pdf Estudio de las rizobacterias de Vicia Villosa Roth: optimización

Universidad San Pablo-CEU
Estudio de las rizobacterias de Vicia
Villosa Roth: optimización de la
productividad por técnicas biológicas
Nuria Acero de Mesa
Tesis de Doctorado
Facultad:
Ciencias Experimentales y Técnicas
Director:
Dr. Fco. Javier Gutiérrez Mañero
1997
ÍNDICE
ÍNDICE DE MATERIAS
pg.
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................ 1
1.1. El ciclo del nitrógeno....................................................................................................... 2
1.1.1. Fijación biológica de nitrógeno (FBN)...............................................................
5
1.1.1.1. Fijación libre de nitrógeno (FLN).............................................................................. 6
1.1.1.1.a. Factores que afectan a la fijación libre de nitrógeno y microorganismos implicados
en el proceso......................................................................................................... ...... 7
1.1.1.2. Fijación simbiótica del nitrógeno (FSN)................................................................ 9
1.1.1.2.a. Factores que afectan a la fijación simbiótica de nitrógeno y microorganismos
implicados en el proceso..................................................................................... 12
1.1.2. Amonificación.......................................................................................................... 16
1.1.2.a. Factores que afectan a la amonificación y microorganismos implicados
en el proceso............................................................................................................... 17
1.1.3. Nitrificación.................................................................................................................. 22
1.1.3.a. Factores que afectan a la nitrificación y microorganismos implicados
en el proceso............................................................................................................... 23
1.1.4. Desnitrificación..................................................................................................... ...... 26
1.1.4.a. Factores que afectan a la desnitrificación y microorganismos implicados
en el proceso............................................................................................................... 27
1.2. Interacciones del sistema suelo-planta............................................................................ 31
1.2.1. Efecto de la planta sobre las comunidades microbianas edáficas................................ 31
1.2.2. Efecto del sustrato y de las comunidades microbianas edáficas sobre la planta.......... 38
1.3. Vicia villosa Roth............................................................................................................ 44
1.3.1. Características nutritivas de V. villosa......................................................................... 45
1.3.2. Usos de V. villosa......................................................................................................... 47
1.4. Plan de trabajo y objetivos.............................................................................................. 51
1.4.a. Dirección suelo-planta................................................................................................. 52
1.4.b. Dirección planta-suelo................................................................................................. 53
2. MATERIALES Y MÉTODOS EMPLEADOS EN EL ANÁLISIS DE LA
RIZOSFERA DE V. villosa.................................................................................... 54
2.1. Zonas de muestreo......................................................................................................... 55
I
2.2. Recogida y preparación de las muestras rizosféricas.................................................... 56
2.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos........................................................ 57
2.3.1. Capacidad de retención máxima (CRM).................................................................... 57
2.3.2. Textura de los suelos.................................................................................................. 58
2.3.3. Medida de pH............................................................................................................. 58
2.3.4. Determinación del nitrógeno total.............................................................................. 58
2.3.5. Determinación del nitrógeno amonio......................................................................... 59
2.3.6. Determinación del nitrógeno nitrato.......................................................................... 59
2.3.7. Determinación del carbono orgánico......................................................................... 60
2.3.8. Tratamiento de la información de los resultados de los análisis fisicoquímicos de los
suelos rizosféricos............................................................................................................... 60
2.4. Determinación de la actividad reductora de acetileno (ARA) de los nódulos.............. 60
2.5. Análisis microbiológico de los suelos rizosféricos....................................................... 61
2.5.1. Toma de muestras y determinación taxonómica....................................................... 61
2.5.2. Tratamiento de la información de los resultados de la determinación taxonómica.. 62
2.5.3. Análisis de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno........................................ 64
2.5.3.a. Diazotrofos aerobios................................................................................................ 64
2.5.3.b. Diazotrofos anaerobios............................................................................................ 64
2.5.3.c. Amonificantes.......................................................................................................... 65
2.5.3.d. Desnitrificantes........................................................................................................ 65
2.5.4. Tratamiento de la información de los resultados de los análisis de los grupos
funcionales del ciclo del nitrógeno....................................................................................... 65
2.5.5. Análisis del ADN bacteriano...................................................................................... 65
2.5.5.a. Aislamiento del ADN.............................................................................................. 66
2.5.5.b. Amplificación del ADN mediante PCR-RAPDs..................................................... 66
2.5.5.c. Análisis electroforético de los fragmentos de ADN obtenidos mediante
amplificación............................................................................................................. 67
2.5.5.d. Análisis de geles....................................................................................................... 67
2.6. Efectos de las rizobacterias mayoritarias sobre la germinación y crecimiento de V. villosa.
Descripción general del procedimiento...................................................................... 68
2.6.1. Selección de las cepas rizobacterianas ensayadas........................................................ 68
2.6.2. Preparación del medio de cultivo bacteriano................................................................ 69
2.6.3. Ensayos de germinación.............................................................................................. 69
II
2.6.4. Tratamiento de la información de los resultados de los ensayos de germinación........ 70
2.6.5. Ensayos de crecimiento............................................................................................... 71
2.6.6. Análisis biométricos de las plantas.............................................................................. 72
2.6.7. Medidas de nitrógeno total de las plantas.................................................................... 73
2.6.8. Tratamiento de la información de los resultados de los ensayos de crecimiento......... 73
3. MATERIALES Y MÉTODOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO DE LA DINÁMICA
DEL CICLO DEL NITRÓGENO BAJO V. villosa.............................................. 74
3.1. Experiencias realizadas en condiciones controladas de laboratorio................................ 75
3.1.1. Recogida y caracterización del suelo empleado en las experiencias de laboratorio..... 75
3.1.2. Cultivo de las variedades estudiadas y toma de muestras............................................ 75
3.1.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos...................................................... 76
3.1.3.a. Determinación de la capacidad de intercambio catiónico (CIC).............................. 77
3.1.3.b. Determinación de cationes de cambio: calcio, magnesio y potasio.......................... 77
3.1.3.c. Determinación del fósforo lábil del suelo................................................................. 78
3.1.4. Determinación del ARA de los nódulos...................................................................... 78
3.1.5. Análisis de la actividad potencial de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno.. 78
3.1.5.a. Determinación del ARA potencial en los suelos....................................................... 78
3.1.5.b. Determinación del potencial amonificante................................................................ 79
3.1.5.c. Determinación del potencial nitrificante................................................................... 79
3.1.5.d. Determinación del potencial desnitrificante.............................................................. 81
3.1.5.e. Determinación de la producción de CO2 (respiración potencial).............................. 80
3.1.6. Análisis biométricos de las plantas.............................................................................. 80
3.1.7. Análisis químicos de las plantas.................................................................................. 81
3.1.8. Tratamiento de la información..................................................................................... 81
3.2. Estudios de campo previos sobre la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del
nitrógeno realizados en las parcelas de Toledo.......................................................... 82
3.2.1. Descripción de la zona................................................................................................. 82
3.2.2. Siembra de las semillas de V. villosa y recogida de muestras de suelo....................... 83
3.2.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos........................................................................... 84
3.2.4. Análisis de la actividad potencial de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno.. 84
3.2.5. Actividad desnitrificante, ARA y producción de CO2 en condiciones de campo........ 84
3.2.6. Determinación del ARA de los nódulos....................................................................... 84
3.2. 7. Tratamiento de la información.................................................................................... 84
III
3.3. Estudios de campo realizados en las parcelas de experimentación de Montepríncipe sobre
la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del nitrógeno............................ 85
3.3.1. Descripción de las parcelas de experimentación para estudios de campo.................. 85
3.3.2. Siembra de las semillas de V. villosa y recogida de muestras.................................... 86
3.3.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos......................................................................... 86
3.3.4. Análisis de la actividad potencial de la actividad de los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno................................................................................................................... 87
3.3.5. Determinación del ARA de los nódulos..................................................................... 87
3.3.6. Análisis biométricos de las plantas............................................................................. 87
3.3.7. Análisis químicos de las plantas................................................................................. 87
3.3.7.a. Determinación del nitrógeno total........................................................................... 87
3.3.7.b. Determinación de fibra ácido detergente (FAD)..................................................... 88
3.3.7.c. Determinación de fibra neutro detergente (FND).................................................... 88
3.3.7.d. Determinación de azúcares...................................................................................... 88
3.3.7.e. Determinación de alcaloides.................................................................................... 89
3.3.8. Tratamiento de la información................................................................................... 90
4. RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE LA RIZOSFERA DE V. villosa..................... 91
4.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos............................. 92
4.2. Géneros bacterianos encontrados y frecuencia de los mismos...................................... 93
4.3. Actividades del ciclo del nitrógeno llevadas a cabo por las rizobacterias de V. villosa. 96
4.4. Análisis de la divergencia genética de los géneros mayoritarios.................................... 98
4.4.1. Establecimiento de grupos y selección de bacterias.................................................... 115
4.5. Efecto de las rizobacterias mayoritarias sobre la germinación de V. villosa.................. 118
4.6. Efectos de las rizobacterias mayoritarias sobre el crecimiento de V. villosa................. 122
5. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA DINÁMICA DEL CICLO DEL
NITRÓGENO BAJO V. villosa.............................................................................. 141
5.1. Resultados obtenidos en las experiencias realizadas en condiciones controladas de
laboratorio................................................................................................................. 142
5.1.1. Elección de las dos variedades estudiadas.................................................................. 142
5.1.2. Caracterización de los suelos empleados.................................................................... 144
5.1.2.a. Características fisicoquímicas.................................................................................. 144
5.1.2.b. Actividades potenciales de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y
producción
de CO2........................................................................................................... 145
IV
5.1.3. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre parámetros fisicoquímicos edáficos
durante el ciclo fenológico de las plantas............................................................. 145
5.1.3.a. Nitrógeno amonio................................................................................................ 145
5.1.3.b. Nitrógeno nitrato................................................................................................. 147
5.1.3.c. Nitrógeno total.................................................................................................... 148
5.1.3.d. Carbono orgánico................................................................................................ 149
5.1.3.e. pH........................................................................................................................ 150
5.1.3.f. Capacidad de intercambio catiónico (CIC).......................................................... 151
5.1.3.g. Fósforo................................................................................................................. 153
5.1.4. Análisis de componentes principales realizado con los datos fisicoquímicos analizados
durante el experimento........................................................................................... 154
5.1.5. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno y producción de CO2 a nivel edáfico...................................................... 156
5.1.5.a. ARA potencial....................................................................................................... 156
5.1.5.b. Amonificación potencial....................................................................................... 157
5.1.5.c. Nitrificación potencial........................................................................................... 158
5.1.5.d. Desnitrificación potencial..................................................................................... 160
5.1.5.e. Producción de CO2............................................................................................... 161
5.1.6. Análisis de componentes principales realizado con los datos de actividad potencial de
los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2.................... 162
5.1.7. Resultados de los análisis biométricos, nitrógeno total y ARA de los nódulos en las dos
variedades de V. villosa......................................................................................... 163
5.1.7.a. Medidas biométricas............................................................................................. 163
5.1.7.b. Nitrógeno total de la parte aérea y ARA nodular.................................................. 165
5.1.8. Análisis de componentes principales realizado con los datos biométricos obtenidos a lo
largo del experimento............................................................................................. 166
5.2. Resultados de los estudios de campo previos sobre la influencia de V. villosa en la
dinámica del ciclo del nitrógeno............................................................................ 168
5.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos.......................................... 168
5.2.2. Resultados de las actividades del ciclo del nitrógeno en condiciones potenciales y de
campo.................................................................................................................... 169
5.3. Resultados de los estudios de campo realizados en las parcelas de experimentación de
Montepríncipe sobre la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del
V
nitrógeno............................................................................................................... 172
5.3.1. Caracterización de los suelos empleados................................................................ 172
5.3.1.a. Características fisicoquímicas.............................................................................. 172
5.3.1.b. Actividades potenciales de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y
producción
de CO2........................................................................................................ 172
5.3.2. Efectos de las dos variedades de V. villosa sobre los parámetros fisicoquímicos
edáficos
durante el ciclo fenológico de las plantas.................................................. 173
5.3.2.a. Nitrógeno amonio................................................................................................. 173
5.3.2.b. Nitrógeno nitrato.................................................................................................. 174
5.3.2.c. Nitrógeno total..................................................................................................... 175
5.3.2.d. Carbono orgánico................................................................................................. 176
5.3.2.e. pH......................................................................................................................... 177
5.3.2.f. Capacidad de intercambio catiónico (CIC)........................................................... 178
5.3.2.g. Potasio.................................................................................................................. 179
5.3.2.h. Calcio................................................................................................................... 180
5.3.2.i. Magnesio............................................................................................................... 181
5.3.2.j. Fósforo.................................................................................................................. 182
5.3.3. Análisis de componentes principales realizado con las variables fisicoquímicas
analizadas durante el experimento........................................................................ 183
5.3.4. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno y producción de CO2 a nivel edáfico..................................................... 186
5.3.4.a. ARA potencial...................................................................................................... 186
5.3.4.b. Amonificación potencial...................................................................................... 187
5.3.4.c. Nitrificación potencial.......................................................................................... 188
5.3.4.d. Potencial desnitrificante........................................................................................ 189
5.3.4.e. Producción potencial de CO2................................................................................ 189
5.3.5. Análisis de componentes principales realizado con los datos de actividad potencial de
los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2..................... 190
5.3.6. Resultados de las medidas biométricas y bioquímicas de las dos variedades de
V. villosa.................................................................................................................. 192
5.3.7. Resultados de los análisis bioquímicos efectuados a los frutos de las dos variedades de
V. villosa.................................................................................................................. 200
6. DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS DE LA RIZOSFERA DE V. villosa.......................... 202
VI
7. DISCUSIÓN DEL ESTUDIO DE LA DINÁMICA DEL CICLO DEL NITRÓGENO
BAJO V. villosa.................................................................................................... 221
8. CONCLUSIONES....................................................................................................... 243
9. BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................... 247
10. APÉNDICES.............................................................................................................. 294
APÉNDICE A....................................................................................................... 295
APÉNDICE 1........................................................................................................ 299
APÉNDICE 2........................................................................................................ 306
APÉNDICE 3........................................................................................................ 308
VII
ÍNDICE DE FIGURAS y TABLAS
ÍNDICE DE FIGURAS
pg.
Fig. 1.1. Representación esquemática del ciclo del nitrógeno.............................................. 4
Fig. 2.1. Diagrama climático de la estación de Cuatro Vientos............................................ 55
Fig. 2.2. Diagrama climático de la estación de Brunete....................................................... 55
Fig. 2.3. Localización de la Urb. Raya del Palancar y Urb. Montepríncipe.......................... 55
Fig. 2.4. Esquema del protocolo para la obtención y preparación de las muestras
rizosféricas............................................................................................................... 57
Fig. 2.5. Esquema diagnóstico de Acero et al. (1994)......................................................... 63
Fig. 2.6. Esquema del protocolo seguido en los ensayos de crecimiento............................. 71
Fig. 3.1. Esquema del protocolo seguido para la obtención de muestras de suelo y plantas. 76
Fig. 3.2. Localización de la finca “Retamar de Arriba”....................................................... 82
Fig. 3.3. Datos de temperatura y pluviosidad de 1994 de la estación de Mora de Toledo.... 83
Fig. 3.4. Datos de temperatura y pluviosidad de 1995 y 1996 de la estación de
Cuatro Vientos........................................................................................................... 85
Fig. 4.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos....................... 92
Fig. 4.2. Porcentajes totales de los géneros bacterianos encontrados en la rizosfera de V.
villosa.................................................................................................................... 94
Fig. 4.3. Frecuencia de los géneros bacterianos más abundantes encontrados en la rizosfera de
V. villosa en cada momento de muestreo................................................................ 95
Fig. 4.4. Frecuencia de los géneros bacterianos menos abundantes encontrados en la rizosfera
de V. villosa en cada momento de muestreo........................................................... 96
Fig. 4.5. Porcentaje de bacterias en cada momento de muestreo que pertenece a cada grupo
funcional del ciclo del nitrógeno............................................................................. 97
Fig. 4.6. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 10............................. 99
Fig. 4.7. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el
“primer” 10............................................................................................................ 100
Fig. 4.8. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 12............................. 101
Fig. 4.9. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el
VIII
“primer” 12............................................................................................................ 102
Fig. 4.10. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 15............................. 103
Fig. 4.11. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el
“primer” 15............................................................................................................ 100
Fig. 4.12. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 20............................. 105
Fig. 4.13. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el
“primer” 20............................................................................................................ 106
Fig. 4.14. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 4............................... 107
Fig. 4.15. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el
“primer” 4.............................................................................................................. 108
Fig. 4.16. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 11............................. 109
Fig. 4.17. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el
“primer” 11............................................................................................................ 110
Fig. 4.18. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 17............................. 111
Fig. 4.19. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el
“primer” 17............................................................................................................ 112
Fig. 4.20. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas
mediante electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 18............................. 113
Fig. 4.21. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el
“primer” 18............................................................................................................ 114
Fig. 4.22. Divergencia genética obtenida con la información de los cuatro “primers” entre las
cepas del género Bacillus....................................................................................... 116
Fig. 4.23. Divergencia genética obtenida con la información de los cuatro “primers” entre las
cepas del género Pseudomonas.............................................................................. 117
Fig. 4.24. Representación del ACP de los resultados de germinación de las semillas de
Namoi.................................................................................................................... 121
Fig. 4.25. Representación del ACP de los resultados de germinación de las semillas de
Látigo.................................................................................................................... 122
IX
Fig. 4.26. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos radicales de la
variedad Namoi crecida en presencia de los medios de cultivo bacterianos............. 125
Fig. 4.27. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos de la parte aérea
de la variedad Namoi crecida en presencia de los medios de cultivo
bacterianos............................................................................................................. 128
Fig. 4.28. Representación del ACP efectuado con los resultados del peso total y medidas de
nitrógeno de la variedad Namoi crecida en presencia de los medios de cultivo
bacterianos............................................................................................................. 131
Fig. 4.29. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos radicales de la
variedad Látigo crecida en presencia de los medios de cultivo bacterianos.............. 134
Fig. 4.30. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos de la parte aérea
de la variedad Látigo crecida en presencia de los medios de cultivo bacterianos......
137
Fig. 4.31. Representación del ACP efectuado con los resultados del peso total y medidas de
nitrógeno de la variedad Látigo crecida en presencia de los medios de cultivo
bacterianos............................................................................................................. 140
Fig. 5.1. Ordenación de las muestras del ACP efectuado con los resultados de longitud, nº de
foliolos y peso seco en las tres variedades estudiadas.............................................. 144
Fig. 5.2. Concentraciones de amonio en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en condiciones de laboratorio.................................................... 146
Fig. 5.3. Concentraciones de nitrato en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en condiciones de laboratorio.................................................... 148
Fig. 5.4. Concentraciones de nitrógeno total en el suelo donde crecieron las dos variedades de
V. villosa y el control en condiciones de laboratorio............................................... 149
Fig. 5.5. Resultados de carbono orgánico en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en condiciones de laboratorio................................................... 150
Fig. 5.6. Resultados de pH en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control en condiciones de laboratorio.................................................................... 151
Fig. 5.7. Resultados de CIC en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control en condiciones de laboratorio.................................................................... 152
Fig. 5.8. Resultados de fósforo en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa
y el control en condiciones de laboratorio.............................................................. 154
X
Fig. 5.9. Representación de las muestras según el ACP efectuado con los resultados
fisicoquímicos de los suelos bajo la influencia de las dos variedades de V. villosa y el
control en condiciones de laboratorio.................................................................... 156
Fig. 5.10. Resultados de ARA potencial en el suelo bajo la influencia de las dos variedades de
V. villosa y el control en condiciones de laboratorio............................................. 157
Fig. 5.11. Resultados de amonificación potencial bajo la influencia de las dos variedades de
V.
villosa y el control en condiciones de laboratorio.................................................. 158
Fig. 5.12. Resultados de nitrificación potencial bajo la influencia de las dos variedades de V.
villosa y el control en condiciones de laboratorio.................................................. 159
Fig. 5.13. Resultados de desnitrificación potencial bajo la influencia de las dos variedades de
V. villosa y el control en condiciones de laboratorio.............................................. 160
Fig. 5.14. Resultados de producción de CO2 potencial bajo la influencia de las dos variedades
de V. villosa y el control en condiciones de laboratorio......................................... 161
Fig. 5.15. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados de las
actividades fisiológicas del ciclo del nitrógeno y producción de CO2 de los suelos bajo
la influencia de las dos variedades de V. villosa y el control en condiciones de
laboratorio............................................................................................................. 163
Fig. 5.16. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados biométricos
de las plantas crecidas en condiciones de laboratorio.............................................. 167
Fig. 5.17. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos de Toledo....................... 168
Fig. 5.18. Resultados de la amonificación, nitrificación y ARA potencial de los suelos de
Toledo................................................................................................................... 170
Fig. 5.19. Resultados de la producción de CO2 y desnitrificación en condiciones potenciales y
de campo en los suelos de Toledo.......................................................................... 171
Fig. 5.20. Resultados de la concentración de amonio de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 174
Fig. 5.21. Resultados de la concentración de nitrato de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 175
Fig. 5.22. Resultados de la concentración de nitrógeno total de los suelos donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe......... 176
Fig. 5.23. Resultados de carbono orgánico de los suelos donde crecieron las dos variedades de
V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe..................................... 177
XI
Fig. 5.24. Resultados de pH de los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
los controles en las parcelas de Montepríncipe........................................................ 178
Fig. 5.25. Resultados de CIC de los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
los controles en las parcelas de Montepríncipe........................................................ 179
Fig. 5.26. Resultados de la concentración de potasio de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 180
Fig. 5.27. Resultados de la concentración de calcio de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe............... 181
Fig. 5.28. Resultados de la concentración de magnesio de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 182
Fig. 5.29. Resultados de la concentración de fósforo de los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 183
Fig. 5.30. Representación de las muestras según el ACP efectuado con los resultados
fisicoquímicos de los suelos de las parcelas de Montepríncipe................................. 185
Fig. 5.31. Resultados del ARA potencial en los suelos donde crecieron las dos variedades de
V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe..................................... 186
Fig. 5.32. Resultados del potencial amonificante en los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 187
Fig. 5.33. Resultados del potencial nitrificante en los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 188
Fig. 5.34. Resultados del potencial desnitrificante en los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 189
Fig. 5.35. Resultados de la producción de CO2 potencial en los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 190
Fig. 5.36. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados de las
actividades potenciales del ciclo del nitrógeno y producción de CO2 de los suelos
donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de
Montepríncipe........................................................................................................ 192
Fig. 5.37. Resultados de la producción de biomasa de las dos variedades de V. villosa crecidas
en las parcelas de Montepríncipe............................................................................ 193
Fig. 5.38. Resultados de la concentración de nitrógeno en las raíces de las dos variedades de
V. villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe............................................... 194
XII
Fig. 5.39. Resultados de la concentración de nitrógeno en la parte aérea de las dos variedades
de V. villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe.......................................... 195
Fig. 5.40. Resultados del porcentaje de alcaloides en la parte aérea de las dos variedades de V.
villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe................................................... 196
Fig. 5.41. Resultados del porcentaje de azúcares en la parte aérea de las dos variedades de V.
villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe................................................... 197
Fig. 5.42. Resultados del porcentaje de pentosas en la parte aérea de las dos variedades de V.
villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe................................................... 198
Fig. 5.43. Resultados del porcentaje de fibra ácido detergente de las dos variedades de V.
villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe................................................... 199
Fig. 5.44. Resultados del porcentaje de fibra neutro detergente de las dos variedades de V.
villosa crecidas en las parcelas de Montepríncipe................................................... 200
XIII
ÍNDICE DE TABLAS
pg.
Tabla 4.I. Caracterización fisicoquímica de los suelos rizosféricos..................................... 92
Tabla 4.II. Resultados de germinación diaria de las semillas de Namoi en presencia de los
medios de crecimiento bacteriano.......................................................................... 119
Tabla 4.III. Resultados de germinación diaria de las semillas de Látigo en presencia de los
medios de crecimiento bacteriano.......................................................................... 120
Tabla 4.IV. Resultados biométricos de las raíces de la variedad Namoi en presencia del medio
de crecimiento bacteriano y el control.................................................................... 123
Tabla 4.V. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado con
los datos de la Tabla 4. IV..................................................................................... 124
Tabla 4.VI. Resultados biométricos de la parte aérea de la variedad Namoi en presencia del
medio de crecimiento bacteriano y el control.......................................................... 126
Tabla 4.VII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado
con los datos de la Tabla 4.VI................................................................................ 127
Tabla 4.VIII. Resultados de peso total y de medidas de nitrógeno de la variedad Namoi en
presencia del medio de crecimiento bacteriano y el control..................................... 129
Tabla 4.IX. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado
con los datos de la Tabla 4.VIII.............................................................................. 130
Tabla 4.X. Resultados biométricos de las raíces de la variedad Látigo en presencia del medio
de crecimiento bacteriano y el control..................................................................... 132
Tabla 4.XI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado con
los datos de la Tabla 4.X....................................................................................... 133
Tabla 4.XII. Resultados biométricos de la parte aérea de la variedad Látigo en presencia del
medio de crecimiento bacteriano y el control......................................................... 135
Tabla 4.XIII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado
con los datos de la Tabla 4.XII............................................................................... 136
Tabla 4.XIV. Resultados de peso total y de medidas de nitrógeno de la variedad Látigo en
presencia del medio de crecimiento bacteriano y el control..................................... 138
Tabla 4.XV. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP efectuado
con los datos de la Tabla 4.XIV............................................................................. 139
Tabla 5.I. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado con
los datos biométricos de Látigo, Namoi y Sita........................................................ 142
XIV
Tabla 5.II. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizado con
los datos biométricos de Látigo, Namoi y Sita........................................................ 143
Tabla 5.III. Características fisicoquímicas del suelo empleado en los estudios de
laboratorio............................................................................................................. 144
Tabla 5.IV. Actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2 de los suelos empleados en los estudios de laboratorio............. 145
Tabla 5.V. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado con
los datos de los análisis fisicoquímicos de los suelos bajo la influencia de las dos
variedades de V. villosa y el control en condiciones de laboratorio......................... 154
Tabla 5.VI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizado con
los datos de los análisis fisicoquímicos de los suelos bajo la influencia de las dos
variedades de V. villosa y el control en condiciones de laboratorio......................... 155
Tabla 5.VII. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado
con
los datos de actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2 en condiciones de laboratorio................................................... 162
Tabla 5.VIII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizados
con los datos de actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del
nitrógeno y producción de CO2 en condiciones de laboratorio................................. 162
Tabla 5.IX. Resultados de las medidas biométricas de las dos variedades de V. villosa en
condiciones de laboratorio...................................................................................... 164
Tabla 5.X. Resultados de nitrógeno total de parte aérea, radical y ARA de los nódulos de las
dos variedades de V. villosa en condiciones de laboratorio..................................... 165
Tabla 5. XI. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado
con los datos biométricos de las plantas crecidas en condiciones de laboratorio...... 166
Tabla 5.XII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizado con
los datos biométricos de las plantas crecidas en condiciones de laboratorio............ 167
Tabla 5.XIII. Caracterización fisicoquímica del suelo de las parcela de Montepríncipe..... 172
Tabla 5.XIV. Actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2 de los suelos de las parcelas de Montepríncipe......................... 173
Tabla 5.XV. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado
con
los datos del análisis fisicoquímico de los suelos bajo la influencia de las dos
variedades
de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe..................... 183
XV
Tabla 5.XVI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizado
con los datos del análisis fisicoquímico de los suelos bajo la influencia de las dos
variedades de V. villosa y los controles en las parcelas de Montepríncipe................ 184
Tabla 5.XVI. Porcentaje de varianza absorbida por los dos primeros ejes del ACP realizado
con los datos de las actividades potenciales del ciclo del nitrógeno y producción de
CO2 de los suelos bajo la influencia de las dos variedades de V. villosa y los controles
en las parcelas de Montepríncipe............................................................................... 191
Tabla 5.XVII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes del ACP realizado
con los datos de las actividades potenciales del ciclo del nitrógeno y producción de
CO2 de los suelos bajo la influencia de las dos variedades de V. villosa y los controles
en las parcelas de Montepríncipe............................................................................... 191
Tabla 5.XVIII. Resultados del porcentaje de alcaloides, azúcares, pentosas y concentración de
nitrógeno en los frutos y semillas de las dos variedades de V. villosa crecidas en las
parcelas de Montepríncipe......................................................................................... 201
XVI
LISTA DE ABREVIATURAS
ACC.- 1-aminociclopropano 1-carboxilato
ADN.- Ácido Desoxiribonucleico
ANOVA.- Análisis de la Varianza
ARA.- Actividad Reductora de Acetileno
CIC.- Capacidad de Intercambio Catiónico
CO.- Carbono Orgánico
CRM.- Capacidad de Retención Máxima
dATP.- d-Adenosina Trifosfato
dCTP.- d-Citosina Trifosfato
dGTP.- d-Guanosina Trifosfato
DRB.- Rizobacteria Deleterea (Deleterious Rhizobacteria)
dTTP.- d-Timidina Trifosfato
EDTA.- Etilendinitrilo tetraacético, sal disódica
FAD.- Fibra Ácido Detergente
FBN.- Fijación Biológica de Nitrógeno
FID.- Detector de Ionización de Llama
FLN.- Fijación Libre de Nitrógeno
FND.- Fibra Neutro Detergente
FSN.- Fijación Simbiótica de Nitrógeno
LSD.- Mínima Diferencia Significativa
PCR.- Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
PGPR.-
Bacteria
Promotora
del
Crecimiento
Vegetal
(Plant
Growth
Promoting
Rhizobacteria)
RAPD.- Amplificación de ADN con Primers Aleatorios (Random Amplification of
Polymorphic DNA)
TAMPÓN TAE.- Tampón Tris-Acetato
TCD.- Detector de Conductividad Térmica
TRIS.- Hidroximetil-amino-metano
UPGMA.-
XVII
YIB.- Bacterias que Incrementan el Rendimiento (Yield Increasing Bacteria)
XVIII
1. INTRODUCCIÓN
Los continuos y generalizados incrementos de la producción agrícola que se han
producido durante los últimas décadas, no han llegado a equilibrar la incesante demanda de
alimentos a nivel mundial. Por otra parte la presión sobre los sistemas agrícolas y forestales ha
generado graves problemas de contaminación debido al empleo de fertilizantes y pesticidas.
Las tendencias actuales de la investigación en este campo, se integran en tres aspectos
fundamentales:
- Mejora de la producción mediante biotecnología.
-Estudio de la dinámica de ciclos biogeoquímicos y sus implicaciones en la nutrición
vegetal.
- Estudio de la fisiología de las plantas para su aplicación en la mejora de la producción.
Las tres áreas de investigación se encuentran íntimamente relacionadas entre sí,
interaccionando de forma que el estudio de cualquiera de ellas obliga a considerar las restantes.
En la presente memoria se pretenden abordar aspectos fundamentales que inciden en la
productividad de una especie, Vicia villosa, con un considerable impacto económico en la
agricultura de determinados países. El estudio se realiza considerando la interacción de la
planta, con el sistema edáfico, separándonos de los sistemas de producción clásicos en los que el
factor productividad anulaba otras consideraciones vitales, como el mejor aprovechamiento de
los recursos edáficos con la mínima presión externa. El objetivo es reducir los efectos nocivos
de la producción sobre el ambiente, optimizándola y permitiendo una agricultura sostenible
basada en el conocimiento de la fisiología de las plantas y del sistema edáfico en que se
desarrollan.
