Estudio de susceptibilidad tumoral en ratones deficientes en

Universidad de Oviedo
Instituto Universitario de Oncología del Principado de
Asturias
Máster en Biomedicina y Oncología Molecular
Estudio de susceptibilidad tumoral en
ratones deficientes en Adamts12
Laura Solares Sampedro
Julio 2015
Trabajo Fin de Máster
1
SANTIAGO CAL MIGUEL y ÁLVARO OBAYA GONZÁLEZ, profesores titulares del
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Departamento de Biología Funcional de
la Universidad de Oviedo.
CERTIFICA:
Que la Graduada, Laura Solares Sampedro, ha realizado bajo su dirección el Trabajo Fin de
Máster titulado: “Estudio de susceptibilidad tumoral en ratones deficientes en Adamts12” que
reúne a nuestro juicio las condiciones necesarias de originalidad y calidad para ser admitido
como Trabajo Fin de Máster de la Universidad de Oviedo
Y para que así conste, firman la presente certificación.
Oviedo, en Julio de 2015
Fdo: Santiago Cal Miguel
Fdo: Álvaro Obaya González
2
ABREVIATURAS Y SIGLAS
ADAMTS
Metaloproteasa y desintegrina con dominios trombospondina
ADAM
Metaloproteasa con dominios desintegrina
EGF
Factor de crecimiento epitelial
FBS
Suero fetal bovino
HGF
Factor de crecimiento de hepatocitos
kDa
Kilodalton/s
KO
Knock out
MEX
Matriz extracelular
mg
Miligramos
mM
Milimolar
pb
Pares de bases
PBS
Tampón fosfato salino
RNAi
RNA de interferencia
SDS-page
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
TGF-β1
Factor de crecimiento transformante beta-1
Tris
Tris(hidroximetil)-animometano
TSP-1
Motivo trombospondina tipo 1
TSP
Motivos trombospondina
VEGF
Factor de crecimiento endotelial vascular
vWF
Factor de Von Villebrand
WT
Wild type
3
Resumen………………………………………………………………….............................................5
INTRODUCCIÓN………………………………………………………….…………………..........6
ADAMs y ADAMTSs…………………..……………………….…..................................................8
ADAMTS-12……………………………………………………….................................................13
OBJETIVOS…………………………………………………………………………………..........16
MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………….........18
Líneas celulares y animales de experimentación……………........................................................19
Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-page)………………………………...........19
Análisis por Western Blot…………………………………………………………………….…..20
Cultivos celulares y transfecciones………………………………………………………….........20
Ensayos de invasión y migración……………………………………………………………........21
Ensayos de formación de colonias……………………………………………………………......22
Genotipado de ratones………………………………………………………………………...…..22
Generación de tumores subcutáneos………..………………………………………………….....22
Tumorigénesis química mediante empleo de uretano…………………………………………….23
Análisis estadístico…………………………………………………………………………..…....23
Bibliografía……………………………………………………………………………………….24
4
RESUMEN
Las ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloprotease domains with ThromboSpondin motifs)
son un conjunto de metaloproteasas de matriz extracellular (MEX) que han sido relacionadas con
funciones tanto oncogénicas como anti-tumorales. Estos enzimas pueden ser secretados por células
tumorales y del estroma contribuyendo a modificar el microambiente tumoral por múltiples
mecanismos. Así, algunas ADAMTSs como ADAMTS-12 pueden hidrolizar o interactuar con un
amplio rango de componentes de MEX o factores reguladores de crecimiento, afectando a procesos
de adhesión, migración, proliferación celular y angiogénesis. Por otra parte, diferentes ADAMTSs se
han encontrado sobreexpresadas, mutadas o epigenéticamente silenciadas en tumores de distinto
origen, sugiriendo el impacto directo de estas metaloproteasas en el desarrollo del cáncer. En este
trabajo hemos examinado las alteraciones que provocan, en el comportamiento de tres líneas
celulares de origen murino, cambios en la expresión de ADAMTS-12. Estas líneas han sido RM1,
derivada de carcinoma de próstata; LLC, derivada de carcinoma de pulmón; y MC38, derivada de
carcinoma de colon. Nuestros datos indican que las tres líneas celulares expresan endógenamente
Adamts12 y que una bajada en los niveles de su expresión mediante interferencia de RNA provoca un
descenso en su capacidad invasiva de dos de ellas, RM1 y MC38, lo que sugiere un papel protumoral
de la metaloproteasa. Además estas tres líneas nos han permitido iniciar el estudio de la
susceptibilidad tumoral del ratón deficiente en Adamts12, TS12(-/-). Los primeros ensayos indican
que las tres líneas celulares inyectadas subcutáneamente en ratones TS12(-/-), no inducen la
formación de tumores de mayor tamaño que cuando son inyectadas en ratones "wild-type"
TS12(+/+). Sin embargo, el modelo de carcinogénesis química mediante uretano revela una mayor
susceptibilidad del ratón TS12(-/-) que el TS12(+/+) a formar tumores de pulmón. Estos datos
profundizan en la función dual, pro y antitumoral, de ADAMTS-12, que depende de factores tan
diversos como la línea tumoral empleada, el microambiente tumoral o la interacción con otros
componentes de la matriz extracelular.
