,75
1,71
2,56
T26B
TNT
6,75
1,82
2,73
T0
TNT
6,74
96,27
144,41
T29B
TNT
6,75
2,74
4,11
T30B
TNT
6,76
1,71
2,57
T45B
TNT
6,76
1,71
2,57
T65B
TNT
6,45
1,71
2,56
T84B
TNT
0,00
0,00
T87B
TNT
0,00
0,00
T88B
TNT
0,00
0,00
T90B
TNT
0,00
0,00
T91B
TNT
0,00
0,00
T92B
TNT
0,00
0,00
T110B
TNT
0,00
0,00
T111B
TNT
0,00
0,00
T54
TNT
0,00
0,00
T66
TNT
0,00
0,00
T67
TNT
0,00
0,00
T4B.2
TNT
0,00
0,00
T24B
TNT
0,00
0,00
T65A
TNT
0,00
0,00
T68
TNT
0,00
0,00
T109
TNT
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
detected.
No peak is
0,00
0,00
T69
TNT
No peak is
0,00
0,00
T110
TNT
No peak is
0,00
0,00
T112
TNT
No peak is
0,00
0,00
Autor. Adaptación por las autoras.
55
Fuente. Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana.
De los setenta y ocho aislamientos se evidencio una mayor capacidad de
degradación en veinticuatro, los cuales registraron lecturas en la concentración
cero del explosivo TNT, de estos se escogieron
bacterianos como se presentan en la tabla 11.
56
al azar cinco aislamientos
Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del TNT seleccionados al azar.
Muestra
Tratamiento
Aislamiento
Color
Textura
Tamaño
Elevación
Forma
Borde
T2 +10-5
T54
Amarillo
Cremosa
Grande
Convexa
Circular
Redondo
T2 +10-5
T88
Café
Dura
Mediana
Plana
Irregular
Ondulado
T2 +10-5
T87
Blanco
Dura
Mediana
Plana
Irregular
Ondulado
T2 +10-5
T92
Blanco
Mucosa
Pequeña
Convexa
Irregular
Ondulado
T2+10-6
T109
Naranja
Viscosa
Pequeña
Convexa
Irregular
Ondulado
3. Canal exterior
11.Fitorremediacion
11.Fitorremediacion
11.Fitorremediacion
6.Tanque de
transporte
Fuente: las autoras
57
2.1.7 Bioensayo.
Con los cinco aislamientos bacterianos seleccionados que poseían mayor
capacidad de degradación se realizo el bioensayo. Para esto es importante
determinar las siguientes condiciones: tiempos de retención, concentración del
explosivo, componentes del agua residual sintética, unidades experimentales y
densidad óptica de los Inóculo.
Para el tiempo de retención se estimo un periodo de cuatro días19, los cuales se
les asigno una nomenclatura especifica con mediciones cada veinte cuatro horas
±1, la concentración del explosivo fue de 100 mg/L, se trabajaron cinco unidades
experimentales con un control. Estas unidades se trabajaron por triplicado (n=3)
para un total de 18 unidades experimentales. Para determinar la concentración de
los inóculos en los bioensayos, se hizo necesario hacer una escala de Mac
Farland (Ver Anexo D), la cual fue comparada con los aislamientos bacterianos
inoculados en 10 mL de medio mineral líquido después de cinco días en agitación
a 75 rpm
y a temperatura ambiente en shaker. El valor obtenido
en esta
comparación fue igual al tubo 3 es decir que contenía 9.0X108 u.f.c/ml. Para el
bioensayo se trabajo con agua residual sintética (ARS), que contiene los
siguientes componentes:
Tabla 12. Componentes agua residual sintética
Material
Cantidad
Unidades
Suero de leche
0,326
mg/L
Sucrosa
0,49
mg/L
Fosfato ácido
0,45
mg/L
Urea
2,4
mg/L
Acetato de sodio
1,12
mg/L
de potasio
Fuente. Escuela de Ingeniería de Antioquia, Medellín (Colombia
)20
19
Este periodo de tiempo fue estipulado de acuerdo a la disponibilidad de material y utilización del equipo
HPLC.
20
Remoción Biológica De Materia Orgánica, Nitrógeno Y Fósforo en un Sistema Tipo anaerobio-Anóxico-Aerobio Revista
EIA, ISSN 1794-1237 Número 10, p. 45-53.
