Bacteriología Introducción

Bacteriología
Introducción
En esta práctica se trata de estudiar diversos microorganismos mediante técnicas de identificación en diversos
medios de cultivo, observando las diferencias en el comportamiento de los distintos microorganismos.
Dentro de las eubacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relación a la
estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos
sistemas de identificación, y basta con un microscopio óptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La
forma más sencilla de iniciar una identificación del microorganismo que se desea estudiar es realizar una
coloración o tinción de Gram. La tinción de Gram es una tinción diferencial porque no todas las células se
tiñen de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram
positivas y Gram negativas.
Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta después de
la coloración de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los
microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado. El tercer grupo
de eubacterias es el de los Bacilos Acido−Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados
utilizando la coloración de Ziehl−Neelsen. La diferencia en la coloración no se debe a reacciones químicas
con ciertos componentes de la pared sino a la estructura física de la misma.
Eubacterias Gram Positivas
Las eubacterias Gram positivas son células que contienen una membrana citoplasmática con fosfolípidos y
proteínas. Por fuera de la membrana citoplamática se encuentra la pared celular que está compuesta por una
ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un
dímero compuesto por N−acetilglucosamina y N−acetilmurámico. A su vez, estas cadenas se encuentran
unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan. Estos
puentes peptídicos son característicos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto más
completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la
célula, y evita que la célula estalle en medios hipotónicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el
exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula.
La pared celular Gram positiva también contienen ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos
son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodiésteres, y están unidos covalentemente al peptidoglicano
por medio de grupos fosfodiéster en el oxihidrilo del C6 del N−acetilmurámico. Los ácidos lipoteicoicos son
polímeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmática y no están unidos al
peptidoglicano. La función de estos compuestos sería estructural, pero existen evidencias que indican que
también participarían en la regulación de las enzimas hidrolíticas que renuevan la pared celular (autolisisnas)
y que serían sitios de fijación de fagos.
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Eubacterias Gram Negativas
Las eubacterias Gram negativas son células rodeadas por una membrana citoplasmática formada por una
bicapa fosfolipídica y proteínas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano
que se halla unida covalentemente a unas lipoproteínas de anclaje que fijan la membrana externa por
medio de porciones lipofílicas. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa queda delimitado el
espacio periplásmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotónica respecto al
citoplasma, isotonicidad que es mantenida mediante los oligosacáridos derivados de membrana (MDO), y
en la que se hallan componentes catalíticos de suma importancia para la viabilidad celular.
La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimétrica en donde la cara externa esta compuesta por el
lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolípidos. Además, esta membrana es rica en proteínas,
algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de
permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados
en el periplasma. El LPS está formado por tres regiones: el polisacárido O (Antígeno O), el polisacárido del
centro (KDO) y el lípido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la
célula una efectiva protección contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la
superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la célula evadir la fagocitosis, tener cierta
resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune específica por alteración de la superficie antigénica y
adherirse a ciertas células del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no específicos que
pueden ser atravesados por pequeñas moléculas hidrofílicas. En la membrana externa se encuentran otras
proteínas que funcionan como canales de difusión específicos y facilitan el paso de di, tri y oligosacáridos.
Eubacterias Acido−Alcohol Resistentes (BAAR)
Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular
completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de
lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen
adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram
positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl−Neelsen
(Tinción Acido−Rápida o Acid−Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y
ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración
ácido−alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una
bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido
peptidoglicano que contiene N−glucolilmurámico en lugar de N−acetilglucosamina. Por medio de una unión
fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa
y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos
que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos
de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos
micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón
porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se
encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es
un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el
equivalente mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante
respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal
del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están
recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a
través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son
utilizadas con fines diagnósticos (PPD).
El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente
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produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen
otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis,
mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son
consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae
que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares
como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios.
IDENTIFICACIÓN DE AEROBIOS:
Agar
MacConkey
Es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo
hacen.
+
La hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo.
Las colonias lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio tira a amarillo por la subida de pH que
origina la utilización de las proteínas (peptona) del medio
Se inoculan placas del medio y se incuban a 37 oC
Agar sangre
Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematies.
Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a
consecuencia de la lisis de los hematies.
Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba
Beta
galactosidasa
Esta enzima hidoliza la lactosa originando glucosa y galactosa
Se añade un sustrato artificial ortocitrofenial galactósido (ONPG) que hidrolizado por la ß−galatosidasa
originandose en color amarillo
Catalasa
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La catalasa es una enzima que proteje a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el
metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.
Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de
Bacillus (positiva)
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa
que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.
Citrato
Es uno de los test del IMVIC usado para diferenciar enterobacterias. el crecimiento consume el ácido y como
consecuencia se produce un incremento de pH en el medio y el indicador tira de verde a azul.
El citrato es la única fuente de carbono y se realiza sembrando la bacteria en la superficie de un agar de
Simmon's inclinando el tubo
Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus
patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos negativa
Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la
coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.
Contraste
de fases
El microscopio de contraste de fases es un sistema en el que se acentúa la diferencia del índice de refracción
entre las células y el medio incrementando así el contraste en células translúcidas sin uso de colorantes.
Descarboxilasa
de aminoácidos
Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el
indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de
enterobacterias.
Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador
de pH (púrpura de bromocresol)
DNasa
Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA
Se hace una estría gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que
precipita el DNA no hidrolizado.
Esporas
(calentamiento)
Las Endosporas son formadas por Bacillus y Clostridium. Son Formas de resistencia, metabolicamnete
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inactivas que resisten la alta temperatura, la desecación y la radiación.
Las endosporas pueden sobrevivir al calentamiento y originan nuevas formas vegetativas en un medio de
cultivo.
Se inocula un tubo de caldo con una suspensión sospechosa de contener endosporas.
Se calienta a 80 oC durante 10 min.
Se enfría y se incuba a temperatura adecuada.
Fenilalanina desaminasa
Las desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico
Se incolulan tubos inclinados conteniendo un medio complejo y fenilalanina. Después de la incubación se
añade una solución de cloruro férrico.
Fermentación
de azucares
Las bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y
gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham.
Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas.
Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona, un indicador de pH y una
fuente de carbono fermentable al 1−2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.
Gram
La tinción de Gram es la más importante de las tinciones diferenciales. Las células Gram positivas retienen el
cristal violeta cuando se tratan con etanol mientras que las gram negativas no lo tienen y se tiñen entonces del
color rojo de la safranina.
Diferencias en la estructura de la pared son las responsables de este comportamiento.
Se tiñe con cristal violeta
Se trata con lugol como mordiente
Se decolora con etanol 96o
Se añade safranina como colorante de contraste
Hidrólisis
de Esculina
La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este test se usa a menudo para
distinguir especies de Streptococcus.
Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato férrico.
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Hidrólisis
de gelatina
La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias
excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en
monómeros que les sirven para crecer.
La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio
sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteina no hidrolizada.
Hidrólisis
de lípidos
Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo
peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento.
Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo.
Hidrólisis
del almidon
Los polisacaridos, como el almidón son demasiados largos para ser transportados al interior de la célula. Los
microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligo o monosacáridos que pueden
usarse como sustratos para crecer.
La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se
inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.
Hidrólisis
del hipurato
El hipurato es un compuesto orgánico aromático que puede ser hidrolizado enzimáticamente originando
benzoato y glicina. Este test se usa a menudo para diferenciar especies de Streptococcus.
Una suspensión de bacterias se añade a una solución de hipurato y se incuba 2 horas. En ese momento se
añade la nihidrina.
Indol
Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias.
Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol
La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma). La presencia de indol se ensaya
añadiendo dimetilaminobenzaldehído.
Inhibición
por KCN
El KCN inhibe la cadena de transporte de electrones uniéndose a los citocromos impidiendo el crecimiento
microbiano. Sin embargo, algunas bacterias no son inactivadas y pueden nacer.
Las bacterias se inoculan en caldo de peptona que contiene cianuro potásico.
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Motilidad
La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en
preparación en fresco con el microscopio de contraste de fase
Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco que se observa en contraste de fases.
La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación.
O−F
(oxidación−fermentación)
En condiciones aerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2 gas. El oxígeno es el aceptor final
de e− en el metabolismo respiratorio. en condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e− como
nitrato, las bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se evalúa la capacidad de
las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido que se detecta gracias al azul de bromotinol
(indicador de pH) Es útil en la distinción de pseudomonas y enterobacterias.
Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para
aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación)
Oxidasa
La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e− puede detectarse utilizando un aceptor de
e− artificial p−fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias
(negativo)
Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar
nutritivo.
Producción
de sulfhídrico
Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno a partir de aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o
tiosulfato.
La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un
precipitado negro de FeS
Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.
Reducción
de nitrato
Algunas bacteris pueden usar nitratos como aceptor final de e− en la respiración. el nitrato puede ser reducido
a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Las enterobacterias y pseudomonas son usualmente
positivos.
Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de
células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciendose un color rojo. Se puede
saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciendose gas. Si al añadir zinc en polvo no
hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación)
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Rojo de
metilo
Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vias fermentativas originan ácidos orgánicos
mientras otras originan productos que son neutros.
Las bacterias se crecen en caldo de glucosaçpeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3.
Se añade rojo de metilo como indicar que es rojo a pH <4.3. y amarillo a pH >4.3.
Tioglicolato
Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio
semisólido contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la
superficie y no en el resto del tubo. Un indicador redox, resazurina, indica si hay oxígeno (rojo) o no
(incoloro).
El tubo es inoculado con un asa de punta y se incuba hasta que se produce su crecimiento.
Ureasa
Este enzima hidroliza la urea (H2N−CO−NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que
puede detectarse con un indicador.
Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa−peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza
rojo fenol
Utilización
Fuentes de Carbono
La mayoría, pero no todas las bacterias pueden crecer en medios simples con una única fuente de carbono.
Este método permite ensayar tal habilidad y la capacidad para utilizar sustratos específicos.
Las bacterias se inoculan en medios simples conteniendo diferentes sustratos orgánicos como fuentes de
cargono y energía.
Voges−
Proskauer
Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las especies que llevan a caso
fermentación a butanodiol de la glucosa acumulan acetoína en el medio.
Las bacterias se inoculan en caldo glucosa−peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación
butanodiólica de la glucosa aumentean acetoína en el medio.
Se añade alfanaftol en medio alcalino (KOH). La acetoina se convierte en diacetilo que reacciona formandose
un color rojo
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