ABSTRACT
ADAMTSs (A Disintegrin And Metalloprotease domains with ThromboSpondin motifs) consist
of a set of extracellular matrix (MEX) proteases that have been related to both as anti-tumor
oncogenic functions. These enzymes can be secreted by tumor and stromal cells contributing to modify
the tumor microenvironment by multiple mechanisms. Thus, some ADAMTSs as is the case of
ADAMTS-12 can cleave or interact with a wide range of extracellular matrix components as well as
with growth factor involved in processes such as cell adhesion, migration and proliferation or
angiogenesis. Moreover, different ADAMTSs have also been found overexpressed, mutated or
epigenetically silenced in tumors of different origin, suggesting the direct impact of these
metalloproteinases in cancer development. In this work we have examined potential alterations in cell
behavior of three murine cancer cell lines. These cell lines were the prostate carcinoma RM1; the lung
carcinoma LLC, and the colon carcinoma MC38. Our data indicate that these cell lines endogenously
express Adamts12 and that a reduction of gene level expression by RNA interference induces a
decreases in their invasive capacity of RM1 and MC38, which suggests a tumor-promoting effect by
the metalloprotease. Moreover, these cell lines have been employed to initiate the tumor susceptibility
analysis of the Adamts12 deficient mouse, TS12(-/-). Fist assays indicate that tumor size induced by
these three lines subcutaneously injected in TS12(-/-) did not show differences respecting the tumor
size induced in wild-type TS12(+/+) mouse under the same conditions. However, induction of lung
chemical carcinogenesis by urethane revealed more tumor susceptibility in TS12(-/-) mice than in
TS12(+/+) mice. These findings provide new insights into the dual function of ADAMTS-12 as a proand anti-tumor agent, which may depend on several factors including the type of cell line, tumor
microenvironment or different interactions that upon secretion ADAMTS-12 can establish with other
extracellular matrix components.
5
INTRODUCCIÓN
6
Originalmente las proteasas fueron consideradas como enzimas degradativos
encargados de la digestión de proteínas procedentes de la dieta. Sin embargo, hoy conocemos
que estos enzimas también influyen decisivamente tanto en procesos normales como en
distintas patologías humanas. Así, mediante su actividad enzimática, las proteasas también
llevan a cabo hidrólisis rigurosamente controladas y procesamientos proteolíticos mediante la
rotura de enlaces peptídicos. Se trata de modificaciones irreversibles y post-traduccionales
que intervienen en la localización, actividad o interacciones de gran variedad de proteínas,
implicando a estos enzimas en multitud de funciones biológicas (López-Otín & Bond, 2008).
La importancia de estos enzimas proteolíticos se puede traducir también en términos
de diversidad. Hasta el momento, se han identificado en el genoma humano 578 genes que
codifican proteasas. Este número es aún más elevado en el caso de los genomas de rata y
ratón,
que
incluyen
652
y
664
genes
de
proteasas,
respectivamente
(http://degradome.uniovi.es). Estos números constituyen alrededor del 2% del total de genes
identificados en estos genomas, de ahí la necesidad de intentar ampliar la comprensión y
manejo de este tipo de enzimas. Por ello, el conjunto de proteasas de cualquier organismo,
denominado degradoma (Lopez-Otin & Matrisian, 2007), se ha organizado en grupos que a su
vez son extensibles a las diferentes especies. Según esto, las proteasas pueden clasificarse en
base a diferentes criterios como especificidad de sustrato, mecanismo catalítico, localización
intracelular o funciones en el organismo. Una de las clasificaciones de las proteasas se basa en
el mecanismo catalítico de éstas. De este modo, podemos encontrar 6 clases catalíticas: las
aspartil, las glutamil, las metaloproteasas, las cisteín-, serín- y treonín-proteasas (Rawlings &
Barrett, 1992; Quesada et al., 2009). Todas estas clases catalíticas de proteasas se pueden a su
vez organizar en familias según sus similitudes en secuencia o estructura. De esta manera
obtenemos un conjunto inmenso y dispar, tanto en lo que se refiere a complejidad estructural
como a especificidad. Un punto clave para establecer la relevancia funcional de las proteasas
es la identificación de sus sustratos. En este contexto nos encontramos con situaciones de
menor especificidad, en las que una misma proteasa es capaz de procesar múltiples sustratos
(López-Otín, & Overall, 2002).