58
Las cinco cepas son inoculas por separado en el ARS en tubos de ensayo de 10
mL; las proporciones para cada tubo fueron 5mL de ARS, 0.125 mL de explosivo y
de inoculo 5 mL de inoculo.
Para determinar las concentraciones iniciales del explosivo en el bioensayo se
realizo una primera medición donde el ARS no contenía inoculo del aislamiento
bacteriano. Seguido de esto se inoculo el aislamiento bacteriano en el ARS,
incubando a 25°C±1 por un periodo de 24 horas, después de este periodo de
tiempo se realizaron las siguientes mediciones. Las mediciones para el bioensayo
se hicieron con el mismo método de filtración antes mencionado, estos se llevaron
al HPLC con las condiciones antes mencionadas de corrida.
La curva de calibración (Anexo E) reporto un factor de correlación (r2) de 0.9936
indicando la estrecha relación entre los valores del eje X y el eje Y, que se ve
representado en la distribución lineal de la curva y por ende el comportamiento
normal de los datos.
f(x)=2.26479e-005*x+11.1662
Rr1=0.9968314 Rr2=0.9936729
La tabla 13 muestra los resultados obtenidos por HPLC y los porcentajes de
remoción para cada uno de los aislamientos bacterianos tanto en las
concentraciones iniciales, como en la variación con respecto al tiempo, este último
se hizo con el fin de obtener la representatividad en cuanto a la degradación por
periodo de tiempo y comportamiento individual de los aislamientos bacteriano
(porcentaje de remoción acumulado).
59
Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo.
Tiempo
(días)
Muestra
Tiempo de
retención
(min)
Concentración
del explosivo
(ppm)
Concentración
Final (ppm)
Patrón
100mg/l
7,47
93.50
N/A
t1
50,1
53,05
75,15
79,575
t3
7,47
7,47
7,47
51,42
77,13
T54A2
7,47
60,05
T54A.1
7,47
77,15
T54A
7,47
29,8
T54B2
7,46
52,58
T54B1
7,47
51,77
T54B
7,47
45,162
T54C
7,47
42,72
T54C1
7,46
42,08
T54C2
7,46
40,12
T54D
7,47
38,54
T54D1
7,46
36,96
T54D2
7,47
33,36
100mg/l
7
103.48
T109.A
7
59,75
T109.A1
7,11
56,62
T109.A.2
7
57,34
T109.B
7
53,83
T109.B1
7,11
52,79
T109.B2
7,12
52,47
Control
t0
t1
t2
t3
Patrón
t0
t1
t2
t3
t0
t1
t2
T109.C
7,11
43,56
T109.C1
7,11
52,14
T109.C2
7,11
52,79
T109.D
7,12
41,17
T109.2D
7,12
28,34
T109.2
7,11
36,15
T87A
6,9
42,13
T87A1
6,9
42,4
T87.A2
6,9
43,05
T87.B2
6,9
42,6
T87.B1
6,9
39,13
60
Porcentaje
de
remoción
Porcentaje
de
remoción
acumulado
74,76
10,47
10,47
62,46
25,19
16,45
54,43
34,81
12,86
79,54
8,42
8,42
78,7
9,38
1,06
52,83
39,17
32,87
5,92
5,93
83,5
86,85
63,79
60,01
t2
t3
t0
t1
t2
t3
t0
t1
t2
t3
T87.B
6,9
38,31
T87.C
6,9
31,84
T87.C1
6,9
34,14
T87.C2
6,9
29,53
T87D2
6,9
28,13
T87.D1
6,9
28,83
T87.D
6,9
25,16
T92.A
6,9
39,605
T92.A1
6,9
35,41
T92.A2
6,9
35,14
T92.B
6,9
35,21
T92B1
6,9
32,63
T92B2
6,9
33,51
T92C
6,9
30,51
T92.C1
6,9
30,25
T92.C2
6,9
28,73
T92.1D
6,9
26,28
T92.D
6,9
26,94
T92.D2
6,9
25,69
T88A2
6,9
45,9
T88.A1
6,9
49,61
T88A
6,9
39,6
T88.B1
6,8
38,75
T88.B
6,9
36,16
T88.B2
6,8
31,75
T88.C
6,9
29,92
T88.C2
6,8
30,51
T88.C2
6,9
30,3
T88.D
6,9
28,05
T88.D1
6,9
27,08
T88.D2
6,9
27,24
47,76
25,12
20,41
41,05
35,6
14,05
50,67
8,01
8,01
44,74
18,77
11,70
39,45
28,37
11,82
53
21
21,07
45,36
32,85
14,94
41,46
38,63
8,60
55,08
67,56
Fuente. Las autoras .Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana.