1.1. El ciclo del nitrógeno
El nitrógeno, elemento muy abundante en el planeta, se encuentra formando rocas ígneas
(14x109 Tg), sedimentos y rocas sedimentarias (4x109 Tg), como nitrógeno atmosférico
(3.9x109 Tg), nitrógeno de biomasa oceánica (5x102 Tg) y nitrógeno de biomasa terrestre
(1.5x104 Tg). Sin embargo, a pesar de su abundancia, la biodisponibilidad es baja y los niveles
de nitrógeno en la biomasa total vienen a ser una milésima parte de las reservas orgánicas. La
causa de ello está en que la molécula de nitrógeno es inaccesible para la mayor parte de los seres
vivos por lo que no se puede utilizar como fuente de nitrógeno. Las consecuencias de la escasa
biodisponibilidad suelen ser muy negativas ya que el nitrógeno es un constituyente esencial de
las biomoléculas y junto con el agua y el fósforo es el factor principal que aumenta la
2
producción primaria (Gutschick, 1981; Risser y Parton, 1982; Vitousek y Howarth, 1991;
Danso, 1995).
Las carencias de nitrógeno se suplen artificialmente mediante la administración de
fertilizantes químicos, con el consiguiente aumento en la contaminación de los acuíferos (NRC,
1989; Ollinger et al., 1993), eutrofización de las costas (Estavillo et al., 1996), y el incremento
en la producción de gases como N2O ( Anderson y Levine, 1987; Nevison et al., 1996 ).
La biomasa microbiana del suelo es un factor esencial para la descomposición de
residuos, ciclo del nitrógeno y flujo de energía (Jenkinson y Ladd, 1981)(2070). Esta biomasa
funciona como fuente y como sumidero de nutrientes en la mayoría de los ecosistemas
terrestres (Okano et al., 1989)(2070).
El ciclo del nitrógeno edáfico está controlado principalmente por bacterias, y su
actividad afecta la distribución de compuestos nitrogenados en el sistema. Las condiciones
ambientales que regulan la actividad de las bacterias determinan donde ocurre cada proceso, el
grado de intercambio entre las distintas formas de nitrógeno y las posibles interacciones físicas,
químicas y biológicas que pueden darse (Ward, 1996)(2534). Por tanto, el número de
interacciones que se pueden desarrollar es tal que, aunque existe mucha información bioquímica
sobre las reacciones bacterianas, no es suficiente para entender el control y para predecir los
procesos en distintos ambientes.
El ciclo del nitrógeno consiste en una serie de reducciones y oxidaciones sucesivas, que
conducen a la transformación del nitrógeno en formas accesibles al metabolismo de animales,
plantas y microorganismos. De esta manera el nitrógeno circula de forma cíclica a través del
suelo y de la atmósfera (Figura 1.1).
3
NO
N2
N 2O
N2atmosférico
Aporte de
seres vivos
Fijación
Desnitrificación
(libre, industrial o simbiótica)
Reducción
asimilatoria
Pérdidas gaseosas
SERES VIVOS Y
MATERIA ORGANICA
EDÁFICA
-
Lixiviación
NO3
Inmovilización
Nitrificación
Nítrica
Reducción
desasimilatoria
Amonificación
Arcillas
+
NH4
NH 3
NO2-
Nitrificación
Nitrosa
Pérdidas gaseosas
Volatilización
Figura 1.1. Representación esquemática del ciclo del nitrógeno.
El ciclo del nitrógeno ha sido objeto de especial atención por diversas razones, entre las
que podemos destacar:
- El incremento de nitrificación y desnitrificación puede ir acompañado, directa o
indirectamente, de un aumento de la producción de óxido nitroso y nítrico. El N2 es un producto
final más favorable ecológicamente hablando (Burns et al., 1996)(2200) y además es un
componente de la deposición ácida (Logan, 1983)(2194). El N2O es un gas con efecto
invernadero y además está implicado en la destrucción catalítica de la capa de ozono (Crutzen,
1981)(2624). Aunque su concentración absoluta es baja comparada con el CO2 , contribuye de
forma significativa al efecto invernadero, por su capacidad de absorción de IR y a que reside en
la atmósfera durante mucho tiempo. Desde la época preindustrial hasta nuestros días ha
aumentado un 5% la concentración de N2O atmosférico (Houghton et al., 1990)(2191) lo que
supone una concentración de N2O de 310 ppb y aumenta entre un 0.2 a un 0.3% al año (Papen y
Seiler, 1994)2619). Un aumento del 0.25% corresponde con una adición de 3.5 Tg de N2O/año
en la escala global (Benkise et al., 1996)(2619). El N2O es responsable de un 2 a un 3% del
calentamiento global del planeta (Watson et al., 1992)(2191) y puede contribuir hasta en un
10% en el futuro (Cicerone, 1989)(2191) y por otra parte doblar la concentración de este gas en
la atmósfera se estima que puede hacer disminuir la capa de ozono en un 10% (Mosier et al.,
4
1996)(2191). Los suelos contribuyen con un 70% del total de emisiones de N2O antropogénicas
(Kroeze, 1993)(2624). Los procesos microbiológicos en los suelos son las fuentes más
importantes de N2O (Granli y B∅ck,man, 1994)(2194), razón por la cual se asume que los
cambios en el ciclo del nitrógeno a nivel edáfico han influido decisivamente en el aumento de
N2O en la atmósfera durante el pasado centenio y pueden ayudar a predecir futuros cambios
(Bowman, 1990)(2191).
- La desnitrificación es uno de los procesos causantes de la disminución de eficacia de
los fertilizantes químicos. Tiedje (1988) estima que entre el 52 y el 100% del nitrógeno fijado
vuelve a la atmósfera por procesos de desnitrificación. Bouwman (1990) calcula que en
ecosistemas naturales terrestres se emiten entre 9.7 y 12 Tg de nitrógeno al año y entre 2.3 y 3.7
Tg en suelos cultivados; si a esto unimos los datos anteriormente comentados, se comprende la
gran importancia de este proceso.
- Algunas formas de nitrógeno combinado afectan a la tasa de producción primaria, a la
descomposición de la materia orgánica y a las propiedades físicas, químicas y biológicas del
suelo (Cannon et al., 1984; Juma, 1993).
- El incremento o disminución de la concentración de nitratos asociado al proceso
nitrificante se propone como factor regulador de la dinámica de cationes en los ecosistemas
edáficos (Kölling y Prietzel, 1995).
- Las pérdidas de nitrógeno en forma de nitratos son, en muchas ocasiones, mayores que
las pérdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989).
- La disponibilidad de nitrógeno para la nutrición vegetal es uno de los factores
determinantes de la riqueza en lignina en las paredes celulares, lo que condiciona los aportes de
compuestos fenólicos y de materia orgánica fácilmente degradable. Además los compuestos
fenólicos acidifican el sustrato, dificultando la movilización de nutrientes (Gosz, 1981).
- Efectos negativos de exceso de nitritos y nitratos sobre la salud humana (Prasad y
Power, 1995).
A continuación se comentan los aspectos más importantes de las distintas etapas del
ciclo del nitrógeno, así como algunos de los trabajos más sobresalientes al respecto.
1.1.1. Fijación biológica del nitrógeno (FBN)
5
La FBN es la etapa reguladora del ciclo. Junto con la fotosíntesis, dicho proceso es clave
en la producción de los ecosistemas (Worthington, 1975). Sólo ciertos procariotas poseen el
aparato enzimático necesario para reducir el nitrógeno molecular, de estado de oxidación 0,
hasta amonio, estado de oxidación -3. Este amonio se incorpora a compuestos orgánicos
formando glutamina y otros compuestos nitrogenados (Schubert, 1986).
Las entradas de nitrógeno vía fijación biológica se estiman en 139-170 millones de t
N/año (Paul, 1988) de los cuales un 25-30% se deben a asociaciones simbióticas en suelo
cultivado, otro 30% a través de pastizales permanentes, y el resto se explica por otras
asociaciones o por fijación libre (Peoples et al., 1995). Estas entradas de nitrógeno en el
ecosistema compensan las pérdidas por desnitrificación (14.75 Tg N/año) (IPCC, 1994),
cosechas (830 kg N/ha) (Soon y Arshad, 1996), volatilización de amonio (13-23 Tg N/año),
lixiviación (30 Tg N/año) y erosión (2-20 Tg N/año) (Roswal y Paustian, 1984).
Este proceso requiere un gasto energético elevado. Los microorganismos implicados
pueden obtener los compuestos orgánicos necesarios para conseguir energía, directamente del
sustrato sobre el que se desarrollan (fijación libre), o bien colonizar raíces de ciertas plantas que
les suministran compuestos orgánicos (fotosintatos) que utilizan como fuente energética. De
esta forma se establece una relación simbiótica, ya que parte del nitrógeno fijado es asimilado
por la planta, que lo integra en su metabolismo (fijación simbiótica).
Las implicaciones de ambos sistemas de fijación de nitrógeno son decisivas en lo que se
refiere a su efecto sobre la producción primaria, sin embargo los mecanismos por los que el
nitrógeno fijado queda a disposición de las plantas son muy distintos, así como el rendimiento
energético del proceso y los factores que regulan el flujo de energía que se establece en cada
caso. Por esta razón pasamos a considerar los procesos por separado.
1.1.1.1. Fijación libre del nitrógeno (FLN)
Blackburn (1983) apunta a los microorganismos fijadores libres fotosintéticos como los
reductores más eficaces, sin embargo, como quiera que la energía solar incide escasamente
sobre la productividad del suelo, la mayoría de los fijadores libres, a nivel edáfico son
microorganismos heterótrofos (Evans y Burris, 1992) que se ven obligados a competir por su
sustrato con el resto de los microorganismos heterótrofos, y su actividad dependerá en gran
parte del éxito en la competencia por el sustrato (Hill, 1992)(libro).
6
El grupo funcional de los fijadores libres de nitrógeno atmosférico está formado por
numerosos microorganismos, entre ellos podemos citar las cianofíceas (Haselkorn y Buikema,
1992); bacterias aerobias y microaerobias heterótrofas, como Azotobacter spp. y Azospirillum
spp. respectivamente (Evans y Burris, 1992) o Beijerinkia spp. y Derxia spp. (Boddey y
Dobereiner, 1995); bacterias quimioautótrofas, incluyendo aquellas que oxidan metano (Dalton
y Chatfield, 1985) y azufre (Mackintosh, 1978) y las que utilizan H2 como fuente de energía
para el crecimiento autótrofo (Berndt et al., 1976); bacterias anaerobias facultativas como las
del género Klebsiella y Enterobacter, que requieren compuestos nitrogenados para crecer bajo
condiciones aerobias pero fijan nitrógeno en anaerobiosis (Aho et al., 1976); bacterias
pertenecientes a los géneros Bacillus (Line y Loutit, 1971) y Pseudomonas, que son
probablemente los géneros más abundantes en la rizosfera (Acero et al., 1994; Puente y Bashan,
1994); y por último, bacterias anaerobias estrictas, siendo el género Clostridium el más
importante (Rosenblum y Wilson, 1948; Flather y Beauchamp, 1992)(2624).
En ecosistemas terrestres, las cianobacterias fijan cerca de 30 kg N ha-1 año-1 en
pastizales, mientras que en los sistemas agrícolas sólo fija entre 3 y 5 kg N ha-1 año-1.
Azotobacter spp. fija entorno a 1 kg N ha-1 año-1 en estado libre, mientras que asociado a
gramíneas fija 20 kg N ha-1 año-1 (Paul y Clark, 1989)(2518).
Una asociación de gran interés, que no se puede considerar exactamente como
simbiosis, es la formada por la bacteria fijadora de nitrógeno Azospirillum, que prolifera sobre
raíces de maíz, trigo, cebada, avena y otros cereales, constituyendo una rizocenosis no nodulante
que conduce a un aumento del número de espigas y de biomasa vegetal (Bashan y Levanony,
1990; Zaady et al., 1994).
1.1.1.1.a. Factores que afectan a la fijación libre de nitrógeno y microorganismos
implicados en el proceso
Los diazotrofos libres, están marcadamente afectados por las propiedades y
requerimientos del complejo nitrogenasa. El oxígeno es uno de los factores que más afecta al
proceso, dada la sensibilidad de la nitrogenasa a este gas (Drevon et al., 1988; Hunt y Layzell,
1993). Las condiciones microaerófilas son óptimas para el crecimiento de estas bacterias es la
microaerofilia, ya que en estos hábitats las bacterias tienen el oxigeno necesario para su
respiración, pero la nitrogenasa no se encuentra inhibida (Hill, 1992)(Libro)
7
La presencia en el suelo de nitrógeno inorgánico inhibe la actividad de las bacterias
fijadoras de nitrógeno (Kitoh y Shiomi, 1991; Roper et al., 1994)(2518). Por el contrario, las
condiciones inducen la inmovilización del nitrógeno estimulan la actividad nitrogenasa en el
suelo (Roper et al., 1994)(2518). Rao (1976) y Sawicka (1982, 1983) (368), indican que la
adición de pequeñas cantidades de nitrógeno junto con carbono orgánico incrementan la FLN de
estos suelos.
Las bacterias diazotrofas libres están estimuladas y su actividad nitrogenasa aumenta en
presencia de altos niveles de materia orgánica en el suelo. La rizosfera es una zona con elevada
concentración de compuestos orgánicos fácilmente degradables debido a la exudación radical,
razón por la cual las bacterias fijadoras libres encuentran en la rizosfera un lugar muy apropiado
para fijar nitrógeno (Glick, 1995)(1141). Distintas plantas creciendo en el mismo suelo y bajo
las mismas condiciones climáticas poseen distintas tasas de fijación en su rizosfera (Sawicka,
1983)(368). Estas diferencias se deben a la composición específica de los exudados de cada
planta (Rovira, 1956)(368). La adición de compuestos no nitrogenados exudados por las raíces,
confiere a las bacterias diazotrofas ventajas competitivas sobre el resto de los heterótrofos de la
rizosfera, así como la liberación de diversas vitaminas, como tiamina, que aumenta de forma
considerable el número de bacterias diazotrofas en la rizosfera (Azaizeh et al., 1995)(2254).
Dado el efecto de la naturaleza y cantidad de carbono orgánico disponible sobre la FLN
(Alexander y Zuberer, 1989)(2518), cierto tipo de manejo, como el aporte de restos vegetales de
leguminosas al suelo aumenta los niveles de fijación al proporcionar niveles más altos de
carbono lábil a las bacterias fijadoras (Wander et al., 1994)(2518).
Esta etapa del ciclo es especialmente sensible a la presencia de metales pesados en el
suelo, por lo que se han propuesto como indicadores biológicos de la toxicidad de estos
elementos (Lorenz et al., 1992)(567). Sin embargo, las bacterias fijadoras heterótrofas y
anaerobias, en presencia de metales pesados, son capaces de fijar en un amplio rango de
condiciones de alcalinidad y acidez del suelo (Paul y Clark, 1989)(567), y además su actividad
nitrogenasa es normalmente mayor que la de aquellas que crecen en condiciones aerobias
(Jones, 1977)(567).
Otros factores que afectan considerablemente al proceso son: pH (DeLuca et al.,
1996)(2518); fósforo (Grant y Binkley, 1987; Kay y Virginia, 1989; Smith, 1992; Crews, 1993),
tipo de suelo (Azaizeh et al., 1995b)(2254), temperatura (Stewart, 1974; Granhall, 1981; Lynch
y Smith, 1993) y el estrés hídrico (Venkateswarlu, 1990).
1.1.1.2. Fijación simbiótica del nitrógeno (FSN)
8
La fijación simbiótica de nitrógeno tiene un papel muy importante sobre la producción
primaria ya que supone la entrada de nitrógeno más importante en los ecosistemas terrestres
(Tamm, 1991). Por tanto, este proceso resulta fundamental en la nutrición y crecimiento de las
plantas (Michiels y Vanderleyden, 1994).
Bumb (1994) indica que la mejora de la fijación simbiótica reduciría en esta década el
uso de fertilizantes nitrogenados en 80-90 millones de t de N, por lo que actualmente se está
realizando un esfuerzo para intentar aumentar la eficiencia fijadora (Hardarson, 1993),
profundizando en el estudio de métodos agronómicos, microbiológicos y biotecnológicos. El
análisis es complejo ya que la fijación de nitrógeno no está regulada sólo por la demanda de
nitrógeno de una planta individual, también, de forma indirecta por la demanda del ecosistema
como un todo (Hartwing et al., 1996)(2450).
Las relaciones simbióticas más estudiadas corresponden a Rhizobium y Bradyrhizobium
con las fabáceas, y al actinomiceto Frankia con angiospermas no leguminosas. Algunas
cianofíceas también establecen simbiosis, si bien lo hacen con pteridofitos del género Azolla,
pudiendo fijar entre 70-110 kg de nitrógeno por hectárea y año (Ventura y Wantanbe, 1993). Así
mismo, las cianobacterias del género Nostoc, establecen simbiosis con una herbácea tropical del
género Gunnera (Rasmussen, 1996)(2304).
Aproximadamente 194 especies de plantas se han descrito como actinorrizas no
leguminosas y están englobadas dentro de ocho familias y cuatro subclases de plantas
angiospermas (Cronquist, 1981)(2592). Estas plantas tienen tendencia a crecer en suelos
marginales y juegan un papel importante como pioneras en las primeras etapas de sucesión.
Aparecen en muy diversos hábitats como la tundra (Dryas), bosques (Alnus, Comptonia,
Coriaria y Sheperdia), dunas (Casuarina, Hipophaë, Myrica y Elaeagnus) bosques riparios
(Alnus, Myrica y Datisca) y chaparrales (Ceanothus, Comptonia, Cerocarpus, Cowania y
Purshia). La cantidad de nitrógeno fijado por las plantas actinorrizas es similar al fijado por las
leguminosas (40-350 kg N ha-1
año-1)(Torrey, 1978), y algunas especies pueden devolver
al ecosistema hasta un 70% de este nitrógeno (Schwintzer, 1984)(2592). Además de su
importancia como pioneras, son importantes como fuentes de biomasa y sirven de plantas
nodrizas para otras especies de interés económico.
Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium son capaces de nodular únicamente plantas
leguminosas. Dentro de las leguminosas podemos distinguir tres subfamilias, Mimosoideae,
Papilionoideae y Caesalpinoideae. Un 90% de las dos primeras familias entran en simbiosis
9
con rizobios del suelo formando nódulos tanto radicales, como en algún caso caulinares, sin
embargo, sólo unos pocos miembros de la familia Caesalpinoideae son capaces de establecer
este tipo de relación (Doyle, 1994).(993)
La diversidad taxonómica de familias dentro de las plantas actinorrizas, en comparación
con las leguminosas, hace pensar que la simbiosis actinorrízica se originó repetidamente en la
evolución de las angiospermas (Mullin, Swensen y Goetting-Minesky, 1990; Baker y Mullin,
1992; Swense, 1996).
Desde un punto de vista agronómico, la fijación de nitrógeno mediante la simbiosis
rizobio-leguminosa tiene gran importancia ya que su rendimiento se estima entre 41-51 millones
de t N/año (Paul, 1988). La fijación se lleva a cabo por los rizobios en estructuras de morfología
definida, denominadas nódulos, que se desarrollan en las raíces (Bergersen, 1982) o en los
tallos (Loureiro et al., 1995) de plantas leguminosas.
Por
las
razones
expuestas,
los
procesos
de
simbiosis
entre
fabáceas
y
Rhizobium/Bradyrhizobium y entre otras angiospermas no leguminosas y Frankia resultan de
gran importancia en agricultura y silvicultura, respectivamente. La asociación de vegetales
nodulados con otros revierte en una mejor nutrición nitrogenada de estos últimos (Cochran y
Schlentner, 1995). Haynes et al. (1979) encontraron en plantaciones de Platanus occidentalis
que si se incorporaba una vegetación acompañante de leguminosas herbáceas, aumentaba
considerablemente el volumen, diámetro e índice volumétrico de las plantas con respecto al
control. Pero también se ha visto que las leguminosas herbáceas fijadoras de nitrógeno, tienen
una gran importancia en sistemas agrícolas cuando se utilizan en programas de rotación de
cultivos, ya que aumentan significativamente la producción de cereal, principalmente trigo y
cebada (King, 1984; Reeves et al., 1984; Rowland et al., 1986; Doyle et al., 1988). Reynolds et
al. (1994) observan en cultivos mixtos de leguminosas con trigo o cebada, en suelos pobres en
nitrógeno, un aumento en la cantidad de proteínas en el grano, hecho que relacionan con un
mejor transporte del nitrógeno en presencia de las leguminosas.
Los rizobios son bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia Rhizobiaceae.
Actualmente se engloban en tres géneros, Rhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium
constituidos por los rizobios de rápido crecimiento clásicos (2-4 horas de tiempo de generación)
y Bradyrhizobium de lento crecimiento con un tiempo de generación de 8 horas o más.
Los rizobios presentes en el suelo interaccionan con las raíces de distintas leguminosas,
induciendo la formación de nódulos, estructuras en los que se produce la fijación del nitrógeno.
El desarrollo del nódulo y la fijación de nitrógeno es un proceso complejo que requiere señales
10
entre los rizobios y las células de la planta. Los polisacáridos superficiales de los rizobios,
particularmente exopolisacáridos y lipopolisacáridos, parecen estar implicados en el
establecimiento de la simbiosis con distintas leguminosas (Gray y Rolfe, 1990; Leigh y Coplin,
1992). Los lipopolisacáridos, no sólo se necesitan a distintos tiempos durante el desarrollo del
nódulo, también están encargados de proteger al rizobio por supresión de los mecanismos de
defensa de la planta (Noel, 1992)(2176). El papel de estos polisacáridos en la infección y
desarrollo del nódulo depende de que el nódulo sea determinado o indeterminado (Ko y Gayda,
1990; Parniske et al., 1993, 1994)(2154). Los exopolisacáridos tienen mayor importancia en la
formación de los nódulos indeterminados, mientras que los lipopolisacáridos en los
determinados (Eggleston et al., 1996)(2154).
Los mecanismos de reconocimiento célula-célula vienen determinados en un primer
momento por una proteína calcio dependiente muy común en las rizobiaceas, que permite a las
bacterias ligarse a la raíz (Smit et al., 1992)(2130). En una segunda etapa, que depende de las
condiciones de crecimiento, las lectinas de la planta suponen puntos de anclaje para las bacterias
(Wsniewski y Delmotte, 1996)(2130). Además, parece ser que las lectinas inducen la capacidad
de nodulación de Rhizobium (Halverson y Stacey, 1986)(2130).
Los flavonoides presentes en los exudados radicales, también juegan un papel
importante en los procesos de nodulación. Estos compuestos fenólicos atraen a los rizobios e
inducen genes de nodulación (Dharmatilake y Bauer, 1992)(2130). Además estos compuestos
pueden modificar el metabolismo bacteriano provocando un aumento en la síntesis de
exopolisacáridos (Hartwing et al., 1991; Dunn et al., 1992). Así mismo, otros productos
presentes en los exudados radicales como isoflavonoides y sacáridos, estimulan a las bacterias
para iniciar la nodulación (Wisniewski y Delmotte, 1996)(2130).
Existen una serie de genes, tanto de la planta (Nif y Fix) como de la bacteria (Nod) que
codifican para proteínas necesarias para el desarrollo del nódulo y para el proceso posterior de
fijación de N. Los genes Nif y Fix se activan durante la formación del nódulo y que dan lugar a
proteínas denominadas nodulinas (Sanchez et al., 1991)(2118). Entre estas nodulinas podemos
destacar: leghemoglobina (Brisson y Verma, 1982), una glutamina sintetasa específica del
nódulo (Cullimore et al., 1984) y polipéptidos ricos en lisina que se expresan en los primeros
estadíos del desarrollo del nódulo (Franssen et al., 1987; Scheres et al., 1990)(2118). Los genes
Nod codifican para los factores Nod que llevan a cabo cambios morfológicos en la raíz de la
planta huesped como deformaciones de los pelos radicales (Lerouge et al., 1990), formación del
canal de infección (van Brussel et al., 1992) y formación del primordio nodular (Spaink et al.,
11
1991; Truchet et al., 1991)(sep Javier). Además los factores Nod inducen alteraciones en la
composición de flavonoides de los exudados radicales que provocan una activación de los genes
inductores de los Nod (van Brussel et al., 1990)(sep Javier). Entre los factores Nod podemos
citar: quitina y celulosa sintasas, acetiltransferasas y ATP sulfurilasa.
1.1.1.2.a. Factores que afectan a la fijación simbiótica de nitrógeno y microorganismos
implicados en el proceso
La fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) se ve afectada por un amplio espectro de
factores bióticos y abióticos. La mejora del proceso controlando los factores que a continuación
se mencionan puede constituir una de las principales vías de investigación en este campo.
Entre los factores bióticos los más relevantes son: el tipo de inóculo y la vía de
inoculación (Brockwell et al., 1988), la elección de cultivares apropiados que influye
decisivamente sobre las entradas de nitrógeno en sistemas agrícolas (Wani et al., 1995), el
control de las pestes y enfermedades que afectan al vigor de la planta y a su potencial de
crecimiento ( Johnstone y Barbetti, 1987; Sinclair, 1994).
En cuanto a los factores abióticos, son muchos los que inciden sobre el proceso, factores
que además suelen interaccionar entre sí. Uno de los más estudiados es la concentración de
nitrato, ya que es una de las formas de nitrógeno más utilizada como fertilizante y actúa como
un potente inhibidor de la FSN (Streeter, 1988). Por otra parte los niveles de nitrato en el suelo
intreraccionan con la concentración de oxígeno en el mismo (Arrese-Igor et al., 1993(656); de
Lorenzo et al., 1994), este último factor afecta al funcionamiento de la nitrogenasa nodular
(Ianneta et al., 1995). Se han observado cambios de la resistencia a la difusión de oxígeno en el
cortex nodular implicados en el descenso de la FSN en presencia de altas concentraciones de
nitrato (Vessey y Waterer, 1992)(2461) así como una regulación por retroalimentación basada
en el estatus de nitrógeno mediado por los aminoácidos que fluyen por el floema y que actúan
en el nódulo (Parsons et al., 1993)(2461). Sin embargo, concentraciones bajas de nitrato
estimulan la FSN, particularmente, durante la época de crecimiento de la planta (Allos y
Bartholomew, 1959; Ingestad, 1980; Rigaud, 1981; Macduff et al., 1989)(2185). Durante esta
época, un pequeño suplemento de nitrato, aumentaría la actividad fotosintética de la planta y el
aporte de carbohidratos al nódulo, lo que favorece su desarrollo y actividad. Sin embargo, los
niveles no deben ser lo suficientemente elevados (< 2 mol m-3) como para provocar altos niveles
12
de nitrógeno en el floema (Macduff et al., 1996)(2185) que dispararía el mecanismo de
retroalimentación propuesto por Parsons (1993) y que ya hemos mencionado.
El NH4+ inhibe la FSN de forma indirecta por un incremento en la concentración
citoplasmática de amonio o de aminoácidos derivados de la asimilación de amonio por parte de
las raíces, lo que puede llegar a exceder temporalmente la capacidad constitutiva de las rutas
asimilatorias de las raíces (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por otro lado, el amonio, puede
regular la nodulación reprimiendo los genes Nod (Dusha et al., 1989; Kondorosi et al., 1989).
El fósforo, es uno de los factores limitantes de la producción vegetal en muchos
ecosistemas (Andrew y Robins, 1969)(2668). La FSN depende de la energía que le
proporcionan los fotosintatos traslocados a las raíces (Graham, 1984)(2393), el fósforo es
esencial en la formación de fotosintatos y en su traslocación, por lo tanto es un factor esencial
(Soliman et al., 1996)(2393). Las leguminosas están especialmente afectadas por este factor, ya
que necesitan más fósforo que otras plantas no simbióticas (Israël, 1987)(2668). En leguminosas
noduladas un 20% del fósforo total de la planta se localiza en los nódulos (Adu-Gyamfi et al.,
1989; Gunawardena et al., 1992)(2668). Además, la masa nodular desciende drásticamente en
condiciones de deficiencia de este nutriente (O´Hara et al., 1988; Gunawardena et al.,
1992)(2668)(Ribet y Drevon, 1995a). Sin embargo, Ribet y Drevon (1995a)(2668) observan un
aumento en la permeabilidad del cortex nodular al oxígeno. Vadez et al. (1996) encuentran los
mismos resultados y proponen algún tipo de relación entre la tolerancia a bajas concentraciones
de fósforo frente a la FSN mediante una regulación de la permeabilidad nodular.
El hierro es uno de los nutrientes necesario para la iniciación de la nodulación,
desarrollo de la bacteria en el nódulo, producción de leghemoglobina y de nitrogenasa (Barton
et al., 1994)(2503). Por este motivo, se propone que la producción de sideróforos por parte del
simbionte puede ser importante para el metabolismo del nódulo, sobre todo bajo condiciones de
limitación de hierro. Ciertos rizobios producen sideróforos como carboxilatos, fenolatos, catecol
e hidroxamato (Barran y Bromfield, 1993)(2503). Persmark et al. (1993)(2503) caracterizan la
rizobactina, un sideróforo específico de Rhizobium meliloti, que aumenta la FSN en plantas
noduladas que crecen bajo condiciones deficientes de hierro (Gill et al., 1991; Barton et al.,
1992)(2503). Tanto la ausencia como la producción continuada de sideróforos afecta
negativamente a la FSN (Barton et al., 1996)(2503). La producción continuada resulta tóxica
para la bacteria en el nódulo. Sin embargo, una producción adecuada estimula el crecimiento de
la planta y regula la fijación de nitrógeno en condiciones de deficiencia de hierro (Gill et al.,
1991; Barton et al., 1992)(2503).
13
El tipo de manejo afecta a este proceso, Herridge y Bergarser (1988)(2586) observan
diferencias en la fijación de nitrógeno según el tipo de práctica agrícola, y Horn et al.(1996)
observan que el momento de la siembra afecta, obteniendo mayores tasas de fijación sembrando
prematuramente. Sin embargo, estos últimos autores aclaran, que el momento de siembra debe
ser elegido según el tipo de planta, la humedad del suelo, y momentos, en que los niveles de
nitratos sean bajos para mejorar así, la producción y el rendimiento de la fijación de nitrógeno.
Goh et al. (1996)(2634) observan una variación estacional en la fijación simbiótica de
nitrógeno que explican, al menos en parte por variaciones en la temperatura. Las temperaturas
más bajas del invierno, afectan al metabolismo de la planta (Lie, 1981), a la formación de raíces
(Rohini-Kumarashinghe et al., 1979), al crecimiento del rizobio, a su capacidad de infección y a
la formación del nódulo (Roughley y Dart, 1970)(2634), lo que reduce las tasas de fijación
durante estos meses. Así mismo, temperaturas por debajo de 5-10°C limitan la fijación de forma
indirecta impidiendo el crecimiento de los pelos radicales y de forma directa al disminuir la
demanda de nitrógeno por la planta (Svenning y Macduff, 1996)(2461). La temperatura de la
zona radical parece afectar al balance entre la cantidad de nitrógeno mineral absorbido por las
raíces y la fijación de nitrógeno por parte de los nódulos (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por
otro lado la temperatura afecta de forma indirecta al proceso, puesto que es responsable, en
parte, de los niveles de humedad en el suelo (Yunusa et al., 1995 a)(2634), aspecto en el que se
incide a continuación.
La humedad del suelo es un factor de incidencia crítica sobre el proceso (Weisz et al.,
1985)(2282). La FSN es incluso más sensible a la humedad del suelo que otros parámetros
fisiológicos como la fotosíntesis (Durand et al., 1987)(2282), transpiración (Sall y Sinclair,
1991)(2282) o la asimilación de nitratos (Obaton et al., 1982)(2282). Pankhurst y Sprent
(1975)(2282) proponen que el principal efecto de la sequía sobre la actividad nodular es un
descenso de la permeabilidad a la difusión del oxígeno en el nódulo. Así mismo, la sequía
produce alteraciones en el metabolismo del nitrógeno. Los uréidos deben estar directamente
implicados en la regulación de la permeabilidad del nódulo al oxígeno (Streeter, 1992; Purcell y
Sinclair, 1994). Serraj y Sinclair (1996)(2282) proponen que la síntesis y transporte de uréidos
está íntimamente ligada a la disminución de la fijación de nitrógeno durante la sequía. Como
consecuencia del estrés hídrico: baja la demanda de nitrógeno por parte de las raíces y se limita
el agua disponible para el nódulo; baja el transporte de solutos nitrogenados, incluidos los
uréidos; se acumulan los productos de la fijación de nitrógeno en el nódulo y se inhibe la
actividad nitrogenasa en los bacteroides. Así mismo, altos niveles de agua en el suelo resultan
14
también negativos para este proceso (Serraj y Sinclair, 1996)(2282). El óptimo parece
encontrarse en una humedad edáfica entorno a la capacidad de campo (Castellanos et al.,
1996)(2081).
