Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías
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Perspectivas de futuro del diagnóstico prenatal de las anomalías cromosómicas fetales Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales Antoni Borrell Hospital Clínic de Barcelona Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PASADO Tasa procedimientos invasivos (REDCBarcelona 1992-2009) 80 70 70 69 64 60 65 63 60 58 57 56 71 70 59 58 57 41 40 34 30 25 21 20 16 10 53 52 51 50 8 19 16 10 28 34 31 30 18 16 33 31 33 28 26 23 21 19 13 27 38 21 19 18 20 26 22 20 16 12 12 9 0 92 93 94 95 96 97 98 99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 total Edat 35+ Edat<35 Cribrado secuencial con interpretación independente • • • • • ~ 8% edad materna avanzada ~ 5% TN aumentada ~10% screening bioquímico positivo ~ 6% angustia ~ 1% marcadores ecografía 20 semanas • 30% procedimientos invasivos • 85% detección T21 Evolución AC y BC HCB 1033 1000 958 965 921 837 814 800 815 720 731 657 600 542 501 409 400 383 316 264 620 661 621 531 530 441 442 430 369 344 606 560 312 318 359 509 400 491528 483 492 488 426 418 388 381 372 411 385 267 188 200 154 81 86 0 736 724 19 154 104 10 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 0 2 4 6 8 10 . Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: PRESENTE Amniocentesis Obtención de líquido amniótico por punción transabdominal Biopsia Corial Obtención de vellosidades coriales por vía transcervical/transabdominal Indicaciones Indicación AC BC 2t 1t Alto riesgo aneuploidia - edad materna avanzada - cribado bioquímico 2o trimestre - cribado combinado 1r trimestre - anomalía parental - anomalía previa - anomalía fetal Estudios moleculares/bioquímicos Infección fetal/amniótica Edad gestacional AC < 14 s. nunca 14 s. excepcionalmente 15 s. si membranas coaptadas ≥ 16 s. idonea Riesgo elevado RPM y malposición extremidades Nicolaides. Lancet, 1994 BC < 10 s. nunca 10-14 s. TC ≥ 11 s. TA Asociado a defectos de reducción de extremidades e hipoplasia oromandibular Dolk. Lancet, 1992 Preprocedimiento • Grupo y RhD Evaluar riesgobeneficio • Serologías víricas – VIH VIH: CV, HAART – VHB VHB: HBeAg,DNA – VHC si factores de riesgo VHC: DNA AC mejor BC? Lopez & Coll, Fetal Diagn Ther 2010 Técnica procedimiento: AC – Técnica ambulatoria – Control ecográfico: • previo a punción • punción ecoguiada • aspiración ecoguiada Romero et al. Obstet Gynecol 1995 – Aguja 22-20G - Punción transplacentaria • si es el acceso más fàcil al pool de LA Ventajas Amnio-Vacutainer Borrell et al.,Prenat Diagn 2008 • Aspiración más sencilla – no se necesita un segundo operador o dejar la sonda ecográfica – colocación de vacutainers por auxiliar • Menor manipulación • Mejor transporte Técnica procedimiento BC • Procedimiento ambulatorio • Control ecográfico continuo • TC – Pinza – Cánula • TA − aguja 18-20 G − doble aguja − cánula 18G +pinza Dolor -Anestesia subcutánea AC: no diferencias RCOG 2010 -AC en zona más baja, más dolor -Scores de dolor Csaba,06 41 BC-TA 35 AC 26 BC-TC -BC: TA más dolorosa en obesas TC más dolorosa en nulíparas Wax,09 Postprocedimiento • Gammaglobulina anti-D si RhD negativo • VHB: IG específica (600UI) en: - HBeAg o DNA positivo - AC transplacentaria o en tercer trimestre • Reposo 24 h. • Dolor abdominal: AC, BC-TA • Sangrado vaginal: BC-TC • Riesgo de amniorrexis • Riesgo de pérdida fetal AC: riesgo de pérdida fetal Estudio Randomizado Tabor,1986 en 4606 mujeres bajo riesgo: 1% exceso (1.7% vs 0.7%) Cochrane Review Alfirevic & Mujezinovik, 2003 5 estudios con grupo control: 0,6% exceso de pérdida Centros con experiencia 0,13% exceso de pérdida (CI 0,07-0,20).Odibo,2007 Amniocentesis de tercer trimestre (Hodor, 2007’ no aumenta riesgo de RPM, DPPNI, exitus fetal, cesarea urgente BC: Riesgo de perdida fetal No estudios randomizados: BC vs Control Metaanálisis Alfirevic, 2007 antes 14 d. total AC BC 0.6 0.7 1.9 2.0 Cohorte Danesa: > 60000 gestantes. AC 1.4% - BC-1.9% (Tabor,2009) Grupo control: No exceso riesgo BC. No diferencias TC vs TA (Odibo, 2008) Randomización (US) TC (2.5%) vs. TA (2.3%) (Jackson, 1992) Pèrdida < 24 