Los datos de cada uno de los triplicados del ensayo con las bacterias aisladas se
promediaron para obtener las concentraciones finales a través de los tiempos
establecidos y se multiplican por
el factor 1.5 ya que hubo una dilución en
acetonitrilo 0,5mL y ARS 1mL.
61
2.1.8 Análisis estadístico.
El bioensayo tuvo como propósito determinar el porcentaje de remoción
en
agua residual sintética mediante los aislamientos bacterianos seleccionados, a
través de un tiempo pre establecido. Para ello se eligió un periodo de cuatro días,
haciendo mediciones cada veinticuatro horas por HPLC. Para esto se aplico un
diseño por bloques para determinar el efecto que tiene el tiempo (pre–establecido)
y las cepas aisladas sobre la remoción del explosivo TNT.
2.1.8.1 Modelo.
El número de unidades experimentales para cada bloque coincide con el número
de tratamientos, en este caso
el boque es
el tiempo y el tratamiento es el
aislamiento bacteriano.
Yij = μ + αi + βj + εij
Donde:
Yij: Porcentaje de remoción.
μ: Es el porcentaje de remoción que se espera.
αi: Período de tiempo utilizado en el bioensayo.
Βj: Aislamiento bacteriano utilizado en cada bioensayo.
εij: Error estándar.
Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento bacteriano.
Tiempo(días) T54 T109 T87 T88 T92
t1
10%
8%
5%
t2
16%
1%
20% 15% 1%
t3
13%
33%
14%
Fuente: Las autoras
62
21% 8%
8%
32%
2.1.8.2 Hipótesis
Ho: El tiempo y el aislamiento bacteriano no tienen efecto sobre el porcentaje de
remoción.
μ + tiempo + cepa =0
Ha: El tiempo y el aislamiento bacteriano tienen efecto sobre el porcentaje de
remoción.
μ + tiempo + cepa ≠0
Se obtiene una tabla ANOVA
Tabla 15.Análisis de varianza.
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de
las
variaciones
Tiempo
Bacteria
Error
Total
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
0,02917142
0,00058638
0,10111253
0,13087033
2
4
8
14
Promedio
F
Probabilidad
de los
cuadrados
0,01458571 1,15401791
36%
0,0001466 0,01159862
100%
0,01263907
Fuente: Las autoras
ANOVA
Tabla 16.Resultados del análisis de varianza.
Variables
Hipótesis
P valor
Tiempo
αi =0 vs αi ≠ 0
0.36
Aislamiento
Βj =0 vs Βj ≠0
1.00
0
0
Yij = μ + αi + βj + εij
63
Valor crítico
para F
4,458970108
3,837853355
Los resultados obtenidos tabla 16 (análisis de varianza), nos indican que tanto el
tiempo
utilizado para el bioensayo 4 días, como los cinco aislamientos
bacterianos no tienen efecto en la remoción esperada del explosivo TNT.
Frente a la hipótesis planteada anteriormente el p valor dio mayor del 0.5 en el
tiempo y en los aislamientos bacterianos lo que indica que estas dos variables no
tienen representatividad; aunque se haya presentado un porcentaje de remoción
por los aislamientos bacterianos, mostrando un comportamiento homogéneo de la
degradación a través del tiempo.
64
3. Análisis de resultados
Los aislamientos bacterianos en las muestras tuvieron la capacidad de crecer a un
pH neutro, ya sea por tolerancia o adaptación debido a la regulación de su pH
citoplasmático que es cercano a 7, indicando que estas bacterias no son acidofilas
o alcalofilas obligadas.
De las siembras realizadas al pre- enriquecimiento se obtuvieron setenta y ocho
aislamientos bacterianos las cuales presentaron una amplia gama morfo- típica.
