ALK Break Apart - Cancer Genetics Italia

ALK Break Apart DNA-FISH Probe
Sonda de Translocación de Dos Colores
h21-002
VC
s wF
Instrucciones de uso
-20oC
Uso previsto
La sonda DNA-FISH de separación de ALK de Cancer Genetics Italia está
diseñada para detectar translocaciones que involucran al gen ALK en el
cromosoma 2p23 y uno de por lo menos 14 loci conocidos asociados con
la translocación, mediante hibridación in situ con fluorescencia (FISH).[1] La
translocación del gen ALK ocurre en ~50% de casos de linfoma anaplásicos
de células grandes (LACG) con una forma de t(2;5)(p23;q35), según lo determinado por citogenética convencional; en tales casos, la presencia del
t(2;5)(p23;q35) que lleva a un formulario de pronóstico en general, mejores para los pacientes con LACG.[2] La translocación ALK se ha observado en
tumores vesicales miofibroblástico inflamatorio (TMI) de la vejiga (>66%)
[3,4]
y sirve como un biomarcador de diagnóstico para el diagnóstico diferencial de las lesiones de las TMI sarcomatosos.[3] La translocación del gen
ALK se observa en aproximadamente el 5% -16% del casos de células no
pequeñas de cáncer de pulmón (CNPCP)[5] en la forma de inv(2)(p21p23),
según lo determinado por FISH,[5] y sirve como un biomarcador en la respuesta al tratamiento.[5,6] La presencia de la translocación de ALK en pacientes con CNPCP se correlaciona con una marcada sensibilidad a pemetrexed y crizotinib tratamiento.[7]
ALK
2p23
5’
telómero
~541kb
ALK
3’
centrómero
~556kb
2
Representación esquemática de la sonda DNA-FISH ALK Break Apart:
Las barras horizontales roja y verde indican las regiones que están cubiertas por las
sondas (aproximadamente a escala GRCh37/Hg19/2009). Las sondas 5’ ALK (roja)
y 3’ ALK (verde) directamente marcadas bordean los puntos de ruptura comunes
dentro del gen ALK.
Almacenamiento
Al recibir el producto, guardarlo a -20 °C protegido de la luz hasta la fecha de
caducidad.
Para almacenar el portaobjetos a largo plazo, se lo puede guardar a -20°C, protegido de la luz directa.
Nota: Las condiciones de almacenamiento se aplican tanto a los productos sin
abrir como a los productos abiertos. El número de ciclos de congelamiento-descongelamiento no debeŕa exceder el número recomendado de
pruebas por vial. El producto debe ser almacenado en el recipiente original.
Los viales que se guarden bajo otras condiciones podrían no funcionar de
manera óptima y por lo tanto afectar el resultado del ensayo.
Manipulación
»» Manipular todos los reactivos como capaces de transmitir agentes infecciosos. Desechar todos los materiales despúes de su uso de acuerdo con la ley
nacional vigente.
»» Manipular todos los reactivos y portaobjetos que contengan fluoŕoforos en
condiciones de luz ambiental reducida para evitar el fotoblanqueado.
Advertencias y precauciones
Lea las instrucciones antes de proceder.
»» El transporte o almacenamiento inadecuado puede destruir o afectar el funcionamiento del producto.
»» En caso de recibir un paquete o vial alterado, de que el dispositivo falle (cuando
se lo utilice de acuerdo con las instrucciones de uso) o de lesión al usuario, comuníquese con el fabricante.
»» Se debeŕa desechar cualquier vial alterado de acuerdo con la ley nacional vigente
y no realizar ensayos con el mismo.
»» Manipule todos los reactivos con cuidado y use equipo de protección personal
adecuado.
»» La formamida, el tampon citrato salino de sodio (SSC) y el dodecil sulfato de sodio (SDS) pueden tener efectos teratogénicos y mutagénicos: Evite la inhalació n,
la ingestion o el contacto con la piel.
»» La DAPI es un irritante. Para más información sobre seguridad, consulte la Material Safety Data Sheet (MSDS).
Reactivos suministrados
Sonda DNA-FISH lista para usar: 100 μl por vial (10 pruebas).
Sonda marcada con fluoróforo para el locus 5’ ALK (rojo) y sonda marcada
con fluoróforo para el locus 3’ ALK (verde), premezcladas con ADN de bloqueo y tampon de hibridación (formamida, sulfato de dextrán, SSC y SDS).