Además, las proteasas desempeñan un papel fundamental en la regulación de multitud
de rutas de las que dependen la vida y la muerte celular, tales como división y diferenciación
celular, construcción y remodelación de tejidos, angiogénesis, ovulación, fertilización,
inflamación, coagulación sanguínea o cicatrización de heridas, entre otros muchos (LópezOtín & Bond, 2008). La multitud de eventos proteolíticos explica que la alteración en las
7
funciones normales de muchas proteasas constituye una causa de enfermedad. Dichos
cambios se pueden producir a nivel de la propia proteasa, por mutaciones que modifican sus
propiedades o por alteraciones en los patrones de expresión o de actividad en el tiempo o
espacio, o bien, afectar a componentes de los sistemas proteolíticos, como pueden ser
sustratos o inhibidores de dichas proteasas. La lista de patologías con dicha etiología es
amplia e incluye varias enfermedades neurodegenerativas, como son la enfermedad del
Alzheimer o la distrofia muscular de Duchenne; inflamatorias como el asma, artritis; o
cardiovasculares como la aterosclerosis, además de estar implicadas en cáncer (Wagstaff et
al., 2001; Jorgesen et al., 2007; Paulissen et al., 2009). En lo referente a tumorigénesis, las
proteasas se han considerado tradicionalmente, y tal y como Fischer postuló (Fischer, 1946),
promotoras del desarrollo neoplásico y metastásico ya que muchas se encontraban
sobreexpresadas en gran cantidad de tumores y a que, con el descubrimiento de inhibidores de
metaloproteasas, se vio reducida la capacidad de invasión in vitro y de metástasis in vivo de
las células tumorales (Folgueras et al., 2008). Sin embargo, tras numerosos ensayos clínicos
basados en terapias con estos inhibidores, no se produjeron los efectos esperados e incluso, en
ocasiones, se aceleraba el proceso tumoral. Hoy en día sabemos que existen proteasas
extracelulares e intracelulares que participan en todos los estadios tumorales a través del
control de gran variedad de procesos biológicos. Así, estos enzimas desarrollan diversos
papeles en la progresión tumoral, y pueden incluso comportarse como supresores tumorales
(Wagstaff et al., 2001; López-Otín & Matrisian, 2007)
ADAMs y ADAMTSs
Las adamalisinas son una familia de metaloproteasas que incluye los grupos ADAM
“A Disintegrin And Metalloprotease domains” y ADAMTS
y “A Disintegrin And
Metalloprotease Domains with ThromboSpondin motifs”, respectivamente (figura 1).
Miembros de estos grupos se hallan ampliamente distribuidos en mamíferos y en otros
eucariotas pero no se han encontrado ni en plantas ni en bacterias.
8
Figura 1. Organización estructural básica de la familia de ADAM y ADAMTSs. A) La familia de ADAMs
presenta como estructuralmente reseñables un dominio desintegrina (involucrado en adhesión), un dominio
metaloproteinasa (encargado de la proteólisis), repeticiones de dominios EGF, un dominio transmembrana y
una cola citoplasmática. Aunque todas las ADAMs poseen un dominio metaloproteinasa común, no todas son
catalíticamente activas. B) ADAMTSs poseen además de los indicados para las ADAM, un dominio TSP-1 y
varias repeticiones de este tipo de dominios en el extremo carboxilo terminal. A diferencia de las ADAMs, las
ADAMTSs no poseen un domino transmembrana ni cola citoplasmática y por tanto son proteínas que no están
ancladas a la matriz extracelular. Además varios dominios adicionales se han encontrado en algunas
ADAMTSs (dominio CUB, GON o PLAC). Imagen tomada de Lafleur et al., 2003.
Dentro de esta familia, las ADAMs fueron los primeros miembros caracterizados,
tratándose de proteínas con un dominio transmembrana que suelen permanecer en la
superficie celular, aunque se pueden encontrar formas solubles generadas mediante proteólisis
o como consecuencia de splicings alternativos. En un principio se asociaron a la
espermatogénesis, unión y fusión del esperma al huevo, sin embargo, más adelante fueron
implicadas en modulación de la migración y adhesión de las células tumorales, activación de
vías señalizadoras y liberación de citoquinas y factores de crecimiento unidos a membrana
(Duffy et al., 2011; Klein & Bischoff, 2011). Así, la complejidad de esta familia se
incrementó considerablemente con la identificación de la primera ADAMTS, ADAMTS-1
(Kuno et al.,1997). Un total de 19 ADAMTSs han sido funcionalmente identificadas en los
genomas humano y de ratón, ejerciendo funciones específicas en procesos tanto fisiológicos
como patológicos (figura 2) (van Goor et al., 2009; Klein & Bischoff, 2011; Kelwick et al.,
2015). Todas las adamalisinas presentan algunas características estructurales comunes. Así,
tanto ADAMs como ADAMTSs llevan en su secuencia polipeptídica una región de adhesión
9
y otra proteolítica (figura 1). Además, presentan un dominio proteasa, relacionado con la
capacidad que presentan estas moléculas para degradar componentes de MEX como colágeno
o fibronectina. En cuanto a funciones de adhesión, las adamalisinas presentan un dominio
desintegrina y otro rico en cisteínas para interacciones con proteoglicanos y componentes de
MEX (Lafleur et al., 2003). Sin embargo, las ADAMs son proteínas ancladas a la membrana
citoplasmática, mientras que las ADAMTS se secretan e interaccionan con la MEX (Lafleur
et al., 2003). Otro aspecto estructuralmente destacable es que las ADAMTSs además poseen
uno o varios dominios trombospondina-1 (TSP-1) relacionados con funciones de interacción
proteica, los cuales fueron descritos inicialmente en proteínas secretadas con funciones