En algunos de los medios de cultivo incubados a 21° C presentaron
una
coloración naranja indicando la presencia del complejo Meisenheimer (Ver
ilustración 2), a partir de lo anterior se puede deducir que las bacterias emplearon
este vía de degradación.
Se pudo observar que en el tratamiento T2 se presentó un mayor porcentaje
(54%) de crecimiento bacteriano, esto quiere decir que las bacterias aisladas
tomaron la fuente de carbono como su fuente de energía y la fuente de nitrógeno
la tomaron del explosivo.
Los sitios de muestreo de donde se aislaron 3 de las 5 bacterias con mayor
capacidad de degradación del TNT, se caracterizan por estar directamente
involucrados con algún tratamiento biológico como es el punto de muestreo de
fitorremediación, donde las bacterias están adheridas a las raíces siendo allí
donde se presenta la degradación enzimática del TNT por los bacterios21; se
aislaron las bacterias T87, T88, T92,con las cuales se trabajo en el bioensayo; lo
que nos muestra que estos aislamiento bacterianos presenten una adaptación a
este tipo de degradación biológica.
En la primera medición (cero) se encontró que los valores
iniciales de la
concentración del explosivo no eran iguales, como se muestra en la Tabla 14 esto
se debe a que posiblemente se presento una pérdida de TNT por adsorción en el
21
Revista científica Ozono 21. 31 de Julio de 2009. http://ozono21.blogcindario.com/2009/07/00198
65
plástico y en el vidrio de los elementos de laboratorio utilizados, como los tubos
falcon, tubos de ensayo, tubos eppendorf, etc.
Otra razón por la cual se pudo presentar variabilidad en las concentraciones
iniciales del explosivo, puede obedecer a que el TNT, se retenga en el filtro de
nylon utilizado durante las filtraciones.
Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo
Tiempo(días)
T54
T109
T87
T88
T92
t0
t1
t2
t3
83.50 ppm
74.76 ppm
62.46 ppm
54.43 ppm
86.85 ppm
79.54ppm
78.70ppm
52.83ppm
63.79ppm
60.01ppm
47.76ppm
41.05ppm
67.56ppm
53.325ppm
45.36ppm
41.46ppm
55.08ppm
50.67ppm
44.74ppm
39.45ppm
Fuente: las autoras
Grafica 2. Comportamiento de la concentración del TNT en el tiempo.
Concentración /Tiempo
Concentración (ppm)
90
80
T54
T109
T87
T88
T92
70
60
50
40
30
T0
T1
T2
Tiempo (Min)
Fuente. Las Autoras.
66
T3
Aunque el valor final de la concentración del explosivo TNT, no fue representativo
con referencia a los valores iniciales, se puede observar que la concentración del
explosivo disminuye a través del tiempo (grafica 2).
Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT.
Tiempo(días)
t1
t2
t3
T54
T109
T87
T88
T92
10%
16%
13%
8%
1%
33%
5%
20%
14%
21%
15%
8%
8%
1%
32%
Fuente. Las autoras.
Los porcentajes de reducción encontrados en los aislamientos después de un
periodo de cuatro días oscilan en un rango de 83 % y 32 %, lo que indica que
estos aislamientos poseen una capacidad para reducir los grupos nitro y de esta
manera degradar el TNT.
Para este bioensayo se parte de una curva patrón 100 ppm, la cual sirve de
referencia para comparar los picos de concentración obtenidos después de correr
las muestras del bioensayo.
A continuación se presenta los cromatogramas
obtenidos del aislamiento
bacteriano T109, indicando para cada uno los tiempos de retención y las
concentraciones de explosivo parciales.
67
Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L.
Explosivo: TNT.
Tiempo de retención: 6.64 min.
Concentración :103.56 mg/L
Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0
Explosivo: TNT.
Tiempo de retención: 6.989min.
Concentración :59.75mg/L
68
Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3.
Explosivo: TNT.
Tiempo de retención: 6.989min.
Concentración :40.7mg/L
Se obtuvo los picos de concentración, evidenciando una disminución en la
concentración
con
respecto
al
patrón
de
100mg/l,
encontrándose
una
concentración en el tiempo final (t3) de 33.36 mg/L.