Reactivos y materiales necesarios pero no suministrados
Preparación de reactivo
Nota: Utilizar agua destilada para preparar todas las soluciones madre y de trabajo.
Series de diluciones de etanol (70%, 85% y 100%): Preparar diluciones v/v de
etanol 100% usando agua destilada. Guardar a TA.
HCl 0,01N (Ácido clorhídrico): Añadir 0,5 ml de HCl 1 N a 49,5 ml de agua
destilada. Guardar a TA.
Solución madre de pepsina 0.4% (4 mg/mL): Disolver 100 mg de pepsina en
25 ml de HCl 0,2N. Guardar alícuotas de 500 μl a -20 °C.
Formaldehído 1%: Añadir 12,5 mL de formalin 10% (formaldehido 4%) a 37
ml de PBS 1X. Añadir 500ml de MgCl2 box. Guardar a 4oC hasta una emana.
SSC 0,5X (Citrato salino de sodio)/Tween 20 0,1%: Añadir 25 ml de SSC 20X y
1 ml de Tween 20 a 974 ml de agua destilada. Mezclar bien con movimientos giratorios. Guardar a TA.
PBS 1X (Tampón fosfato salino): Mezclar 100 ml de PBS 10X con 900 ml de
agua destilada. Ajustar el pH a 7,4. Guardar a TA.
SSC 2X: Mezclar 100 ml de SSC 20X con 900 ml de agua destilada. Ajustar el pH
a 7,0. Guardar a temperatura ambiente (TA).
SSC 2X/Tween 20 0,1%: Añadir 100 ml de SSC 20X y 1 ml de Tween 20 a 899 ml
de agua destilada. Mezclar bien con movimientos giratorios. Guardar a TA.
100X MgCl2 (Cloruro de magnesio) en PBS 1X: Añadir 50 ml de MgCl2 y 450
ml de PBS 1X.
Materiales
Frasco de coplin
Cubreobjetos (22x22 mm y
25x25 mm)
Microscopio de constraste
de fase
Pinzas
Campana extractora
Guantes
Cámara húmeda
Aceite de inmersión
Incubadora
Lámpara de mercurio
(100 vatios)
Microcentrífuga
Tubo de microcentrífuga
(0,5 ml)
Micropipetas (1-200 ml)
Peachímetro
Pegamento de caucho
Portaobjetos positivos
recubiertos
Bandeja portaobjetos
Placa caliente
Termómetro calibrado
(37oC to 80oC)
Placa caliente
Baño de agua
CitrisolvTM es marca registada de Fisherbrand
Reactivos
Etanol 100%
PBS 10X
HCl 1N
MgCl2 1M
NaOH 1M
NaSCN 1M
SSC 20X
Formalina 10%
CitrisolvTM
DAPI y Antifade
Agua distilada
Pepsina
Tween 20
Procedimiento
pretratamineto opcional con pepsina).
Nota: Producto listo para usar. No reconstituir ni diluir. Sólo para uso profesional.
Pretratamiento de portaobjetos con pepsina (Opcional)
»» El ensayo únicamente puede ser realizado por un tecnólogo que esté fa- 1. Precalentar 50 ml de la solución de HCl 0,01N a 37°C.
miliarizado con los métodos citogenéticos y capacitado para realizar la 2. Añadir 25 μl de la solución madre de pepsina 0.4% a los 50 ml precalentatécnica FISH. Se deberá calibrar todo el equipo antes de realizar el ensayo.
dos de HCl 0,01N y incubar el portaobjetos durante 5-10 minutos a 37 °C
en la dilución de pepsina.
»» El tejido a usarse es sangre periférica y médula ósea. Preparar los portaobjetos de acuerdo con las recomendaciones para los mé todos citogenéticos
Nota sobre el procedimiento: Algunas muestras pueden requerir una digestión en
estándares del laboratorio que realiza el ensayo.
pepsina más prolongada.
3. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBS 1X a TA.
Preparación de portaobjetos
Todos los portaobjetos recientemente preparados se deberán dejar reposar 4. Incubar el portaobjetos durante 5 minutos en formaldehído 1% a TA.