s. (Caughey,06’ Pérdida fetal: Experiencia operador AC •Comparación ginecológo-perinatólogo (Blessed,01) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC • Comparación con la experiencia anual (Stone,04) 0.3% vs 0.03% en 30 dias post-AC segun </> 50 AC anuales BC 40% más de riesgo de perdida fetal (OR 1,4) según <1000 />1500 proc ( periodo de estudio 11 años) (Tabor, 2009) Pérdida fetal Estudio randomizado HCB Borrell, 1999 • 301 BC vs. 335 AC • Pérdida fetal espontanea hasta 1 s. post-parto : – BC 2.3% (7/301) – AC 2.4% (8/335) – by intention to treat: 2.3% vs. 2.3% – by actual treatment: 2.3% vs. 2.4% • Pérdida fetal 2 s. post-procedimiento: – BC 1.7% (5/301) – AC 0.9% (3/335) RIESGO AMNIOCENTESIS: ¿0.06%? 1% vs. 0.94% hasta 24 s. RIESGO ABORTO: - edad materna - peso - etnicidad - pérdidas previas - diabetes mellitus - inducción ovulación - PAPP-A bajo - DV reverso - TN aumentada No resultado en AC y BC • RIESGO DE NO OBTENER MUESTRA (< 1%) • AC: 2 punciones blancas • BC-TC: Estenosis cervical • BC-TA: No acceso al corion • RIESGO DE NO OBTENER UN CARIOTIPO (<1%) • AC: 0.5% fallo cultivo • BC directo: no hay cultivo Fiabilidad de AC y BC • FALSOS POSITIVOS AC: Pseudo/mosaicos (0.9%) BC: Resultado no conclusivo: mosaico/ anomalía confinada placenta (2%) • FALSOS NEGATIVOS AC: Contaminación materna (<1%) BC directo: 0.4% pero 9/10 anomalías ecográficas (van denBerg,06) BC directo+cultivo 0.08% ¿QF-PCR en todas las amnios ? No es necesario, sólo sirve per avanzar el resultado ¿QF-PCR substituyendo el cariotipo ? Quizas sí, en casos de edad materna avanzada y screening de 2 trimestre En gemelos: ¿AC o BC? • RIESGO DE CONFUSION DE MUESTRAS EN DC DA - AC: NO (no fluoresceina) - BC: 1% en 2 placentas adyacentes • RIESGO DE PERDIDA FETAL - AC: 2% Yukobowich,01 en 476 gemelares - BC: 1% • PRECOCIDAD RESULTADO riesgo interrupción selectiva 1 gemelo DC: • 5% < 16 s. • 10% 16-20 s. • 15% > 20 s. ¿Una o dos entradas? • DICORIALES: SI • MONOCORIALES DIAMNIOTICOS: NO, a no ser que exista una anomalía discordante • MONOCORIALES MONOAMNIOTICOS NO es posible Conclusiones 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) La edad materna no debería considerarse indicación de procedimiento invasivo Los estudios genéticos y cromosómicos precisan de la extracción de material fetal mediante un procedimiento invasivo Los procedimientos invasivos comportan un cierto riesgo de pérdida fetal Indicación clara La AC se realiza a partir de la semana 15, idealmente en la semana 16 La BC es una técnica que se realiza precozmente Ventajas En manos expertas, la biopsia corial y la amniocentesis tienen similar tasa de complicaciones. Un programa de cribado precoz debe disponer de un método diagnóstico precoz Procedimientos invasivos para el diagnóstico de las anomalías cromosómicas fetales: FUTURO Dos escenarios de futuro 1. Abandono: Diagnóstico prenatal no invasivo 2. Universalización: Estudio genómico masivo Cell-free fetal DNA (cffDNA) en circulación materna • Descubrimiento del DNA fetal libre (cffDNA) abrió nuevas perspectivas • 1947: hallazgo DNA extracelular • 1977: aumento DNA libre en pacientes cancer • 1997: secuencias del cromosoma Y en sangre de gestantes portadoras de fetos masculinos (Lo,97) Caracteristícas cffDNA/RNA • Cuantificación cffDNA en plasma: – 3% en segundo trimestre – 6% en tercer trimestre – 10% estimaciones más recientes en T21 • Persistencia cffDNA: eliminación en 2h post-parto en 7/8 gestants y en todas en 2 d. (Lo,99). Vida media 16 min. • Presencia RNA específico de la placenta (ZFY) en plasma materno (Poo,00). Diagnóstico Prenatal no invasivo Al haber mucho más DNA libre materno que fetal, sólo es factible identificar las secuencias de origen paterno ausentes en la madre: 1) determinación sexo: cromosoma Y 2) RhD en gestantes RhD negativas 3) mutaciones paternas DPNI aneuploidías 1) Selección ácidos nucleicos específicos fetales: - mRNA: “RNA-SNP allelic ratio” - DNA metilado: “epigenetic allelic ratio” 2) Dosificación cromosómica relativa - Massively Parallel Sequencing (MPS) RNA Allelic Ratio • Localización selectiva ácidos nucleicos fetales: – DNA: gen maspin (c18) imprintado en madre y no metilado en placenta – RNA: transcrits PLAC4 (c21): cffRNA de un gen que sólo se expresa en la placenta • Dosificación cromosómica – “Allelic ratio”: analisis de unos locus heterozigotos de SNPs (diferencia único oligonucleotido entre genomas paterno y materno) localizados en el gen estudiado. Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus G G A 2:1 (heterozygote) transcription Normal Fetus G A release into circulation 1:1 (heterozygote) 1. Transcribed SNP locus on 21st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating 4. Measure placental RNA in G/A ratio maternal plasma Testing strategy for Down syndrome heterozygous on one SNP – 1:2 (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus G A A 1:2 (heterozygote) transcription Normal Fetus release into circulation G A 1:1 (heterozygote) 1. Transcribed SNP locus on 21st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating 4. Measure placental RNA in G/A ratio maternal plasma Testing strategy for Down syndrome homozygous on one SNP (Lo YMD et al., 2007) Down syndrome Fetus A A A ? (homozygous) transcription Normal Fetus release into circulation A A ? (homozygous) 1. Transcribed SNP locus on 21st chromosome 2. RNA expressed in placenta 3. Circulating 4. Measure placental RNA in G/A ratio maternal plasma The RNA Study (RNA-based Non-invasive testing for Aneuploidy) Jacob A. Canick & Glenn E. Palomaki Co- Principal Investigators Women & Infants Hospital Alpert Medical School of Brown University V4.1 An independent observational study funded by Sequenom, Inc. BROWN Women & Infants • Regiones diferentemente metiladas (DMR) en el cromosoma 21 • Enriquecimiento de regiones hipermetiladas (DMR) del cromosoma 21 fetal • Analisis discriminante muestra 8 DMR útiles The Concept Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Normal Fetus 18 copies + 2 copies 20 copies Relative amount of chromosome 21 Normal Mother Down syndrome Fetus 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfDNA is fetal) But fetal and maternal DNA are not distinguishable in MPS Relative amount of chromosome 21 18 copies + 2 copies 20 copies Relative amount of chromosome 21 18 copies + 3 copies 21 copies Need to distinguish 21 copies from 20 copies, a 5% difference. (assumes 10% of ccfDNA is fetal) Schematic illustration of the procedural framework for using massively parallel genomic sequencing for the noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidy. Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458 Schematic illustration (cont) %chr21 = 1 / 51 = 2% Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458 Schematic illustration (cont) ` 2.01 2.00 1.98 2.11 2.02 2.03 1.99 -----2.01 (sd=0.02) (2.11 – 2.01) Z = ---------------- = 5.0 0.02 Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458 Black genomic representation Blue normal male Orange normal female Green T21 male Red T21 female Z-score % of all unique reads Percent unique reads and corresponding z-score for chromosome 21, on 28 maternal plasma samples Normal range Chiu R W K et al. PNAS 2008;105:20458 Consideraciones finales DPNI • ¿Cuando estará a punto? • ¿Screening o diagnóstico? • ¿Sólo para T21? Alteraciones DNA • A. genómica: anomalía cromosómica numérica Alteraciones DNA • A. genómica: anomalía cromosómica numérica • A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural Síndromes microdelecionals Alteraciones DNA • A. genómica: anomalía cromosómica numérica • A. cromosómica: anomalía cromosómica estructural • A. génica: cambio de un par de bases Resolución técnicas de citogenética CITOGENETICA CONVENCIONAL ~10 Mb CITOGENETICA MOLECULAR FISH ~130 Kb (sonda-específica) 3.000 Mb CGH-array 10Kb-1Mb CGH-array CGH-array CGH-array CGH-array CGH-array ¿Procedimentos invasivos? 1) ABANDONO: El DPNI de la trisomia 21 fetal está en fase de estudio y su futuro inmediato dependerá en gran medida de los resultados de los proyectos en marcha basados en MPS. 2) UNIVERSALIZACIÓN: es una posibilidad futura, cuando un estudio exhaustivo de anomalías genéticas no comporte ni tantas dudas en su interpretación (CNV), ni unos costos tan altos.
