Tinción simple

2.8 Estudio microscópico
de los microorganismos.
http://es.dreamstime.com/imagenes-de-archivo-microscopio-y-bacterias-image29404744
Preparaciones
Microbiológicas
•Preparaciones en fresco (microorganismos vivos)
•Preparaciones fijas y teñidas (microorganismos muertos)
Frotis
Una capa delgada de muestra extendida sobre un
portaobjetos que permite el paso de la luz a través de ella.
•Impronta
•Frotis sanguíneo
•Gota de cultivo
líquido
•Cinta adhesiva
transparente
•Cultivo sólido
resuspendido
•Hisopo
Tinciones
•Positivas
•Negativas
Se observa teñida la célula
sobre un fondo claro.
El fondo se tiñe de oscuro
para observar células o
estructuras refringentes.
Frotis Sanguíneo
Cryptococcus neoformans
Tinciones
•Simples
Se utiliza un solo colorante
(básicos).
- Azul de metileno
- Safranina
- Cristal violeta
•Compuestas
Se utilizan dos ó más
colorantes. Pueden usar
mordentes y decolorantes
- Giemsa
- Wrigth
- May Grünwald
(Eosina-Azul de metileno)
Bacillus
megaterium. Tinción
simple con cristal
violeta.
Frotis sanguíneo con
Yersinia pestis.
Tinción de Wrigth.
Médula ósea.
Tinción de May
GrünwaldGiemsa.
Trypanosoma sp
en sangre.
Tinción de
Wrigth.
Tinciones
•Tinción negativa de
Cápsula
•Selectivas
Son utilizadas para dar
color y aislar partes
específicas de los
microorganismos
- Endosporas
- Flagelo
- Núcleo
Tinción
negativa de
cápsula.
Streptococcus
pneumoniae.
Tinción de
endosporas.
Bacillus subtilis.
Tinción de
flagelos.
Proteus sp
Tinciones
Tinción de
Ziehl-Neelsen.
•Diferenciales
Reaccionan de manera
diferente entre las distintas
clases de bacterias.
- Ziehl-Neelsen
Tinción de
Gram.
- Gram
Tinción de
Gram.
Colorantes
Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les
imparten color; están formados por un grupo cromóforo que es la
parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar
sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto
químico intensificador de color.
•Ácidos.
•Básicos.
El cromóforo es el anión de
la molécula.
El cromóforo es el catión
de la molécula.
Br
NaO
Br
O
Br
O
Cl -
N
Br
COO- Na +
Eosina
(CH3)2N
S
+
N(CH3)2
Azul de metileno
Técnicas de tinción
Frotis
•Tinción simple
Colorante básico
(1 minuto)
Enjuagar con agua
Bacillus anthracis
Tinción simple con
cristal violeta.
Neisseria
gonorrhoeae.
Tinción simple con
safranina.
Pseudomonas
aeruginosa.
Tinción simple
con safranina.
Staphylococcus
aureus.Tinción
simple con azul
de metileno.
Técnicas de tinción
•Tinción de cápsula
Streptococcus pneumoniae
Extendido
Muestra + tinta china o
nigrosina
Secar al aire
Acinetobacter calcoaceticus
Safranina de Gram o
Cristal Violeta (1 minuto)
Técnicas de tinción
•Tinción de endosporas
Verde de malaquita 5%
con emisiones de vapor
de agua (10 minutos)
Bacillus subtilis
Lavar con agua
Safranina 0.5% (1minuto)
Clostridium tetani
Técnicas de tinción
•Tinción de flagelo
Colorante primario. Pararosa anilina
Proteus vulgaris
Mordente. Acido
tánico
Colorante de
contraste. Azul de
metileno
Vibrio cholerae
Técnicas de tinción
•Tinción de Gram
Colorante primario. Cristal
violeta 1% en solución de
oxalato de amonio al 0.85%
(1 minuto)
Mordente. Lugol Iº/KI 1g/2g
en 300 mL de agua (1 minuto)
Streptococcus pyogenes
Decoloración. Alcohol-Acetona
70:30. Hasta eliminar el exceso
de colorante
Colorante de contraste.
Safranina 0.25% (1 minuto)
Bacilos Gram
negativos y levaduras
Técnicas de tinción
Bacilo
Ácido
Alcohol
Resistente
•Tinción de Ziehl-Neelsen
(BAAR)
Colorante primario. Fucsina
fenicada con emisiones de
vapor de agua (10 minutos)
Mycobacterium tuberculosis
Decoloración. Alcohol-Acido
(etanol-HCl) 97:3. Hasta eliminar
el exceso de colorante
Colorante de contraste.
Azul de metileno de Loeffler
(1 minuto)
Mycobacterium tuberculosis
Fijar
carbol- fucsina
calentar
Tinción
de
ZiehlNeelsen
Mantener humedo
Decolorar con ETOH-HCl
calentar
Contrastar con azul
de metileno
lavar con agua
Observar 1000X
Nocardia sp.
Bacterias filamentosas,
Acido-Alcohol-Resistentes
Microscopía
Microscopía
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Microscopía
Las
bacterias y
las células
de arqueas
tienen
aprox. 1–5
micrómetros
(µm) largo.
Comparación de tamaño entre varios átomos, moléculas y microorganismos. No está dibujado a escala. Tomado de
Alcamo´s Fundamentals of Microbiology.
Microscopía óptica y
electrónica
Tipos de microscopías
•Óptica de campo claro
•Contraste de fases
•Óptica de campo oscuro
•De contraste de interferencia
diferencial (DIC).
Tipos de microscopías
•Confocal
•Electrónica de barrido
•De fluorescencia
•Electrónica de transmisión
z
En la microscopía de fluorescencia, el
especímen es cubierto con un colorante
fluorescente y se ilumina con luz ultravioleta.
Microscopía de fluorescencia de células esporulantes de B. subtitlus
Courtesy of Dr. Peter Lewis; School of Environmental and Life
Sciences, University of Newcastle
|
La microscopía electrónica provee imágenes
detalladas de células, partes celulares, y virus.
z
z
Los electrones son absorbidos, reflejados o
transmitidos dependidendo de la densidad de
las estructuras en la muestra.
El límite de resolución es aprox. de 2nm.
Microscopía electrónica de
Transmisión (TEM)
z
Con la Microscopía Electrónica de Transmisión se
visualizan estructuras en cortes ultrafinos de
células.
Pseudomonas whole cells TEM
© CNRI/Photo Researchers, Inc.
z
La microscopía electrónica de barrido (scanning
electron microscope (SEM)) Se utiliza para visualizar
superficies de objetos no seccionados.
Pseudomonas whole cells SEM
© Dr. Dennis Kunkel/Visuals Unlimited
Confocal image of some dividing cells that are triple labeled for Golgi
apparatus (green), microtubules (red), and DNA (blue).
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http://www.microscopyu.com/staticgallery/featuredmicroscopist/deerinck/images/deerinckimage8larg
e.jpg
Microscopía
http://endospore.freeblog.hu/files/e
arly_microscope.jpg