1,5 horas a 45-50°C antes de la hibridación. Si no va a hacer la hibridación 5. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en PBS 1X a TA.
el mismo día en que se preparan los portaobjetos, guárdelos a 4°C o -20°C. 6. Deshidratar el portaobjetos en etanol 70%, 85% y 100% a TA, cada uno
Es posible que se necesite pretratar los portaobjetos que contengan células
durante 1 minuto.
con citoplasma visible con una enzima proteolitica tal como pepsina (ve al
(Continúa en la página siguiente)
Procedimiento
7. Secar el portaobjetos al aire.
Nota sobre el procedimiento: Controle la morfología de la muestra con un microscopio de contraste de fase antes de la hibridación. No hibridice si la morfología
nuclear está alterada.
Desnaturalización/hibridación de la sonda DNA-FISH
1. Mezclar brevemente la sonda DNA-FISH usando un vórtex y sedimentarla
en una microcentrifuga durante 30 segundos.
2. Aplicar 10 μl de sonda DNA-FISH al área seleccionada en el portaobjetos y
cubrir con un cubreobjetos (22 x 22 mm).
Nota sobre el procedimiento: Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas
de aire al aplicar la sonda. Se puede utilizar cubreobjetos más pequeños o más
grandes cambiando proporcionalmente el volumen de la sonda DNA-FISH.
3. Sellar muy bien los bordes del cubreobjetos con pegamento de caucho.
4. Desnaturalizar conjuntamente el portaobjetos y la sonda DNA-FISH durante 3 minutos a 80°C en una placa caliente de temperatura controlada.
5. Incubar durante 12-18 horas en una cámara húmeda a 37°C, protegido
de la luz directa.
Procedimiento para tejido FFPE
Nota: Producto listo para usar. No reconstituir ni diluir. Sólo para uso profesional.
»» La prueba únicamente puede ser realizada por un técnico que esté familiarizado con los métodos citogenéticos y capacitado para realizar la técnica
FISH. Se deberá calibrar todo el equipo antes de realizar el prueba.
»» El desao tejido a usarse es secciones de tejido FFPE de 4-5 μm de espesor. Preparar los portaobjetos de acuerdo con las recomendaciones para
los métodos citogenéticos estándares del laboratorio que realiza la prueba.
Preparación de portaobietos
Nota del procedimiento: Simultáneamente con la preparación de las secciones seriadas.
utilizadas para el análisis FISH, se deberá preparar una sección o secciones para la
tinción con hematoxilina y eosina (H-E).
1. Las secciones de 4-5 μm de espesor para el ensayo FISH se deberán montar sobre portaobjetos positivos recubiertos.
2. Incubar durante la noche (12-18 horas) a 55 °C antes de la hibridación, usa
dentro de 3 diás.
Pretratamiento del portaobjetos (a realizarse en una campana de extracción)
1. Desparafinizar el portaobjetos en tres cambios de CitriSolv™ a TA, 10
minutos cada uno.
Lavado posthibridación
Nota sobre el procedimiento: No permita que el portaobjetos se seque antes los lavados
están completos.
1.Precalentar las soluciones SSC 2X/Tween 20 0,1% y SSC 0.5X/Tween 20
0,1% a 45 °C.
2.Quitar el pegamento de caucho del portaobjetos usando pinzas.
3.Remojar brevemente el portaobjetos en SSC 2X a TA. Quitar el cubreobjetos.
4.Lavar el portaobjetos 2 veces, 5 minutos cada una, en SSC 2X/Tween 20
0,1% a 45 °C.
5.Lavar el portaobjetos 2 veces, 5 minutos cada una, en SSC 0.5X/Tween 20
0,1% a 45 °C.
6.Enjuagar brevemente el portaobjetos en agua destilada.
7.Secar el portaobjetos al aire, protegido de la luz directa.
8.Aplicar 20 μl de DAPI/Antifade al área hibridizada y cubrir con un cubreobjetos (25 x 25 mm).
11.Incubar el portaobjetos en formalina 10% en tampón neutro durante 15
minutos a TA.
12.Enjuagar el portaobjetos en dos cambios de SSC 2X durante 5 minutos
cada uno a TA.
13.Sumergir brevemente en agua destilada y secar al aire.