Los cromatogramas presentaron, colas y solapamientos esto puede deberse a las
sustancias detectadas y los metabolitos resultado del proceso de degradación del
TNT.
69
4. CONCLUSIONES
Las condiciones fisicoquímicas establecidas para el crecimiento bacteriano
en los medios minerales, favorecieron la bioaumentación, tanto en el preenriquecimiento como en las siembras y replicas de los aislamientos.
Los valores de pH muestran un rango muy amplio entre 2.11 – 8.95 lo que
nos indica que las muestras tomadas tienen variedad de ambientes
dependiendo de la línea de producción del explosivo y de los procesos
físicos y biológicos que se llevan a cabo en cada punto donde fue tomada
la muestra.
De los tratamientos evaluados T1, T2 y T3, se considera el mejor de ellos
es el tratamiento T2 ya que los aislamientos bacterianos presentaron un
mayor porcentaje (54%) de crecimiento bacteriano en la fuente de carbono
más explosivo.
Se obtuvieron setenta y ocho aislamientos procedentes de las muestras
tomadas, de los cuales veinticuatro presentaron una posible degradación
del explosivo. Obteniendo concentraciones de TNT con valores de cero en
los análisis realizados en HPLC.
Los análisis realizados en HPLC
corresponden
se
presentaron picos que no
al explosivo, lo que puede indicar la presencia de otras
sustancias o metabolitos producto de la degradación del explosivo 2, 4,6
trinitrotolueno, por los aislamientos bacterianos.
Los resultados obtenidos demuestran que los aislamientos bacterianos
seleccionados poseen una capacidad degradadora del 35 % en promedio,
en un periodo de tiempo de 4 días, en condiciones de laboratorio.
70
5. RECOMENDACIONES
El bajo porcentaje de remoción del explosivo en el bioensayo, se debe
principalmente al tiempo de retención del aislamiento bacteriano en el agua
residual sintética, por lo que se sugiere que estos bioensayos superen un
tiempo de 30 días,
para corroborar si el porcentaje de
remoción del
explosivo, sigue disminuyendo de manera considerable.
Es necesario estandarizar la extracción y filtración de los bioensayos para
evitar la pérdida de explosivo por la variabilidad de recipientes utilizados
para dichos procedimientos, ya que esto altera los tiempos de retención de
la muestra y por consiguiente los datos obtenidos por el equipo.
Se recomienda tener en cuenta los diez y nueve aislamientos bacterianos
que
presentaron
concentración
cero
de explosivo,
ya
que
estos
posiblemente poseen un potencial para la degradación del 2,4,6
TRINITROTOLUENO.
71
6. BIBIOGRAFIA
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75
ANEXOS.
76
ANEXO A. CROMATOGRAMAS AISLAMIENTOS ESCOGIDOS AL AZAR
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
/8.501
/7.352
tnt/6.712
/5.355
0
/4.266
/4.487
/1.703
/1.810
250
/4.894
/3.204
/3.407
mAU
500 254nm,4nm (1.00)
/6.180
Cromatograma. 1. 100 mg/l
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
Cromatograma. 2. Cero.