antiangiogénicas (trombospondinas 1 y 2) (Vázquez et al., 1999). Las ADAMTSs disponen de
un dominio TSP-1 conservado en posición central, entre el dominio desintegrina y el dominio
rico en cisteínas, un número variable en el extremo carboxilo terminal con mayor variabilidad
(a excepción de la ADAMTS-4 que no presenta ningún TSP-1 en dicho extremo). Además,
tanto ADAMTS-7 como ADAMTS-12 presentan dos dominios espaciadores que separan dos
sets de repeticiones TSP-1. Finalmente, algunas ADAMTSs presentan otros dominios
específicos en la región carboxilo terminal como pueden ser el motivo proteasa y lacunina
(Plac), el motivo gon-1 (Gon), o motivo cubilina (Cub), exclusivo de ADAMTS-13 (figura 2)
(Barret, 2003; Kelwick et al.,2015). Es precisamente el extremo carboxilo terminal el que
aporta mayor variabilidad estructural a estos enzimas, afectando al modo de interacción con
sus sustratos y con el entorno celular. Esta región es además diana de frecuentes
modificaciones mediante proteólisis lo que podría provocar alteraciones en las propiedades de
estos enzimas (Cal et al., 2001; Liu et al., 2006a).
Figura 2. Familia de ADAMTS (A Disintegrin
And Metalloproteinase with ThromboSpondin
Motifts). La figura ilustra la organización básica de
las 19 ADAMTSs identificadas hasta el momento
en mamíferos y clasificadas según su función.
Imagen tomada de: (Kelwick et al. , 2015)
10
La MEX que rodea a las células de un tejido está formada por gran cantidad de
componentes que se clasifican en tres grupos: proteoglicanos y glicosaminoglicanos,
proteínas estructurales (colágeno y elastina), y proteínas de adhesión (fibronectina y
laminina). Tal variedad de componentes se encuentran interconectados y requieren de la
función de las proteasas, cuya misión es degradar las proteínas integrantes de dicha matriz o
activar factores de crecimiento, receptores de superficie y moléculas de adhesión (Laconi,
2007). La interacción de la célula con la matriz desencadena cascadas de señalización que
promueven la diferenciación, migración y movilización celular, esenciales para el
mantenimiento de la homeostasis tisular (Gillian & Nagase, 2008). Por lo tanto, las
ADAMTSs actúan como mediadores esenciales de procesos de remodelación de matriz y
señalización celular. Así, algunas ADAMTSs son capaces de procesar distintas formas de procolágenos eliminando sus propéptidos y participando en procesos de maduración de
componentes de matriz, como es el caso de las ADAMTS-2, -3 y -14, manteniendo la
homeostasis tisular. Otro caso es el de la ADAMTS-13, que actúa sobre el sustrato vWF o
factor de von Willebrand, proteoglicano implicado en la agregación plaquetaria,
contribuyendo a la adecuada homeostasis en la formación de trombos. Sin embargo,
mutaciones en el gen de ADAMTS-13 desencadena la pérdida de función de la misma
generando la patología vascular de la púrpura trombocitopénica trombótica (Levy et al., 2001;
Colige et al., 2002). Además de estas funciones, muchas ADAMTSs están también implicadas
en la aparición y progresión de tumores así como en procesos de angiogénesis y en el
desarrollo de metástasis a través de la acción de sus dominios TSP-1 entre otros (Liotta, 1986;
Liu et al., 2006b; El Hour et al., 2010). Alteraciones en la expresión de ADAMTSs en
tumores de distinto origen han llevado a asociar estas proteasas con cáncer. En el caso de la
ADAMTS-1, proteasa mejor caracterizada por sus efectos pro y antitumorales (figura 3), se
ha relacionado con la progresión tumoral facilitando procesos de invasión celular y metástasis
hacia nódulos linfáticos en carcinoma pancreático (Masui et al., 2001). También se encuentra
sobreexpresada en modelos de fibrosarcomas favoreciendo el crecimiento del tumor de
manera independiente a procesos de angiogénesis. Independientemente del efecto inhibitorio
mediado por el corte proteolítico del dominio TSP-1, se ha observado que la actividad
enzimática de ADAMTS-1 también es necesaria para incrementar el proceso de formación de
nuevos vasos a partir de otros ya preexistentes así como para promover metástasis pulmonar
en células de carcinoma de pulmón y de mama. También se ha estudiado que ADAMTS-1
puede facilitar la salida de las células tumorales del propio tumor y favorecer su migración
hacia otras zonas por su capacidad para degradar el versicano, proteoglicano presente en gran
11
variedad de tejidos humanos, con funciones de adhesión, migración y proliferación celular por
estar involucrado en respuestas estromales basadas en el agrupamiento de fibroblastos que
promueven el crecimiento de algunos tumores pulmonares (Rocks et al., 2008; Shiaw-Wei et
al., 2012). Además la actividad proteolítica de la proteasa ADAMTS-1 se ha visto
incrementada por su interacción con la fibulina-1, glicoproteína que puede interactuar con
distintos componentes de la MEX incluyendo sustratos propios de ADAMTS-1 como son
nidogen-1 y versicano (Lee et al., 2005). Estos estudios reflejan como la actividad catalítica
de ADAMTS-1 puede influir en una remodelación del microambiente tumoral facilitando la
migración de las células desde su lugar de origen en diferentes tipos de cáncer y, por lo tanto,
pueden promover la metástasis tumoral. Otras proteasas como las agrecanasas ADAMTS-4 y
-5 también pueden contribuir a incrementar el potencial invasivo de células tumorales de
glioblastomas mediante una degradación de brevicano, un proteoglicano altamente expresado
en un tipo de tumor cerebral (Held-Feindt, 2006).
