Los análisis de quimerismo se utilizan para determinar el

PROTOCOLO PARA EL ANALISIS Y LA INTERPRETACION DEL
QUIMERISMO EN EL TPH
1.
Tablas de resumen
Definiciones
Quimera completa (QC): 100% de celularidad de donante
Quimera mixta (QM): <95% de células de donante
Quimera splits (QS): células de R en un tipo celular y de D en otro
Muestras
Receptor: 5 ml en tubo EDTA de sp pre TPH
Donante adulto: 5 ml tubo EDTA
SCU: microvial, muestra cordón descongelado
Recomendaciones NMDP/IBMTR 2001
Técnica: sensibilidad < 1%: STR/VNTR/FISH
Muestra: S.P. es más útil que la MO
En TPH no mieloablativo: subpoblaciones celulares (LT) c/2-4
semanas hasta QC, o si modificación en IS, o ILD
En TPH mieloablativo estándar: 1, 3, 6, 12 meses en celularidad
total SP/MO. Tras alcanzar QC: suspender controles
Interpretación
Valoración del
injerto
< 20% células D: fallo de injerto
SCU día +14: <50-60% de células de D: fallo
de injerto
Inmunomodulación TPH no mieloablativo
QC LT día +30: alto riesgo EICH
QM LT + no EICH: ↓ IS / ILD hasta QC
QM progresiva: riesgo recaída
Seguimiento EMR Sólo demostrada utilidad para detección
precoz de recaída en patología mieloide
crónica
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2.
Definiciones:
Los análisis de quimerismo se utilizan para determinar el origen genotípico de la hematopoyesis
pos trasplante en el receptor. El término “quimera” designa a un organismo en el que coexisten
poblaciones celulares que derivan de individuos diferentes. En el caso de trasplante alogénico,
definiremos las siguientes situaciones pos trasplante:
1. Quimerismo completo (QC): 100% de las células detectadas son del donante
2. Quimerismo mixto (QM): se detectan al menos un 5% de células del receptor: y por tanto,
< 95% de células del donante. Dentro del quimerismo mixto podemos distinguir:
a. Quimerismo mixto transitorio: en los 6 primeros meses posTPH: es frecuente detectar
células del receptor en una proporción inferior al 10%, las cuales revierten en las
siguientes determinaciones a quimerismo completo.
b. Quimerismo mixto estable: persisten a lo largo del tiempo un proporción entre 1-20%
de células del receptor
c. Quimera mixta progresiva: las células del receptor aumentan > 10% en las siguientes
determinaciones.
3. Quimerismo “ split”: se detectan células del receptor en algún subtipo celular. Ej: 100%
de células mieloides del donante pero 100% de LT del receptor
3.
Indicaciones del estudio de quimerismo
La determinación del quimerismo postrasplante puede ofrecernos información relevante para:
1. Valoración del injerto pos trasplante: útil en cualquier tipo de TPH alogénico, como
confirmación del implante de las células del donante o para diagnóstico de fallo de injerto
2. Inmunomodulación: determinación de quimerismo en subpoblaciones de LT de SP en
trasplante no mieloablativo para ajustar inmunosupresión o valorar infusión de linfocitos de
donante( ILD)
3. Seguimiento de EMR y posible detección precoz de recaídas: especialmente útil en
enfermedades de crecimiento lento que no dispongan de otro marcador genético de
seguimiento.
4.
Muestras
Para poder realizar las determinaciones, es necesario enviar previo a trasplante;
1.- Muestra de SP del receptor ( R ):5 ml EDTA (otros tipos celulares del R, por ejemplo,
raspado de mucosa oral ofrecen un rendimiento muy bajo)
2.- Una muestra del donante (D):
a) Donante adulto: 5 ml EDTA de sp.
b) Cordón umbilical: un criovial o también puede utilizarse un segmento adyacente
al cordón o una mini-muestra del propio cordón descongelado. Cuando se realice
trasplante de doble unidad de cordón umbilical, deberá enviarse una muestra debidamente
identificada de cada uno de los cordones a trasplantar.
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Tras la realización del trasplante, a intervalos regulares de tiempo, se enviarán muestras del
receptor (SP/MO).
Si SP: 5-10 ml EDTA en función de las subpoblaciones a analizar
Si MO: 0.5-1 ml en tubo EDTA.
La frecuencia y el tipo de muestra y análisis solicitado dependerán de la enfermedad de base
(maligna o no maligna, neoplasia mieloide o linfoide, alta o baja agresividad), del tipo de
acondicionamiento (mieloablativo o no mieloablativo), del tiempo desde el trasplante y del
resultado de determinaciones anteriores.
5.
