T. gondii - Universidad Nacional de San Martín

La infección crónica con Toxoplasma gondii induce células
capaces de suprimir una inflamación alérgica pulmonar
Fenoy Ignacio; Sánchez Vanesa; Soto Ariadna; March Florencia; Martín Valentina; Goldman Alejandra
1Centro
de Estudios en Salud y Medio Ambiente-ECyT, Universidad Nacional San Martín.
RESULTADOS
INTRODUCCIÓN
Supresión in vitro
El incremento en la incidencia de desórdenes atópicos observado durante
las ultimas décadas ha sido asociado a una disminución en la prevalencia
de ciertas infecciones.
proliferación T
supresión
*
35
25
30
20
25
15
Index
índice
Estudios epidemiológicos mostraron que la incidencia de alergias
respiratorias
es
menos
frecuente
en
personas
expuestas
a
microorganismos orofecales tales como Toxoplasma gondii (BMJ. 320:412
2000).
20
15
10
10
5
5
0
0
Normal
Toxo
Ov a
O+T
N
Toxo
O+T
Células provenientes de ganglios toráxicos fueron estimuladas in vitro con OVA. Luego de 5 días (OVA) de
cultivo se evaluó la proliferación celular por incorporación de 3[H]timidina. Células de ganglios torácicos de
ratones alérgicos fueron co-cultivadas con células de ganglio torácico provenientes de ratones normales,
infectados o infectados y sensibilizados y estimulados in vitro con OVA. *p<0,05 vs todos los grupos.
T. gondii es un parásito intracelular obligado del phylum apicomplexa. La
infección induce una fuerte inmunidad celular, caracterizada por una alta
respuesta polarizada de tipo Th1 en etapas tempranas de la infección (Clin
Microbiol Rev. 11:569 1998).
Supresión in vivo
Día 44-45-46
Desafío oral
OVA
Demostramos previamente que la infección crónica con Toxoplasma gondii
es capaz de proteger frente al desarrollo de una inflamación alérgica
pulmonar (Clinical and Experimental Immunology, 155:275-284, 2009).
Hipotetizamos que los niveles de IFN-γ secretados en respuesta a la
infección durante la etapa crónica, aunque más bajos que en la etapa
aguda, son suficientes para inhibir la diferenciación de precursores hacia
Th2 sin inducir un desvío hacia una respuesta celular Th1. De hecho no
observamos un aumento de IFN-γ en respuesta al alergeno.
Día 0
Inf. oral
T. gondii
Día 30
Día 48
Transferencia
Adoptiva
Día37
ip
OVA/ALUM
Día 53
Análisis
Día 35
Día 42 Día 49-50-51
ip
Desafío oral
OVA/ALUM
OVA
De todas formas, otros mecanismos podrían también estar involucrados. Se
ha demostrado que ciertas infecciones bloquearían el desarrollo de alergias
a través de la inducción de citoquinas regulatorias como IL-10 y TGF- , y la
expansión de células regulatorias CD4+Foxp3+. No hay muchos datos
bibliográficos acerca de las células regulatorias inducidas por la infección
con T.gondii (Microbes and Infection 13: 394, 2011; Journal of Biomedicine
and Biotechnology 1:1, 2010; J Exp Med 204:273, 2007)
El objetivo del presente trabajo fue analizar si células de ganglio
toráxico proveniente de animales infectados eran capaces de suprimir
in vivo el desarrollo de un fenotipo alérgico. Se evaluó además, en
ganglio toráxico, la población CD4+Foxp3+ y los niveles de citoquinas
regulatorias IL-10 y TGF- .
mucus
*
8
60
3
7
50
6
40
30
20
2
5
Indice
**
Indice
%eosinófilas
Previamente demostramos in vitro que células de ganglios toráxicos de
ratones crónicamente infectados y sensibilizados muestran una menor
proliferación frente a OVA. Esta disminución esta dada por la presencia de
células con capacidad supresora.
infiltrado
eosinofilia
4
3
1
2
10
1
0
0
N
T
0
N
OT
T
OT
N
T
OT
Los pulmones fueron lavados con PBS y fijados con formalina. Se realizó un conteo diferencial en las células
presentes en el lavado para obtener la eosinofilia. Los pulmones fijados se cortaron y tiñeron con PASHematoxilina. Células de ganglios torácicos fueron estimulados in vitro con OVA o ConA. MEDIA±ES.ANOVA
con Bonferroni a posteriori : *p<0,05 vs todos los grupos. ** p<0,05 vs N
Células regulatorias en ganglio toráxico
MATERIALES Y METODOS
Modelo de asma experimental
Se utilizaron ratones BALB/c hembras de dos meses de edad.
FOX+CD4+/CD4+
Día 48
Análisis
Día 30
Día37 Día 44-45-46
ip
Desafío oral
OVA/ALUM
OVA
Transferencia adoptiva
Células de ganglio toráxico (5x106) de ratones N, T y OT fueron inoculadas
iv en ratones BALB/c luego de haber sido sensibilizados
intraperitonealmente y previo al desafío por vía aérea con OVA.
%
5
0
N
TGF-
IL-10
700
*
0.2
*
600
500
400
300
0.1
200
100
0.0
0
Citometría
Células de ganglio toráxico (1x106) fueron marcadas con anticuerpo α-CD4
FITC. Luego se fijaron, permeabilizaron y marcaron con α-FOXP3 PE.
OT
Citoquinas regulatorias en ganglio toráxico
pg/ml
pulmones fueron instilados con formalina, removidos y fijados en la
misma solución. Los cortes para microscopía fueron teñidos con H&E y PAS.
La infección fue confirmada por medición de IgG especifica para T. gondii.
O
Células de ganglios torácicos de ratones alérgicos fueron marcadas con anticuerpos contra CD4 FITC
y FOXP3 PE. MEDIA±ES, ANOVA con Bonferroni a posteriori: **p<0,05 vs N
Histopatología pulmonar
Los animales fueron sacrificados y sangrados por punción cardíaca. Se
realizó un conteo diferencial a partir de lavados broncoalveolares (BAL) (Tincion 15
(BiopurSA), versión modificada de Wright-Giemsa). Luego del lavado, los
T
CD4+
OD
Medición de citoquinas
Células de ganglio torácico (3x105) fueron cultivadas y estimuladas in vitro
con OVA. Luego de 72 hs se midió, en el sobrenadante, la concentración de
IL-10 y TGF- por ensayos de ELISA tipo sandwich.
**
**
10
FOXP3
Día 0
Inf. oral
T. gondii
15
N
T
O
OT
N
T
O
OT
Se midió la concentración de IL-10 y TGF-por ELISA en sobrenadante de células
provenientes de ganglio toráxico estimuladas in vitro con OVA . MEDIA±ES, ANOVA con
Bonferroni a posteriori. *p<0,05 vs todos los grupos
Resultados similares se obtuvieron cuando los ratones fueron sensibilizados en la etapa aguda de la infección
CONCLUSIONES:
• Las células provenientes de ganglio toráxico son capaces de disminuir la eosinofilia y el infiltrado peribronquial incluso en animales
previamente sensibilizados.
• La infección crónica con T. gondii muestra un aumento significativo en la población regulatoria CD4+FOXP3+
• El aumento de TGF-β en células de ganglio toráxico provenientes de animales infectados y sencibilizados correlaciona con la supresión
observada
• La IL-10 producida por células de ganglio toráxico se comporta como una citoquina Th2
• Estos datos sugerirían que el TGF- y/o la población de células CD4+Foxp3+ estarían involucrados en la supresión ejercida por las
células de GT de ratones infectados y sensibilizados.