Sin embargo, también se han asociado propiedades antitumorales a las ADAMTSs y
no relacionadas únicamente con dominios estructurales ya que numerosos genes ADAMTSs
se han encontrado mutados o silenciados epigenéticamente en determinados tumores (figura
3) (Moncada-Pazos et al., 2009; Cal & López-Otín, 2015).
Figura 3. Representación esquemática de los efectos antitumorales (a la izquierda) y protumorales (a la derecha) mediados
por las metaloproteasas ADAMTSs (Imágenes tomadas de Cal & López-Otín, 2015).
12
ADAMTS-12
La proteasa ADAMTS-12 fue identificada en 2001 en nuestro laboratorio, tras ser
clonada a partir de una genoteca de cDNA de pulmón fetal humano (Cal y col., 2001). Se
expresa en ovario, glándula mamaria, útero y pulmón de ratón, pero tiene baja expresión en
tejidos humanos (El Hour et al., 2010). Estructuralmente esta metaloproteasa es similar a otras
ADAMTSs, excepto por el hecho de que las repeticiones TSP-1 de su extremo carboxilo
terminal están separadas en dos regiones por un segundo espaciador (figura 4), estructura
compartida con ADAMTS-7(Liu, 2009).
Repetición TSP-1
Prodominio
Péptido señal
Desintegrina
Metaloproteasa
Rico en
Espaciador
cisteínas
Espaciador-2
Motivo
PLAC
Figura 4. Representación esquemática de la estructura de ADAMTS-12. El dominio trombospondina (TSP-1)
situado entre el dominio desintegrina y el rico en cisteínas es el más conservado en toda la familia, mientras que los
dominios terminales muestran una mayor variabilidad. PLAC, dominio proteasa-lacunina. (Imagen adaptada de Wei
et al., 2014).
En cuanto a sus funciones, ADAMTS-12 ha sido implicada tanto en procesos artríticos
por su actividad proteolítica sobre la proteína oligomérica de matriz de cartílago (COMP),
como en procesos inflamatorios. Así, mediante el uso de ratones deficientes en Adamts12 se
observa que la falta del enzima exacerba los síntomas en enfermedades inflamatorias tales
como colitis, pancreatitis o choque séptico. Los tejidos afectados presentan un aumento del
número de neutrófilos en los ratones deficientes en Adamts12, además de observar una
ralentización en la cicatrización de heridas de piel producidas sobre estos animales (Liu et al.,
2006a; Liu, 2009; Hodgkinson et al., 2010; Moncada-Pazos et al., 2012; Paulissen et al.,
2012).
Uno de los ensayos llevados a cabo para comprobar el papel de la metaloproteasa
ADAMTS-12 en el proceso tumoral fue emplear un modelo celular utilizando células MDCK
(Madin-Darby canine kidney). Son células no tumorales derivadas de riñón canino que
muestran un fenotipo mesenquimal tras ser tratadas con factores de crecimiento, como el HGF
(Hepatocyte Growth Factor). Al seleccionar los clones que producen elevadas cantidades de
13
ADAMTS12, dichas células son refractarias al cambio fenotípico. ADAMTS-12 inhibe la
fosforilación de Erk sobre modelos celulares que sobreexpresan esta metaloproteasa,
bloqueando efectos protumorales (Llamazares et al., 2007; Koch y col., 2011).