Métodos de detección del quimerismo
1. Análisis FISH para la detección de cromosomas X e Y en pacientes transplantados de
donante de distinto sexo: es una técnica sensible (1%) y permite la cuantificación. Se
realiza en MO/SP utilizando sondas fluorescentes que hibridan sobre los centrómeros de
los cromosomas X e Y.
2. Análisis de ADN: los métodos basados en PCR son los más sensibles (VNTR y STR), en
general su sensibilidad varía entre un 0.1% y un 5% dependiendo del alelo que está siendo
medido y el método de detección (radiactivo o fluorescente). Son métodos
semicuantitativos, aunque el grado de cuantificación alcanzado se incrementa al usar una
PCR multiplex. Se considera que la técnica gold-standar para estudio del quimerismo
es el análisis de STR con detección de fluorescencia.
En el laboratorio de la FPGMX se realiza análisis de FISH siempre que D y R sean de distinto
sexo y un método de PCR multiplex comercial: PowerPlex® 16 HS System que permite
coamplificar 16 loci: 15 SRTs y Amilogenina (marcador de cromosomas sexuales). La sensibilidad
teórica del método es del 1%, variando entre el 0.8% y el 6.2% dependiendo de la informatividad
de las muestras.
En cada análisis se amplifican simultáneamente la muestra pretransplante y postransplante del
receptor y la muestra donante. En los casos de seguimiento también se amplifica la muestra
postransplante previa, guardando la correspondencia médula ósea/médula ósea o sangre
periférica/sangre periférica. La fluorescencia del producto amplificado se detecta mediante
electroforesis capilar en un ABI 3730 (Applied Biosystems) y el porcentaje del origen celular se
realiza según el cálculo del área bajo la curva (Sufliarska S et al)
Disponemos de columnas inmunomagnéticas con Ac monoclonal antiCD3 para realización de
análisis de quimerismo en subpoblación de LT en SP. La quimera mieloide se analiza con
celularidad total de MO o si se requiere con separación de granulocitos por sedimentación en SP.
6.
Recomendaciones de NMDP y IBMTR ( Biol BMT 2001, 7: 473-485)
Utilizar técnicas de sensibilidad adecuada ( al menos < 1%): STR/VNTR/ FISH en trasplantes
de diferente género.
La sangre periférica, es de forma general, más útil que MO. El quimerismo de células totales
en MO documenta la quimera de células mieloides, pero se correlaciona pobremente con la
quimera de células T y de otros linajes.
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El análisis de quimerismo en subpoblaciones celulares debería ser de elección en el
trasplante con acondicionamiento no mieloablativo.
Los análisis de quimerismo en el trasplante mieloablativo no manipulado utilizando profilaxis
frente a EICH estándar no son imprescindibles y su realización puede ser opcional. Sería
suficiente obtenerlo a 1, 3, 6 y 12 meses. Una vez alcanzado el quimerismo completo, es
innecesario repetirlo, a no ser que haya un cambio en la clínica del paciente que lo
recomiende. Si se utiliza un régimen de profilaxis de EICH no estándar o manipulación del
injerto ( ej: depleción T), sí sería recomendable realizar estos estudios.
En los TPH no mieloablativos el patrón de quimerismo puede ser predictivo de EICH (
aumento de quimera de LT) o fallo de injerto ( pérdida de un 20% de quimera en LT). Cuando
se planificación la inmunomodulación con ILDs: se deben realizar análisis en sp c/ 2-4
semanas hasta la primera administración de ILDs:
a) Iniciar ILD si:
1) Disminuye la quimera de LT (pero al menos un 20% pertenece al donante),
2) Quimera mixta estable de > 2 semanas
3) Enfermedad persistente o progresiva.
b) Una vez iniciada la ILDs: realizar quimerismo en LT c/ 2-4 semanas
c) Si el paciente presenta EICH y no es candidato a ILDs o si presenta quimera completa:
realizar c/ 3-6 meses
Para anemia aplásica: se recomienda análisis de quimerismo a 1, 3, 6 y 12 meses en SP no
fraccionada
Para enfermedades no malignas distintas de anemia aplásica: 1, 2 y 3 meses pos TPH
Si la proporción de células del donante disminuye: aumentar la frecuencia de las
determinaciones: c/ 4 semanas
En algunas enfermedades puede ser necesario quimerismo en determinadas subpoblaciones
ej: en determinadas inmunodeficiencias, sorting para seleccionar población CD132 o CD127
(no disponibles actualmente en el laboratorio de la PMXPG)
6.- BASADOS EN ESTAS RECOMENDACIONES PROPONEMOS:
Tipo de muestra y subpoblación a estudiar:
1.- Celularidad total en SP o MO en trasplante mieloablativo
2.- LT en SP en trasplante no mieloablativo
2.- Neutrófilos en SP (o celularidad total en MO) en patología mieloide
Frecuencia de las determinaciones:
a) Trasplante de donante adulto con acondicionamiento mieloablativo: buscaremos la
valoración del injerto y el seguimiento de EMR
i. Determinación en población total de MO/SP a día +30, +100, +180, + 1 año.