La competencia por la luz puede darse en algunas ocasiones, como en cultivos mixtos, y
ser un factor limitante de la FSN. Este hecho se debe a una disminución de la fotosíntesis en la
planta y por lo tanto una menor disponibilidad de fotosintatos para la formación del nódulo y
para el proceso de fijación en los mismos (Wahua y Miller, 1978)(2571).
Por otra parte la concentración de protones en el medio está ligada a la concentración de
cationes como Al3+, Mn2+, Ca2+ y Mo2+. Cuando baja el pH se movilizan Al3+ y Mn2+ que
resultan tóxicos para muchos poblaciones microbianas (Coventry et al., 1985; Richardson et al.,
1988; Evans et al., 1990)(2202). Además el Al3+ y la concentración elevada de H+ inhiben
específicamente el crecimiento radical y la formación del nódulo (Munns, 1968; Whelan y
Alexander, 1986; Blamey et al., 1993; Brady et al., 1994)(2202). En cuanto al Ca2+ y Mo2+, su
disponibilidad evoluciona de forma inversa a la concentración de protones (Unkovich et al.,
1996)(2202). La carencia de Ca2+ en el medio inhibe la formación de pelos radicales (Loneragan
y Dowling, 1958; Evans et al., 1988; Flis et al., 1993)(2202), lo que influye decisivamente en el
proceso de infección. Además dado que el anclaje de los rizobios a la raíz está mediado por una
proteína dependiente de calcio, la nodulación resulta fuertemente inhibida. Por otro lado, al
bajar el pH también descienden las concentraciones de molibdeno, lo cual revierte en una
supresión de la actividad nitrogenasa de los nódulos ya existentes (Coventry et al., 1985)(2202).
El oxígeno es necesario para mantener la respiración bacteriana, ya que los rizobios son
aerobios estrictos, sin embargo el oxígeno inhibe la nitrogenasa, razón por la cual, los niveles en
el interior del nódulo son bajos, oscilando entre 3 y 25 nM, concentración determinada por la
permeabilidad del cortex al O2 (Hunt y Layzell, 1993; Serraj et al., 1995). En estas condiciones
para proveerse del oxígeno necesario para la respiración, la bacteria utiliza la leghemoglobina,
una proteína que transporta O2, directamente a los bacteroides pero no deja oxígeno libre que
inhibiría la nitrogenasa (Appleby, 1984)(2092). La síntesis de ATP en el nódulo a bajas
concentraciones de oxígeno requiere una alta afinidad por parte de las oxidasas (Appleby,
1984)(2668) y por la mitocondria (Millar et al., 1995)(2668). Al exponer los nódulos a altas
concentraciones de oxígeno, se ha observado, que en un primer momento, su actividad
nitrogenasa aumenta, así como la respiración (King y Layzell, 1991; Roy, 1993)(2668). Sin
embargo, con el tiempo la nitrogenasa queda inhibida, existiendo dos hipótesis para explicar
este hecho. Por un lado Hunt et al. (1984)(2373), opinan que al someter al nódulo a altas
15
presiones de oxígeno, se producen alteraciones en la barrera de difusión de este gas en el cortex
nodular. Sin embargo, Zeng y Tjepkema (1996)(2373) observan que existe un retraso en la
respuesta de la respiración nodular al aumento de las presiones de oxígeno en el exterior, y
como consecuencia aumenta la concentración de este gas en el interior del nódulo. Este aumento
interno, inhibe a la nitrogenasa, hasta que la respiración aumenta y la inhibición revierte.
La actividad nitrogenasa de leguminosas se ve incrementada por presiones parciales de
CO2 altas (Finn y Brun, 1982; Williams et al., 1982)(2450). Este hecho puede ser debido, a que
bajo estas altas presiones, la relación C/N aumenta tanto en los exudados radicales como en la
hojarasca, lo cual favorece a las bacterias implicadas en la FSN (Curtis et al., 1994; Norby,
1994)(2450). El aumento en la actividad nitrogenasa en los nódulos puede deberse a una mayor
disponibilidad de C, necesario para la reducción del N2, (Hardy y Havelka, 1976)(2450). Sin
embargo, Zanetti et al. (1996) observan que la mayor fijación de nitrógeno por parte de la planta
bajo altas concentraciones de CO2, coincide con el aumento en el número y peso de los nódulos.
Otros factores abióticos que afectan directa o indirectamente a este proceso son, entre
otros, el magnesio, necesario para el funcionamiento de una pirofosfatasa en la membrana
peribacteroide (Bassarab y Werner, 1989), el boro (Bolaños et al., 1996), la concentración salina
(Delgado et al., 1993; Cordovilla et al., 1996), la concentración de ácidos orgánicos en el suelo
(Yuen y Stacey, 1996), la defoliación (Hartwig et al., 1987)(2259) y el etileno (Suganuma et al.,
1995).
1.1.2. Amonificación
La amonificación, también denominada mineralización del nitrógeno, consiste en un
conjunto de reacciones a través de las cuales el nitrógeno de proteínas y otros compuestos
presentes en la materia orgánica se libera en forma de amonio, siendo ésta forma asimilable
por las plantas (Singh y Kashyap, 1996) (Sep 2181). Este proceso es complejo y depende de
la actividad de microorganismos aerobios y anaerobios (Nugroho y Kuwatsuka, 1990)(sep
2365) que utilizan los compuestos orgánicos nitrogenados como fuente de energía (Jarvis et
al., 1996)(sep 2579). Parte del amonio que es liberado por la acción de los microorganismos
mineralizadores
es
utilizado
para
su
propio
desarrollo
quedando
inmovilizado.
Mineralización e inmovilización son procesos íntimamente conectados y se dan
simultáneamente en el suelo (Recous et al., 1992; Hart et al., 1994)(sep 2189). La
inmovilización es responsable de una demora en el rendimiento de fertilizantes (Broadbent y
16
Nakashima, 1967). Benkiser et al. (1989) sitúan entre un 20 y un 40% el nitrógeno de
fertilizantes que es inmovilizado en suelos agrícolas, y Hadas et al. (1989) establecen una tasa
algo menor (13-26%) en suelos adaptados para el cultivo en Israel. No obstante esta
inmovilización es relativa, toda vez que el amonio asimilado no escapa a la dinámica del
ciclo y a medio plazo se volverá a incorporar al suelo, siendo disponible para las plantas. En
teoría el balance entre éstos dos procesos podría fluctuar según las condiciones ambientales,
el suelo y la cantidad y naturaleza de los sustratos orgánicos. La tasa de mineralización
depende de la relación C/N de las bacterias en comparación con la relación de su sustrato.
Cuando las bacterias descomponen la materia orgánica se libera mayor cantidad de amonio si
la bacteria tiene mayor proporción de C/N que su sustrato (Hassink et al., 1994)(1003). En la
mayoría de los casos, existe una mineralización neta a lo largo del año, aunque en breves
periodos de tiempo pueda dominar la inmovilización (Ocio et al., 1991)(Sep 2579). El
balance entre estos dos procesos determina el flujo y la disponibilidad de nitrógeno (Powlson
et al., 1994)(Sep. 2180) y han sido reconocidos como importantes procesos edáficos desde
principios de siglo (Löhnis, 1910)(Sep 2579) ya que las formas minerales del nitrógeno son
esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas (Jarvis, 1996)(2579). Por tanto, su
estudio es necesario para tomar decisiones sobre las necesidades de fertilizantes, reciclado de
nitrógeno proveniente de restos de cultivos, abonos animales, mantenimiento de la materia
orgánica del suelo, emisión de gases con efecto invernadero y futuras prácticas agrícolas
(Jarvis, 1996)(Sep 2180).
1.1.2.a. Factores que afectan a la amonificación y microorganismos implicados en el
proceso
El rendimiento de la amonificación es muy variable y viene determinado por la
resultante de complejas interacciones entre los componentes biológicos, químicos y físicos
del suelo, que a su vez están sujetos a influencias externas.
McKenney et al. (1995) (sep 1068) indican que la naturaleza de la materia orgánica,
así como la cantidad y calidad de los restos vegetales es el principal factor que regula la
mineralización. Mengel y Kirkby (1978)(sep 2579) estiman que las proporciones relativas de
compuestos nitrogenados en los residuos vegetales son: menos de un 2% correspondiente a
fracción mineral (NO3-, NH4+, NO2-); aproximadamente un 5% de compuestos amino solubles
(ácidos, amidas y aminas); 90-95% proteínas y ácidos nucleicos. La proporción de cada una
17
de las tres fracciones esta influida por el estado de crecimiento de las plantas y tipo del
cultivo y nutrición, sobre la que tiene una especial incidencia los aportes de sustancias
nitrogenadas. Por tanto, atendiendo a las observaciones de McKenney et al. (1995) (sep 1068)
el tipo de cultivo y su manejo afecta de manera decisiva a la mineralización.
Las plantas inciden en la amonificación por el aporte de materia orgánica nitrogenada
de restos vegetales y a través de la exudación radical (Swift et al., 1979; Aber et al.,
1990)(sep 1992). Los exudados radicales no sólo afectan al proceso debido a que suponen una
fuente de materia orgánica, sino también porque en su composición aparecen diversas
sustancias que alteran el metabolismo de los microorganismos implicados en la
mineralización del nitrógeno (von Lützow y Ottow, 1994; Martens, 1995)(Sep 2070);
Badalucco et al., 1996)(sep 2544). Sobre este aspecto incidiremos más adelante al describir el
efecto de las plantas sobre los microorganismos rizosféricos.
Con respecto al aporte de compuestos orgánicos a través de los restos vegetales, su
riqueza en sustancias fenólicas solubles en agua es uno de los factores más importantes que
afectan la mineralización en suelos forestales, ya que dichos compuestos provocan la
estabilización de los compuestos orgánicos. La mayoría de los extractos acuosos de la
hojarasca incrementan la amonificación, pero otros la inhiben (Palm y Sanchez, 1991;
Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Hobbie (1996)(Sep 2511) afirma que la descomposición
viene controlada principalmente por la proporción de lignina y carbohidratos más que por el
nitrógeno presente en la hojarasca. Sin embargo en suelos agrícolas la situación parece ser
distinta, Broersma et al. (1995)(2098) encuentran que la tasa de mineralización en suelos
donde se han cultivado leguminosas es diez veces mayor que aquellos en los que han crecido
otro tipo de cultivo. Este hecho lo atribuyen a que estas plantas proporcionan mayores
cantidades de nitrógeno mineral al medio edáfico. Como se puede apreciar la diferencia
básica es que en sistemas agrícolas el aporte de compuestos polifenólicos no suele ser
importante si lo comparamos con sistemas forestales. Además el régimen de manejo del
suelo es completamente distinto. González-Prieto et al. (1996)(sep 2116) observan que la
mineralización neta a lo largo del año es mayor en suelos forestales que en suelos agrícolas.
El manejo de los suelos explicaría según estos autores alrededor del 20-25% de la varianza en
los índices de mineralización.
Hasta ahora se ha comentado el efecto de la materia orgánica sobre el proceso
amonificante derivado simplemente del aporte de sustrato metabolizable y su degradabilidad.
Sin embargo la presencia de sustancias que afectan al proceso metabólico en si también se
18
puede dar en esta vía además de por exudación radical. Durante la última década se ha
prestado especial atención a los mecanismos empleados por las plantas para controlar la
actividad de los microorganismos del ciclo del nitrógeno mediante toxinas o inductores. En
dichos procesos están implicados compuestos orgánicos complejos (taninos, terpenos y
fenoles) que alteran directamente la actividad microbiana en el suelo (Palm y Sanchez, 1990,
1991; Irons et al., 1991; Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Por lo tanto los metabolitos
secundarios afectan de forma importante al ciclo del nitrógeno y a la disponibilidad del
mismo (Schimel et al., 1996)(Sep 1992).
La textura controla la mineralización afectando a la distribución física de la materia
orgánica y confiriéndole cierto grado de protección a través de la asociación con partículas de
arcilla (Hassink et al., 1993)(2180). Por otra parte cuando la textura del suelo favorece las
condiciones aerobias aumenta la actividad amonificante (Drazkiewicz, 1995, 1996)(2365).
Por tanto los suelos con texturas más finas tienen menores tasas de amonificación que en
aquellos en los que la textura es más gruesa (van Veen et al., 1985; Catroux et al., 1987;
Hassink, 1994a)(1003). La textura del suelo no solo influye por su efecto sobre la aireación
del mismo, la reducción de los poros del suelo después de la compactación reduce el
transporte de sustancias solubles, disminuyendo el aporte de nutrientes (Drazkiewicz,
1996)(2365). Esto puede inhibir la degradación de lignocelulosa (Colberg, 1988)(2203), que
tiene una gran influencia en la degradabilidad de los residuos vegetales (Pinck et al.,
1950)(2203). Breland y Hansen (1996)(2203) encuentran que la mineralización disminuye en
un 18% en un suelo compactados, frente a otro no compactado.
La humedad del suelo es otro factor que afecta a la amonificación (Moorhead et al.,
1988)(Sep 1737). La deficiencia de agua hace disminuir la tasa de mineralización, ya que
determina la difusión de solutos y la distribución de los productos de la actividad microbiana
(Cabrera, 1993)(2579). Sin embargo, el exceso reduce la aerobicidad del suelo y altera las
actividades de distintas poblaciones bacterianas en diferentes micrositios. Se ha comprobado
que existe un aumento de la mineralización después de secar y rehidratar el suelo (Stevenson,
1956; Nordmeyer y Richter, 1985; Cabrera, 1993)(2606). La explicación de este hecho es que
mediante el secado del suelo y posterior rehumedecimiento los compuestos orgánicos se
vuelven disponibles para la extracción y también para la descomposición. Gestel et al.
(1991)(2606) proponen que los compuestos orgánicos mineralizados después de rehidratar el
suelo seco derivan principalmente de materia orgánica no biótica.
19
Existe una fuerte interacción entre la temperatura y la mineralización (Addiscott,
1983; Beck, 1983; Lochman et al., 1989; (2188) Neve et al., 1996) (Sep 2188), siendo
responsable de entre un 31 y un 41% de la varianza en las tasas de mineralización anuales de
un pastizal (Gill et al., 1995)(2579). La mayoría de los microorganismos del suelo son
mesófilos y prefieren temperaturas moderadas con un óptimo entre 25 y 37°C y una
temperatura base de 5°C. Los cambios de congelación descongelación tienen efectos similares
a los de secado y rehidratado (Jarvis et al., 1996)(2579). En general la mineralización
aumenta con la temperatura y tiende a ser menos variable a temperaturas altas (Stanford et al.,
1973)(2579), viéndose más favorecida la mineralización de residuos más resistentes (Neve et
al., 1996)(2188).
Un concepto interesante que puede aportar datos al conocimiento de la dinámica de la
mineralización del nitrógeno en el suelo es el introducido por Bonde et al. (1988)(2606).
Estos autores indican que sólo una pequeña parte del nitrógeno orgánico en el suelo es
realmente accesible a la mineralización y de ésta una proporción importante corresponde ala
propia biomasa bacteriana. Estos resultados encajan con los resultados de Choi y Nelson
(1996)(2553) que encuentran en la biomasa bacteriana un fertilizante nitrogenado de
excelente calidad ya que su nitrógeno es rápida y fácilmente utilizable por la planta, más que
los compuestos orgánicos procedentes de restos vegetales (Abuzinadah et al., 1986)(2446).
Un factor que puede tener influencia sobre la tasa de mineralización es la actividad de
la mesofauna y microfauna. La mineralización en la rizosfera se ve incrementada por el
“pastoreo” de los protozoos (Clarholm, 1985)(2544). Los protozoos estimulan la tasa de
crecimiento bacteriano (Coleman et al., 1978; Woods et al., 1982; Clarholm, 1985)(1003) así
como la producción de enzimas bacterianas implicadas en la mineralización (Badalucco et al.,
1996)(2544). Por otro lado la proporción C/N es normalmente mayor en la microfauna
comparada con la relación de su sustrato, mientras que para las bacterias es al revés y por ello
la microfauna excreta mayor cantidad de nitrógeno en forma de NH4+ (Hunt et al., 1987)
(1003). La textura afecta de forma indirecta, en éste sentido, a la mineralización del
nitrógeno, ya que la compactación del suelo disminuye el volumen de poros disponible para
los nemátodos, organismos que incrementan el reciclado de nitrógeno por la predación de
microorganismos (Elliott et al., 1980; Woods et al., 1982; Griffiths, 1986)(2203). En los
suelos con textura más gruesa la presión de pastoreo de nemátodos y flagelados sobre
bacterias es mayor y las tasas de mineralización también (Hassink et al., 1994)(1003). Se ha
comprobado que el “pastoreo” es mayor en suelos dedicados a pastos, donde la entrada de
20
residuos orgánicos es mayor que en suelos arados donde las entradas son menores, y además
se concentran sobre todo en la época de cosecha. (Hassink et al., 1994)(1003).
Tietma et al. (1992)(2116), no encuentran ninguna relación entre el pH del suelo y la
mineralización. sin embargo, trabajos posteriores como los de González-Prieto et al.
(1996)(2116) demuestran que la mineralización es mayor en suelos ácidos (pH<4.5), aunque
la incidencia de este factor sólo explicaba en torno a un 3-17% de la varianza. Pese a que la
mineralización se ve completamente inhibida en suelos bajo la influencia de lluvia ácida
(Wolters, 1991)(2116), estos resultados no se pueden extrapolar a suelos no alterados, en los
cuales las poblaciones microbianas están adaptadas a pH ácidos (Bramley y White,
1990)(2116).
Otros factores que afectan a la mineralización son: CIC (González-Prieto et al.,
1996)(Sep 2116). el fuego (Fritze et al., 1994; Singh, 1994), el estado de la sucesión (White
et al., 1988; Vitousek et al., 1989), la adición de nitrógeno (Jenkinson et al., 1985; Hart et al.,
1986)(2579), la disponibilidad de nutrientes (Entry et al., 1986), la presencia de
contaminación por metales pesados (Chang y Broadbent, 1982)(2579) y el pretratamiento de
los suelos (Campbell et al., 1993)(Sep 2098).
El grupo funcional de los mineralizadores es amplio y abarca a hongos y bacterias.
Entre los primeros destacan géneros del orden Mucorales (Mucor y Rhizopus) y
ascomycotinas del orden Aspergillales (Aspergillus y Penicillium), (Garrt 1963 y Alexander,
1980). Los hongos liberan menos amonio que las bacterias, dada su mayor necesidad de
nitrógeno para la síntesis celular y abundan en medios con pH ácido (Garret, 1963). Llevan a
cabo las primeras etapas de la descomposición de la materia orgánica vegetal especialmente
la de la hojarasca más recalcitrante. Hace falta un primer paso en la descomposición por parte
de hongos saprófitos para liberar el nitrógeno contenido en la hojarasca (Colpaert y Laere,
1996)(2446). Ectomicorrizas y basidiomicetos colonizan los horizontes orgánicos de los
suelos forestales y movilizan nutrientes a partir de los sustratos orgánicos (Read,
1991)(2447). Una vez los carbohidratos son metabolizados por los microhongos, los
basidiomicetos saprófitos se encargan de descomponer y mineralizar los compuestos más
recalcitrantes (Colpaert y van Tichelen, 1996)(2447). Las bacterias heterótrofas, son los
principales descomponedores y suponen más de un 90% del flujo de energía en el suelo
(Ladd y Foster, 1988). Normalmente se dividen en dos grupos: a) especies autóctonas que
mantienen relativamente constante su actividad y b) especies zimógenas que reaccionan
rápidamente ante nuevos aportes de sustrato y luego permanecen en dormición (Ladd y
21
Foster, 1988)(2579). Las bacterias están representadas por diversas especies de los géneros
Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Serratia y Micrococcus. A diferencia de los hongos,
Colpaert y van Tichelen (1996)(2447) señalan una mayor abundancia de bacterias en medios
básicos o neutros.
1.1.3. Nitrificación
La nitrificación es el proceso microbiológico que transforma el N-NH4+ en formas
oxidadas de N, nitrato y nitrito. De este proceso depende en parte la productividad del suelo, ya
que el nitrato suele ser la forma nitrogenada que prefieren las plantas para su nutrición (Tu,
1996)(2527). Según Manzhosov y Maymusov (1994) la productividad de un suelo depende de
la cantidad de nitratos que pueda producir y retener.
Benckiser, et al. (1996) esquematizan el proceso de la siguiente manera:
NH3 ➙ NH2OH ➙ HNO ➙ NO ➙ NO2- ➙ NO3➘
➘
N2O
N2O, N2
La transformación de NH4+, relativamente inmóvil, a NO3-, extremadamente móvil,
pasando por NO2- proporciona la oportunidad de escape de numerosos formas nitrogenadas
(NO3-, NO2-, NOx, N2O, N2). Estudios in vitro con Nitrosomonas europea (Yoshida y
Alexander, 1970; Ritchie y Nicholas, 1972)(2620) demostraron que las bacterias oxidantes de
amonio eran capaces de producir N2O bajo determinadas condiciones. Ritchie y Nicholas
(1972)(2620) concluyeron que éstas bacterias reducían el nitrito a óxidos de nitrógeno para
minimizar la acumulación de niveles tóxicos de nitrito intracelulares. Sin embargo, Poth y Focht
(1985) observaron que N. europea usa el nitrito como aceptor de electrones bajo condiciones de
anaerobiosis. Estudios posteriores han confirmado esta hipótesis (Benckiser et al., 1996)(2619).
Maag y Vinther (1996)(2620) estiman que un 1% del nitrógeno nitrificado se pierde en forma de
N2O. Esta ruta alternativa de los nitrificantes para continuar sintetizando ATP usando parte de
los productos de su metabolismo aerobio cuando están en condiciones de anaerobiosis, supone
una vía de reducción de la contaminación de aguas por nitratos, pero un aumento de los niveles
de N2O en la atmósfera (Benckiser et al., 1996)(2619). Si excluimos las pérdidas de nitrógeno
como N2O vía desnitrificación, las perdidas de nitrógeno añadido como fertilizante por
volatilización de amonio y por emisión de óxido nítrico vía nitrificación, se estiman
22
aproximadamente en un 20%, si los fertilizantes son orgánicos, y en un 10% si son químicos
(Schepers y Mosier, 1991). Por otra parte las pérdidas de nitratos a través del lavado pueden
llegar a ser mayores que las pérdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989; Davies y
Williams, 1995). Por las razones anteriormente expuestas se ha prestado especial atención
durante los últimos años al estudio de la nitrificación y al empleo de inhibidores de la misma,
que permitan mantener la productividad del suelo alcanzando un equilibrio entre las perdidas
por volatilización del amonio, por producción de óxidos de nitrógeno y por lavado de nitratos
(Davies y Williams, 1995). Diversas sustancias se han utilizado como inhibidoras de la
nitrificación, como por ejemplo herbicidas (Tu, 1996)(2527), insecticidas, fungicidas, así como
diversos compuestos químicos (Prasad y Power, 1995)(1304). El estudio de esta etapa del ciclo
del nitrógeno, se hace indispensable, no sólo por ser un proceso limitante, que además es vital
para el flujo, transferencia , pérdidas y utilización del nitrógeno, si no por las implicaciones
ecológicas que conlleva (Jarvis, 1996)(2180).
1.1.3.a. Factores que afectan a la nitrificación y microorganismos implicados en el proceso
Holmes et al. (1996)(2548) señalan la disponibilidad de amonio como regulador de la
nitrificación (Vitousek et al., 1982). Por esta razón, Standford et al. (1975) señalan como factor
limitante de la nitrificación la velocidad de mineralización y como ya hemos puntualizado en el
apartado anterior, la naturaleza y cantidad de los restos vegetales afectan de forma indirecta a
éste proceso (Paul y Clarck 1989)(2481). Sin embargo, H∅jberg et al. (1996) encuentran que en
suelos con niveles de amonio en torno a los 40 µg/g son otros factores distintos de la
disponibilidad de sustrato los que afectan al proceso, como aireación y humedad del suelo.
La disponibilidad de oxígeno es otro de los factores que más afecta a la nitrificación,
puesto que es un proceso aerobio. La supervivencia de las bacterias nitrificantes en ambientes
con concentraciones bajas de oxígeno, depende de su capacidad para competir con las raíces de
las plantas, con otras bacterias aerobias heterótrofas y con procesos químicos de oxidación
(Bodelier et al., 1996)(2458). Laanbroek y Gerards (1993) y Laanbroek et al. (1994)(2458),
demuestran que las bacterias nitrificantes son malas competidoras por el oxígeno comparadas
con bacterias heterótrofas (Laanbroek y Woldendorp, 1995)(2458). Sin embargo Bodelier et al.
(1996)(2458) observan que las bacterias nitrificantes que viven en ambientes donde se dan
fluctuaciones óxicas y anóxicas, son capaces de desarrollar adaptaciones fisiológicas,
23
aumentando su afinidad por el oxígeno para sobrevivir a las condiciones de microaerofilia.
Gunderson (1966) observa que un 10% de O2, es el óptimo para el crecimiento de nitrificantes.
Presiones superiores de oxígeno se han descrito como inhibidoras de Nitrobacter, siendo
necesarias bajas presiones de O2 para su crecimiento en medio sólido (Prosser, 1989)(2200).
Determinadas plantas promueven la aparición de nitrificantes en su rizosfera aportando oxígeno
a través del aerénquima (Lodhi et al., 1996)(2331). Sin embargo, como ya se ha indicado
anteriormente éstas bacterias deben competir con las plantas por el oxígeno y por tanto, la
disponibilidad de éste depende en gran parte de el estado de desarrollo de la planta y de la época
de crecimiento (Bodelier et al., 1996)(2458).
La humedad del suelo afecta a la nitrificación tanto por deshidratación como por
limitación de sustrato. Esta sensibilidad de los nitrificantes a la humedad del suelo está
relacionada con sus altos requerimientos energéticos, al diversificar su energía para sintetizar
solutos como aminas o polioles, que les ayudan a soportar situaciones de sequía (Sprent, 1987).
En organismos de crecimiento lento como los nitrificantes, se espera una fuerte selección
(selección k), y por ello, sus poblaciones suelen variar poco en el tiempo (Woldendorp y
Laanbroek, 1989)(2181), aunque Focht y Verstraete, (1977) (2548) observan variaciones
estacionales en estas poblaciones.
Las alteraciones del suelo debidas a la acción antropogénica afectan al funcionamiento
del ciclo del nitrógeno. El aumento en las concentraciones de nitratos, por deposición, tiene
diversos efectos sobre el suelo forestal, como por ejemplo, aumentar el lavado de Ca2+,
aumentar la solubilidad de Al3+ y disminuir la relación Ca/Al (Aber et al., 1989; Foster et al.,
1989)(2336). Este dato resulta de gran importancia, ya que la nitrificación se inhibe a altas
concentraciones de Al3+ y Fe3+, aunque las concentraciones de amonio sean altas (Liang y
Tabatabai, 1978)(2336). Como consecuencia del cultivo se altera la estabilidad del suelo y se
reduce la cantidad de carbono orgánico (Bauer y Black, 1981; Gupta y Germida, 1988;
Srivastava y Sing, 1989)(2181). Las pérdidas de carbono orgánico reducen el número de
macroagregados en los suelos cultivados (Sing y Sing, 1995)(2181) y esto tiene un considerable
impacto sobre la mineralización ya que la materia orgánica de macroagregados es más lábil y
más fácil de mineralizar que la asociada a microagregados (Gupta y Germida, 1988)(2181). Jha
et al. (1996)(2181) calculan que el número de oxidantes de amonio y de nitrito en suelo agrícola
es un 48 y 31% del presente en suelo forestal lo que podría deberse a los factores antes
señalados.
24
A pesar de ser microorganismos autótrofos, Berg y Rosswall (1985, 1987)(2181)
encuentran una correlación positiva entre las cantidades de carbono orgánico y el número y
actividad de oxidantes de amonio y nitrito. En este sentido influye el efecto de la materia
orgánica sobre la mineralización y la relación entre este proceso y la nitrificación (Standford et
al., 1975; Paul y Clark, 1989), pero además la materia orgánica del suelo aumenta la aireación
del mismo, lo cual es crucial para los nitrificantes que dependen de los sistemas citocromo para
el transporte de electrones y finalmente del oxígeno (Haynes, 1986). Sin embargo, cantidades
excesivas de materia orgánica junto con una excesiva humedad pueden crear situaciones de
anoxia inhibiendo, por tanto, la nitrificación (Jha et al., 1996)(2181).
La textura del suelo afecta decisivamente la nitrificación puesto que la difusión de
oxígeno, así como el mantenimiento del agua se produce de forma desigual según el tamaño del
poro y de los agregados telúricos Drazkiewicz (1996)(2289). Por otro lado la heterogeneidad del
suelo y el contenido en arcillas afectan decisivamente al proceso ya que las arcillas adsorben
iones amonio, y como resultado existe una colonización entorno a ellos de los oxidantes de
amonio (Powell y Prosser, 1992)(2181).
El metabolismo del nitrito es extremadamente rápido, salvo en ocasiones que queda
retenido en el suelo, dependiendo de las características del mismo, las prácticas agrícolas como
fertilización con amonio, pH, contenido de materia orgánica, temperatura y humedad (Burns et
al., 1995)(2269). La alcalinidad del suelo favorece la acumulación de nitrito, en los lugares
donde se dan altas concentraciones de NH3 y altos pH, el nitrito tiende a acumularse, ya que su
oxidación está inhibida (Van Cleemput y Samater, 1996)(2269). Estos dos factores parecen
afectar más a los oxidantes de nitrito que a los oxidantes de amonio, lo cual deriva en una
acumulación de NO2- en el suelo. Otros autores han observado una acumulación de nitrito a
bajas concentraciones de carbono orgánico y a bajas temperaturas (Habr y Goltermasn,
1990)(2269).
Las plantas afectan a este proceso produciendo compuestos alelopáticos que inhiben
directamente la nitrificación (Rice, 1984)(1992). Entre estos metabolitos secundarios destacan
los taninos (Thibault et al., 1982; Baldwin et al., 1983), fenoles de bajo peso molecular (Lodhi y
Killingbeck, 1980) y terpenos (White, 1986). Por otro lado, los fenoles, taninos y otros
metabolitos secundarios de las plantas afectan a la nitrificación de forma indirecta, cambiando la
descomponibilidad de los compuestos orgánicos, lo que supone un retraso en la descomposición
y mineralización de los mismos (Palm y Sanchez, 1990, 1991; Irons et al., 1991; Gallardo y
Merino, 1992)(1992).
25
Otros factores que afectan al proceso son la temperatura (Savey, 1967), el pH (Katyal et
al., 1988), la concentración de ácidos orgánicos (Karmarkar y Tabatabai, 1991), metales
pesados (Dusek, 1995), capacidad de intercambio catiónico y disponibilidad de fosfatos
(Vitousek et al., 1982), el fuego (Acea y Carballas, 1996)(2658) y concentración de nitrato
(Gomez et al., 1996)(2127), entre otros.