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
/8.860
/8.335
0
0.0
/4.960
/4.111
/2.781
25
/3.419
50
/10.874
tnt/6.336
mAU
254nm,4nm (1.00)
9.0
10.0
11.0
min
10.0
11.0
min
11.0
min
Cromatograma. 3 Patrón
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
/8.841
/8.213
/7.637
/6.965
0
/4.937
250
/4.327
/1.635
/1.745
/1.938
/2.101
/2.296
tnt/6.347
/3.411
mAU
500 254nm,4nm (1.00)
9.0
/8.743
/9.020
tnt/6.574
/4.479
1
/0.427
2
/2.921
/0.883
mAU
254nm,4nm (1.00)
/9.971
Cromatograma. 4 T54
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
77
7.0
8.0
9.0
10.0
/9.449
/8.103
/8.528
/5.113
/4.701
1
/4.314
/3.412
/3.541
2
/3.989
/2.910
mAU
3 254nm,4nm (1.00)
/6.215
Cromatograma. 5 T87
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
min
9.0
10.0
11.0
min
9.0
10.0
11.0
min
9.0
10.0
11.0
min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
/5.727
/5.131
0
/4.075
/3.395
/1.426
1
6.0
/8.139
mAU
254nm,4nm (1.00)
/2.900
2
/6.260
Cromatograma. 6 T88
7.0
8.0
Cromatograma. 7 T92
/8.146
1
/4.487
/3.387
2
/6.241
/2.938
mAU
254nm,4nm (1.00)
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
/8.132
/2.716 /2.805
2.5
/3.083
/3.385
mAU
5.0 254nm,4nm (1.00)
/6.230
Cromatograma. 8. T 109
0.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
78
7.0
8.0
ANEXO B. CROMATOGRAMAS BIOENSAYO
Cromatograma. 9. T54 para el tiempo 0
mAU
210nm,4nm (1.00)
tnt/60.052
225
200
175
150
125
100
75
50
0
/0.000
/0.000
/0.000
/0.000
25
-25
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
min
Cromatograma. 10 T54para el Tiempo 1
TNT/52.587
mAU
160 210nm,4nm (1.00)
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
79
10.0
11.0
12.0
13.0
min
Cromatograma. 11. T54 tiempo 2
mAU
210nm,4nm (1.00)
170
160
tnt/42.085
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
/0.000
/0.000
0
/0.000
10
/0.000
20
-10
-20
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
min
mAU
210nm,4nm (1.00)
180
/0.000
Cromatograma. 12.T 54 tiempo 3.
170
160
150
140
130
tnt/33.366
120
110
100
90
80
70
60
50
40
/0.000
/0.000
/0.000
0
/0.000
10
/0.000
/0.000
/0.000
20
/0.000
30
-10
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
80
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
min
Cromatograma. 13 T109, tiempo 1.
/0.000
mAU
210nm,4nm (1.00)
TNT/59.757
120
110
100
90
80
70
60
/0.000
50
40
/0.000
30
20
10
0
-10
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
Cromatograma. 14 T109.tiempo 2.
TNT/52.792
mAU
140 210nm,4nm (1.00)
130
120
110
100
90
80
70
/0.000 /0.000
60
50
/0.000
40
30
/0.000
PETN/2.025
20
10
0
-10
-20
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
81
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
min
min
Cromatograma. 15 T109 tiempo 2.
TNT/43.567
mAU
110 210nm,4nm (1.00)
100
90
80
70
60
/0.000
/0.000
/0.000
/0.000
50
40
30
/0.000
PETN/2.492
20
10
0
-10
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
min
Cromatograma. 16 T109 tiempo 3
TNT/41.174
mAU
120 210nm,4nm (1.00)
/0.000
110
100
90
80
70
60
50
40
30
/0.000
/0.000
/0.000
10
/0.000
20
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
82
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
min
Cromatograma. 17 T87tiempo 0.
TNT/42.137
mAU
100 210nm,4nm (1.00)
95
90
85
80
75
70
/0.000
65
60
/0.000
55
50
45
/0.000
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
min
Cromatograma. 18 T87 tiempo 1.
TNT/38.317
mAU
210nm,4nm (1.00)
75
70
65
60
55
/0.000
50
/0.000
45
/0.000
40
35
30
25
20
15
5
/0.000
10
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
83
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
Cromatograma. 19 T87.tiempo 2.
/0.000
70
TNT/31.846
/0.000
mAU
75 210nm,4nm (1.00)
65
60
55
50
45
40
35
30
/0.000
25
20
/0.000
15
/0.000
10
5
0
-5
-10
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
mAU
90 210nm,4nm (1.00)
/0.000
Cromatograma. 20 T87.tiempo 3.
85
80
75
70
65
/0.000
60
55
TNT/25.167
50
45
40
35
30
20
PETN/23.781
/0.000
25
5
/0.000
/0.000
10
/0.000
15
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
84
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
min
Cromatograma. 21 T92.tiempo 0.
/0.000
TNT/35.412
mAU
210nm,4nm (1.00)
70
65
60
/0.000
55
50
45
/0.000
40
35
30
25
20
15
/0.000
10
5
0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
min
Cromatograma. 22 T92 tiempo1.
/0.000
55
TNT/32.631
mAU
210nm,4nm (1.00)
50
/0.000
45
40
/0.000
35
30
25
20
/0.000
10
PETN/8.980
/0.000
15
5
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
85
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
Cromatograma. 23 T92.tiempo 1.