Desnaturalización/hibridación de la sonda DNA-FISH
1. Mezclar la DNA-FISH Probe con un vórtex 2 a 3 segundos y precipitar en
una microcentrífuga para concentrar los contenidos.
2. Aplicar 10 μl de sonda DNA-FISH al área seleccionada en el portaobjetos y
cubrir con un cubreobjetos (22 x 22 mm).
Nota del procedimiento: Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire
al aplicar la sonda. Se puede utilizar cubreobjetos más pequeños o más grandes
cambiando proporcionalmente el volumen de la sonda DNA-FISH. Regresar el
vial de la DNA-FISH Probe a -20 °C inmediatamente después de su uso.
3. Sellar muy bien los bordes del cubreobjetos con pegamento de caucho.
4. Desnaturalizar conjuntamente el portaobjetos y la DNA-FISH Probe durante 5 minutos a 90 °C en una placa caliente de temperatura controlada
en un dispositivo de hybridición automatizada.
5. Incubar durante 12-18 horas en una cámara húmeda a 37 °C, protegido
de la luz directa.
Nota del procedimiento: Los frascos de CitriSolv™ se pueden usar dos veces. Sin embargo, el tercer frasco deberá contener un reactivo que no se usó anteriormente. Lavado poshibridación
2. Deshidratar el portaobjetos en dos cambios de etanol 100% a TA, 5 minu- Nota del procedimiento: No permita que el portaobjetos se seque después de finalizar
tos cada uno. Secar al aire.
los lavados.
Nota del procedimiento: El portaobjetos puede mantenerse seco a TA durante varias 1. Quitar el pegamento de caucho del portaobjetos usando pinzas.
horas.
2. Remojar el portaobjetos en SSC 2X a TA y quitar el cubreobjetos.
3. Incubar el portaobjetos durante 20 minutos en HCl 0,2 N a TA.
3. Lavar el portaobjetos 2 veces, 5 minutos cada vez, en SSC 2X/Tween 20
0,1% a 45°C.
4. Enjuagar el portaobjetos en un cambio de agua destilada durante 1 minuto a TA y dos cambios de SSC 2X durante 5 minutos a TA.
4. Enjuagar el portaobjetos sumergiéndolo en agua destilada secar el portaobjetos al aire, protegido de la luz directa.
5. Incubar el portaobjetos en la solución de NaSCN 1M precalentada durante 10 minutos a 80°C.
5. Aplicar 20 μl de DAPI/Antifade al área hibridizada y cubrir con un cubreobjetos (25 x 25 mm).
Nota del procedimiento: Ciertos tipos de tejidos, tales como el de mama, requieren
un tiempo de incubación más largo (30-60 minutos).
6. Enjuagar el portaobjetos en un cambio de agua destilada y 2 cambios de
SSC 2X durante 5 minutos a TA.
7. Colocar el portaobjetos en una cámara húmeda o en un Thermobrite. Cubrir el área con pepsina 0.4% , mantener la humedad y las condiciones
de humedad en el portaobjetos durante la incubación. No permita que
la muestra se seque.
8. Incubar durante 10 minutos a 37 °C.
Nota del procedimiento: Dependiendo de las condiciones de la fijación y de la antigüedad de la sección, puede ser necesario ajustar este tiempo.
9. Enjuagar el portaobjetos en agua destilada durante 5 minuto a TA.
10.Enjuagar el portaobjetos en dos cambios de SSC 2X durante 5 minutos
cada uno a TA. Sumergir brevemente en agua destilada y secar al aire.
Nota del procedimiento: Dependiendo de la fijación, la antigüedad de la sección
y las condiciones del pretratamiento, se puede ver un fondo verde. Si el fondo
verde es excesivo o interfiere con el contado de señales, los portaobjetos se pueden volver a lavar en condiciones de mayor astringencia.
Antes de volver a lavar los portaobjetos, elimine el Antifade quitando el cubreobjeto y lavando en dos cambios de SSC 2X/Tween 20 0,1% a TA, 5 minutos cada
lavado con agitación; prosiga a volver a lavar inmediatamente y no permita que
el portaobjetos se seque.
La astringencia se puede aumentar con un paso de adicional de 2 lavados cada 5
minutos en SSC 0,5X/Tween 20 0,1% a 45 °C; la astringencia se puede aumentar
aún más incrementando el tiempo de lavado y/o la temperatura (hasta 65 °C).