La nitrificación la pueden realizar ciertos microorganismos heterótrofos. Estudios
llevados a cabo con cultivos de microorganismos nitrificantes heterótrofos (Doxtader y
Alexander, 1966; Schmidt, 1973; Focht y Verstraete, 1977; Tate, 1985) indican que éstos no
hacen uso de la energía liberada en la oxidación para su crecimiento y, como apunta Alexander
(1980), los productos oxidados no aparecen hasta que ha cesado la fase exponencial de
crecimiento. Todo ello sugiere que la nitrificación heterótrofa no tiene una importancia muy
grande en lo que respecta a la producción de N-NO3-.
La nitrificación quimioautótrofa es llevada a cabo por dos grupos fisiológicos de
bacterias Gram negativas quimioautótrofas pertenecientes a Nitrobacteraceae (Watson et al.,
1981; Schmidt, 1982)(2181); la primera etapa, la conversión de amonio a nitrito, es mediada por
bacterias oxidantes de amonio (Jha et al., 1996)(2181) que pertenecen sobre todo a los géneros
Nitrosomonas, Nitrosoglea, Nitrosospira, Nitrosococcus y Nitrosocystis. La segunda, el paso de
nitrito a nitrato por bacterias oxidantes de nitrito (Jha et al., 1996)(2181) pertenecientes en su
mayoría a los géneros Nitrobacter y Nitrocystis. Entre los microorganismos que realizan la
nitrificación heterótrofa pueden mencionarse algunos géneros de bacterias como Azotobacter,
Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Alcaligenes, Nocordia y Thiosphaera, a este último
género pertenecen los desnitrificantes aerobios anteriormente mencionados y hongos del orden
Aspergillales de los géneros Aspergillus y Penicillium.
1.1.4. Desnitrificación
La desnitrificación microbiológica consiste en la reducción del nitrato a óxidos de
nitrógeno y nitrógeno molecular. Para ello las formas oxidadas de nitrógeno sirven como
últimos aceptores de la cadena respiratoria con el subsiguiente rendimiento energético (Bernet et
al., 1995)(1290), por lo tanto el proceso sólo ocurre en condiciones anaerobias. Zanner y Bloom
(1995), detectan actividad desnitrificante en suelos bien aireados, hecho que imputan a la
presencia de microespacios anaerobios entre las partículas constituyentes del suelo o en la
proximidad de residuos orgánicos. En consecuencia, en el suelo se dan simultáneamente
26
procesos nitrificantes y desnitrificantes (Burns et al., 1995b)(2200) ocupando los
microorganismos la superficie de agregados del suelo (con mayor tensión de oxígeno) o el
interior de las partículas (con menor tensión de oxígeno), respectivamente (Tate, 1985). Ye et
al., (1994) especifican el conjunto de reacciones constituyentes del proceso como sigue:
NO3- ➙ NO2- ➙ NO ➙ N2O ➙ N2
Cada una de las distintas etapas está catalizada por una enzima específica distinta
(Hochstein y Tomlinson, 1988; Stouthamer, 1991)(2637). Así, sólo algunos microorganismos
poseedores del juego enzimático completo pueden producir nitrógeno molecular a partir de
NO3-, por lo que Ingraham (1981) sólo considera desnitrificantes estrictos a dichos
microorganismos. Lo más habitual es, sin embargo, que sólo posean algunas de estas enzimas,
por lo cual liberan únicamente productos parcialmente reducidos (Hall, 1978(Tesina Lu);
Tiedje, 1988; Ye et al., 1994)(2637). Las cuatro reductasas implicadas en el proceso difieren en
sus condiciones óptimas con respecto a variables, como: concentración de oxígeno, pH,
concentración de NO3-, disponibilidad de carbono, etc. Por tanto las condiciones ambientales
juegan un papel importantísimo determinando si la desnitrificación es total o parcial y por tanto
que productos del proceso se acumulan (Burns et al., 1996)(2200).
El nitrato puede ser también reducido asimilatoriamente (se han encontrado procariotas
capaces de dicha reducción) sin que éste sea liberado al medio (Blackburn, 1983). Esta ruta,
conocida como reducción asimilatoria es reprimida por el amonio y no está acoplada a la
producción de ATP, por lo que se verifica tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Bernet et
al. (1995) apuntan que existe una vía desasimilatoria que produce amonio y que está acoplada a
la formación de ATP. Esto supone para los microorganismos capaces de realizarla una fuente
extra de energía y para los ecosistemas, una vía de liberación de nitrito y del exceso de poder
reductor (Yordy y Ruoff, 1981). La proporción entre desnitrificación y reducción
desasimilatoria es función de la relación carbono disponible/aceptor electrónico, tamaño de la
población bacteriana y su actividad (deCatanzaro y Beauchamp, 1985; Fazzolari et al.,
1990)(2481).
Existen también procesos de desnitrificación estrictamente abióticos, aunque su
importancia es mínima (Hutchinson y Davidson, 1993), limitándose a suelos muy ácidos o
helados (Vermoesen et al., 1996).
27
1.1.4.a. Factores que afectan a la desnitrificación y microorganismos implicados en el
proceso
La tasa de desnitrificación responde a la concentración de nitrato de acuerdo con una
cinética de Michaelis-Menten (Firestone, 1982)(2209). Sin embargo, esta variable afecta de
forma diferente a las distintas enzimas implicadas en la desnitrificación. En algunas bacterias el
nitrato inhibe la síntesis de la nitrito reductasa (Unden et al., 1980)(2200). Por lo tanto en suelos
donde la nitrificación sea intensa y se acumulen altas concentraciones de NO3-, este se reduce a
NO2-, pero su transformación en óxidos de nitrógeno estará bloqueada y se pueden acumular
cantidades elevadas de NO2-. La concentración de NO3- afecta a la cantidad de N2O y N2
producidas durante la desnitrificación (Swerts et al., 1996)(2624). Hutchinson y Davidson
(1993)(2624) proponen la hipótesis de que cuando la disponibilidad de oxidantes prevalece
sobre la de reductores, el sustrato nitrogenado es sólo parcialmente reducido, por lo que la
relación N2O/N2 aumenta.
También el NO inhibe la nitrito reductasa (Carr et al., 1989)(2200). Esto supone un
mayor rendimiento en la reducción completa hasta N2 y por lo tanto un mejor rendimiento
energético, al evitar pérdidas de NO cuando se sobrepasa la capacidad de la óxido nítrico
reductasa.
Al aumentar la humedad del suelo, los niveles de desnitrificación aumentan (Mosier et
al., 1983; Groffman y Tiedje, 1991; Weier et al., 1993)(2200). Este efecto es muy acusado si la
humedad es superior al 60% (Linn y Doran, 1984; Aulakh et al., 1991). Cuando la humedad del
suelo está en torno a su capacidad de retención máxima, se favorece el aumento de NO
incrementándose las cantidades de oxido nitroso (Burns et al., 1996)(2200) al mismo tiempo
que la relación N2O/N2 disminuye (Vinther, 1996)(2620).
La desnitrificación heterótrofa requiere una abundante fuente de carbono orgánico
degradable, por lo tanto es un factor crítico para dicha actividad (Bowman y Focht, 1974;
Stanford et al., 1975a; Beauchamp et al., 1989)(2209). Cuando en el suelo existen
concentraciones de NO3- no limitantes para el proceso, la disponibilidad de carbono es el factor
más importante en el control de la desnitrificación (Lalisse-Swerts et al., 1996)(2624). En
condiciones aerobias las bacterias desnitrificantes son capaces de utilizar gran variedad de
fuentes de carbono, sin embargo, bajo anaerobiosis, este número se reduce (Beauchamp et al.,
1989)(2481). Además, Ganaye et al. (1996) demuestran que el tipo de fuente de carbono afecta
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de forma decisiva a la actividad de las distintas enzimas implicadas en el proceso, de forma que
según la fuente de carbono empleada, la cantidad de nitrito acumulada varía considerablemente.
El oxígeno afecta de forma diferencial a las distintas enzimas del proceso. La síntesis de
la nitrito reductasa es reprimida por el oxígeno, siendo esta enzima la más sensible a este factor
de todas las implicadas en la desnitrificación (Cole, 1994)(2200). Parkin (1987)(1748) introduce
el concepto de “puntos calientes”, zonas en que la intensidad de respiración microbiana se ve
favorecida debido a una abundante disponibilidad de carbono orgánico junto con niveles
apropiados de oxígeno. Dicha respiración excede el suplemento de oxígeno por difusión durante
un tiempo limitado, favoreciendo la desnitrificación. La variabilidad en la actividad
desnitrificante bajo condiciones de campo sugiere que la desnitrificación en gran parte debe
estar asociada a estos puntos calientes. En los sistemas agrícolas se forman tipos especiales de
puntos calientes ya que los residuos vegetales proporcionan altas concentraciones de carbono y
nitrógeno (Paul y Beauchamp, 1989; Nielsen y Revsbech, 1994)(1748). Estos puntos calientes
sostienen la actividad desnitrificante durante largos periodos (Thompson et al., 1987)(1748).
El tipo de manejo que se le de al suelo afecta de forma significativa a la desnitrificación
en el suelo. Los suelos agrícolas son una importante fuente de emisión de óxidos de nitrógeno
ya que el cultivo continuo altera la agregación del suelo (Hart et al., 1985; Burns y Davies,
1986)(1012). Además en estos suelos la disponibilidad de nitrógeno inorgánico y carbono
orgánico es alta por varias razones: la aplicación de fertilizantes nitrogenados, la mineralización
de nitrógeno orgánico y la disponibilidad de carbono orgánico debido a los aportes de restos
vegetales (Vermoesen et al., 1996)(2194). La desnitrificación es uno de los procesos causantes
de la disminución de eficacia de los fertilizantes químicos y en general del nitrógeno disponible
para los cultivos (Swerts et al., 1996)(2624). Constable et al. (1992)(2582) observan que sólo
un 40% del nitrógeno de los fertilizantes pasa a formar parte de la cosecha. Se ha estimado que
cerca de 1.5 Tg de nitrógeno se inyectan directamente a la atmósfera cada año en forma de N2O
como resultado de la aplicación de fertilizantes en los sistemas agrícolas (CAST, 1992; Watson
et al., 1992)(2191). Esto supone un 44% de las entradas debidas a la acción antrópica y un 13%
del total anual. Estas estimas (Watson et al., 1990, 1992) (2191) no incluyen la producción de
N2O por otras vías como son los abonos animales y la fijación simbiótica de nitrógeno. En los
pastizales las pérdidas de N2O son normalmente menores que en suelos agrícolas, en torno a un
2% del nitrógeno aplicado por fertilización (Granli y B∅ckman, 1994; Van Cleemput et al.,
1994; Velthof y Oenema, 1994) y la transformación de pastizal a tierra de cultivo incrementa la
desnitrificación (Mosier et al., 1996)(2191). Por todas las razones expuestas, la desnitrificación
29
en suelos cultivados se ha estudiado durante muchos años para cuantificar las pérdidas de
nitrógeno por esta vía, determinar el efecto de factores ambientales en las tasas de
desnitrificación y optimizar el rendimiento de los cultivos (Fuch, 1974; Linn y Doren, 1984;
Myrold y Tiedje; 1985; Prade y Trodlenier, 1989; Klemedtsson et al., 1991; Colbourn,
1993)(1761).
Como ya se ha indicado anteriormente el tipo de materia orgánica disponible afecta
considerablemente al proceso. Por esta razón el tipo de cultivo influye sobre la tasa de
desnitrificación. McKenney et al. (1993)(2481) observan un aumento significativo de la
actividad desnitrificante al suministrar restos secos de leguminosas. Este aumento es mayor que
si los restos provenían de otro tipo de planta. Galbally et al. (1992) indican que las leguminosas
contribuyen a la emisión de oxido nitroso de varias formas: el nitrógeno atmosférico fijado por
las leguminosas puede ser nitrificado y desnitrificado del mismo modo que el nitrógeno de los
fertilizantes, y además los rizobios que viven en simbiosis con este tipo de plantas son capaces
de desnitrificar y de producir N2O (García Palazola et al., 1995)(1394).
La textura afecta al proceso interaccionando con otros factores como la temperatura
(Vinther, 1996)(2620) y el oxígeno (Corre et al., 1995). Cuando se añade nitrógeno y carbono al
suelo, la desnitrificación aumenta, pero, este aumento es variable según la textura y la humedad
del suelo (Paul, et al., 1993; Vinther, 1996)(2620). Diferencias en las propiedades físicas del
suelo se traducen en diferencias en la capacidad de retención del agua y capacidad de
percolación. Esto afecta de modo indirecto a la desnitrificación, ya que la disponibilidad de
nutrientes también varía con estos parámetros. Ensayando agregados simples, Sexstone et al.
(1951) y Lensi et al. (1991) (1012) observan que la actividad desnitrificante no aparece en
todos los agregados telúricos, aunque existiesen centros anaerobios (Sexstone et al., 1985)
(1012). Comparando suelos agregados y no agregados, Sexstone et al. (1988) (1012) sugirieron
que la discontinuidad de carbono disponible, concentración de nitrato y bacterias
desnitrificantes eran los factores limitantes de la desnitrificación en suelos agregados, mientras
el oxígeno inhibe más que la disponibilidad de sustratos en suelos no agregados.
Entre otros factores que también inciden en la desnitrificación podemos citar: la
temperatura (Estavillo et al., 1994; Zanner y Bloom, 1995), el pH (Wang et al., 1995;
Vermoesen, et al., 1996)(2194), la vegetación y sus características (García, 1977; Mikkelsen,
1987; H∅jberg et al., 1996), los pesticidas (Goring y Laskowski, 1982; Knowles, 1982), las
condiciones climáticas (Aulakh et al., 1992) y el tamaño de la población desnitrificante
(Firestone, 1982)(2209).
30
De los microorganismos heterótrofos un 5% son desnitrificantes (Tiedje et al.,
1982)(1012). Las bacterias heterótrofas que llevan a cabo la desnitrificación pertenecen a
diversos grupos taxonómicos. García (1977) señala el género Bacillus como el máximo
contribuyente a la desnitrificación en ambientes naturales. Tiedje et al. (1984) señalan a
Pseudomonas y Gamble et al., (1977) a Clostridium. Existen otros géneros en los que aparecen
especies desnitrificantes como Thiosphaera y Alcaligenes
(Robertson et al., 1995) y
Flavobacterium (Wang et al., 1995), pero su menor representatividad
cuantitativa en
comparación con los géneros anteriormente mencionados, hace pensar que su incidencia en la
desnitrificación a nivel edáfico a de ser apreciablemente menor.
1.2. Interacciones del sistema suelo-planta
En 1904, Hiltner define la rizosfera como aquella porción del suelo en torno a la raíz de
leguminosas, con una mayor actividad microbiana dada la alta concentración de carbono y otros
nutrientes existentes en esta zona. Posteriormente este concepto fue redefinido y actualmente se
considera rizosfera la porción de suelo influida por las raíces vivas. Son muchos autores los que
a partir de 1904 se han dedicado al estudio de la rizosfera, cabe destacar, entre otros, los trabajos
de Starkey (1949) en los que demuestra los principales efectos de la planta en el crecimiento de
microorganismos edáficos, los de Rovira (1959), Vancura (1964), Rovira y Bowen (1966) y
Rovira et al. (1979) sobre la naturaleza y el papel de los exudados en la rizosfera y toda una
serie de trabajos y revisiones sobre las propiedades y características de esta región edáfica que
nos permiten considerar el "efecto rizosfera" como uno de los factores clave que afectan a la
producción primaria (Rovira, 1979; Lynch, 1983; Curl y Truelove, 1986; Wild, 1988; Lynch,
1990)(Agus).
La rizosfera posee una estructura compleja en la que actúan gran número de variables.
Al igual que cualquier ecosistema, es un sistema termodinámicamente abierto en el que se
produce un intercambio constante de masa y energía (Foster, 1988; Smiles, 1988). El estudio de
este sistema es muy complicado debido al alto número de interacciones que en él se dan. La
planta durante su desarrollo va a influir en la microflora edáfica, y los microorganismos a su vez
interaccionan con las plantas, encontrándose diferencias importantes en la fertilidad del suelo
según estudiemos el suelo rizosférico y el no rizosférico (Gobran y Clegg, 1996). Los
microorganismos también interaccionan con los componentes físicos del ambiente radical
alterando la naturaleza del suelo, produciendo polisacáridos y otros compuestos orgánicos que
31
promueven la formación de agregados (Lynch, 1987). En resumen, el entorno rizosférico viene
determinado por la triple interacción suelo, planta y microorganismos.
1.2.1. Efecto de la planta sobre el suelo y las comunidades microbianas edáficas
Las plantas modifican las comunidades microbianas del suelo de un modo fundamental
(Remacle y De Leval, 1975; Acero et al., 1994). Alexander (1980) observa cómo diferentes
especies de plantas en un mismo tipo de suelo, presentan rizosferas muy diversas, mientras que
la rizosfera de una misma especie, cultivada en suelos muy diferentes varía muy poco.
Lozano y Velasco (1972 y 1981), estudian este problema en zonas repobladas con Pinus
pinaster Ait. y Eucaliptus camaldulensis Denn., donde el bosque climácico era un robledal de
Quercus pyrenaica Wild. y un alcornocal-encinar, respectivamente. En el primer caso observan
como la especie introducida modifica substancialmente el ciclo del carbono, mientras que en el
segundo caso es el ciclo del nitrógeno el que se altera de forma importante. En la rizosfera se da
una mayor desnitrificación que en el resto del suelo (Klemedtsson et al., 1987b)(1637). La
rizosfera puede ser un sitio de bajo contenido en oxígeno, las raíces y los microorganismos
consumen rápidamente el O2 (Woldendorp, 1962; Klemedtsson et al., 1987a; Hfjberg y
Sfrensen, 1993) (1637). El aporte de C por los exudados radicales y las bajas concentraciones
de O2 favorecen la síntesis de enzimas desnitrificantes y por lo tanto la actividad y crecimiento
de estas bacterias (Hfjberg et al., 1996)(1637). Los trabajos de Gutiérrez Mañero y Bermúdez
de Castro (1983), Bermúdez de Castro y Gutiérrez Mañero (1987) y Pozuelo Gonzalez et al.
(1992) con Myrica gale (L.) indican que esta especie tiene un efecto beneficioso sobre el suelo
de los lugares en que es autóctona, ya que acelera el reciclado de la materia orgánica
nitrogenada, incentivando así la productividad del ecosistema. Llinares (1990) y Pozuelo et al.
(1995) encuentran que Eleagnus angustifolia L. y Alnus glutinosa (L.) Gaertn. respectivamente
modifican los componentes bióticos y abióticos del suelo, produciendo un incremento de la
materia orgánica y de la velocidad de reciclado del nitrógeno. Los trabajos de Lawley et al.
(1983) y Schmitz et al. (1989) siguen la misma línea, estudiando en el primer caso los
microorganismos asociados a la rizosfera de varias plantas herbáceas, y en el segundo la
variación de los microorganismos edáficos durante la sucesión de un pastizal mediterráneo.
Turner y Frantz (1985) señalan que el efecto de la vegetación sobre el suelo y las
comunidades microbianas que lo pueblan se verifica principalmente por cuatro vías:
* Aporte de diferentes compuestos por el lavado de las partes aéreas por la lluvia.
32
* Adición de materia orgánica al suelo a través del lecho de hojarasca.
* Efecto de las raíces a través de exudados, secreciones etc, en la aireación y estructura
del suelo así como en la composición y funcionalidad de microorganismos.
* Formación de microclimas por efecto dosel.
La lluvia, al lavar las partes aéreas de la planta (tallos, ramas y hojas) arrastra nutrientes
hacia el suelo. Bollen y Lu (1968) encuentran que el agua de lluvia que ha lavado las partes
aéreas del aliso, contienen de 2 a 10 veces más nitrógeno que la caída a cierta distancia de la
betulácea. Este aporte junto con el producido por otras vías provoca un incremento significativo
del nitrógeno en aquellos lugares colonizados por esta planta (Pozuelo et al., 1995), provocando
modificaciones importantes en algunas etapas del ciclo del nitrógeno (Kim et al., 1995).
Muchas plantas excretan en la superficie foliar complejos resinosos de compuestos orgánicos,
formados principalmente por: terpenoides, agliconas, flavonoides y fenoles embebidos en una
matriz acuosa (Wollenneber y Dietz, 1981; Wollenneber et al., 1991)(1505). Estos componentes
pueden ser lavados y afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas del
suelo, actuando como activadores o inhibidores enzimáticos.
La materia orgánica condiciona muchas de las propiedades del medio edáfico que
influyen en el sistema suelo-planta y por tanto afecta al crecimiento y desarrollo de la microflora
del suelo (Fresquez y Lindemann, 1982 (Marisa); Grayston et al., 1996(Agus). La hojarasca
constituye una de las principales vías de entrada de materia orgánica al suelo (Tiessen et al.,
1984). La estructura y composición del lecho de hojarasca regula la tasa de mineralización, por
lo que incide de forma decisiva en la producción primaria de los ecosistemas (Hunt et al., 1988).
Los restos vegetales de coníferas se descomponen con lentitud, ya que contienen una baja
proporción en nutrientes con nitrógeno y fósforo(Cowling y Merril, 1966). Sin embargo, la
descomposición de las hojas de plantas fijadoras de nitrógeno es relativamente rápida debido a
su elevada concentración en compuestos nitrogenados; estas plantas además influyen
considerablemente en los microorganismos edáficos, principalmente sobre aquellos implicados
en el ciclo del nitrógeno. Rossiter (1966) indica que las estructuras vegetativas de leguminosas
tienen más del doble de nitrógeno que las gramíneas, y lo mismo ocurre con sus semillas y con
los frutos (semillas más la vaina). Valores parecidos encuentran Gómez Gutiérrez y Duque
Macias (1973) y Duque et al. (1973).
Las plantas son capaces de mejorar el estatus de nutrientes de suelos pobres, tanto
absorbiendo los nutrientes de las capas más profundas y aportándolos de nuevo en las más
superficiales a través de la hojarasca como aumentando la retención de los mismos
33
incrementando la capacidad de intercambio catiónico del suelo (Bernhard-Reversat,
1996)(2609).
El crecimiento microbiano está limitado por la disponibilidad de carbono orgánico. Las
raíces en crecimiento son una fuente vital de carbono para la biomasa microbiana (Whipps y
Lynch, 1983; Helal y Sauerbeck, 1986; Wheatley et al., 1990). Como resultado de todo ello la
rizosfera es rica en microorganismos, Paul y Clark (1989), estiman que la densidad microbiana
es 100 veces mayor abundante que fuera de ella. Pero esta variación es también cualitativa,
como se desprende de los trabajos de Bowen y Foster (1978) en los que comprueban que los
tiempos de generación de Psedomonas sp. y Bacillus sp., creciendo en la rizosfera, son 5.2 y 39
horas respectivamente, en tanto que fuera de ella hay una generación cada 77 y 100 horas.
Norton y Firestone (1991) observan que el 57% de las bacterias son activas en la rizosfera del
pino ponderosa, mientras que sólo el 41% los son en el suelo libre de la influencia de las raíces.
Estos autores proponen que únicamente en el ambiente rizosférico las bacterias encuentran
fuentes de carbono adecuados para mantener sus requisitos metabólicos. Por tanto, la liberación
de compuestos orgánicos por las raíces tiene una influencia decisiva sobre la disponibilidad de
nutrientes y en consecuencia sobre la actividad microbiana (Bowen y Rovira, 1991). Además de
sustrato para las bacterias, estos compuestos orgánicos son importantes, dada su capacidad para
quelar cationes (Marschner, 1991; Vaughan et al., 1993) y para formar agregados telúricos
(Foster, 1990).
Las rizodeposiciones podríamos dividirlas en varios grupos dependiendo de su forma de
liberación:
* Exudados hidrosolubles. Comprenden sustancias de bajo peso molecular que son
liberadas sin la mediación de ninguna actividad metabólica. Su exudación se lleva a cabo a
favor de un gradiente de concentración (Burström, 1955; Bowen y Rovira, 1991).
* Secreciones. Comprenden sustancias de mayor peso molecular, requieren de un
proceso metabólico para su liberación. Pueden liberarse en contra de gradientes de potencial
químico o electroquímico (Hale et al., 1978).
* Lisados que provienen de la autolisis celular y que comprenden el contenido celular y
con el tiempo, toda la raíz (Whipps, 1990)
* Gases como etileno, dióxido de carbono y cianhídrico. Rovira (1956, 1969, 1973)
considera estos gases como parte de los exudados de bajo peso molecular.
* Mucílagos que cubren las raíces de muchas plantas y están compuestas principalmente
por polisacáridos y ácidos poligaracturónicos de alto peso molecular (Marschner, 1986; Watt et
34
al., 1993). Cuando este mucílago se forma en condiciones no axénicas, resulta de la actividad de
la planta y de los microorganismos y recibe el nombre de mucigel (Jenny y Grossenbancher,
1963; Oades, 1978)(A).
Normalmente es imposible distinguir entre los distintos tipos mencionados, por lo que
Uren y Reisenauer (1988) y Rovira (1969) consideran exudados a todas las sustancias orgánicas
liberadas por la raíz. La exudación radical se produce sobre todo en las uniones longitudinales
de las células (Bowen, 1979). Por otra parte los restos de raíces muertas constituyen un 40% del
total de la materia orgánica que entra en el suelo (Lee y Pankhurst, 1992). Este carbono se libera
en la rizosfera que constituye un 2-3% del total del volumen del suelo (Coleman et al., 1978).
Las raíces muertas también aportan compuestos orgánicos y suministran nutrientes al suelo que
influyen decisivamente sobre la biomasa (Joslin y Henderson, 1987; Whipps, 1990), en la
dinámica del ciclo del nitrógeno (McClaugherty et al., 1984) y la producción primaria neta de
los ecosistemas forestales (McClaugherty et al., 1982).
La especie, edad de la planta, estado fisiológico y grado de lignificación del aparato
radical son características que afectan decisivamente a la composición cualitativa y cuantitativa
de los exudados radicales (Hamlen et al., 1972; Lynch, 1990; Gutiérrez Mañero et al., 1994;
Gutiérrez Mañero et al., 1995) y por lo tanto son factores que influyen en la magnitud del efecto
rizosfera. El tipo de proteínas (Juo y Stotzky, 1970) o de carbohidratos (Hamlen et al., 1972)
exudados por las herbáceas depende de la edad de la planta. Los cambios en la exudación con la
edad también se han detectado en leñosas, observándose que las plántulas exudan una mayor
cantidad de carbohidratos (cuantitativa y cualitativamente hablando), mientras que las plantas
adultas exudan más aminoácidos, amidas y ácidos orgánicos (Smith, 1970). Las plantas
perennes suelen exudar una mayor proporción de fotosintatos (40-73%) que las anuales (1046%) (Marschner, 1986; Helal y Sauerbeck, 1986). Esto puede ser debido a que las plantas
perennes utilizan parte de estos exudados para sobrevivir a lo largo del año a situaciones de
estrés (Harris et al., 1980). Como regla general, las leguminosas provocan un efecto rizosfera
más pronunciado que los pastizales o los cultivos de grano y esto se potencia aún más en
leguminosas bienales o perennes (Alexander, 1980).
La intensidad y fotoperiodo de luz, la temperatura y el estrés hídrico influyen del mismo
modo, así este último produce un aumento de materia orgánica por un proceso osmótico y
porque hay raíces que no son capaces de resistir esas condiciones. Bajo condiciones de estrés la
planta parece ejercer un control completo sobre los patrones de liberación temporales y
espaciales (Takasi et al., 1984; Pellet et al., 1995; Ryan et al., 1995)(2575).
35
La naturaleza de los exudados ha sido objeto de distintos estudios. Es clásico el trabajo
de Vancura y Hovadik (1965), en el que encuentran que las distintas plantas estudiadas liberan
al exterior aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares de muy diversos tipos. Estos compuestos
son para Kraffczyk et al. (1984) y Sundin et al. (1994) los componentes fundamentales de los
exudados de la mayoría de las plantas. También se han detectado esteroles, ácidos fenólicos,
ácidos grasos, vitaminas, compuestos volátiles, factores de crecimiento, nucleótidos, flavonas,
enzimas y hormonas (Curl y Truelove, 1986; Whipps, 1990). Algunos de estos productos
inciden en la microflora rizosférica alelopáticamente como los dos isoflavonoides (cumestrol y
daizeina), que D`Arcy Lameta y Jay (1987) encuentran como inhibidores o estimuladores de
distintos géneros bacterianos.
Smith (1976) observa que a través de las raíces se liberan gran cantidad de iones
inorgánicos relacionados con los constituyentes orgánicos. Alrededor de un 71% son cationes
(Ca2+, Na+, K+, NH4+, Mg2+) y un 12% de aniones (SO42-, Cl-, PO43-, NO3-), un 11% de ácidos
orgánicos, 5% de carbohidratos y un 1% de aminoácidos (Smith, 1976).
La composición de los exudados varía según la zona de la raíz que estudiemos. Los
azúcares se liberan a lo largo de toda la raíz mientras que los aminoácidos y los ácidos orgánicos
parecen exudarse sobre todo en las zonas más próximas al ápice (Hoffland, 1992; Jones y
Darrah, 1994).
Los ácidos orgánicos son liberados por las raíces para mejorar la nutrición de la planta,
ya que facilitan la movilización de metales como el manganeso (Godo y Reisenauer, 1980;
Uren, 1982). Pero de un modo indirecto la movilización de nutrientes también puede afectar a la
actividad microbiana. El ácido málico y el cítrico forman quelatos estables con el Fe3+ y con
Al3+ (Vaughan et al., 1993)(A)(Jones y Kochian, 1996)(2574), y por lo tanto aumentan la
disponibilidad de fósforo inorgánico (Otani et al., 1996)(2339). Bajo condiciones de toxicidad
de Al3+, se incrementa la liberación de estos ácidos, que forman complejos con el Al3+ y evitan
así su toxicidad (Delhaize et al., 1993; Ryan et al., 1995)(2575). Las deficiencias de hierro y
fósforo aumentan la cantidad de quelantes en los exudados (Gardner et al., 1983; Takagi et al.,
1984; Hofland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991)(1053). La deficiencia en hierro aumenta los
niveles de ácido fenólicos que aumentan la movilización de Fe3+ y Mn2+ y facilitan su transporte
y captación (Marschner, 1986; Jolley y Brown, 1987). Además el descenso de pH conlleva la
exudación de estos ácidos, y como consecuencia de este descenso, una mayor disponibilidad de
Fe3+, Mn2+ y Zn2+ y una menor disponibilidad de Mo2+ (Marschner, 1991).
36
El efecto directo de los exudados radicales no se limita a los compuestos orgánicos de
bajo peso molecular, incluye también enzimas como por ejemplo fosfatasas ácidas (Chhonkar y
Tarafdar, 1981), muy importantes para la adquisición de fósforo en suelos ácidos (Haüssling y
Marschner, 1989).
Las bacterias son más eficaces que los hongos utilizando los compuestos de peso
molecular bajo. Estas sustancias constituyen una parte importante de los exudados radicales y
son poco abundantes en las primeras etapas descomponedoras de los restos vegetales muertos.
Por el contrario los hongos metabolizan fácilmente los polímeros de peso molecular elevado,
que son más abundantes en los restos vegetales muertos y por tanto son más eficaces durante el
comienzo de la descomposición de las raíces muertas (Nakas y Klein, 1980). Tales
características metabólicas justifican que las bacterias dependan sobre todo de los exudados
radicales y los hongos de los restos vegetales en descomposición.
Las diferencias en la composición de los exudados hacen que varíe la composición de
las poblaciones microbianas rizosféricas (Curl y Truelove, 1986; Bowen y Rovira, 1991). Como
resultado de este hecho, cada especie y genotipo de planta tiene asociada una microflora
específica (Neal et al., 1970; Neal et al., 1973). Por otro lado, otros compuestos exudados por
las raíces actúan como señales para atraer microorganismos simbióticos, patógenos o
beneficiosos a la rizosfera. La mayoría de estos compuestos son ácidos fenólicos con actividad
quimiotáctica y son activos a bajas concentraciones 10-6-10-12 M (Lopez de Vitoria y Lovell,
1993)(1193). El efecto de quimiotaxis se ha demostrado que no está relacionado con la
capacidad del organismo para metabolizar el sustrato (Reinhold et al., 1985). Estas señales
también estimulan la germinación de esporas y la elongación de hifas en micorriza arbusculares
(Tsai y Philips, 1991) y en ectomicorrizas (Horan y Chilvers, 1990) y provoca cambios en la
morfología de las hifas que preceden a la formación de la micorriza (Giovannetti et al., 1993b).