Posteriormente, mediante la utilización de animales deficientes en la proteasa ADAMTS-12
se comprobó que esta proteasa está implicada en inhibición de procesos angiogénicos (El
Hour et al., 2010). Otro de los efectos antitumorales ha sido inferido teniendo en cuenta que
muchos genes supresores tumorales se ven sometidos a fenómenos de silenciamiento a través
de hipermetilacion de sus promotores. El promotor de este gen presenta una isla CpG en la
región promotora, con alta frecuencia de hipermetilaciones, tal y como se observó mediante
técnicas de PCRs específicas de metilación y secuenciación de bisulfito (Moncada-Pazos et
al., 2009). Además, por técnicas de inmunofluorescencia pudo observarse que eran las células
estromales (fibroblastos activos) las responsables de la producción de esta proteína y no las
células del tumor propiamente dichas, experimentando las primeras, una inducción
transcripcional de la expresión de ADAMTS-12 ante la presencia de células malignas
(Moncada-Pazos et al., 2009) . Un tumor se debe interpretar como una entidad formada por la
agregación de varios componentes de matriz (estroma) y no sólo por la presencia de las
células tumorales. En este contexto, ADAMTS-12 ha sido relacionada con una respuesta
estromal basada en el control de la progresión tumoral, sugiriendo que esta metaloprotelasa
podría ser un marcador de buen pronóstico en carcinomas colorrectales (Moncada-Pazos et
al., 2009; Filou et al., 2015). La intervención de ADAMTS-12 in vivo tendría lugar bajo
ciertos estímulos propios del ambiente tumoral. De tal forma que primarían las señales
particulares como el TGF-β1 que estimularía la producción de la proteasa (Cal et al., 2001).
En los fibroblastos este evento provocaría su activación, diferenciándose a un tipo celular
distinto, típico de situaciones reactivas como cicatrización de heridas o tumorigénesis. Así
podría explicarse que la expresión de ADAMTS-12 en ratones silvestres se detecta
preferentemente en tejidos con remodelación constante (glándulas mamarias, útero, ovario o
nódulos linfáticos) en los que también están presentes los fibroblastos activos (El Hour et al.,
2010). Tal y como se ha ido comentando, hay un conjunto creciente de enzimas con
propiedades antitumorales, explicando por su presencia, el fracaso de numerosos ensayos
clínicos con inhibidores de amplio espectro, incapaces de distinguir entre acciones pro y
antitumorales causadas por enzimas proteolíticos, entre los que se encontrarían las ADAMTSs
(López-Otín & Matrisian, 2007).
14
Sin embargo, aunque existe un menor número de evidencias al respecto, ADAMTS-12
también desempeña acciones protumorales además de estar relacionada con una exacerbación
de la inflamación e hipersensibilidad en procesos asmáticos (Paulissen et al 2012; Fontanil et
al., 2014; Cal & López-Otín, 2015). Así, se ha comprobado que una mayor expresión de
ADAMTS-12 en células trofoblásticas humanas lleva a que dichas células adquieran mayor
fenotipo invasivo. Esto es debido a que ADAMTS-12 modula la invasión celular mediante la
regulación de la expresión y la función de la integrina αvβ3 (Beristain y col., 2011). Otro de
los factores que puede condicionar el papel pro- o anti-tumoral de ADAMTS-12 y de otras
metaloproteasas es la modulación de su actividad mediante la interacción con componentes de
la matriz extracelular. Se sabe que ADAMTS-12 es capaz de potenciar procesos de migración,
invasión celular y formación de tumores subcutáneos, en MCF-7, una línea de cáncer de
mama. Sin embargo, de forma similar a como ADAMTS-1 lo hace con la fibulina-1,
ADAMTS-12 interacciona con fibulina-2, lo que conduce a una reducción de la capacidad
protumoral de la proteasa en células de cáncer de mama. Además, una alta expresión conjunta
de ambas proteínas extracelulares se correlaciona con un mejor pronóstico en pacientes con
este tipo de patología (Fontanil et al., 2014).
15
OBJETIVOS
16
La metaloproteasa ADAMTS-12 ejerce sus funciones tanto en procesos fisiológicos
como patológicos, manteniendo la homeostasis de tejidos así como participando en diversas
patologías asociadas a procesos inflamatorios o a enfermedades como el cáncer. En el
presente trabajo, se plantea profundizar en el papel que la adamalisina ADAMTS-12
desempeña en cáncer, utilizando distintas líneas celulares tumorales que endógenamente
expresan ADAMTS-12. Además, el estudio de la susceptibilidad tumoral que presentan
ratones deficientes en esta proteasa, contribuirían a esclarecer los factores que potencian una
acción protumoral o favorecen una inhibición de crecimiento tumoral. En base a estos
precedentes, los objetivos concretos de este trabajo son:
1. Establecimiento y selección de clones derivados de las líneas de cáncer de
próstata RM1, cáncer de pulmón LLC y cáncer de colon MC38 con bajos niveles de
expresión de Adamts12 .
2. Estudio de cambios en el fenotipo de la líneas celulares indicadas mediante
ensayos in vitro.
3. Inicio de los estudios de susceptibilidad tumoral en el ratón deficiente en
Adamts12.
17
MATERIAL Y MÉTODOS
18
Líneas celulares
Para el presente trabajo se emplearon 3 líneas celulares, todas ellas isogénicas con la
cepa de ratones C57BL/6J; por un lado la línea celular RM1, derivada de carcinoma de
próstata y cedidas por el Dr. Timothy Thompson, MD Anderson Cancer Center-Universtity of
Texas; la línea celular LLC (Lewis Lung carcinoma cells, ATCC), derivada de cáncer de
pulmón y la línea celular MC38, cedida por Ignacio Melero (Centro de Investigación Médica
Aplicada CIMA, Navarra) derivada de carcinoma de colon.