/0.000
mAU
210nm,4nm (1.00)
95
90
85
80
75
TNT/28.737
70
65
/0.000
60
55
/0.000
50
45
/0.000
40
35
30
25
20
15
/0.000
10
5
0
-5
-10
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
Cromatograma. 24 T92.tiempo3.
/0.000
mAU
210nm,4nm (1.00)
120
110
100
90
80
/0.000
70
TNT/25.695
60
/0.000
/0.000
50
40
30
10
/0.000
/0.000
/0.000
20
0
-10
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
86
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
min
Cromatograma. 25 T88 tiempo 0.
TNT/39.605
mAU
210nm,4nm (1.00)
85
80
/0.000
75
70
/0.000
65
60
55
50
/0.000
45
40
35
30
/0.000
25
20
5
/0.000
/0.000
10
/0.000
15
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
min
/0.000
mAU
210nm,4nm (1.00)
TNT/36.163
Cromatograma. 26 T88 tiempo1.
80
75
70
/0.000
65
60
/0.000
55
50
/0.000
45
40
35
30
25
20
PETN/1.613
/0.000
/0.000
5
/0.000
10
/0.000
/0.000
15
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
87
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
min
Cromatograma. 27 T88 teimpo2.
mAU
210nm,4nm (1.00)
TNT/29.925
/0.000
70
65
/0.000
60
55
50
/0.000
45
35
/0.000
40
30
25
20
/0.000
15
/0.000
10
5
0
-5
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
9.0
10.0
min
Cromatograma. 28 T88 tiempo3.
mAU
210nm,4nm (1.00)
TNT/28.055
/0.000
65
60
/0.000
55
50
45
/0.000
/0.000
40
35
30
25
20
/0.000
10
/0.000
15
5
0
-5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
88
7.0
8.0
min
ANEXO C.PROTOCOLOS DE
LABORATORIO.
89
ANEXO D.CURVA DE CALIBRACION
PARA LAS LECTURAS DE HPLC.
90
ANEXO D. ESCALA DE MAC FRALAND
TUBO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cl2Ba 1%
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
SO4H2 1%
9,9
9,8
9,7
9,6
9,5
9,4
9,3
9,2
9,1
9,0
Fuente: http://perso.wanadoo.es/microdominguez/c.htm
91
u.f.c/ml
3,0x108
6,0x108
9,0x108
1,2x109
1,5x109
1,8x109
2,1x109
2,4x109
2.7x109
3,0x109
ANEXO E.CROMATOGRAMAS
CORRESPONDIENTES AL BIOENSAYO.
Cromatograma: curva patrón de 100 ppm.
Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 0.
Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 3.
Cromatograma: aislamiento T 87 para el tiempo 0.
Cromatograma: aislamiento T87 para el tiempo 3.
Cromatograma: aislamiento T 88 para el tiempo 0.
Cromatograma: aislamiento T88 para el tiempo 3.
Cromatograma: aislamiento T 92 para el tiempo 0.
Cromatograma: aislamiento T92 para el tiempo 3.
Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 0.
Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 3.
92
ANEXO F.REGISTRO FOTOGRAFICO
93
Extracción de las muestras en los doce puntos designados
1. Afluente caja de cristalización
2.Canal de recepción exterior.
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
3. Caja de recepción taller multiplicadores
4. Canal recepción
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
5. Caneca
6.Tanque transporte
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
94
7. Caja de captación
Muestras empacadas de los doce
puntos de muestreo.
Explosivos
Fuente. Grupo de investigación.
95
ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL LABORATORIO
ELABORACIÓN PRE-ENRIQUECIMIENTO
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
MONITOREO SIEMBRA AISLAMEINTOS BACTERIANOS
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
96
Fuente. Grupo de investigación.
Fuente. Grupo de investigación.
Medio de cultivo liquido
Caja de petri sembrada
Fuente. Grupo de investigación.
MEDIOS DE CULTIVO SEMBRADOS
Siembre Cajas de petri
Siembra Bacterias
97
AISLAMIENTOS BACTERIANOS
Diversos morfo tipos encontrados
Muestras 1. Tratamiento 2
98
Cajas de petri siembra
99
100