Los flavonoides también inducen la expresión de los genes nod de Rhizobium (Dharmatilake y
Bauer, 1992; Hungria et al., 1992); la de los genes de virulencia (vir) de Agrobacterium
tumefaciens (Winans, 1992)(1193); la de genes responsables de la reacción de hipersensibilidad
y patogeneidad (hrp) de Erwinia amylovora (Wei et al., 1992)(1193) y de Pseudomonas
solanacearum (Arhat et al., 1992)(1193). Algunos microorganismos tienen quimioreceptores de
alta afinidad por los flavonoides de la planta huesped, dichos quimioreceptores están ligados a
expresión génica (Deacon, 1996). La liberación de estas señales parece ser bastante específica
(Giovannetti et al., 1993a).
37
Las plantas son capaces de limitar la colonización de las raíces por parte de bacterias
patógenas produciendo radicales hidroxil, aniones superóxidos y peróxido de hidrógeno (Doke,
1983; Klotz et al., 1989; Sutherland, 1991). Del mismo modo, las plantas responden a la
colonización por bacterias promotoras del crecimiento, produciendo especies de oxígeno activo
(Katsuwon y Anderson, 1989, 1990). Los fitopatógenos que contienen mayores cantidades de
enzimas capaces de reducir especies de oxígeno activo, como superóxido dismutasa, catalasa y
peroxidasa, son más efectivos como patógenos (Klotz y Hutcheson, 1992)(1141)
1.2.2. Efecto del sustrato y de las comunidades microbianas edáficas sobre la planta
Las características fisicoquímicas de los agregados orgánicos y minerales que
constituyen el suelo son un factor importante que influye en el desarrollo de las raíces, y en su
capacidad de exudación, ya que determina características como la porosidad y por tanto la
aireación, el potencial hídrico, la transferencia de calor, la disponibilidad de nutrientes y el pH.
En general el efecto rizosfera es más pronunciado en suelos arenosos que en los arcillosos y
húmicos, alcanzando los valores más altos en el caso de plantas de dunas de arena y en los
desiertos (Curl y Truelove, 1986; Lynch, 1990). Además la textura del suelo está íntimamente
relacionada con la nutrición vegetal, los cationes retenidos por el complejo adsorbente,
constituyen la fuente principal de nutrientes para la alimentación mineral de las plantas
(Duchaufour, 1978). Así mismo la biodegradación de compuestos xenobióticos, está regulada
por factores fiscoquímicos del suelo, regulando por tanto el catabolismo de estos productos por
parte de las bacterias. Los productos químicos interaccionan con parte de la matriz edáfica
aumentando o disminuyendo su biodegradabilidad (Ivarson et al., 1982; Stotzky, 1986; Knaebel
et al., 1996)(2635).
La humedad del suelo influye cualitativa y cuantitativamente en la exudación radical. El
estrés hídrico es uno de los factores que inducen la exudación radical (Curl y Truelove, 1986;
Whipps, 1990); el número total de bacterias suele ser mayor en suelos que han sufrido un
periodo de estrés, debido a que encuentran en ellos mayor cantidad de materiales orgánicos
solubles en agua procedentes sobre todo de la autolisis celular de los tejidos radicales (Martin,
1977). El estrés hídrico es también uno de los factores que afectan decisivamente en la
liberación de nutrientes asimilables, por procesos puramente físicos, estimulando la actividad
microbiana, fundamentalmente la mineralización (Walworth, 1992), lo que afecta
decisivamente a la planta.
38
Las concentraciones de O2 y CO2 varían de un suelo a otro y de una porción de suelo a
otra, dependiendo de la temperatura, humedad (Yamaguchi et al., 1967)(2198), contenido en
materia orgánica (Abrosimova y Revut, 1964)(2198), profundidad del suelo (Wood et al.,
c1993) y tipo de cultivo (Buyanovsky y Wagner, 1983)(2198). La influencia de las rizobacterias
sobre la planta depende en gran medida de que éstas encuentren óptimos de crecimiento en el
medio en el que se desarrollan, por tanto, variaciones en la concentración de estos gases
afectarán al crecimiento de las poblaciones microbianas y a su capacidad de biocontrol (Kim et
al., 1996)(2198). Pseudomonas fluorescens, por ejemplo, bajo altas concentraciones de CO2,
sintetiza menos sideróforos (Kim y Misaghi, 1992)(2198).
En el suelo conviven gran cantidad de microorganismos, como bacterias, hongos,
actinomicetos, protozoos y algas (Paul y Clark, 1989)(1141). Las modificaciones en la
abundancia de microorganismos, o en las proporciones relativas de grupos individuales, afectan
a la planta a través de las transformaciones de la materia orgánica y de los compuestos
minerales que éstos sinteticen. De todos estos grupos, el más abundante es el constituido por las
bacterias, posiblemente por ser capaces de crecer más rápidamente y por poder utilizar una gran
variedad de compuestos como fuentes de carbono y de nitrógeno. Las bacterias se localizan en
la superficie de las partículas del suelo, pudiendo interaccionar con las raíces de las plantas. De
hecho, la concentración de bacterias entorno a las raíces, es mucho mayor que en el resto del
suelo (Lynch, 1990)(1141). Esto refleja la alta concentración de nutrientes en esta zona, que
permite un elevado crecimiento y metabolismo bacteriano.
La colonización de las raíces es el primer paso de la interacción planta-microorganismo.
La acción de las bacterias depende de su capacidad para establecerse en la rizosfera (Simons et
al., 1996)(2360). Estudios sobre la colonización microbiana de las raíces indican que las
bacterias se distribuyen irregularmente en el rizoplano en función del tipo de planta, del suelo y
de las especies de microorganismos (Asanuma et al., 1979). La estructura tanto física como
biológica de esta zona y los factores que afecten a su funcionamiento, tienen un efecto decisivo
sobre el desarrollo del vegetal.
Puesto que la microflora está íntimamente relacionada con el sistema radicular,
cubriendo parcialmente su superficie, cualquier sustancia beneficiosa o tóxica producida puede
causar una respuesta fisiológica inmediata y profunda. La interacción entre bacterias y raíces
puede ser beneficiosa, perjudicial o neutra para la planta, y en ocasiones, como ya hemos
comentado, el efecto de una bacteria determinada varía según las condiciones del suelo (Lynch,
39
1990). Por ejemplo, una bacteria fijadora de nitrógeno, resulta beneficiosa bajo condiciones de
escasa disponibilidad de este elemento, pero no en suelos abonados.
Las bacterias que favorecen el crecimiento de las plantas se pueden clasificar en dos
tipos, aquellas que establecen simbiosis con determinadas especies de planta (de las que ya
hemos hablado en el apartado 1.1.1.2) y las edáficas de vida libre (Kloepper et al., 1988;
vanPeer y Schipers, 1989; Fremmel et al., 1991)(1141). A las bacterias beneficiosas de vida
libre se las denomina PGPRs (Plant Growth Promoting Rhizobacteria)(Kloepper et al.,
1989)(1141) o YIB (Yield Increasing Bacteria)(Piao et al., 1992; Tang, 1994)(1141). Dentro de
las PGPRs encontramos bacterias pertenecientes a distintos géneros bacterianos como
Azotobacter, Acetobacter, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas y Bacillus (Brown, 1974;
Elmerich, 1984; Kloepper et al., 1988, 1989; Bashan y Levanony, 1990; Tang, 1994; Okon y
Labandera-González, 1994; Probanza et al., 1996)(1141). Al tratar la planta con la PGPR, ésta
crece mejor, tiene un mejor aparato radical y en general es una planta más sana. Generalmente
se asume que para que una bacteria tenga un efecto sobre una planta, debe estar íntimamente
ligada a su raíz de la planta (Wiehe y Höflich, 1995)(1422). Esta afirmación, aunque en la
mayoría de los casos es cierta, no resulta un requisito indispensable (Murty y Ladha, 1988;
Hong et al., 1991b)(1141).
Las PGPRs pueden afectar al crecimiento de la planta de forma directa o indirecta:
indirecta, evitando o previniendo el ataque de organismos patógenos y directamente a través de
la síntesis de distintos compuestos. Los mecanismos de estimulación del crecimiento vegetal
por parte de estas bacterias son: la mobilización de nutrientes (Lifshitz et al., 1987; Zhoinska et
al., 1992)(989), estimulación del crecimiento de raíces mediante la producción de fitohormonas
(Müller et al., 1988; Bothe et al., 1992)(989) o la producción de sideróforos (Kloepper et al.,
1980; Leong, 1986) y antibióticos (Haas et al., 1992)(989). La producción de sideróforos y
antibióticos permite además a las PGPRs competir satisfactoriamente con patógenos y otras
bacterias saprofíticas (Weller, 1988)(989).
Las moléculas de sideróforos secretadas por las PGPRs quelan la mayor parte del Fe3+
presente en el suelo, y esto evita que los patógenos proliferen debido a la carencia de este
nutriente (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). La bacteria que sintetiza el sideróforo, toma el
complejo hierro-sideróforo mediante un receptor específico localizado en la membrana
bacteriana (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). Las plantas no se ven afectadas por el secuestro
de hierro por parte de las bacterias, ya que la mayoría de las plantas son capaces de crecer en
medios con concentraciones de Fe3+ mucho más bajas que los microorganismos (incluso 1000
40
veces menores) (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). Además, algunas plantas son capaces de
capturar el complejo sideróforo-hierro (Crowley et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang
et al., 1993)(1141). La capacidad de los sideróforos para actuar como supresores de patógenos
depende de la planta, el fitopatógeno a eliminar, la composición del suelo, la bacteria PGPR y la
afinidad del sideróforo por el hierro (Glick, 1995)(1141).
Si el efecto de la PGPR fuese únicamente suministrar Fe3+ a la planta, su efecto positivo
en el crecimiento de la misma variaría según las concentraciones de hierro presente en el suelo.
Sin embargo, no es así, por tanto el sideróforo bacteriano debe contribuir a la nutrición de la
planta, aumentando su crecimiento, aunque en la mayoría de los casos este efecto sea pequeño
(Glick, 1995)(1141). Estos fitosideróforos son útiles también en casos de déficit de aluminio o
intoxicación por aluminio (Gardner et al., 1983; Hoffland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991;
Takagi et al., 1984). La unión de estos fitoquelantes (como ácidos orgánicos) con cationes es lo
suficientemente eficaz como para formar complejos que puedan ser luego reabsorbidos por la
raíz (Mori et al., 1991); se liberan malato y citrato en grandes cantidades y forman quelatos con
metales en suelos calizos, que puede ser un mecanismo para proporcionar nutrientes a la raíz en
casos de deficiencia o toxicidad. Se ha comprobado que los ácidos orgánicos son capaces de
movilizar manganeso (Godo y Reisencuer, 1980; Uren, 1982)(PUBL LU), fósforo, y hierro,
siendo los dos ácidos grasos mencionados más eficientes a la hora de movilizar este último
nutriente (Strom et al., 1994)(lu). En suelos calcáreos se observan síntomas causados por la falta
de nutrientes, debido a la baja solubilidad de óxidos e hidróxidos en solución, la liberación de
quelantes puede jugar un importante papel en el aumento de la disponibilidad de nutrientes. En
este sentido, las bacterias capaces de liberar ácidos orgánicos parecen tener una importancia
decisiva, ya que las plantas no son capaces de liberar vía exudación este tipo de compuestos en
estos suelos (Strom et al., 1994)(lu).
Otra propiedad de algunas bacterias, es la capacidad de controlar patógenos mediante
antagonismos o competencia (Burr y Caesar, 1984; Schroth et al., 1984; Gaskins et al., 1985;
Davison, 1988). Muchas bacterias y en particular Pseudomonas y Bacillus son capaces de
controlar patógenos, sobre todo hongos, sintetizando pequeñas moléculas que son antifúngicos
como la pirrolnitrina, pioluteorina, tropolona, etc. (Howell y Stipanovic, 1979; Howell y
Stipanovic, 1980; Lindbergh, 1981). Sin embargo, algunas bacterias del género Pseudomonas
son capaces de inducir resistencia por parte de la planta, incrementando la velocidad y los
niveles de síntesis de compuestos fenólicos en el tallo, llamados fitoalexinas (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). La señal responsable de la inducción de resistencia y del aumento de
41
acumulación de fitoalexinas está inducida por los lipopolisacáridos de la bacteria (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). Otro posible mecanismo de acción para reducir la actividad patógena
de hongos es la detoxificación del ácido fusárico (Harbone, 1983)(653)
Otros mecanismos empleados por las PGPRs para controlar la actividad de los
fitopatógenos son: la síntesis de antibióticos (Schnider et al., 1994)(1141); la síntesis de
cianhídrico (Voisard et al., 1989)(1141); la capacidad de hidrolizar ácido fusárico (Toyoda y
Utsumi, 1991)(1141); la producción de enzimas capaces de hidrolizar la pared de los
fitopatógenos (Lim et al., 1991)(1141); la competencia con los patógenos por nutrientes y
nichos ecológicos (Kloepper et al., 1988; O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141)(Devliegher et al.,
1995)(1927); la inducción de resistencia a patógenos tras tratar la planta o la semilla con la
PGPR (van Peer et al., 1991; Tuzun y Kloepper, 1994)(1141)(Tuzun y Kloepper, 1995)(1798);
Liu et al., 1995)(1350).
Por otro lado las PGPRs utilizan distintas vías para facilitar de modo directo el
crecimiento de la planta. Entre estos mecanismos podemos citar: la fijación de nitrógeno;
producción de sideróforos que proporcionan hierro a la planta; la síntesis de hormonas que
favorecen el crecimiento de la planta; solubilización de minerales como el fósforo y síntesis de
compuestos de bajo peso molecular, enzimas y moduladores del crecimiento vegetal (Brown,
1974; Kloepper et al., 1986, 1989; Davison, 1988; Lambert y Joos, 1989; Glick et al., 1994a,
1994b)(Noel et al., 1996)(1945). Cada bacteria en particular puede afectar al crecimiento de la
planta utilizando uno o varios de estos mecanismos. Por ejemplo, Azospirillum incrementa le
crecimiento de leguminosas, produciendo hormonas, aumentando la capacidad de la planta para
asimilar agua y nutrientes y favoreciendo la actividad de Rhizobium, es decir, incrementando la
cantidad de nódulos por planta (Okon y Itzigsohn, 1995)(1541).
La existencia de bacterias capaces de fijar nitrógeno tanto de vida libre como
estableciendo simbiosis con la planta se ha argumentado en puntos anteriores, así como la
existencia de plantas capaces de utilizar los complejos hierro-sideróforo de la bacteria (Crowley
et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang et al., 1993)(1141).
El mecanismo de acción de las PGPRs más directo es la producción de fitohormonas.
(Brown, 1974; Tien et al., 1979)(1141). Algunas especies de los géneros Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter y Bacillus favorecen el crecimiento de la planta mediante la
producción de ácido indol-acético (AIA), giberelinas o citoquininas en la rizosfera de las plantas
cuando éstas están en estado de plántula (Brown, 1974; Nieto y Frankenberger, 1989; Lebuhn et
al., 1994). Probanza et al.(1996), encuentra que entre las rizobacterias de aliso hay algunas del
42
género Bacillus que estimulan claramente la germinación y el crecimiento vegetal.
Posteriormente se comprobó que el efecto puede deberse, entre otros factores, a la producción
de auxinas de Bacillus (Gutierrez Mañero et al., 1996)
Otra hormona implicada en la acción de las PGPRs es el etileno. Se ha demostrado, que
Pseudomonas putida es capaz de sintetizar la 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC)
deaminasa (Jacobson,1993; Jacobson et al., 1994)(1141). Esta enzima hidroliza el ACC,
precursor inmediato de la biosíntesis del etileno en plantas. El etileno, estimula la germinación,
rompe la dormición de las semillas (Esashi, 1991)(1141) y actua sinérgicamente con otros
microorganismos como las bacterias fijadoras simbióticas (DeFreitas et al., 1993)(617) .
Existe una alta especificidad entre el genotipo de la planta y el de la bacteria con
respecto a la capacidad de la bacteria para estimular el crecimiento de la planta (Provorov et al.,
1994(1737); García de Salomone y Döbereiner, 1996)(1902).
La actividad y la supervivencia de las bacterias PGPR en la rizosfera depende de
factores físicos como pH, textura, estatus de nutrientes, humedad y temperatura, contenido en
materia orgánica y de interacciones biológicas en la rizosfera. Por este motivo, la inoculación de
PGPR en la rizosfera de diversas plantas en ocasiones, resulta errática (Germida y Walley,
1996)(2498). Sin embargo, este hecho no es del todo negativo, puesto que pequeñas cantidades
de estas bacterias pueden afectar positivamente a la planta, y además interaccionan
sinérgicamente con otros microorganismos que también promueven el crecimiento vegetal
como las micorrizas o fijadoras simbióticas.
La mayoría de las plantas se encuentran micorrizadas y el término micorrizosfera
(Rambelli, 1973)(A) se ha utilizado para describir la porción de suelo bajo la influencia de las
raíces micorrizadas. La presencia de micorrizas altera significativamente la composición física,
química y microbiológica de la rizosfera (Katznelson et al., 1962; Oswald y Ferchau, 1968;
Rambelli, 1973; Linderman, 1988), mejorando el crecimiento de la planta. Las micorrizas
benefician a la planta aumentando su resistencia a patógenos, mejorando su nutrición (sobre
todo la captación de fósforo) y protegiéndola de diversas toxinas (Harley y Smith, 1983)(A).
Algunas bacterias rizosféricas afectan al crecimiento de la planta de forma negativa, bien
causando daños en los tejidos radicales, o bien produciendo metabolitos tóxicos que inhiben el
crecimiento y desarrollo del sistema radical (Brian et al., 1951; Sarathchandra et al.,
1996)(2115). Este tipo de bacterias deletéreas denominadas DRBs (Deleterious rhizobacteria),
pertenecen mayoritariamente al género Pseudomonas (Elliott y Lynch, 1984) y han sido aisladas
de gran cantidad de ecosistemas (Woltz, 1978; Suslow y Schroth, 1982)(2115). Estas bacterias
43
inhiben el crecimiento de raíces, mediante la producción de metabolitos extracelulares tóxicos
(Woltz, 1978; Fredrickson y Elliot, 1985)(2115), aunque también pueden reducir los índices de
germinación (Probanza et al., 1996), provocar lesiones en las raíces, aumentar la sensibilidad de
la planta al ataque de patógenos, y reducir la formación de pelos radicales (Elliott y Lynch,
1985)(2115). La mayoría de las toxinas producidas por las DRB son metabolitos secundarios de
bajo peso molecular (Durbin, 1983; Bolten et al., 1989)(2115). Sin embargo Bolten y Elliott
(1989) sugieren que los metabolitos producidos por diversas Pseudomonas, que inhiben el
crecimiento de las raíces, no están bajo el mismo control que el resto de los metabolitos
secundarios. Estos metabolitos suelen ser compuestos de bajo peso molecular (Bolten et al.,
1989)(2115). El efecto de estas bacterias en condiciones de campo, no suele detectarse, ya que
no provocan síntomas identificables en las plantas, pero sin embargo reducen
considerablemente la producción vegetal (Sarathchandra et al., 1996)(2115).
Por otro lado, aunque en el suelo existen bacterias patógenas para las plantas, los
patógenos más importantes desde un punto de vista agrícola son hongos, como los
pertenecientes a los géneros Fusrium, Pythium y Rhzoctonia (Glick, 1995)(1141).
1.3. Vicia villosa Roth.
El Género Vicia está encuadrado taxonómicamente en el Orden Fabales, dentro de la
Familia Fabaceae. Este Género comprende cerca de 140 especies, que se distribuyen en Europa,
Asia, NorteAmérica, Sudamérica y este de África (Kupicha, 1981)(1238). Las relaciones
infragenéricas se han estudiado clasificándose en dos Subgéneros: Vicilla y Vicia, y cada
Subgénero se divide en 17 y 5 secciones respectivamente (Kupicha, 1976, 1981)(1238).
Vicia villosa es una planta herbácea de duración anual o bienal, y en raras ocasiones
perenne o vivaz. Posee indumento desde densamente peloso hasta casi lampiño. Los tallos son
angulosos, poco consistentes, ramosos y trepadores, pueden alcanzar hasta 1.5 m de longitud.
Las hojas llevan entre 5 y 10 pares de foliolos y terminan en zarcillos ramosos que
utilizan para apoyarse en soportes. Los foliolos son desde linear-lanceolados hasta aovadoalargados y miden entre 15 y 25 mm. Las hojas poseen estípulas pequeñas, las superiores
lanceoladas y enteras y las inferiores semisagitadas y más o menos desgarradas.
Las flores se agrupan en racimos laxos y unilaterales y llevan entre 3 y 30 flores, estas
miden entre 12 y 20 mm, abriéndose todas casi a la vez. Los estilos son dorsalmente
comprimidos y en manojos abaxiales (Endo y Ohashi, 1995)(1237). El cáliz tiene los dientes
muy desiguales, los inferiores son mucho mas largos que los superiores. La corola es lampiña
44
tres veces más larga que el cáliz y con los pétalos provistos de largas uñas de tonalidad
blanquecina; el limbo del estandarte es marcadamente más corto que la uña y por lo común
teñido de violeta; las alas son casi de igual longitud que el estandarte, pero su tonalidad es más
clara.
La legumbre está pediculada y en su ápice tiene un pico bien marcado procedente de los
restos del estilo agrandado y endurecido. Tiene forma linear-oblonga, con una longitud de entre
20 y 40 mm y una anchura de 5 a 9 mm, es aplanada, lampiña y oscuramente reticulada, de
coloración marrón; contiene de 2 a 8 semillas que vienen a medir entre 3 y 4 mm de diámetro.
Florece de abril a septiembre, siendo una planta de polinización cruzada (Zhang y
Mosjidis, 1995)(2327). Una floración temprana es una característica importante para la
producción de cultivos en los ambientes mediterráneos (Siddique et al., 1993; Loss y Siddique,
1994)(2327). En condiciones naturales se encuentra en campos de cereales o en estaciones
ruderales, aunque también se cultiva artificialmente.
Se considera especie endémica de la región mediterránea y tal vez de la Europa
suboriental, pero en la actualidad se ha difundido por gran parte de Europa alcanzando la mitad
meridional de la Península escandinava y también las zonas más extremas del Africa
septentrional y del Asia occidental (Guinea, 1953).
V. villosa presenta diversas ventajas frente a otras especies de leguminosas como:
producir gran cantidad de biomasa y soportar mejor el frío intenso y otras condiciones de estrés
que otras leguminosas como Trifolium hirtum (Volseky et al., 1996).(2477); estar adaptadas a
un alto rango de pH desde 5 a 8 (Siddique y Loss, 1996)(2327); ser más tolerante a
enfermedades producidas por ácaros del suelo, bastante frecuentes en continentes como
Australia, que otras especies de Vicia (Siddique y Loss, 1996). (2327).
1.3.1. Características nutritivas de V. villosa
Muchas especies del género Vicia se han utilizado para consumo animal desde
tiempos remotos debido a su elevado poder nutritivo y a su resistencia en condiciones
extremas. Sin embargo, su uso se ha visto restringido en alimentación animal debido a la
presencia de alcaloides tóxicos. Existe variación genética en la concentración de compuestos
tóxicos en las vezas (Siddique y Loss, 1996)(2327).
Los efectos tóxicos de los alcaloides no son acumulativos, y éstos son rápidamente
excretados por el riñón. Por lo tanto se pueden consumir grandes cantidades de Vicia siempre
45
que la cantidad de alcaloides no exceda un nivel determinado. Las semillas de V. villosa son
aptas para la alimentación de ganado, ya que contienen menos de un 2% de canavinina
(Enneking, 1995)(2327).
Los alcaloides juegan un papel muy importante para las plantas, ya que estos actúan
como defensas contra la infección por bacterias, hongos y contra la predación por herbívoros
(Wink, 1992; Wink et al., 1995). La gran diversidad estructural de los alcaloides, reduce las
posibilidades de que los herbívoros creen resistencia a todos ellos aumentando de este modo
su toxicidad (Wink, 1993; Schmeller, et al., 1994).
Las leguminosas tienen un alto contenido en azúcares (más de un 50%) y la energía
por unidad de peso es parecida a la de los cereales (Ranalli, 1995)(1449).
Uno de los factores que limita el consumo de leguminosas, es su capacidad para
producir gas en el tracto gastrointestinal. Trabajos antiguos (Lienner, 1980) muestran que
tanto en animales como en el hombre, la ingesta de leguminosas produce grandes cantidades
de gas en el intestino, compuesto en proporciones variables de anhídrido carbónico,
hidrógeno y metano en menor cuantía. De estos estudios se concluye que los causantes de la
flatulencia son los α-galactósidos: rafinosa, estaquiosa, verbascosa y ajucosa, que se
acumulan en el intestino grueso, donde son utilizados por las bacterias anaerobias en su
metabolismo, dado que por la ausencia de enzimas hidrolizantes no pueden ser degradados en
el tracto intestinal. Son estos gases los responsables de la flatulencia que se manifiesta en
forma de nauseas, contracciones musculares, diarreas y malestar general.
Parece que existen otros compuestos que pueden tener un efecto sinérgico. Así,
pectinas, glucanas, hemicelulosa, celulosa y ligninas aunque no son digeribles, pueden ser
utilizadas por microorganismos en el intestino grueso produciendo gases al fermentar
(Fleming, 1981).
Las semillas de leguminosas normalmente contienen carbohidratos de bajo peso
molecular, como oligosacáridos de rafinosa y sacarosa. Estos compuestos son metabólicamente
importantes como reservas de energía y su síntesis y acumulación varía con las condiciones
ambientales. Sin embargo, se han descrito pequeñas diferencias en el tipo de carbohidratos y en
su estabilidad (Hymowitz et al., 1972; Yasui et al., 1985). En todas las especies de Vicia
aparecen: sacarosa, almidón, verbascosa y galactosa, siendo la sacarosa el azúcar que predomina
en las semillas de V. villosa. Derivados galactosil y pinitol se encuentran en bajas cantidades en
V. villosa (Yasui et al., 1987)(1238)
46
La fibra está constituida por celulosa, hemicelulosa, lignina y pectinas (Selvendran y
Robertson, 1990). El análisis de este parámetro es necesario en cuanto que refleja la porción
de Vicia que no es digerida, y desde un punto de vista nutricional también da una idea de la
calidad del mismo (Jung y Allen, 1995). Existen distintos trabajos donde se indica que un
elevado contenido de fibra en la dieta disminuye la digestibilidad de la materia orgánica
(Loewe y Meyer, 1974; Smolders et al., 1990; Olsson y Ruudvere, 1995), por lo tanto es un
aspecto económico importante puesto que incide en el gasto en pienso para el ganadero y en
la productividad animal (Jung y Allen, 1995). La digestibilidad de la materia orgánica está
relacionada positivamente con el contenido citoplasmático celular y negativamente con los
constituyentes de la pared celular, principalmente lignina (Demarquilly y Jorriege, 1981). Es
precisamente la lignina la que limita la digestibilidad de la pared celular, protegiendo a los
polisacáridos de la acción enzimática (Jung y Deetz, 1993). Una alternativa para aumentar la
digestibilidad de la dieta es tratarla previamente con enzimas tipo celulasa, hemicelulasa o
pectinasa que disminuyan el contenido en fibra (Muck, 1993; Weinberg et al., 1995). Van
Soest (1994) concluye que el contenido en fibra de la planta aumenta con el desarrollo de la
misma al mismo tiempo que su digestibilidad va disminuyendo.
1.3.2. Usos de V. villosa
Más de 20 cultivos de grano se cultivan en el mundo como fuentes de proteínas; estos
cultivos corresponden con 8 familias incluyendo mono y dicotiledóneas. Se encuentran especies
en distintas áreas geográficas y climáticas incluyendo zonas templadas, tropicales húmedas,
áridas, tierras altas, sabana y tierras bajas (Ranalli, 1994). 1449.
Los cultivos ricos en proteínas se dividen en dos: semillas oleaginosas, que
proporcionan alimento rico en proteínas tras la extracción del aceite y semillas de leguminosas
que se consumen enteras o molidas. Las leguminosas de grano contienen un 25-30% de
proteínas y normalmente menos de un 2% de aceite (Ranalli, 1994). 1449
Por otro lado, a partir de la reforma de la PAC aprobada en Consejo de Mayo 1992, la
gestión del mercado de proteaginosos entre las que se encuentra la veza, ha sufrido una fuerte
transformación pasando al régimen de apoyo en la producción de cultivos herbáceos. Así la
producción de proteaginosas ha pasado de 2.9 millones de toneladas en 1987-88 a 5.6 millones
de toneladas en 1993-94 y pese a todo, en 1992 la CE importó casi un millón de toneladas. El
92% de la producción de leguminosas de la CE se obtiene de España. En el marco de las
47
modificaciones introducidas por el Consejo de Ministros en los actuales regímenes de apoyo a
los productores para lograr el objetivo de que a medio plazo se cultiven en España 280.000 ha
más de estos productos.
Las vezas tienen un considerable potencial como leguminosas de forraje y como cultivo
de grano (Siddique y Loss, 1996).2327.
Por todos estos motivos V. villosa es una de las plantas más utilizadas en Estados
Unidos en los llamados cultivos de invierno (Guinea, 1953). Namoi es una variedad de floración
tardía y produce pocas semillas y un bajo índice de cosechado, y sin embargo es más apropiada
para el pastoreo y la producción de heno.
Esta planta se usa para la nutrición del ganado, como suplemento de otras leguminosas
de grano para el pastoreo de rumiantes y ovejas y comida para cerdos sustituyendo a otras
leguminosas de grano en un porcentaje de 10-20%.
Debido a un aumento en el uso de fertilizantes químicos, en la actualidad existen
excelentes razones para incrementar la producción de leguminosas fijadoras de nitrógeno, ya
que la fertilidad residual de un cultivo de leguminosas es de entre 40-50kg N ha-1 (Ranalli,
1994). 1449. La rotación de cultivos con leguminosas anuales proporciona nitrógeno a los
cultivos de cereal creciendo en rotación con ellos debido a la fijación de nitrógeno (Wright,
1990; Green y Biederbeck, 1995)2079. El manejo de sistemas agrícolas intensivos depende de
la adición de fertilizantes agrícolas para mantener las cosechas. Con estos sistemas de
producción, las capacidad del suelo para retener nitrógeno disminuye con la disminución de
carbono orgánico como resultado de menores entradas de restos vegetales y la aceleración de la
descomposición de los restos provenientes de la siega. El nitrógeno residual de los fertilizantes
puede pasar a óxidos de nitrógeno por desnitrificación y al lavado de nitratos con la
contaminación de aguas que esto conlleva. Por tanto, para reducir la erosión, mejorar la
estructura del suelo, los ciclos de nutrientes, los procesos microbiológicos y reducir las
contaminaciones, se están buscando otros sistemas alternativos como los cultivos mixtos y
cultivos de cobertura que aportan cantidades significativas de nitrógeno al cultivo principal
(Vigil et al., 1991) y reducen las pérdidas de este nutriente por lavado (McKenney et al.,
1993).615.
Como resultado de su capacidad para fijar nitrógeno en simbiosis con Rhizobium y su
alto valor nutritivo V. villosa suele utilizarse en rotación de cultivos (Holderbaum, 1990;
Wagger, 1989b; Blevins, 1990). El cultivo de maíz con V. villosa, aumenta el cultivo en un
123%. En suelos con textura media con alto contenido en materia orgánica, la rotación de
48
cultivos contribuye substancialmente al efecto positivo de un cultivo previo de leguminosas en
el cultivo de maíz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte).