Animales de experimentación
Los animales empleados en los ensayos in vivo fueron ratones deficientes en
Adamts12, knock out (KO), así como los wild type (WT). Fueron generados en una
colaboración de nuestro laboratorio con el que dirige la Dra. Agnes Noel (Universidad de
Lieja, Bélgica), por técnicas de recombinación homóloga en células pluripotenciales
embrionarias de ratón pertenecientes a la cepa C57BL/6J (El Hour et al., 2010).
Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)
Tras el crecimiento de las distintas líneas tumorales en placas de cultivo, se procedió
al lavado de las mismas con PBS y a su homogenización mediante la adición del volumen
adecuado de tampón de disociación (Tris-HCl 0,25M, SDS 8%, glicerol 35% y 2βmercaptoetanol 2,5% bromofenol, glicerol35%, pH 6,8). Las muestras se calentaron a 100ºC
durante 5 min asegurándose así de la completa desnaturalización de las mismas, antes de
proceder a la electroforesis en geles SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PoliAcrilamide Gel
Electrophoresis”). Para la electroforesis se empleó el tampón Tris-HCl 24,8mM; pH 8,8,
glicina 192 mM; SDS 0,1% y se aplicó un voltaje de entre 150-200V.
19
Análisis Western-blot
Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham
Biosciences) a 50 voltios en un soporte Miniprotean II (Bio-Rad Laboratories,) con un
tampón de transferencia (CAPS 10mM, NaOH 4mM, metanol 20%, pH 10,5) durante hora y
media. Una vez terminada la transferencia, se procedió al bloqueo de las membranas
incubándolas durante media hora con leche en polvo desnatada al 5% diluida en tampón
TBST-1X (pH 7,4; 20Mm Tris-NaCl; 150mM NaCl; 0,05% Tween-20). Posteriormente, se
incubaron las membranas con el correspondiente anticuerpo primario (anti ADAMTS-12 de
Lifetechnologies; anti-Fibulin-2 de SantaCruz Biotech) 16h en agitación y a 4oC. Los
anticuerpos primarios se prepararon en leche al 3% diluyéndolos con el tampón TBST-1X,
añadiendo 10µl de azida sódica al 0,2% para su conservación. Como anticuerpo secundario se
usó el anticuerpo Donkey Anti-Rabbit peroxidase (DARPO 2%). Para el revelado de la
membrana se empleó el sustrato Luminata TM Forte, (Western HRP Substrate) de Millipore
Corporation, Billerica, MA 01821 reveladas para su visualización mediante el aparato
LAS3000 mini (Fujifilm) o exposición autorradiográfica.
Cultivos celulares y transfecciones
Las líneas celulares RM1, LLC y MC38 se cultivaron en medio DMEM suplementado
con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina/glutamina, todos
ellos de Gibco, y fueron mantenidas en incubadores a 37ºC y 5% de CO2. Dichas líneas
celulares se transfectaron con los plásmidos que contenían los shRNAs de interferencia para
ADAMTS-12 (Origene) usando además como control el correspondiente vector vacío. El
procedimiento se llevó a cabo utilizando TransIT-X2 de Mirus, siguiendo las indicaciones del
fabricante.
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Ensayos de invasión
Para estudiar la capacidad de invasión in vitro, se utilizó el sistema BD BioCoatTM
MatrigelTM Invasion Chamber de BD Biosciences, que dispone de una placa BD Falcon ™
TC Companion con transwells con una membrana de Matrigel que contiene poros de 8 µm.
Primero se hidrataron las cámaras de invasión con medio DMEM completo (con suero y
antibióticos) durante 2 horas. Posteriormente, se eliminó el medio y se sembraron 8x10⁵ de las
tres líneas celulares resuspendidas cada una de ellas en 500 µl de medio sin suero en cada
transwell, por fuera de este se añadió medio suplementado con 10% de FBS (actuando de
quimioatrayente). Tras una incubación de 48 horas, las células que habían alcanzado la
superficie inferior de la cámara se tiñeron con cristal violeta. El número de células en cada
uno de los casos se contó a partir de 3 campos de observación al microscopio, escogidos
aleatoriamente, mediante fotografías tomadas con el programa LAS EZ 2.0 (Mycrosystems),
Leica.
Ensayo de migración mediante insertos en Micro-Dish de Ibidi
Para comparar la capacidad migratoria de las células RM1 así como de las células
tumorales LLC y MC38 con sus respectivas líneas con la interferencia de ADAMTS-12 se
empleó el sistema de insertos en Micro-Dish de Ibidi. En este ensayo, se enfrentó a cada línea
celular con su respectiva interferencia de ADAMTS-12 en los dos pocillos del soporte, para
ello se añadieron 1x10⁶ células de cada línea y condición, una vez adheridas a la base de la
placa se retiró el insert, dejando un espacio libre de células de 500 µm (figura 5). Después se
rellenó la placa con medio completo y se procedió a tomar fotografías cada 2h, observando las
diferencias que posteriormente fueron analizadas mediante el programa ImageJ.