Puede interrumpirse tras alcanzar QC
ii. Otras determinaciones en función de la situación clínica del paciente.
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b) Trasplante de donante adulto con acondicionamiento no mieloablativo: especial
atención a la inmunomodulación.
i. Determinación de subpoblación de LT en sp desde el día +30 c/ 2-4 semanas
hasta QC
ii. Determinaciones c/ 2 semanas en LT en SP si se están realizado disminución de
inmunosupresión o ILD
iii. Determinaciones en población total de MO día +30, +100 +180 y al año, sobre
todo si patología mieloide/mieloma para valorar EMR. Otra opción es realizar
análisis en subpoblación no linfoide en SP
c) Trasplante de cordón umbilical: especial atención a la valoración del injerto.
Determinación precoz a día+14 como factor que predice el fallo de injerto.
i. Determinación de quimerismo en LT de SP a día +14, +28 y c/ 2-4 semanas hasta
QC.
ii. Otras determinaciones en función de la situación clínica del paciente
7.- Interpretación de los resultados: aspectos prácticos
En trasplantes de cordón umbilical resulta de utilidad la realización de una determinación de
quimerismo en MO y/o LT de SP a día +14. Datos de algunos centros sugieren que un niveles
de bajos de hematopoyesis del cordón en el día +14 (¿ < 64%?) se correlacionan con fallo de
injerto. Esta información puede ser de utilidad para preparar un segundo trasplante.
En TPH con donante adulto, la existencia de < 20% de células del donante en cualquier
momento pos TPH se correlaciona con fracaso de injerto
El quimerismo completo en LT a día +30 en TPH no mieloablativo se correlaciona con alto
riesgo de EICH y la quimera mixta estable precoz en LT con bajo riesgo de EICH
En ausencia de EICH; debemos de tratar de convertir las quimeras mixtas en quimeras
completas para reducir el riesgo de recaída, especialmente en casos de quimeras mixtas
progresivas. Ello se logra disminuyendo la inmunosupresión y realizando infusiones
periódicas de ILDs
Debido a la sensibilidad de las diferentes técnicas, el quimerismo no puede ser considerado
de elección para seguimiento de EMR en las enfermedades que dispongan de otro marcador
(ej : BCR-ABL en LMC o LAL Ph+)
En enfermedades de crecimiento rápido la recaída clínica suele producirse muy pronto tras la
quimera mixta y no da oportunidad de maniobras terapéuticas
Existen pacientes con quimeras mixtas linfoides estables de larga duración, en los que no se
produce recaída clínica de su enfermedad y cuyo estado de quimerismo mixto les protege de
EICH severa.
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BIBLIOGRAFIA SELECCIONADA:
J H Antin et al. Establishment of complete and MIxed Donor Chimerism After Allogeneic
Lymphohematopoietic Transplantation: Recomendations Form a Workshop at the 2001
TAmdem Meetings. Biology of Blood and Marrow Transplant, 2001; 7: 473-485 (2001)
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Transfusion and apheresis science 2005; 32: 55-61
P. Bader et al. How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell
transplantation?. Bone marrow Transplant 2005; 35:107-119
F Khan et al. Significance of chimerism in hematopoietic stem cell transplantation: new
variations on an old theme. Bone marrow Transplant, 2004; 34, 1-12
JL Liesveld et al. Mixed chimerism in SCT: conflict or peaceful coexistence?. Bone
Marrow Transplant, 2008; 42, 297-310
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framework for routine analysis. Bone Marrow Transplant 2009 doi: 10.1038/bmt.2009.120
T Lion. Detection of impending graft rejection and relapse by lineage specific chimerism
analysis. Methods Mol Med 2007; 134: 197-216
Sufliarska S et al. Establishing the method of chimerism monitoring after allogeneic stem
cell transplantation using multiplex polymerase chain reaction amplification of short
tandem repeat markers and Amilogenin. Neoplasma 2007. 54,5: 424-430.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------Manual de diagnóstico genético y seguimiento de las neoplasias hematológicas.
Editado por el Grupo para el Estudio de las Hemopatías Malignas de Galicia (GEHMA) de la
Asociación Gallega de Hematología y Hemoterapia (AGHH)
Capítulo: Determinación de quimerismo en alotrasplante hematopoyético.
Autores: Carmen Albo y Sonia González. Complexo Hospitalario Xeral Cies- Vigo y H. Clínico
Universitario de Santiago (CHUS.)
Revisión por Teresa González y Celsa Quinteiro. Fundación Pública de Medicina Xenómica (FPMX)
de Galicia.
Actualizado a 28/02/10.
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