Un inconveniente de la rotación de cultivos es que los frutos de esta planta se abren y la
semilla germina en el cultivo siguiente. Este problema puede ser solventado con el uso de
herbicidas. Sin embargo si el cultivo siguiente es de leguminosas, no existen herbicidas
específicos para eliminar solo a la veza. (2327).
Uno de los usos más extendido de esta especie es la de cultivo mixto con cereal
(Anderson, 1975; Bull y Mayfield, 1992)2327. Varios cultivos anuales se han evaluado en
cultivos mixtos (Creamer, 1994), así como en monocultivos (Abdul-baki y Teasdale, 1993b;
Stivers y Shennan, 1991). Se ha observado que el cultivo mixto de V. villosa con tomate tiene
un efecto beneficioso sobre éste último. Las cosechas eran superiores y la calidad del fruto era
superior que en cultivos convencionales, lo que supone en una mayor ganancia económica
(Kelley et al., 1995). Reynolds et al. (1994) comprueban cómo en cultivos mixtos de cereales
con leguminosas, en lugares con contenidos en nitrógeno bajos en el suelo, la producción de
cereal no se veía afectada por la presencia de la leguminosa; sin embargo, se demuestra que el
transporte de nitrógeno hasta el cereal es más eficaz en presencia de la leguminosa que si se
fertiliza el cultivo con fertilizantes químicos. Esto se debe a la conexión directa que existe entre
la raíz de la leguminosa y la del cereal a través de las micorrizas fúngicas. Este dato se refleja en
la cantidad de proteínas que se encuentra en los granos del cereal en cultivos con leguminosas y
sin ellas.
Otro sistema alternativo, es el uso de cubiertas orgánicas. Este sistema consiste en
sembrar una leguminosa de cobertura y una vez florecida, segarla dejando el residuo sobre el
suelo, residuo que formará una cubierta orgánica. La cobertura orgánica reduce la erosión del
suelo, la necesidad de fertilizantes, aumenta la cantidad de materia orgánica, incrementa la
capacidad de retención hídrica y reduce la competencia por malas hierbas y la necesidad de usar
herbicidas (Abdul-Baki y Teasdale, 1993). El uso de cobertura orgánica en lugar de polietileno
negro, generalmente proporciona mejores cosechas y retrasa la producción, con lo cual ésta
coincide con los precios más altos de la temporada. Las Vicias, al fijar nitrógeno proporcionan
este elemento a los cultivos siguientes, con lo cual se puede reducir e incluso eliminar el uso de
fertilizantes. Además el uso de polietileno es caro y presenta la desventaja de su eliminación
(Servis, 1992). La combinación de mejoras ambientales así como económicas hacen de la
cobertura con V. villosa un sistema alternativo atractivo para el cultivo de otras plantas como el
tomate (Kelly et al., 1995). (1571).
49
V. villosa se ha usado como cobertura en cultivos de tomate aumentando
significativamente la producción y por tanto los beneficios económicos. Los costes de
producción de este tipo de cultivo son mayores puesto que hay que pagar la semilla y su
cosechado. Sin embargo, los beneficios debidos a una mayor cosecha de tomate, así como la
reducción de la fertilización nitrogenada compensan los costes de producción. En un suelo sin
Vicia, usando fertilizantes podríamos conseguir producciones parecidas y a un coste similar, sin
embargo los niveles de fertilizantes excederían los recomendables y aumentarían la
contaminación. V. villosa, aparte de introducir nitrógeno en el sistema, actúa de forma
beneficiosa mejorando la estructura del suelo y la eficiencia en el uso del agua (Decker et al.,
1994). Los resultados eran mejores que en cultivos bajo cobertura de polietileno negro (AbdulBaki y Teasdale, 1993a). Con los sistemas de cobertura de V. villosa la necrosis foliar era
menor, lo que permite a las plantas mantener más tiempo su área foliar y sintetizar más
fotosintatos durante un periodo de tiempo más largo, lo que incrementa la producción (AbdulBaki et al., 1996). (2120).
Además de influir en la fertilidad del suelo, los residuos de leguminosas de invierno
influyen en las poblaciones de malas hierbas en tierras sin labrar por su proximidad a la
superficie del suelo, zona donde germinan las semillas. La cobertura orgánica reduce la cantidad
de radiación que llega al superficie del suelo, baja la temperatura máxima del mismo pero tiene
poco efecto en la temperatura mínima (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988; Fortin y Pierce,
1991). Además la cubierta mantiene la humedad del suelo en niveles más altos que el suelo
desnudo (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988). La humedad del suelo y la temperatura son
parámetros relacionados, ya que la radiación recibida por el suelo, no empieza a calentar hasta
que la demanda de evaporación no se satisface (Bristow, 1988). La germinación de las semillas
de malas hierbas esta afectada por la magnitud y las fluctuaciones de temperatura y humedad
(Egley, 1986). Por lo tanto los cultivos de cobertura influyen en la germinación de malas hierbas
a través de la temperatura y la humedad del suelo, así como a través de la luz (Teasdale y
Mohler, 1993). (682). Las temperaturas del suelo bajo V. villosa no se reducen lo suficiente
como para evitar la germinación de las semillas de malas hierbas, como mucho retrasan la
germinación. Esta planta tiene una mayor influencia en la germinación de malas hierbas a través
de la reducción de la amplitud entre la temperatura máxima y mínima diaria. Algunas semillas
necesitan una amplitud de por lo menos 10°C para germinar. (601). Estas plantas también
reducen, retardan o en ocasiones favorecen la emergencia de malas hierbas ya que alteran las
50
condiciones físicas y por tanto los micrositios de la germinación de semillas (Teasdale y
Mohler, 1993). (682)
La producción de biomasa de esta planta oscila entre 2140 y 9010 kg ha-1 en la
primavera, indicando la potencialidad de esta leguminosa para suprimir malas hierbas a través
de la competencia durante el crecimiento en primavera y a través de la cobertura que ofrece tras
la senescencia (Holderbaum et al., 1990; McVay et al., 1989). Además sustancias producidas
por los residuos de V. villosa parecen producir procesos alelopáticos que interfieren en la
germinación de las semillas de malas hierbas (White et al., 1989; Bradow y Connick,
1990).(662). En estos sistemas aparecen gran cantidad de insectos, babosas y culebras que se
alimentan de parte de las plántulas de las malas hierbas. 648
V. villosa viva elimina más malas hierbas que cuando se usa residuo seco (Teasdale y
Daughtry, 1993). Sin embargo, esta planta se descompone relativamente rápido, por lo que
permite que emerjan, más tarde, muchas de estas plantas. Teasdale et al. (1991) observan que al
aumentar los niveles de V. villosa reducen linealmente la densidad de malas hierbas. (684).
La utilización de leguminosas como abono verde proporciona al suelo ganancias de
nitrógeno(por fijación), mejora su conservación y disponibilidad y supone una cubierta contra la
erosión del agua y del viento. Este abono puede sustituir a los fertilizantes comerciales en los
sistemas agrícolas (Welty et al., 1988; Andrén et al., 1990; Follett et al., 1991; Hargrove, 1991)
y se ha propuesto como estrategia de manejo para sistemas con bajas entradas de nutrientes y
para tierras marginales (Vlek et al., 1981; Biederbeck, 1990).2079. El uso de cultivos de grano
de leguminosas como abono verde es un modo de reducir la cantidad de fertilizantes
nitrogenados en la producción de maíz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte). Cerca de un
20% del nitrógeno de las leguminosas es captado por el primer cultivo, tras el abonado, pero los
beneficios persisten en cultivos posteriores (Ladd et al., 1983; Ladd y Amato, 1986; Janzen et
al., 1990). Además el abono verde va haciéndose disponible gradualmente para cultivos
posteriores, lo que contrasta con la disponibilidad del nitrógeno comercial (Groffman et al.,
1987; Jans-Hammermeister et al., 1994b).2079. Estudios que comparan la respuesta de un
cultivo de no leguminosa que sigue a uno de leguminosa con la respuesta a distintas
concentraciones de nitrógeno comercial indican que los beneficios del abono verde con
leguminosas es mayor que el predicho por las estimas de 15N (Welty et al., 1988; Badaruddin y
Meyer, 1990; Blevins et al., 1990; Utomo et al., 1990)(2079).
1.4. Plan de trabajo y objetivos
51
Las
modificaciones
de
distintas
características
edáficas
(fisicoquímicas
y
microbiológicas) que se dan en torno a plantas diazotrofas han sido objeto de distintos estudios
previos (Gutiérrez Mañero, 1987; Llinares, 1990; Probanza, 1991 y Pozuelo, 1991; Probanza,
1994). La mayor parte de estos estudios se han centrado en los efectos de la planta sobre el suelo
circundante a diferentes distancias y profundidades de la misma, estudiando los
microorganismos de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sus actividades potenciales.
En la presente memoria se estudia el efecto de V. villosa sobre su rizosfera, las
características bióticas y abióticas de la misma y el efecto de bacterias rizosféricas de
poblaciones naturales de V. villosa sobre la germinación y crecimiento de dos variedades
comerciales de esta especie.
El objetivo fundamental de este estudio sobre el que convergen todos los que a
continuación se desglosan, es el poder ofrecer un plan de manejo que optimice la producción
aprovechando las características productivas de la planta y su influencia sobre el sustrato
edáfico. Al mismo tiempo el estudio del sistema rizosférico pretende aprovechar la posible
adaptación de las bacterias rizosféricas de V. villosa al sistema rizosférico de esta,
previsiblemente resultado de procesos de coevolución, para seleccionar cepas PGPRs con futura
aplicación biotecnológica que permiten mejorar las técnicas de producción. Este último aspecto
enlaza con el anterior conduciendo a un estudio integral de la planta con su medio para
desarrollar técnicas dirigidas hacia una agricultura sostenible.
Por todo ello el trabajo está estructurado en dos partes diferenciales.
Dirección suelo-planta:
1. Estudio de las bacterias asociadas a la rizosfera de V. villosa, creciendo en
poblaciones naturales. Se estudió su composición taxonómica a nivel de género y grupos
fisiológicos del ciclo del nitrógeno a los que pertenecen y la variación a lo largo del ciclo
fenológico de la planta.
2. Estudio de la diversidad genética de las bacterias pertenecientes a los géneros
bacterianos mayoritarios de cada momento de muestreo.
3. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre la velocidad
y tasa de germinación.
52
4. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre el
crecimiento de la veza. Efectos sobre plantas pertenecientes a la variedad Namoi y Látigo
(nitrógeno total y distintos parámetros biométricos de la parte aérea y radical de las plantas).
Dirección planta suelo:
1. Estudios en condiciones de laboratorio para conocer el efecto que dos variedades
comerciales de Vicia villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sobre
parámetros fIsicoquímicos edáficos relacionados con dicho ciclo. Paralelamente también se
controlan parámetros biométricos de las plantas. Para todo ello se hace un seguimiento durante
todo el ciclo vital de la planta, haciendo los correspondientes análisis en tres estadíos de ésta,
vegetativo, floración y fructificación, coincidiendo los tres con actividades agrícolas
tradicionales llevados a cabo con esta planta.
La selección de las dos variedades (Namoi y Látigo) se realizó teniendo en cuenta sus
características de crecimiento y aprovechamiento diferencial de las mismas, para lo cual se
realizaron las pruebas biométricas oportunas. La hipótesis de trabajo es que dos variedades con
características en su crecimiento bien distintas demandarán nutrientes y exudarán productos
orgánicos a través de su aparato radical siguiendo patrones diferentes, lo cual podría tener su
efecto correspondiente sobre la dinámica del ciclo del nitrógeno y por lo tanto sobre la
productividad del suelo y de la planta. Estos factores junto con la variable "momento de
muestreo" en función de la etapa del ciclo vital de las plantas, suponemos que interaccionan de
manera decisiva, por lo que habría que tener en cuenta todos los factores mencionados a la hora
de hacer un balance cuyo objetivo sea decidir el momento adecuado para cosechar en función de
la variedad seleccionada.
2. Estudios en condiciones de campo para conocer el efecto que las dos variedades
comerciales de V. villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sobre
parámetros fIsicoquímicos edáficos relacionados con dicho ciclo.
3. Paralelamente también se controlan parámetros biométricos y bioquímicos de las
plantas, para conocer las ventajas nutricionales y de producción de una y otra variedad. Para
todo ello se hace un seguimiento durante todo el ciclo vital de la planta, haciendo los
correspondientes análisis en tres estadíos de ésta, vegetativo, floración y fructificación,
coincidiendo los tres con actividades agrícolas tradicionales llevados a cabo con esta planta.
53
54
2. MATERIALES Y MÉTODOS EMPLEADOS EN EL
ANÁLISIS DE LA RIZOSFERA DE V. villosa
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Zonas de muestreo
Los suelos empleados para el estudio de las comunidades microbiananas presentes en la
rizosfera de V. villosa fueron recogidos en la urbanización Montepríncipe (Boadilla del Monte,
Madrid) y en la urbanización Raya del Palancar (Villanueva de la Cañada, Madrid). La
vegetación de estas zonas se encuadra dentro de la serie meso-supramediterráneo de la provincia
de vegetación Carpetano Ibérico Leonesa, sector Guadarrámico. La vegetación potencial es un
encinar sobre suelo silíceo de la Asociación Junipero oxicedri-Quercetum rotundifoliae, en su
facies matritense sobre sustratos detríticos (Rivas-Martínez et al., 1988). En la actualidad se
instala una de las etapas de la serie donde además de la encina abundan otras especies como:
Cistus ladanifer L., Retama sphaerocarpa (L.) Boiss., Helichrysum stoechas (L.) DC.,
Lavandula stoechas subsp pedunculata.
La zona es de origen Miocénico (período medio) y está constituida por arcosas, arcillas
arenosas y limos. Climatológicamente se caracteriza por su carácter sub-húmedo, con una
precipitación anual de 433.91 a 463.96 mm y una temperatura media entre 12.28 y 13.9 °C.
Se exponen los diagramas climáticos (Figura 2.1 y 2.2) pertenecientes a las estaciones
meteorológicas más cercanas a los puntos de muestreo,
Cuatro Vientos, a 5 Km de la
urbanización Montepríncipe y Brunete a 5 Km de la urbanización Raya del Palancar.
50
100
100
50
CUATRO VIENTOS (687 m)
BRUNETE (580 m)
90
40
30
80
70
T=13,94 °C
P=463,96 mm
90
80
40
60
30
70
T=12,28 °C
P=433,91 mm
60
50
20
50
40
40
20
30
10
P.A.V.
Feb
Mar
Abr
May
Jun
Jul
Ago
20
10
10
0
Ene
30
20
Sep
Oct
Nov
10
P.A.V.
0
Dic
0
Ene
Tª PRECIPITACIÓN
Feb
Mar
Abr
May Jun
Jul
Ago
Sep
Oct
Nov
0
Dic
Tª PRECIPITACIÓN
Figura 2.1. Diagrama climático
Figura 2.2. Diagrama climático
de la estación de Cuatro Vientos.
de la estación de Brunete.
55
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Se estudiaron tres poblaciones de V. villosa: la 1ª situada en la Urb. Raya del Palancar
(RP) y las otras dos en la Urb. Monteprícipe (MPa y MPb) .
Urb. Raya del Palancar
Urb. Montepríncipe
Figura 2.3. Localizacion dentro de la Comunidad de Madrid de la Urb. Raya del Palancar y Urb.
Montepríncipe.
2.2. Recogida y preparación de las muestras rizosféricas
Se recogieron muestras a mediados de Febrero, cuando la planta estaba en estado
vegetativo, a principios de Abril, cuando floreció y a mediados de Mayo, cuando los frutos
estaban ya bien formados y maduros. En cada momento de muestreo se recogieron tres réplicas,
una por cada zona de muestreo. Cada réplica está constituida por las raíces de 10 plantas
recogidas al azar y el suelo adherido a ellas. Así mismo, se recogieron otras 5 plantas al azar en
cada zona para comprobar la actividad reductora de acetileno de sus nódulos.
Las muestras se tomaron en condiciones asépticas, con una azada previamente flameada.
Posteriormente se introdujeron en bolsas de plástico estériles y se trasladaron al laboratorio a 4
°C.
Una vez en el laboratorio, las raíces se agitaron vigorosamente recogiendo el suelo que se
desprendía. Este suelo se tamizó a través de una malla de 2.0 mm, y se secó a 55 °C,
utilizándose para los análisis fisicoquímicos. Las raíces y el suelo que todavía quedó adherido a
ellas se utilizaron para los análisis microbiológicos.
56
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Análisis de la
actividad nodular
Agitación
Análisis microbiológico
Agitación
con perlas de vidrio
Recogida de
suelo rizosférico
Cribar a través de malla de 2
mm y secar a 55°C. Análisis
fisicoquímico
Suspensiones diluciones
Siembra en placa
10 colonias a 36 h
10 colonias a 72 h
Determinación
Taxonómica
Actividades
Ciclo del N
Divergencia genética
de las cepas pertenecientes a
los géneros mayoritarios
Figura 2.4. Esquema del protocolo seguido para la obtención y preparación de las muestras rizosféricas.
2.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos
En cada momento de muestreo se realizó una caracterización fisicoquímica de los suelos,
a excepción de la capacidad de retención máxima y de la textura que sólo se midieron en el
primer muestreo. A continuación se describe la metodología empleada en cada caso.
2.3.1. Capacidad de retención máxima (CRM)
57
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Se determinó por el método de García Trejo (1981). Las muestras de suelo se secaron a
110 °C durante 24 h. Posteriormente se dispusieron 5 g de suelo sobre algodón hidrófobo en un
embudo. Para conocer la CRM se fue goteando agua mediante una bureta sobre, el montaje antes
descrito, hasta que cayó del embudo la primera gota. El volumen de agua empleado es la CRM
expresado en mL/g.
2.3.2. Textura de los suelos
La textura del suelo se determinó por el método de Boyoucos. Este método se basa en la
dispersión de las partículas en un medio líquido, utilizando una solución acuosa de metafosfato
sódico y carbonato sódico en cantidad suficiente para obtener una concentración 0.5 N de sodio.
Previamente se eliminó la materia orgánica de la muestra por tratamiento con peróxido de
hidrógeno, filtración y lavado con agua destilada. Mediante el densímetro de Boyoucos se
comprueba la densidad de la suspensión a tiempos determinados y aplicando la ecuación de
Stokes se obtiene el diámetro de las partículas sedimentadas (Day, 1965).
2.3.3. Medida de pH
Se realizó frente a agua destilada. Se mezclaron 20 g de tierra y 20 mL de agua destilada,
agitándose la mezcla durante 20 minutos. Posteriormente se midió con un pHmetro Crison 2001
provisto de un electrodo combinado de vidrio modelo Radiometer GK 2401 C.
2.3.4. Determinación del nitrógeno total
Las muestras de suelo se sometieron a digestión según el método de Kjeldhal (1883) y
posteriormente se valoró el ion amonio producido, mediante el método colorimétrico de Smith
(1980). A continuación se describe el método detalladamente.
A 2 g de suelo se le añadieron 25 mL de H2SO4 concentrado y se llevó a cabo la
digestión en un digestor de microondas focalizadas de la marca Prolabo, modelo Maxidigest350, a 500 °C durante 25 minutos, tiempo durante el cual se añadieron de forma automática 15
mL de H2O2, como catalizador oxidante de forma que todo el nitrógeno pasara a (NH4)2SO4.
Una vez frío se tomaron 0.05 mL, y se añadieron 12.5 mL de una solución al 0.12 % de EDTA,
58
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
1 mL del reactivo A (nitroprusiato sódico al 0.5 % y fenol en solución alcohólica al 10 % en
proporción 1:1) y 1.25 mL del reactivo B (tampón fosfato (26.84 g de Na2HPO4. 12H2O, 20.65 g
de NaOH y 1000 mL de agua destilada) e hipoclorito sódico al 1.5 % en proporción 4:1).
Después de agitar cada 15 minutos durante 1 hora se midió en un fotómetro Merck modelo
502130/SQ118, a 635 nm.
Los datos obtenidos se interpolan en una recta patrón que se trazó a partir de diluciones
sucesivas de una estándar de 100 ppm de NH4Cl. Los valores correspondientes se ajustaron a
una recta por el método de los mínimos cuadrados.
2.3.5. Determinación del nitrógeno amonio
Se partió de 10 g de suelo a los que se le añadieron 100 mL de cloruro potásico 2M y se
mantuvo agitando durante una hora (Sahrawat, 1982). A continuación se dejó reposar hasta que
todo el suelo se depositó en el fondo, y el sobrenadante era transparente. Posteriormente se
valoró el ion amonio siguiendo el método de Berthelot, modificado por Weatherburn
(Weatherburn, 1967; Vollbrecht et al., 1989; Hecht y Mohr, 1990). A continuación se describe
el método detalladamente.
Del extracto obtenido anteriormente se tomaron 10 mL a los que se añadieron 0.4 mL de
solución alcohólica de fenol al 10 %, 0.4 mL de solución acuosa de nitroprusiato sódico al 0.5 %
y 1 mL de solución oxidante (se prepara mezclando 100 mL de una solución de citrato sódico
que contiene 100 g de C6H5Na3O7. 2H2O, 5 g de NaOH y 500 mL de agua, con 25 mL de una
solución de hipoclorito sódico 1.5 N). La mezcla se mantuvo en reposo durante 1 hora y
posteriormente se midió la absorbancia a 640 nm en un espectrofotómetro Milton Roy modelo
Spectronic 20.
Los datos obtenidos se llevaron a una recta patrón que se trazó a partir de diluciones
sucesivas de una estándar de 100 ppm de NH4Cl. Los valores correspondientes se ajustaron a
una recta por el método de los mínimos cuadrados.
2.3.6. Determinación del nitrógeno nitrato
Se añadieron 10 mL de cloruro potásico 0.1 M a 2 g de suelo. Tras agitar durante 15
minutos se determinó en el filtrado el nitrógeno nitrato por fotocolorimetría con un fotómetro
59
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Merck modelo 502130/SQ118. Los nitratos reaccionan con nitrospectal para dar un
nitrocompuesto de color rojo intenso.
2.3.7. Determinación del carbono orgánico
Se empleó el método de Walkley y Black (1934) modificado. Se basa en la oxidación del
material del suelo fácilmente oxidable con dicromato potásico. La muestra de suelo se trató con
exceso de oxidante y la proporción gastada de éste se determinó valorando por retroceso con una
solución de sulfato ferroso.
A 1 g de suelo se le añadieron 15 mL de K2Cr2O7 1 N y 20 mL de H2SO4 concentrado
agitando la mezcla un minuto y dejándola reposar durante media hora. A continuación se diluyó
con 200 mL de agua destilada, con el objeto de facilitar la observación del punto final de la
titulación. Se añadieron 25 mL de H3PO4 al 50 % (v/v) para hacer más patente el viraje y 10
gotas de difenilamina sulfúrica (10 g de NH(C6H5)2, 1000 mL de H2SO4 y 200 mL de agua
destilada) como indicador. Se valoró con FeSO4 0.5 N por retroceso. Simultáneamente se realizó
un control sin suelo, para valorar los productos oxidantes de los reactivos.
Para calcular el porcentaje de carbono orgánico de la muestra de suelo se consideró que 1
mL de K2Cr2O7 es equivalente a 0.003 g de carbono y que el método es efectivo en un 75 % por
lo cual el factor de corrección al 100 % es 1.33 (García Trejo, 1981).
2.3.8. Tratamiento de la información de los resultados de los análisis fisicoquímicos de los
suelos rizosféricos
Los resultados de los análisis fisicoquímicos del suelo a lo largo del estudio se
compararon mediante ANOVA unidireccional con réplicas (Sokal y Rholf, 1979). En caso de
existir diferencias significativas, se procedió a la comparación de la media mediante el test
estadístico LSD (mínima diferencia significativa) (Sokal y Rohlf, 1979).
2.4. Determinación de la actividad reductora de acetileno (ARA) de los nódulos
60
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Para comprobar el estado fisiológico de los nódulos de las plantas recolectadas en cada
momento de muestreo, los nódulos de cinco de ellas tomadas al azar, se escindieron en el
momento en que se llegó al laboratorio y se introdujeron en viales de 15 cc. Una vez cerrados
herméticamente, el 10 % de la atmosfera se sustituyó por acetileno (Hardy et al., 1973;
Akkermans, 1971). Transcurridos 15 minutos el etileno producido se midió en un cromatógrafo
de gases KONIC 3000 HGRC, fabricado por KONIC INSTRUMENTS S.A. (Barcelona), con
un detector de ionización de llama y una columna Porapak R (malla 80/100) de 150 cm de
longitud y 0.3 cm de sección, en las condiciones siguientes:
Temperatura de la columna: 50 °C
Temperatura del inyector: 100 °C
Temperatura del detector: 150 °C
Gas portador: Nitrógeno
Flujo del gas portador: 20 mL/minuto
Volumen de la muestra: 0.5 mL
2.5. Análisis microbiológico de los suelos rizosféricos
Como en el Apartado 2.3 los análisis se realizaron en cada momento de muestreo. A
continuación se describe la metodología empleada en cada caso.
2.5.1. Toma de muestras y determinación taxonómica
Se elaboró un banco de diluciones sucesivas partiendo de 5 g de raíces de cada una de las
zonas. Las raíces y el suelo adherido a ellas, se depositaron en un erlenmeyer con 50 mL de agua
destilada estéril. Las muestras se agitaron durante 10 minutos con perlas de vidrio de 2 mm de
diámetro. A partir de aquí se hicieron diluciones sucesivas hasta llegar a la dilución 10-9.
Un mL de las suspensiones-diluciones de cada una de las zonas se sembró en un medio
que contenía:
* Agar para métodos estándar (Pronadisa) 23.5 g.
* Solución salina de Winogradsky 50 mL.
* Oligoelementos (Pochon y Tardieux, 1962) 1 mL.
* Extracto de suelo 10 mL.
61
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
* Agua destilada hasta 1 L.
Las placas se incubaron a 28 °C durante 72 horas.
De cada una de las tres zonas se seleccionaron al azar 20 colonias de las placas en que se
hallaron colonias aisladas (10-4 a 10-9), 10 a las 36 h y 10 a las 72. Para la determinación de las
colonias hasta el nivel de género se sembraron en agar B de King, agar McKonkey, D1 y D3
(Kado y Heskett, 1970), y se realizaron pruebas bioquímicas siguiendo el esquema diagnóstico
de Acero et al. (1994) (Figura 2.5).
2.5.2. Tratamiento de la información de los resultados de la determinación taxonómica
Las frecuencias de cada género bacteriano a lo largo del estudio se compararon mediante
ANOVA unidireccional con réplicas (Sokal y Rohlf, 1979). En caso de existir diferencias
significativas, se procedió a la comparación de la media mediante el test estadístico LSD
(mínima diferencia significativa)(Sokal y Rohlf, 1979).
62
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 2.5. Esquema diagnóstico de Acero et al. (1994).
I: Bacillus; II: Coryneformes; III: Micrococcus; IV: Pseudomonas; V: Pseudomonas-Alcaligenes; VI: Moraxella;
VII: Xanthomonas; VIII: Acineobacter; IX: Flavobacterium; X: Enterobacteriaceae; XI: Streptomyces; XII:
Agrobacterium; XIII: Erwinia; *: No se encontraron.
63
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.5.3. Análisis de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
Todos los medios de cultivo empleados en el análisis de los distintos grupos
funcionalesse elaboraron según las técnicas de Pochon y Tardieux (1962) (ver Apéndice A).
También aparece en el Apéndice la composición de los reactivos empleados en este Apartado.
Se estudió la actividad de todas las cepas aisladas a lo largo del estudio en cada una de
las tres zonas muestreadas. Las bacterias se inocularon por triplicado en los medios de cultivo,
operando a continuación como se especifica para cada grupo fisiológico.
2.5.3.a. Diazotrofos aerobios
Se pusieron 5 mL del medio en tubos de 16x160 mm. Se taparon con tapones de metal y
se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 110 °C. Tras la inoculación los tubos se
incubaron en estufa a 28 °C durante 15 días. A continuación se puso 1 mL de cada tubo en viales
estériles de 12 mL de capacidad que se cerraron con tapones de goma estancos a los gases,
fijándolos con una arandela metálica. Luego se extrajeron 1.2 mL de aire de cada vial que se
reemplazaron por igual cantidad de acetileno. Los viales se incubaron a 28 °C durante 24 horas.
Los tubos en los que se detectó etileno se consideraron positivos.
El etileno producido se detectó en un cromatógrafo de gases KONIC 3000 HGRC,
fabricado por KONIC INSTRUMENTS S.A. (Barcelona), con un detector de ionización de
llama y una columna Porapak R (malla 80/100) de 150 cm de longitud y 0.3 cm de sección, en
las condiciones que se especifican en el Apartado 2.4.
2.5.3.b. Diazotrofos anaerobios
Se pusieron 10 mL de medio en tubos de 16x160 mm y en cada tubo se introdujo una
campana Durham. Se taparon con tapones metálicos y se esterilizaron en autoclave a 110 °C
durante 20 minutos. Tras la inoculación se incubaron en estufa a 28 °C durante 15 días.
Se consideraron positivos los tubos en los que tras la incubación había desprendimiento
de gas.
64
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.5.3.c. Amonificantes
Se pusieron 10 mL del medio en tubos de 16x160 mm que se taparon con tapones
metálicos y se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 110 °C. Tras la inoculación los
tubos se incubaron en estufa a 28 °C durante 15 días.
Después de la incubación se retiró con una pipeta estéril 1 mL de cada tubo que se pasó a
otro tubo al que se le añadieron dos gotas del reactivo de Nessler. Se consideraron positivos los
tubos que presentaron coloración anaranjada que indicaba la presencia de amonio.
2.5.3.d. Desnitrificantes
Se pusieron 10 mL del medio en tubos ce 16x160 mm. Se taparon con tapones metálicos
y se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 110 °C. Tras la siembra se incubaron en
estufa a 28 °C durante 15 días.
Después de la incubación se retiraron con un pipeta estéril 0.2 mL de cada tubo que se
pasaron a eppendorfs. Se realizó la prueba de los nitratos según se ha descrito en el caso de los
microorganismos nitrificantes nítricos pero en este caso se consideraron positivos los tubos en
los que no se detectó la presencia de nitratos.
2.5.4. Tratamiento de la información de los resultados de los análisis de los grupos
funcionales del ciclo del nitrógeno
Las frecuencias de cada género bacteriano a lo largo del estudio se compararon mediante
ANOVA unidireccional con réplicas (Sokal y Rohlf, 1979). En caso de existir diferencias
significativas, se procedió a la comparación de la media mediante el test estadístico LSD.
2.5.5. Análisis del ADN bacteriano
El análisis del ADN se llevó a cabo únicamente en las cepas pertenecientes al género
bacteriano mayoritario de cada zona en cada momento de muestreo.
65
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.5.5.a. Aislamiento del ADN
Para la extracción del ADN, las colonias crecieron durante 12 h en caldo nutritivo
(Pronadisa) a 28 °C en agitación. Transcurrido este tiempo, el medio se centrifugó a 4000
r.p.m. en una centrifuga SELECTA MIXTASEL. Las bacterias fueron tratadas según el
método de Noller y Hartsell (1961) que se describe a continuación. Al precipitado bacteriano
se le añadieron 0.5 mL de agua pH 3.5, manteniendo los tubos en baño de agua a 45 ºC
durante 30 minutos. Posteriormente se añadió una gota de NaOH 0.1 M y 2 mg de lisozima y
se incubó en baño de agua a 37 ºC una hora; a continuación se añadieron 2 mL del tampón de
extracción (Tris HCl 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM y SDS al 1 % P/V) y se
incubó a 60 ºC una hora. Transcurrido este tiempo se centrifugó a 4000 r.p.m. y al
sobrenadante se le añadieron 3 mL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1, agitando
suavemente la mezcla hasta formar una emulsión; seguidamente se centrifugó a 4000 r.p.m. Al
sobrenadante se le añadió 1 mL de acetato de sodio 3M y 6 mL de etanol a 5 ºC. Se centrifugó
a 4000 r.p.m. y el ADN precipitado se resuspendió en Tris HCl pH 7.6.