Figura 5. Esquema de insertos en Micro-Dish de Ibidi. A la izquierda del insert se colocó cada línea celular control y a la
derecha del mismo, las correspondientes interferencias de cada tipo celular (TS12-shRNA) estudiando cómo influye la
reducción de la expresión de ADAMTS-12 en procesos de migración celular.
Imagen de Principle for Wound Healingand Migration Assays recuperado de:
http://ibidi.com/fileadmin/products/labware/open_removable/E_8XXXX_CultureInsert/E_8XXX_CultureInsert_image1.jpg
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Ensayos de formación de colonias
Se emplearon placas de 24-well, realizando triplicados de cada condición y tipo
celular. Para la mezcla de la capa base se combinaron DMEM, FBS y agua Milli-Q en las
proporciones 2:1:2. Se preparó también una solución de agar al 1,2% y ambas se dejaron
atemperar a 37ºC. Una vez atemperadas, ambas soluciones se mezclaron en volúmenes
idénticos mediante agitación suave. La mezcla resultante se empleó para rellenar los pocillos
y se dejó solidificar. A continuación se preparó una suspensión de cada línea celular en medio
de cultivo con una concentración de 4x10⁵ células/ml. Esta suspensión se mezcló con las
disoluciones del apartado anterior y la solución de Agar al 1.2% (en ambos casos atemperadas
a 37ºC) en las proporciones 1: 1: 1. A continuación se añadieron 500 µl de la mezcla en cada
pocillo de la placa de 24-well. El gel se dejó solidificar a 4ºC durante 15 min y después se
añadieron 100 µl de medio completo DMEM a cada pocillo. Por último se dejó en incubador
a 37ºC durante 7 días, pasado este tiempo se tomaron fotografías al microscopio para el
posterior recuento de las colonias.
Genotipado de ratones
La identificación genotípica de los ratones se llevó a cabo mediante PCR y
diferenciación de los alelos correspondientes mediante análisis en geles de agarosa de los
productos obtenidos, 330 pb para el alelo WT y 270 pb para el alelo KO tal y como se
describe en El Hour et al., 2010.
Generación de tumores subcutáneos
Cada línea celular tumoral fue inyectada en el flanco izquierdo de cada animal (se
usaron 5 animales Adamts12 (+/+) (TS12-WT) y otros cinco Adamts12 (-/-) (TS12-KO) para
cada línea celular. Se inyectaron 1x105 células para el caso de las LLC y RM1 y 1x106 para
las MC38. Para la generación de tumores subcutáneos se emplearon machos de la cepa
C57BL/6J de 4-6 semanas de edad. Todos los animales fueron mantenidos en el Bioterio de la
Universidad de Oviedo en condiciones SPF (libres de patógenos específicos) y en condiciones
ambientales estándares de temperatura (22±2ºC), humedad relativa (65±1%) y ciclo de luzoscuridad (12:12 horas). Todos los animales tuvieron acceso ad libitum a comida y bebida y
los experimentos realizados con los mismos se llevaron a cabo en el citado Bioterio de
acuerdo a la normativa Europea (86/609/EU) y a la regularización española (BOE 67/850922
12, 1988). Los protocolos experimentales fueron además aprobados por el Comité de Ética de
la Universidad de Oviedo. Los animales fueron anestesiados con isofluorano en el momento
de inyectar subcutáneamente las células. A lo largo del experimento se hizo un seguimiento
rutinario para evaluar la apariencia y el estado de salud de los animales. Asimismo, se midió
el tamaño de los tumores con un calibre, empleando como aproximación para el cálculo del
volumen del tumor la fórmula V=0’4xAxB2, donde A y B son, respectivamente, la mayor y la
menor de las medidas (Llamazares et al., 2007). El sacrificio de los animales se llevó al cabo
de 3 semanas mediante asfixia con CO2 o por dislocación cervical.
Tumorigénesis química mediante el empleo de uretano
Para llevar a cabo el estudio sobre carcinogénesis química se emplearon ratones de 7-8
semanas de edad, a los cuales se les inyectó intraperitonealmente una dosis de 1mg/g por peso
corporal de uretano (Sigma) preparando una disolución de uretano en 0,9% de NaCl
100mg/ml. La segunda dosis fue dada 48h después de la primera y el resto cada 7 días, hasta
un total de 8 dosis. Tras 28 semanas los animales fueron sacrificados y tras esto se les extrae
el pulmón y se procede al recuento de los nódulos tumorales. El pulmón izquierdo fue fijado
en 4% paraformaldehído durante 24h. Las muestras fueron procesadas en el Servicio de
Histopatología molecular en modelos animales de cáncer, del instituto del IUOPA con el fin
de proceder a la valoración histológica.
Análisis estadístico
Para la comparación de medias entre muestras con distribución normal se utilizó el test
t de Student, considerando estadísticamente significativo un p-valor < 0’05.
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