Accessorios de microscopía
»» Filtros
»» Objetivos
Fluoróforo
Para explorar el área seleccionada es adecuado usar un objetivo 10X. Se requiere una magnificación mayor para analizar la señal y deberá realizarse con un
Verde
objetivo 63X o 100X de inmersión en aceite.
»» Aceite de inmersión
Rojo
El aceite de inmersion deberá ser adecuado para microscopía de fluorescenDAPI
cia.
»» Lámpara
Se recomienda usar una lámpara de mercurio de 100 vatios, con una vida
máxima de 200 horas. Reemplazar la lámpara antes de que exceda 200 horas.
Excitación max
Emisión max
496 nm
520 nm
580 nm
603 nm
360 nm
460 nm
(Continúa en la página siguiente)
Visualización e interpretación de la señal
Se deberá visualizar la señal con un microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros adecuados.
Nota del el procedimiento: Las señales pueden estar en distintos planos focales,
por eso es importante enfocar arriba y abajo en la muestra para asegurarsede
contar todas las señales.
»» En los núcleos diploides normales en metafase e interfase, la sonda DNAFISH ALK genera dos señales de fusión (roja/verde o amarilla) que corresponden a los dos cromosomas 2 normales.
»» En las células con redisposición cromosómica que involucran al gen ALK,
el patrón mas frecuentemente observado es una señal de fusión que reprensenta al cromosoma 2 normal y una señal roja y una verde que representan a los cromosomas derivados.
Glosario de símbolos
g
Código de lote
V
Dispositivo medico para diagnóstico
in vitro
FRiesgo biológico
w
Mantener fuera de la luz del sol
h
Número de catálogo
M
Fabricante
YPrecaución, consultar los documentos
adjuntos
s Límite de temperatura máxima
CMarca CE de conformidad
H Úsese para
XContenido suficiente para 10 pruebas
Recomendaciones y limitaciones
»» Este producto ha sido optimizado para usarse en portaobjetos preparados a partir de muestras de sangre periférica, médula ósea y FFPE tejido,
de acuerdo con los métodos citogenéticos de rutina. El fabricante asegura
que este producto cumple con las características de rendimiento analítico
(sensibilidad, especificidad, reproducibilidad e intervalo informable) establecidas en sangre periférica normal o el tejido en el que se intenta usarlo.
»» Con cada lote nuevo de la sonda DNA-FISH, se deberá probar la especificidad del locus en una muestra de sangre periférica normal y del tejido deseado para verificar el funcionamiento correcto del reactivo. El laboratorio
es responsable de establecer los intervalos informables con muestras de
control positivo y negativo del tejido deseado.
»» El uso de filtros con características de espectro distintas a las especificadas puede afectar adversamente la potencia de la señal. Por ejemplo, el
fluoróforo rojo es visible a través de un filtro Anaranjado, pero las señales
aparecen débiles.
»» Se recomienda usar el ensayo FISH en metafase para caracterizar variantes en los patrones de señales así como patrones de señales anormales.
»» Se considera que el ensayo FISH es suplementario a la citogenética clásica
(estudio del cariotipo). Los resultados de estos ensayos deben interpretarse teniendo en cuenta toda la historia clínica del paciente. No se puede
tomar una decisión médica exclusivamente sobre la base del resultado
del ensayo FISH.
M
Cancer Genetics Italia S.r.l.
Viale Luigi Majno, 17
20122 Milano - Italia
www.cancergeneticsitalia.com
[email protected]
Sonda DNA-FISH fabricada en EU por Cancer Genetics Italia S.r.l.
Bibliografía
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Huret, J. L., et al. www.AtlasGeneticsOncology.org.
Drexler, H. G., et al. Leukemia, 2000. 14(9):p.1533-59.
Freeman, A., et al. Mod Pathol, 2004. 17(7):p.765-71.
Sukov, W. R., et al. Mod Pathol, 2007. 20(5):p.592-603.
Kim, H. R., et al. Cancer, 2011 June 30.
Gerber, D. E., et al. Cancer Cell, 2010. 18(6):p.548-51.
Camidge, D. R., et al. J Thorac Oncol, 2011. 6(4):p.774-80.
© 2012 Cancer Genetics Italia S.r.l.
Version: 06.07.12