La concentración de ADN obtenido se midió en un espectofotómetro Shinadzu UV160A.
2.5.5.b. Amplificación del ADN mediante PCR-RAPDs
Las amplificaciones se llevaron a cabo usando “primers” aleatorios de diez nucleótidos
(técnica de RAPDs). Se seleccionaron cuatro “primers”, de un total de 20 (Kit B, Operon
Technologies, Alameda Calif.), para cada uno de los géneros mayoritarios (Pseudomonas y
Bacillus). La selección se realizó por la nitidez y el número de bandas obtenidas en las
amplificaciones, seleccionando los “primers” 4, 11, 17 y 18 para Pseudomonas y 10, 12, 15 y
20 para Bacillus. Las amplificaciónes se efectuaron en un medio que contenía Tris HCl 10mM
pH=8.3, KCl 50mM, MgCl2 4 mM, gelatina al 0.001 %, dATP, dCTP, dTTP, dGTP 200 µM,
1.25 unidades de Taq ADN Polimerasa (Perkin Elmer), primer 2 µM y 500ng del DNA
bacteriano y 40 µL de aceite mineral.
La amplificación del ADN se realizó en un equipo Perkin Elmer Cetus DNA Thermal
Cycler programado para una etapa inicial de 5 minutos a 95 ºC y 45 ciclos de: 1 min a 94 ºC,
2.5 minutos a 35 ºC y 2 minutos a 72 ºC.
66
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.5.5.c. Análisis electroforético de los fragmentos de ADN obtenidos mediante
amplificación
El ADN amplificado, como ya se indico en el Apartado anterior, se analizó por
electroforesis en gel de agarosa al 1 % en TAE (ver Apéndice A) al 1 % y bromuro de etidio
(en solución alcohólica al 1 %) en cantidad suficiente para alcanzar el 1.25 10-3 µg/mL en el
gel. A 10 µL de la muestra se le añadieron 3 µL de tampón de carga (ver Apéndice A),
insertándose en el gel 10 µL de esta mezcla. El gel se corrió en una cubeta MINICELLEC370M a 100 V usando una fuente EC105 (EC Apparatus Corporation, Florida) y utilizando
como tampón de electrodos TAE al 1 %. Como marcador de peso molecular se utilizó ADN
del fago Lambda digerido con Hind III.
Una vez concluida la electroforesis el gel se fotografió con una cámara POLAROID
MP-4, usando como base un equipo transiluminador ultravioleta SPECROLINE Modelo TC302.
2.5.5.d. Análisis de geles
Las fotografías de los geles obtenidos según lo descrito en el Apartado anterior, fueron
digitalizadas con un escáner AGFA, Modelo Arcus II, y mediante el uso del programa
Fotolook 2.08.
El análisis de los geles se hizo mediante el programa Lane Manager 2.1 (TDI SA), que
nos permite calcular los pesos moleculares de las distintas bandas. Para ello el programa
calcula una recta de regresión con la distancia recorrida por las bandas del marcador (Lambda
digerido con Hind III) y sus respectivos pesos moleculares.
A continuación el programa calcula para cada “primer” la distancia ultranumérica
entre las cepas ensayadas en función del número de bandas totales y comunes, basándose en
los algoritmos descritos por Nei y Miller (1990) y Clark y Lanigan (1993), construyendo a
partir de estos datos un dendrograma de similaridad según el método del UPGMA.
Una vez obtenidos las cuatro matrices de similitud (una por “primer”), mediante el
empleo del programa ADA 1.0 (análisis de datos avanzados TDI, SA), se elabora un nuevo
dendrograma empleando para el cálculo de la distancia ultranumérica un algoritmo en el que
se integra la información obtenida por los cuatro “primers” (Nei y Miller, 1990; Clark y
Lanigan, 1993). Este dendrograma nos permite conocer la divergencia genética entre cepas en
función del número de sustituciones nucleotídicas por sitio.
67
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.6. Efectos de las rizobacterias mayoritarias sobre la germinación y crecimiento de V.
villosa. Descripción general del procedimiento.
Se llevaron a cabo pruebas biológicas con el fin de conocer el efecto de los metabolitos
producidos por las bacterias pertenecientes a los géneros bacterianos mayoritarios sobre la
germinación el crecimiento de dos variedades de V. villosa, Namoi y Látigo.
Al diseñar las experiencias para estudiar los efectos de las rizobacterias sobre las plantas
se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones:
(1) Los parámetros biométricos, fisiológicos o químicos que se deberían ensayar en las
plantas germinadas o crecidas bajo el efecto de las rizobacterias, para demostrar su efecto sobre
ellas. En este sentido hemos considerado útil comprobar la capacidad de germinación y el
desarrollo de la planta durante las primeras etapas de su crecimiento (peso seco, longitud y área).
También se han considerado parámetros como el nitrógeno total.
(2) La forma de establecer la relación entre las rizobacterias y las plantas. Las
posibilidades al respecto son dos: bien, tal y como hacen autores como Zhang et al. (1995),
Burdman et al. (1996), inoculando una cantidad determinada de bacterias por planta o bien
empleando el medio donde han crecido las bacterias, eliminadas por centrifugado y filtración
(Derylo y Skorupska, 1993; Gutiérrez Mañero et al., 1996; Probanza et al., 1996). Se optó por
ese segundo procedimiento por motivos que se discuten más adelante.
Tanto en el caso de los ensayos de germinación como de desarrollo se realizaron con
concentraciones de medio de crecimiento bacteriano al 20 %. A continuación se describe
detalladamente la metodología empleada.
2.6.1. Selección de las cepas rizobacterianas ensayadas
La selección de bacterias se realizó estableciendo grupos a nivel del 90 % de similitud
según los dendrogramas obtenidos con el programa ADA tras la amplificación del ADN. De esta
manera se establecieron 15 grupos para el total de 33 Bacillus encontrados y 23 grupos para un
total de 52 Pseudomonas. Dentro de cada grupo se seleccionó una cepa al azar, que se utiliza
para los ensayos sobre crecimiento y germinación.
68
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.6.2. Preparación del medio de cultivo bacteriano
Como se señaló en el Apartado 2.6 para comprobar el efecto de las bacterias
seleccionadas sobre las plantas se empleó el medio donde crecieron dichas bacterias.
Cada una de las colonias, se sembró en matraces de 250 mL que contenían 100 mL del
siguiente medio: 4 g de caldo nutritivo (Difco); 100 mL de extracto de tierra; 1 mL de solución
de oligoelementos; 25 mL de Solución salina de Winogradsky; agua destilada hasta 1L.
Se incubaron a 28 °C en agitación a 3500 rpm, hasta las bacterias alcanzaron el final de
su fase exponencial de crecimiento.
Finalizada la incubación se centrifugó el medio en tubos de plástico estéril a 4500 rpm
durante 15 minutos a 4 °C, en una centrífuga de mesa Heraeus 400R. El sobrenadante se
conservó en alícuotas de 50 mL a -20 °C.
2.6.3. Ensayos de germinación
Las semillas empleadas para los ensayos de germinación pertenecían a dos variedades
comerciales de V. villosa: Namoi y Látigo (Rocalba S.A.). Las semillas se esterilizaron
superficialmente con hipoclorito sódico (20 g/l) 2 minutos. Posteriormente se lavaron con agua
destilada estéril cinco veces.
Cada medio de crecimiento bacteriano se ensayó sobre 60 semillas distribuidas en tres
lotes de 20; cada lote constituyó una réplica. Las 20 semillas de cada lote se dispusieron en
placas Petri utilizando como soporte agar-agar (12 g/L) al que se añadió el medio bacteriano
hasta alcanzar una concentración del 20 %. Para ello, el medio de soporte se esterilizó a
120
°C durante 20 minutos. Una vez frío, pero antes de solidificar, se añadió el medio de crecimiento
bacteriano (obtenido tal y como se reseñó en el Apartado 2.6.2) previamente descongelado y
filtrado por un filtro Millex-GS (Millipore), para eliminar células que en la centrifugación
hubiesen podido quedar en el sobrenadante.
Las placas con las semillas se mantuvieron 5 días en un cámara de cultivo ASL, con un
fotoperiodo de 15 horas de luz (a 26 °C) y 9 de oscuridad (a 20 °C). Cada 24 horas se
contabilizaba el número de semillas germinadas.
69
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
Paralelamente se hicieron controles en las mismas condiciones con medio de cultivo
estéril.
2.6.4. Tratamiento de la información de los resultados de los ensayos de germinación
Se hizo una ordenación de los datos de la germinación diaria (media de tres réplicas) de
semillas de cada variedad, en presencia de los medios de crecimiento bacteriano y el control
mediante un análisis de componentes principales (ACP) (Harman, 1967).
70
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.6.5. Ensayos de crecimiento
En la Figura 2.6 se representa esquemáticamente la metodología empleada en estos
ensayos.
Esterilización de semillas con
hipoclorito sódico 2 min
Cultivo de Rhizobium ISL-5
Lavado con agua
destilada estéril x 5
Siembra
48 h
Centrifugación
Riego cada 3 días
LÁTIGO
Resuspender en Crone sin N
NAMOI
Las plantas se mantienen en cámara
de cultivo hasta alcanzar 17.5 cm
NAMOI
LÁTIGO
Se trasplantan
5 plantas por vaso
10 días en camara
de cultivo
Análisis químico
y biométrico
80mL Crone sin N + 20mL de
medio de cultivo donde crecieron las bacterias filtrado
por 0.2µm.Controles con medio de cultivo bacteriano
estéril.
Figura 2.6. Esquema del protocolo seguido en los ensayos de crecimiento.
Las semillas empleadas en este ensayo se esterilizaron superficialmente con hipoclorito
sódico (20 g/L) durante 2 minutos y posteriormente se lavaron cinco veces con agua destilada
estéril. A continuación se sembraron en bandejas de plástico de 35 x 25 x 8 cm, esterilizadas
71
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
previamente con lejía y lavadas 5 veces con agua destilada estéril. Las bandejas se rellenaron con
vermiculita estéril (termita nº 3) esterilizada en autoclave a 120 °C durante 20 minutos. Las
plantas se regaron con Crone sin N (ver Apéndice A) manteniendo la humedad de la vermiculita
a pesada constante.
Con el fin de nodular las plantas se creció la cepa ISL-5 de Rhizobium, en caldo YMA
(ver Apéndice A). Después de 48 h de crecimiento, el medio se centrifugó y las bacterias se
resuspendieron en solución fisiológica. Esta suspensión bacteriana se mezcló con el Crone sin N,
utilizandola para regar las plantas en el momento de la siembra. La inoculación de Rhizobium se
repitió a los 3 y 6 días de crecimiento.
Una vez que las plantas alcanzaron una altura de 17.5 cm, se trasplantaron de cinco en
cinco (comprobando que tuviesen nódulos bien formados), a vasos de precipitados de 500 mL
que contenían 25 g de vermiculita, esterilizados previamente en autoclave a 120 °C durante 20
minutos. Las plantas en los vasos se regaron con 100 mL de una mezcla de Crone sin N y medio
de crecimiento bacteriano, consiguiendo así una CRM para la vermiculita del 60 %. Para ello se
esterilizaban en un erlenmeyer 80 mL de Crone sin N en autoclave a 120 °C durante 20 minutos
y a éste, una vez frío, se le añadían 20 mL de medio de cultivo bacteriano (obtenido tal y como
se reseñó en el Apartado 2.6.2) previamente descongelado y filtrado a través de un filtro MillexGS (Millipore). Paralelamente se hizo un control con medio de cultivo estéril.
Las plantas se dejaron crecer durante 10 días en una cámara de cultivo ASL con un
fotoperiodo de 15 horas de luz (a 26 °C) y 9 de oscuridad (a 20 °C), manteniendo la humedad
diariamente a pesada constante, con Crone sin N estéril.
Al cabo de los 10 días, las plantas se prensaron, para su posterior análisis.
2.6.6. Análisis biométricos de las plantas
Una vez prensadas y secas las plantas, se pesaron y midieron longitud y superficie aérea
y radical por separado. Las medidas de longitud radical se refieren a la suma de las longitudes
de todas las ramificaciones del sistema. La longitud aérea hace referencia a la altura de la planta.
Estas medidas se realizaron con un analizador de imagen de la marca Delta-T sistema Dias II.
72
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- MATERIALES Y MÉTODOS
2.6.7. Medidas de nitrógeno total de las plantas
Las plantas se sometieron a una digestión según el método de Kjeldhal y posteriormente
se valoró el amonio producido, mediante el método colorimétrico de Smith (1980). A
continuación se describe el método detalladamente.
A cada planta se le añadieron 5 mL de H2SO4 concentrado y se llevó a cabo la digestión
en un digestor de microondas focalizadas de la marca Prolabo, modelo Maxidigest-350, a 500
°C durante 13 minutos, tiempo durante el cual se añadieron de forma automática 10 mL de
H2O2, como catalizador oxidante de forma que todo el nitrógeno pasara a (NH4)2SO4. Una vez
frío se valoró el ion amonio siguiendo el protocolo descrito en el punto 2.3.4.
2.6.8. Tratamiento de la información de los resultados de los ensayos de crecimiento
Con los resultados de los experimentos de desarrollo se construyeron seis matrices:
- Dos, una para cada variedad, con los datos (media de tres réplicas) biométricos de las
raíces.
- Dos, una para cada variedad, con los datos (media de tres réplicas) biométricos de la
parte aérea.
- Dos, una para cada variedad, con los datos (media de tres réplicas) de peso total y
nitrógeno total expresado como mg/g de planta y mg/planta.
Cada una de estas seis matrices se sometieron a un ACP con el fin de generar grupos de
respuestas. Los resultados de esta ordenación se corroboran estadísticamente mediante
ANOVAs unidireccionales sobre los distintos parámetros.
73
3. MATERIALES Y MÉTODOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO
DE LA DINÁMICA DEL CICLO DEL NITRÓGENO BAJO
V. villosa
3.1. Experiencias realizadas en condiciones controladas de laboratorio
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.1. Recogida y caracterización del suelo empleado en las experiencias¡Error! No se
encuentra el origen de la referencia. de laboratorio
El suelo empleado para el estudio fue recogido en las proximidades de la urbanización
Montepríncipe, en Boadilla del Monte, descrita en el Apartado 2.1.
El suelo se recogió en varios puntos del encinar en los 15 primeros cm bajo la hojarasca,
se homogeneizaron todas las muestras y se pasaron por una criba con 2 mm de diámetro de
poro.
3.1.2. Cultivo de las variedades estudiadas y toma de muestras
El suelo se repartió en 18 bandejas de plástico con unas dimensiones de 20 x 30 x 6 cm.
Se sembraron nueve de ellas con semillas de la variedad Namoi y otras nueve con la variedad
Látigo. La densidad de semillas empleadas en la siembra fue el doble de la utilizada
normalmente en el campo (100 Kg/ha), de esta forma se consigue que todo el suelo de la
bandeja sea rizosférico. Tres bandejas más no se sembraron y sirvieron de control. Además otras
tres bandejas de cada variedad sirvieron para el análisis de imagen de las plantas.
Los muestreos se realizaron en tres etapas del desarrollo de la planta, desarrollo
vegetativo (T1), floración (T2) y fructificación (T3).
Durante todo el experimento los suelos se mantuvieron al 30 % de la capacidad de
retención máxima mediante pesada diaria. De esta forma las bandejas se introducen en una
cámara de cultivo (ASL aparatos científicos) empleando los fotoperíodos y temperaturas que a
continuación se indican: 20 días, 11 horas de luz a 14 °C y 13 horas de oscuridad a 3 °C; 15
días, 9 horas de luz a 10 °C y 15 horas de oscuridad a 1 °C; 15 días (T1), 11 horas de luz a 14
°C y 13 horas de oscuridad a 3 °C y finalmente, durante T2 y T3, 14 horas de luz a 28 °C y 10
horas de oscuridad a 10 °C.
En cada muestreo se apartaba al azar una bandeja de cada variedad, de aquellas
destinadas a análisis de imagen y se dividía en tres partes iguales. Cada una de ellas constituyó
una réplica. Las plantas, incluido el aparato radical, se prensaron para posterior análisis de
imagen y químico.
Con las nueve bandejas de cada variedad se constituyeron tres grupos. De cada grupo se
75
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
extrajeron tres fracciones de suelo rizosférico (uno de cada bandeja), las tres fracciones se
homogeneizaron constituyendo una réplica. En cada momento de muestreo, una bandeja
escogida al azar, de las tres destinadas a controles, se dividió en tres partes iguales
constituyendo cada una de ellas una réplica. Todos los análisis se realizaron por triplicado
(Figura 3.1).
NAMOI
ANÁLISIS
DE SUELO
R1
LÁTIGO
R2
R3
ANÁLISIS
DE SUELO
R1
R2
R3
CONTROL
ANÁLISIS
DE SUELO
R1
R2
R3
NAMOI
R1
R2
R3
ANÁLISIS
DE IMAGEN
LÁTIGO
R1
R2
R3
Figura 3.1. Esquema del protocolo seguido para la obtención de muestras de suelo y plantas.
3.1.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos
Las muestras de suelo se sometieron a análisis fisicoquímicos para caracterizarlos en
cada una de las etapas mencionadas, a excepción de la textura y la capacidad de retención
máxima que sólo se determino en el primer muestreo. La metodología empleada en la
76
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
determinación de la CRM, textura de los suelos, pH, nitrógeno total, nitrógeno amonio,
nitrógeno nitrato y carbono orgánico, fue la misma que la descrita en el Apartado 2.3. A
continuación se describe la metodología empleada para la determinación de la capacidad de
intercambio catiónico, concentración de cationes de cambio y fosfatos.
3.1.3.a. Determinación de la capacidad de intercambio catiónico (CIC)
Se utilizó el método descrito por Ritas y Melida (1978). Se basa en la saturación del
suelo con un catión índice, en este caso amonio, lavado del exceso de sales y determinación del
catión índice retenido.
2 g de suelo se colocaron en un tubo de centrífuga y se lavaron durante cinco minutos
con acetato amónico 1 N, después se centrifugó y se recogió el sobrenadante en un matraz
aforado de 50 mL, este proceso se repitió cuatro veces. Posteriormente se aforó el matraz hasta
los 50 mL con acetato amónico 1N y se guardó para la determinación de los cationes de cambio.
A continuación se lavó el suelo con etanol, rechazando los sobrenadantes, esta operación se
realizó 5 veces. Seguidamente se lavó el suelo con una solución de cloruro sódico al 10 %,
recogiendo el sobrenadante en un matraz aforado de 50 mL y repitiendo esta operación 4 veces,
el matraz se aforó con agua destilada. De este matraz se cogieron 2.5 mL y se le añadieron 2 mL
de tartrato sódico al 10 %, agua hasta 90 mL y 5 mL de reactivo de Nessler (45.5 g de HgI2, 35 g
de KI, 112 g de NaOH y 1000 mL de agua destilada) mezclando inmediatamente, después se
aforó la mezcla hasta 100 mL y se midió a 410 nm en un espectrofotómetro Milton Roy modelo
Spectronic 20. Los datos obtenidos se llevaron a una recta patrón con el fin de transformar los
datos en unidades de Capacidad de Intercambio Catiónico. Esta recta se trazó a partir de
diluciones sucesivas de una estándar de 1 meq/L de NH4CL. Los valores correspondientes se
ajustaron a una recta por el método de los mínimos cuadrados.
3.1.3.b. Determinación de cationes de cambio: calcio, magnesio y potasio
La determinación del calcio y magnesio se realizó por absorción atómica en un
espectrómetro Perkin Elmer modelo 3110. Los datos obtenidos se interpolaron en rectas patrón
de calcio y magnesio. Estas rectas se trazaron a partir de diluciones sucesivas de soluciones
estándar de 10 ppm y 0.6 ppm de CaNO3 y MgNO3 respectivamente. Los valores
77
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
correspondientes se ajustaron a una recta por el método de los mínimos cuadrados.
La determinación de potasio se realizó por fotometría de llama en un fotómetro Meteor
modelo Nak II. Los datos obtenidos se interpolaron en una recta patrón trazada a partir de
diluciones sucesivas de una solución estándar de 20 ppm de KCl. Los valores correspondientes
se ajustaron a una recta por el método de los mínimos cuadrados.
3.1.3.c. Determinación del fósforo lábil del suelo
Se utilizó el método de Bray-Kurtz (1945), 2 g de suelo se agitaron durante 5 minutos
con una solución extractante formada por una solución de HCL 0,025 N a la que se le añaden
1,12 g de NH4F. En el filtrado se determinó el fósforo por fotocolorimetría con un fotómetro
Merck modelo 502130/SQ 113. El fósforo reacciona en solución ácida con vanadato de amonio
y heptamolibdato de amonio dando un complejo amarillo anaranjado del ácido
molibdovanadatofosfórico.
3.1.4. Determinación del ARA de los nódulos
Se evaluó por el método de reducción de acetileno de Hardy et al. (1973), modificado
por Akkermans (1971). Los nódulos se separaban de la raíz y se introducían en viales de 15 mL,
se cerraban herméticamente y se sustituía el 10 % de la atmósfera por acetileno, en estas
condiciones se incubaba durante 1 hora.
El etileno producido tras una hora de incubación se midió en un cromatógrafo de gases
KONIC 3000 HRGC, con un detector FID y una columna Porapak-R (malla 80/100) de 200 cm
de longitud y 0.2 cm de sección en las condiciones que se especifican en el Apartado 2.4.
3.1.5. Análisis de la actividad potencial de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
Se determinaron: la actividad reductora del acetileno potencial (ARA), el potencial
amonificante (mineralización), el potencial nitrificante y el potencial desnitrificante total.
3.1.5.a. Determinación del ARA potencial
78
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
La actividad reductora de acetileno en suelos se evaluó siguiendo el método de McNabb
y Geist (1979) en las condiciones que proponen Grant y Binkley (1987). Para ello se colocaron
100 g de suelo en recipientes estancos de 600 mL al que se añadió un 2.5 % de glucosa y agua
destilada hasta CRM.
Posteriormente se sustituyó un 10 % de la atmósfera de los recipientes por acetileno y se
dejaron en incubación durante 24 horas, el etileno producido se evaluó por cromatografía de
gases, con el equipo y condiciones descritas en el Apartado 2.4.
3.1.5.b. Determinación del potencial amonificante
Para evaluar la amonificación potencial se siguieron las condiciones propuestas por Alef
y Kleiner (1986) modificado. En recipientes de 100 mL se incubaron: 15 g de suelo, 0.09 g de
asparagina, 0.15 mL de solución de oligoelementos, 3.75 mL de solución de Winograsky doble
concentrada y agua destilada hasta CRM, los recipientes se taparon con algodón para evitar la
entrada de microorganismos y permitir la transpiración.
De todos los recipientes se tomaron 5 g de la mezcla al iniciarse la incubación y otros
tantos tras la misma, verificada en oscuridad durante 72 horas. En estas alícuotas se midió el
amonio producido, del modo en que se reseña en el Apartado 2.3.5, obteniéndose
respectivamente: No (nitrógeno mineralizado a tiempo cero) y Nt (nitrógeno mineralizado a
tiempo t). El incremento de amonio en dicho período es el potencial amonificante.
3.1.5.c. Determinación del potencial nitrificante
Para la determinación del potencial nitrificante se emplearon las condiciones de
Robertson y Vitousek (1981). Se tomaron 100 g de suelo, se introdujeron en recipientes de 250
mL y se incubaron con: 0.016 g de (NH4)2SO4, cantidad suficiente para que la concentración de
amonio sea superior a 10 ppm e inferior a 800 ppm. Por debajo de 10 ppm el amonio es
limitante para la nitrificación (Verstrate, 1981) y por encima de 800 ppm se inhibe el proceso
(Jones y Hedlin, 1970). Con agua destilada se llevó hasta CRM.
Se tomó una muestra de suelo de cada recipiente al inicio de la incubación y se midió el
contenido de nitrato. La incubación se verificó en oscuridad durante 20 días a 21 °C,
transcurridos los mismos se procedió a medir el contenido en nitrato. Las mediciones de éste se
79
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
hicieron con el mismo instrumental y método descritos en el Apartado 2.3.6. El incremento de
nitrato en ppm durante dicho período es el potencial nitrificante. Durante la incubación se
pesaron los recipientes cada 48 horas para reponer con agua destilada estéril las perdidas de
humedad.
3.1.5.d. Determinación del potencial desnitrificante
Se efectuó por el método de inhibición por acetileno (Yoshinari y Knowles, 1976), en
las condiciones dadas por Gutiérrez Mañero et al. (1995). Se tomaron 100 g de suelo a los que
se añadieron un 2.5 % de glucosa y agua hasta CRM, en estas condiciones se incubó en
recipientes estancos de 600 mL, a los que se había sustituido el 10 % de la atmósfera por
acetileno, durante 96 horas a temperatura ambiente.
El óxido nitroso producido se evaluó con el mismo equipo reseñado en el Apartado 2.4,
pero utilizando ahora un detector TCD y una columna Chromosorb-101 (malla 80/100) de 200
cm de longitud y 0.2 cm de diámetro en las siguientes condiciones:
Temperatura de la columna: 40 °C
Temperatura del inyector: 50 °C
Temperatura del detector: 100 °C
Gas portador: Helio
Flujo del gas portador: 20 mL/min
Volumen de la muestra: 1 mL
3.1.5.e. Determinación de la producción de CO2 (respiración potencial)
Para establecer la producción de CO2 se empleó el mismo protocolo que en la
desnitrificación, tanto en las condiciones de incubación como de cromatografía. La columna y
condiciones empleadas permiten separar el CO2 del resto de los gases (Llinares et al., 1991) y
por lo tanto conocer su producción en moles de gas por gramo de suelo y hora.
3.1.6. Análisis biométricos de las plantas
80
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
En cada momento de muestreo se recogieron todas las plantas de una bandeja de cada
variedad, se prensaron y se midieron la longitud y la superficie de la parte aérea y radical por
separado. Estas medidas se realizaron con un analizador de imagen de la marca Delta-T sistema
Dias II.
3.1.7. Análisis químicos de las plantas
En cada momento de muestreo se llevó a cabo un análisis del nitrógeno total de la parte
aérea y subterránea, de cada variedad. En el T3 se excluyeron los frutos para la realización de
este análisis. El protocolo fue el mismo utilizado para suelos y detallado en el Apartado 2.3.4,
pero partiendo de 0.2 g de material vegetal.
3.1.8. Tratamiento de la información
Se hizo una ordenación de los valores medios de los datos, mediante un análisis de
componentes principales (ACP) (Harman, 1967), con el objeto de descomponer la varianza total
de la muestra en una serie de factores de variación, donde quedó reflejada la importancia de
cada una de las variables, así como la influencia del conjunto de variables en la dispersión de las
muestras analizadas. Este tipo de análisis se hizo con los datos fisicoquímicos, bióticos y
biométricos por separado.
Para la comparación de los datos se empleó análisis de la varianza (ANOVA)
bidireccional con réplicas y dos factores de variación, tiempo de muestreo y las variedades
incluido el control y ANOVA unidireccional con réplicas en aquellos casos en que la
interacción entre las dos variables estudiadas no fue significativa y las diferencias entre medias
para cada tiempo de muestreo eran superiores al error estándar (Sokal y Rohlf, 1979).
Cuando las variables influyeron significativamente al nivel del 95 % o del 99 %, se
procedió a la comparación de la media mediante el test estadístico LSD (mínima diferencia
significativa) (Sokal y Rohlf, 1979).
81
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
3.2. Estudios de campo previos sobre la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del
nitrógeno realizados en las parcelas de Toledo
3.2.1. Descripción de la zona
Los experimentos se llevaron a cabo en tres parcelas de 1500 m2 situadas en la finca “El
Retamar de Arriba” en la provincia de Toledo. El territorio se encuadra biogeográficamente en
la provincia de vegetación Luso-Extremadurensa, sector Toledano-Tagano, subsector Oretano.
Los elementos propios de este subsector son: Centaurea toledana, Dianthus scaber subsp.
toletanus, Thymus villosus y Prunus lusitanica. Dentro de este subsector, el territorio donde se
realizó el estudio está comprendido dentro del distrito de los Montes, que comprende la
comarca natural de los Montes de Toledo, dominada en su gran mayoría por pizarras
paleozoicas sobre las que se asientan comunidades de Sanguisorbo-Quercetun suberis y sus
etapas seriales de Phillyreo-Arbutetum y Erico-Cistetum ladaniferi. La zona de estudio está
situada en el piso mesomediterráneo y posee un clima mediterráneo con ombroclima entre seco
y subhúmedo inferior.
82
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
"El Retamar de Arriba"
Figura 3.2. Localización dentro de la provincia de Toledo de la finca "El Retamar de Arriba"
La Figura 3.3 muestra los datos de precipitación y temperatura del año en que se
llevaron a cabo los muestreos. Estos datos pertenecen a la estación meteorológica de Mora de
Toledo por ser la más cercana con datos disponibles de pluviosidad y temperatura.
30
60
ESTACIÓN DE MORA DE TOLEDO (717 m)
50
20
40
30
10
20
10
0
0
ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC
TEMPERATURA PRECIPITACION
Figura 3.3. Datos de temperatura y pluviosidad de 1994 de la estación de Mora de Toledo.
3.2.2. Siembra de las semillas de V. villosa y recogida de las muestras de suelo
Las semillas de V. villosa variedad Namoi se sembraron en una densidad de 50 Kg/ha a
finales de Octubre.
Cada una de las tres parcelas se trató por separado, constituyendo cada una una réplica.
Se llevaron a cabo tres muestreos, uno en el momento de la siembra para analizar las
83
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
características fisicoquímicas del suelo, el segundo cuando la planta floreció (Mayo) y el último
cuando fructificó (Abril). En cada momento de muestreo, se tomaron cinco muestras de suelo
por zona. Las muestras de cada zona se homogeneizaron y se transportaron al laboratorio en
bolsas estériles a 4 °C. Una vez allí el suelo se cribó a través de una malla de 2 mm y se dividió
en dos fracciones. Una de ellas se empleó inmediatamente para la determinación de las
actividades potenciales del ciclo del nitrógeno, la segunda se secó a 55 °C y se empleó para la
caracterización fisicoquímica de los suelos.
Otras cinco muestras se tomaron preservando la estructura del suelo, con el objeto de
estudiar en ellas la desnitrificación, el ARA y la producción de CO2 en condiciones de campo.
Para ello, se introdujo un cilindro de 7 cm de diámetro hasta una profundidad de 12 cm. El
cilindro de suelo resultante y las plantas creciendo en esa superficie se introdujeron en un
recipiente hermético de 580 mL. Una vez cerrado, el 10 % de la atmósfera del recipiente se
sustituyó por acetileno y se transportaron al laboratorio a 4 °C.
3.2.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos
Una vez en el laboratorio, una fracción del suelo muestreado se cribó a través de una
malla de 2 mm, y se secó a 55 °C. En todos los momentos de muestreo se determinaron, pH,
carbono orgánico, nitrógeno total, nitrógeno amonio, nitrógeno nitrato, según lo descrito en el
Apartado 2.3. Además en el primer muestreo se determinó la CRM y la textura del suelo,
siguiendo el protocolo descrito en el mismo Apartado.
3.2.4. Análisis de la actividad potencial de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
El suelo recogido en todos los momento de muestreo se cribó a través de una malla de 2
mm (sin secar) y en él se determinaron la amonificación, nitrificación desnitrificación,
producción de CO2 y ARA potencial, según los protocolos descritos en el Apartado 3.1.5.
3.2.5. Actividad desnitrificante, ARA y producción de CO2 en condiciones de campo
Las muestras recogidas según 3.2.2 se mantuvieron a 25 °C durante 48 h. Transcurrido
84
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
este tiempo se midió la producción de N2O, CO2 y etileno según lo especificado en los
Apartados 3.1.5.d, 3.1.5.e y 3.1.5.a.
3.2.6. Determinación del ARA de los nódulos
El ARA de los nódulos de V. villosa, se cuantificó separándolos de las raíces e
introduciéndolos en viales de 15 mL. Una vez cerrado el vial, el 10 % de la atmósfera se
reemplazó por acetileno. Tras 15 minutos se midió la producción de etileno en un cromatógrafo
KONIK 3000 HGRC provisto de un detector de ionización de llama y columna Porapak R
como se describe en el Apartado 2.4.
3.2.7. Tratamiento de la información
Los resultados de las actividades potenciales y de campo, así como los resultados de los
análisis fisicoquímicos del suelo a lo largo del estudio se compararon con mediante ANOVA
unidireccional con réplicas (Sokal y Rholf, 1969). En caso de existir diferencias significativas,
se procedió a la comparación de la media mediante el test estadístico LSD (mínima diferencia
significativa) (Sokal y Rohlf, 1979).
3.3. Estudios de campo realizados en las parcelas de experimentación de Montepríncipe
sobre la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del nitrógeno
3.3.1. Descripción de las parcelas de experimentación para estudios de campo
Una vez obtenidos los resultados de los trabajos de campo efectuados en Toledo, se
llevaron a cabo experiencias en parcelas de experimentación situadas en el campus de la
Universidad San Pablo CEU (Urb. Montepríncipe, Boadilla del Monte) con el fin de
profundizar en algunos aspectos que se discuten posteriormente.
Las características climáticas de la zona se describen en el Apartado 2.1.
La Figura 3.4 muestra los datos de precipitación y temperatura de los meses de 1995 y
1996 en los que se llevaron a cabo las experiencias. Estos datos pertenecen a la estación
meteorológica de Cuatro Vientos por ser la más cercana con datos disponibles de pluviosidad y
85
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
temperatura.
60
120
CUATRO VIENTOS (687 m)
110
100
50
90
80
40
70
30
60
50
20
40
30
10
20
10
0
0
Jul
Ago
Sep
Oct
Nov
Dic
Ene
Feb
Mar
Abr
1995
May
Jun
Jul
Ago
Sep
Oct
1996
Tª
PRECIPITACIÓN
Figura 3.4. Datos de temperatura y pluviosidad de 1995 y 1996 de la estación de Cuatro Vientos.
Para el estudio se utilizaron nueve parcelas de 2.25 m2, separadas por pasillos de 0.5 m.
En tres de ellas se sembró la variedad Namoi, en otras tres la variedad Látigo y las tres últimas
se mantuvieron sin sembrar actuando como controles. Cada parcela constituyó una réplica.
3.3.2. Siembra de las semillas de V. villosa y recogida de muestras
Las semillas se sembraron a finales de Octubre en la misma proporción que la utilizada
normalmente en actividades agrícolas con esta planta, 50 Kg/ha. Durante el experimento, estas
parcelas se limpiaron regularmente de malas hierbas, evitando su proliferación. Las plantas
crecieron sin necesidad de utilizar riegos artificiales, y una vez hubieron fructificado y
madurado sus frutos y antes de que se agostase, se enterraron, con el fin de conocer la eficiencia
de esta planta como abono verde.
Se hicieron cinco muestreos. El primero, antes de la siembra, para caracterizar
fisicoquímicamente el suelo, el segundo cuando la planta estaba en estado vegetativo, el tercero,
cuando floreció, el cuarto en fructificación y el quinto cinco meses después de enterrar las
plantas. El quinto muestreo se realizó en el momento en que hubiésemos tenido que sembrar
para una nueva cosecha.
En cada momento de muestreo, se recogieron las plantas y el suelo adherido a sus raíces
86
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
incluidas en una superficie de 900 cm2. El muestreo se realizó tirando al azar un cuadrado de las
dimensiones anteriormente mencionadas en cada parcela. Las muestras se transportaron al
laboratorio en bolsas estériles y una vez allí, se separó la tierra de las plantas mediante agitación.
El suelo se cribó a través de una malla de 2 mm y se dividió en dos fracciones. Una de ellas se
empleo inmediatamente para la determinación de las actividades potenciales del ciclo del
nitrógeno, la segunda se secó a 55 °C y se empleó para la caracterización fisicoquímica de los
suelos. Las plantas se secaron y posteriormente se analizaron parámetros biométricos y
químicos de las mismas.
3.3.3. Análisis fisicoquímicos de los suelos
Las muestras de suelo se sometieron a análisis fisicoquímicos para caracterizarlos, en
cada uno de los muestreos mencionados, a excepción de la textura y la CRM que sólo se
determinó en el primero. La metodología empleada en la determinación de la CRM, textura de
los suelos, pH, nitrógeno total, nitrógeno amonio, nitrógeno nitrato, carbono orgánico, CIC,
concentración de cationes de cambio y fosfatos es la misma que la indicada en el Apartado
3.1.3.
3.3.4. Análisis de la actividad potencial de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
El suelo recogido en todos los momento de muestreo se cribó a través de una malla de 2
mm (sin secar) y en él se determinaron la amonificación, nitrificación desnitrificación,
producción de CO2 y ARA potencial, según los protocolos descritos en el Apartado 3.1.5.
3.3.5. Determinación del ARA de los nódulos
Se evaluó por el método de reducción de acetileno de Hardy et al (1973), modificado
por Akkermans (1971). Las raíces se introducían en frascos con tapón y septo de 250 mL, se
cerraban herméticamente y se sustituía el 10 % de la atmósfera por acetileno, en estas
condiciones se incubaba durante 15 minutos.
El etileno producido tras una hora de incubación se midió según el protocolo descrito en
el Apartado 2.4.
87
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.6. Análisis biométricos de las plantas
En cada momento de muestreo se recogieron todas las plantas de la superficie
muestreada para cada variedad, se secaron y pesaron parte aérea y radical por separado.
3.3.7. Análisis químicos de las plantas
3.3.7.a. Determinación del nitrógeno total
En cada momento de muestreo se llevó a cabo un análisis del nitrógeno total de la parte
aérea y radical por separado, de cada variedad. El protocolo fue el mismo utilizado en el
Apartado 3.1.7.
3.3.7.b. Determinación de fibra ácido detergente (FAD)
Se determinó en la parte aérea de la planta siguiendo el método de Van Soest (1963).
Se pesan 2 g de muestra seca en un matraz de fondo redondo esmerilado. Se añaden tres o
cuatro perlas de vidrio para regular la ebullición, y 100 mL de solución detergente de
bromuro de hexadecil trimetil amonio al 2 % a pH 1.5. A continuación se calienta el matraz
en una manta calefactora a reflujo 5-10 minutos, una vez alcanzado el punto de ebullición se
mantiene durante 1 hora. El contenido del matraz se filtra a través de un crisol de placa
filtrante (nº2), previamente tarado, con ayuda de vacío. El matraz se lava 2 veces con agua
destilada caliente (90-100 ºC) filtrando por el crisol, y finalmente el residuo se lava dos veces
con acetona. El crisol junto con el residuo se deseca en estufa (100 ºC) durante una noche, se
enfría en desecador y se pesa. Por diferencia de pesada se obtiene el porcentaje de FAD.
3.3.7.c. Determinación de fibra neutro detergente (FND)
El fundamento es el mismo que en el caso anterior (Van Soest y Wine, 1967). Se
88
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
toman entre 0.5-1 g de muestra seca y se añaden 100 mL de solución detergente cuyo pH esté
comprendido entre 6.9 y 7.1 (30 g de lauril sulfato sódico, 18.61 g de EDTA, 6.81 g borato
sódico, 4.56 g de fosfato disódico y 10 mL de 2-etoxi etanol), 2 mL de decahidronaftaleno y
0.5 g de sulfito sódico, se mantiene a ebullición 1 hora, y se filtra de la misma manera. Por
diferencia de pesada se obtiene el porcentaje de FND.
3.3.7.d. Determinación de azúcares
Para la determinación de azucares utilizamos el método de la antrona (Loewus, 1952)
combinado con el método del orcinol (Norris y Ribbons, 1971).
En todos los muestreos se realizó en la parte aérea de la planta, y además en
fructificación en frutos y semillas.
La extracción de los azúcares solubles en alcohol, se realiza tomando 0.25 g de
muestra a los que se añaden 75 mL de etanol al 80 % manteniéndolo a reflujo 30 minutos. El
extracto se filtra a través de papel Whatman nº1, lavando el residuo varias veces con el
mismo disolvente para después evaporar lentamente. El residuo después de la evaporación se
disuelve con 200 mL de agua destilada.
Para la determinación de los azúcares reductores se toman 1.5 mL de la solución
anterior y se añaden 3 mL de solución de antrona al 0.2 % en ácido sulfúrico concentrado, y
se mantienen en baño de agua durante 10 minutos. El ácido sulfúrico en estas condiciones
forma con los azúcares 5-hidroxi-metil furfural, que con la antrona proporciona una
coloración verde proporcional a la cantidad de glúcidos, por absorbancia a 540 nm se
determina el contenido de glúcidos solubles en etanol, incluidas las pentosas.
Para la determinación de las pentosas se toma 1 mL de la solución procedente de la
extracción de azúcares y 1 mL de reactivo de orcinol (100 mg de orcinol, 100 mL de HCl y
100 mg de FeCl3). Se mezcla bien y mantiene en baño de agua durante 45 minutos. Después
de enfriar se determinan las pentosas por absorbancia a 672 nm. Los datos obtenidos se
interpolan en una recta patrón trazada a partir de diluciones sucesivas de una solución de
ribosa de 50 ppm. Los valores correspondientes se ajustaron a una recta por el método de
mínimos cuadrados.
La cantidad de hexosas se calcula restando las pentosas a los azúcares obtenidos por
el método de la antrona.
89
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.-MATERIALES Y MÉTODOS
3.3.7.e. Determinación de alcaloides
La determinación de alcaloides se basa en el método de Von Baer (1978). En todos los
muestreos se realizó en la parte aérea de la planta, y además en fructificación en frutos y
semillas. A 100 mg de harina finamente pulverizados se le añaden 0.1 mL de KOH al 15 %
con lo que los alcaloides son transformados en sus correspondientes bases; se secan con 300
mg de Al2O3, triturando hasta obtener una masa seca homogénea. A esta masa se le añaden 10
mL de cloroformo, se mantiene agitando durante 30 minutos y se deja decantar. Después se
filtra en un matraz de 20 mL, se lava el filtro con cloroformo y se enrasa.
Se toma 1 mL del extracto de alcaloides a los que se añaden 9 mL de cloroformo y 0.1
mL de púrpura de bromo-cresol (1 g de púrpura de bromo cresol, 100 mL de isopropanol, 0.5
mL de ácido isobutírico), obteniendo un complejo que absorbe a 450 nm. Los datos obtenidos
se interpolan en una recta patrón trazada a partir de diluciones sucesivas de una solución de
10 ppm de esparteina. Los valores correspondientes se ajustaron a una recta por el método de
mínimos cuadrados.
3.3.8. Tratamiento de la información
Se hizo una ordenación de los valores medios de los datos, mediante un análisis de
componentes principales (ACP) (Harman, 1967), con el objeto de descomponer la varianza total
de la muestra en una serie de factores de variación, donde quedó reflejada la importancia de
cada una de las variables, así como la influencia del conjunto de variables en la dispersión de las
muestras analizadas. Este tipo de análisis se hizo con los datos de los análisis fisicoquímicos de
los suelos y de las actividades potenciales de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno.
Para la comparación de los datos se empleó análisis de la varianza (ANOVA)
bidireccional con réplicas y dos factores de variación, tiempo de muestreo y las variedades
incluido el control y ANOVA unidireccional con réplicas en aquellos casos en que la
interacción entre las dos variables estudiadas no fue significativa y las diferencias entre medias
para cada tiempo de muestreo fuesen superiores al error estándar (Sokal y Rohlf, 1979).
90
4. RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE LA RIZOSFERA DE
V. villosa
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
4.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos
Los resultados de los análisis fisicoquímicos aparecen en la Tabla 4.I y se representan
en la Figura 4.1. Todos ellos corresponden a la media aritmética de las tres réplicas (zonas de
muestreo) por muestra y tres medidas por réplica.
Tabla 4.I. Caracterización fisicoquímica de los suelos. A la derecha de cada dato, en cursiva, aparece el
error estándar y una letra que indica la significación de las diferencias entre momentos de muestreo. Letras
iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
Amonio
Nitrato
(µg/g suelo)
(µg/g suelo)
Vegetativo
7.84 ±0.42 a
20.34 ±0.48 a
Floración
6.54 ±0.23 b
Fructificación
8.4 ±0 a
pH
Carbono
Orgánico (%)
Nitrógeno Total
6.91 ±0.07 a
0.85 ±0.04 a
1.55 ±0.08 a
56.56 ±4.51 b
6.77 ±0.04 a
1.07 ±0.08 a
1.74 ±0.07 a
83.76 ±2.82 c
6.92 ±0.11 a
1.13 ±0.02 a
1.52 ±0.11 a
(mg/g suelo)
9
8
7
6
Vegetativo
Floración
Fructificación
5
4
3
2
1
0
Amonio
Nitrato
pH
CO
Nitrógeno
Total
Figura 4.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos rizosféricos. Unidades: Amonio (µg/g suelo);
Nitrato (µg/g suelo x 10-1); Carbono Orgánico (CO) (%); Nitrógeno Total (mg/g suelo).
La concentración de nitrógeno amonio presenta variaciones a lo largo del
experimento, disminuyendo de forma significativa durante la floración de la planta. Sin
92
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
embargo, posteriormente en fructificación, los valores de amonio se recuperan alcanzando en
este momento las concentraciones más altas (8.4 µg/g suelo).
La concentración de nitrógeno nitrato aumenta considerablemente a lo largo de la
experiencia, llegando a alcanzar en fructificación valores cuatro veces superiores a los del
período vegetativo. Los incrementos detectados fueron significativos en todos los casos.
En cuanto al pH, carbono orgánico y nitrógeno total, no presentan variaciones. Como
se puede observar en todos los muestreos el pH es ligeramente ácido oscilando entre 6.77 y
6.92. El carbono orgánico, se mantiene en valores en torno al 1 %, y el nitrógeno total
presenta los valores más altos durante el segundo muestreo (1.74 mg/g de suelo).
La textura y la capacidad de retención máxima (CRM) se midieron únicamente en el
primer muestreo. Ambos parámetros resultaron semejantes en las tres zonas, siendo la CRM
para los suelos de la Raya del Palancar (RP) de 0.447 mL/g suelo, de 0.49 para los de
Montepríncipe A (MPa) y 0.5 mL/g suelo para los de Montepríncipe B (MPb). La textura de
las tres zonas, de las que se hicieron tres medidas, resultó ser franco arcillosa arenosa, con un
porcentaje de 47 % de arena, 35 % de arcilla y 18 % de limos.
4.2. Géneros bacterianos encontrados y frecuencia de los mismos
Los géneros bacterianos, a los que pertenecían las bacterias aisladas a partir de las
suspensiones diluciones del suelo, se determinaron siguiendo el esquema diagnóstico de
Acero et al., (1993) (Figura 2.5, Apartado 2.5.1 de Materiales y Métodos). La Figura 4.2
muestra los porcentajes totales de los géneros bacterianos encontrados, considerando todas las
zonas y momentos de muestreo.
93
Enterobacteriaceas
16%
Moraxella
1%
Acinetobacter
1%
Erwinia
3%
Xanthomonas
0,5%
Streptomyces
3%
Chromobacterium
1%
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Bacillus
22%
Flavobacterium
7%
Pseudomonas
31%
Coryneformes
14%
Figura 4.2. Porcentajes totales de los géneros bacterianos encontrados en la rizosfera de V. villosa.
Como se puede observar, los géneros predominantes son Pseudomonas (31 %) y
Bacillus (22 %). Las diferencias de estos dos géneros con respecto a los demás son muy
acusadas. Del resto de los géneros encontrados, Flavobacterium (7 %), Streptomyces y
Erwinia (3 %) son los que aparecen en proporciones más altas, mientras que
Chromobacterium, Moraxella y Acinetobacter aparecen en un 1 % y Xanthomonas en un 0.5
%. Cabe destacar la presencia de dos grupos de bacterias que incluyen diversos géneros,
Enterobacteriaceas y Coryneformes, que representan un 16 y 14 % del total respectivamente.
En la Figura 4.3 aparecen las frecuencias de los géneros bacterianos con mayor
representación en todas las épocas de muestreo. Estas frecuencias son el resultado de la media
aritmética de las tres réplicas. En esta Figura, se representa como “Otros”, a la suma de las
frecuencias del resto de los géneros (con frecuencias inferiores al 7 %), los cuales aparecen
desglosados posteriormente en la Figura 4.4.
94
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
0,4
a
b
a
a
0,35
a
0,3
a
Bacillus
Frecuencia
b
0,25
b
0,2
0,15
0,1
a
a
a
Enterobacteriaceas
Otros
b
a a
0,05
Pseudomonas
Coryneformes
Flavobacterium
a
0
Vegetativo
Floración
Fructificación
Figura 4.3. Frecuencia de los géneros bacterianos más abundantes encontrados en la rizosfera de V. villosa en
cada época de muestreo. Sobre cada columna y en su color correspondiente aparece una letra que indica la
significación de las diferencias (p<0.05) entre muestreos para cada género. Letras iguales indican la ausencia de
diferencias significativas.
Bacillus y Pseudomonas son los géneros predominantes en la rizosfera de V. villosa en
los dos primeros muestreos, aunque cuando la planta fructifica el género Bacillus desciende
significativamente. Pseudomonas en conjunto aparece como dominante, manteniendo a lo
largo de todo el experimento frecuencias entre 0.3 y 0.4, y dichas diferencias no son
significativas.
Durante la fructificación se observa un aumento significativo del número de colonias
muestreadas pertenecientes al género Flavobacterium. Las misma tendencia aparece en el
grupo de las Enterobacteriaceas. Sin embargo, el grupo de las Coryneformes aumenta
significativamente durante la floración, llegando a alcanzar una frecuencia de 0.25, mientras
que en el estado vegetativo y en la fructificación las frecuencias (0.083 y 0.123,
respectivamente) son significativamente menores.
El grupo de bacterias menos numerosas, que en la Figura 4.3 se representa como
“Otros”, aumenta durante la fructificación. En la Figura 4.4 aparecen desglosadas las
frecuencia de estos géneros.
95
0,05
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
a
b
b
b
0,045
a
0,04
a
Frecuencia
0,035
Chromobacterium
Moraxella
Acinetobacter
Erwinia
Xanthomonas
Streptomyces
a
0,03
0,025
0,02
a
a
0,015
0,01
0,005
0
a a a a
a a a
Vegetativo
Floración
a
a
Fructificación
Figura 4.4. Frecuencia de los géneros bacterianos menos abundantes en la rizosfera de V. villosa en cada
momento de muestreo. Sobre cada columna y en su color correspondiente aparece una letra que indica la
significación de las diferencias (p<0.05) entre muestreos para cada género. Letras iguales indican la ausencia de
diferencias significativas.
En las Figuras 4.3 y 4.4, se aprecia que durante fructificación se produce un aumento
de la diversidad bacteriana. Todos los géneros minoritarios, a excepción de Streptomyces
experimentan un incremento en esta época de muestreo, dicho incremento fue significativo
para los géneros Moraxella y Erwinia.
4.3. Actividades del ciclo del nitrógeno llevadas a cabo por las rizobacterias de V. villosa
Siguiendo la metodología descrita en el Apartado 2.5.3 de Materiales y Métodos se
determinó la actividad o actividades del ciclo del nitrógeno que las cepas aisladas eran
capaces de realizar. La Figura 4.5 muestra los resultados de dichos análisis. Todos ellos son el
resultado de la media aritmética de tres réplicas (zonas de muestreo).
96
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
70
b
a
60
a
b
40
Vegetativo
Floración
Fructificación
30
a a
a
10
b
Am.+Fij.Aer.+Desn.
Am.+Desn.
Am.+Fij.Aer.
0
Amonificación
b b
a a a
a
a
a
a
a a
Am.+Fij.Aer.+Fij.Anaer.
a a
Am.+Fij.Anaer.+Desn.
20
Am.+Fij.Aer.+
Fij.Anaer.+Desn.
Porcentaje
50
Figura 4.5. Porcentaje de bacterias en cada momento de muestreo que pertenece a cada grupo funcional del
ciclo del nitrógeno. Sobre cada columna aparece una letra que indica la significación de las diferencias (p<0.05)
entre momentos de muestreo. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
Las cepas capaces de amonificar y fijar nitrógeno en condiciones aerobias constituyen
el grupo mejor representado en las tres épocas de muestreo. Dicho grupo presenta una
abundancia significativamente mayor durante la floración. Las diferencias entre el estado
vegetativo y la fructificación no fueron significativas.
Aunque todas las cepas fueron capaces de amonificar, es en fructificación cuando se
detecta una densidad significativamente mayor de bacterias capaces de desarrollar únicamente
esta actividad.
La máxima diversificación en cuanto a actividades del ciclo del nitrógeno se encontró
en floración; en esta época de muestreo, aparecen cepas de 6 de los 7 grupos identificados.
Las bacterias capaces de fijar nitrógeno en condiciones aerobias aparecieron en todos
los muestreos en porcentajes bastante altos, sobre todo en floración. Este aumento se detecta
no sólo en aquellas que amonifican y fijan nitrógeno, sino también en aquellas capaces de
realizar otra actividad como desnitrificar o fijar nitrógeno en anaerobiosis.
El porcentaje de bacterias capaces de fijar nitrógeno en condiciones anaerobias es
mucho menor que en aerobias, para todos los muestreos. Este tipo de bacterias alcanza sus
97
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
máximos en la floración, como en el caso de las fijadoras aerobias. Cabe destacar que durante
la fructificación no se encontró ninguna bacteria capaz de llevar a cabo esta actividad.
Las bacterias desnitrificantes aparecen en mayor porcentaje en el primer muestreo.
Durante la floración todas las bacterias capaces de desnitrificar son capaces también de fijar
nitrógeno en condiciones aerobias, anaerobias o en ambas. Durante la fructificación, las
bacterias capaces de desnitrificar descienden con respecto a los dos muestreos anteriores. Este
descenso resulta significativo, tanto en las bacterias capaces de amonificar y desnitrificar
como en las capaces de amonificar, fijar nitrógeno en condiciones aerobias y desnitrificar.
4.4. Análisis de la divergencia genética de los géneros mayoritarios
El ADN de las bacterias pertenecientes al género mayoritario de cada zona, en cada
momento de muestreo se aisló y amplificó según la técnica de RAPDs. El aislamiento y la
amplificación del ADN se describe en los Apartados 2.5.5.a y b de Materiales y Métodos. A
continuación se muestran los resultados de las amplificaciones con los distintos “primers”.
En todas las Figuras que aparecen a continuación (4.6 a 4.23), se especifica la cepa
correspondiente al pie de cada calle (en los patrones de bandas), así como en cada rama de los
dendrogramas. La nomenclatura empleada para denominar las cepas es como sigue: RP,
recogida en la Urb. Raya del Palancar; MPa, recogida en la Urb. Montepríncipe zona A y
MPb, recogida en la Urb. Montepríncipe zona B. A continuación aparece un número
indicativo del muestreo en que se recogió: 1, vegetativo; 2, floración y 3, fructificación,
seguido de un guión y el número de la cepa correspondiente.
98
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.6. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 10. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
99
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.7. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el “primer” 10 mediante el
algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
100
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.8. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 12. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
101
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.9. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el “primer” 12 mediante el
algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
102
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.10. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 15. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
103
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.11. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el “primer” 15 mediante el
algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
104
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.12. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Bacillus mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 20. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
105
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.13. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Bacillus con el “primer” 20 mediante el
algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
106
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.14. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 4. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
107
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.15. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el “primer” 4 mediante
el algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
108
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.16. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 11. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
109
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.17. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el “primer” 11
mediante el algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
110
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.18. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 17. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
111
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.19. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el “primer” 17
mediante el algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
112
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.20. Patrones de bandas obtenidos para las cepas pertenecientes al género Pseudomonas mediante
electroforesis de ADN amplificado con el “primer” 18. Al pie de cada calle aparece la identificación de las cepas
ensayadas. M: marcador de peso molecular (ADN del fago Lambda digerido con Hind III). El tamaño de cada
fragmento del marcador es de 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125 pb (estas dos últimas bandas son
prácticamente indetectables).
113
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.21. Divergencia genética obtenida entre las cepas del género Pseudomonas con el “primer” 18
mediante el algoritmo de Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA.
114
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
4.4.1. Establecimiento de grupos y selección de bacterias
Una vez obtenidos los dendrogramas para cada “primer” se elaboraron dos
dendrogramas que integran la información de los cuatro “primers” utilizados para cada
género, tal y como se describe en el Apartado 2.5.5.d. Las Figuras 4.22 y 4.23 muestran los
dendrogramas obtenidos mediante el programa ADA, que nos permitió establecer grupos a
nivel del 90 % de similitud. En cada grupo se eligió una bacteria al azar que se utilizará
posteriormente para los ensayos de germinación y crecimiento. La bacteria seleccionada en
cada grupo aparece subrayada.
115
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.22. Divergencia genética de las cepas del género Bacillus obtenida mediante el algoritmo de Clark y
Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA, que integra la información de los 4 “primers”. En la Figura
se numeran los grupos de cepas obtenidos con una divergencia menor o igual al 10 %.
116
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Figura 4.23. Divergencia genética de las cepas del género Pseudomonas obtenida mediante el algoritmo de
Clark y Lanigan (1993) y el método de ordenación UPGMA, que integra la información de los 4 “primers”. En
la Figura se numeran los grupos de cepas obtenidos con una divergencia menor o igual al 10 %.
117
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Como se puede observar en la Figura 4.22, se establecieron 15 grupos con un nivel de
similitud del 90 % de un total de 33 cepas de Bacillus muestreadas. La divergencia genética
entre estas cepas no es superior al 35 %. A nivel de un 70 % de similitud se establecen tres
grupos: el primero constituido por las bacterias pertenecientes a los grupos 1, 2 y 3; el
segundo que comprende los grupos del 4 al 12 y el tercero constituido por los grupos restantes
(13, 14 y 15). Cabe destacar el hecho de que hay pocas cepas cuya similitud sea del 100 %.
En la Figura 4.23 aparecen los 23 grupos establecidos con las 52 cepas del género
Pseudomonas muestreadas a lo largo del estudio. Las bacterias que presentan un 100 % de
similitud pertenecen al mismo momento de muestreo y a la misma zona. A nivel del 60 % de
similitud se establecen 3 grupos: el primero comprendido por los grupos del 1 al 18; el
segundo por el 19 y el 20 y el tercero por los restantes (del 21 al 23).
4.5. Efecto de las rizobacterias mayoritarias sobre la germinación de V. villosa
En la Tabla 4.II se exponen los resultados de germinación obtenidos según 2.6.3 en
presencia del medio de cultivo bacteriano, preparado según se describe en el Apartado 2.6.2.
Se ensayaron las 15 cepas de Bacillus y 16 de Pseudomonas, que se corresponden con los
grupos establecidos en el Apartado anterior. Asimismo, se efectuó un control siguiendo la
metodología descrita en el Apartado 2.6.3.
118
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.II. Resultados de la germinación diaria de semillas de Namoi en presencia de los medios de crecimiento
bacteriano. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas
(Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y
4.23.
Bacteria
1er
2º día
día
3er
4º día 5º día
Bacteria
día
1er
2º día
día
3er
4º día 5º día
día
Bc 1
0.3
4.3
5.7
5.3
1
Ps 2
1
11
5.7
0.7
0.3
Bc 2
0.3
4
6
4.7
2.7
Ps 3
1.7
8.7
3.7
1.3
1
Bc 3
0.3
3.3
4.7
1.7
2
Ps 4
1.3
12.3
3
2.3
0
Bc 4
0
4.3
7.7
2.3
3.3
Ps 6
0.7
6.7
3.3
4.3
0.3
Bc 5
1
5.7
6
4
1
Ps 7
2.7
11.7
2.3
1.7
0.7
Bc 6
0
6
6
3
2.7
Ps 8
2.3
11.7
2.3
2
0
Bc 7
0.7
5.3
7.3
3.7
0.7
Ps 9
2.7
8.7
3.7
1.3
1.3
Bc 8
0
0.7
8.3
6
2.3
Ps 10
2.3
9.7
4
3.7
0
Bc 9
0
4.3
6.3
4.7
2.3
Ps 11
2.3
11.3
4.3
0.7
0.7
Bc 10
0
8
6
1.7
1.3
Ps 12
2
12
2.3
2
0.3
Bc 11
0
2.7
5
7.3
1.7
Ps15
4.7
8.7
3
1
0.3
Bc 12
0
0
10
4.3
2
Ps 16
0.7
9.7
5
2.3
0
Bc 13
0
4
4.7
3
3.3
Ps 17
2.7
9
4.7
0.3
0
Bc 14
0
6
8
1.7
3.7
Ps 18
2
11
1.3
4.7
0.3
Bc 15
0
5.3
6.7
3.7
2.3
Ps19
3
13
2
0.7
0
Control
0.3
3
5.3
4
4.3
Ps 23
2.3
8.3
3.7
2
0.3
119
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.III. Resultados de la germinación diaria de semillas de Látigo en presencia de los medios de
crecimiento bacteriano. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o
Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1,
Figura 4.22 y 4.23.
Bacteria
1er
2º día
día
3er
4º día 5º día
Bacteria
día
1er
2º día
día
3er
4º día 5º día
día
Bc 1
0
8.7
8.7
1
1
Ps 2
7.7
8
2.7
1.3
0
Bc 2
0
15.3
3.7
0.7
0.3
Ps 3
8.3
9.7
1
0
0
Bc 3
0.3
13.3
5.7
0.3
0.3
Ps 4
7.3
11
1
0.3
0
Bc 4
0.7
12.7
6
0.7
0
Ps 6
10.7
6.6
6
0.3
0
Bc 5
1.3
16
1
0
1
Ps 7
9
9
1.3
0
0
Bc 6
0
6
6
3
2.7
Ps 8
14.3
4.7
0.3
0
0
Bc 7
1
1.3
11.7
4.7
0.3
Ps 9
10
8.3
1.3
0
0.3
Bc 8
0
13.7
5.3
0.7
0.3
Ps 10
11
7
0.7
0
0
Bc 9
0
15.7
3
0.3
0.3
Ps 11
5.3
12.7
0.7
0.7
0
Bc 10
1
15
3.7
0
0.3
Ps 12
8.7
11
0.3
0
0
Bc 11
0.3
13.3
4.3
0.7
1
Ps15
8.7
10.3
0.7
0
0
Bc 12
0
12.7
5.3
1.3
0
Ps 16
8
10
1
0.3
0.7
Bc 13
0
10
6.3
1.3
2.3
Ps 17
7.3
11
0.7
0.7
0
Bc 14
2
15
2.3
0
0.3
Ps 18
7.3
10
1.3
1.3
0
Bc 15
2
13.3
1.3
0.3
0
Ps19
6.7
11.7
0.7
0.7
0.3
Control
0
15.3
3.3
1
0
Ps 23
10.3
7.3
1.7
0
0
Con los datos expuestos en las Tablas 4.II y 4.III, se llevaron a cabo dos ACPs, uno
con los resultados de germinación obtenidos para la variedad Namoi y otro para la variedad
Látigo. Cada matriz está formada por las cepas bacterianas ensayadas más el control y el
número de semillas germinadas en cada uno de los 5 días que duró el ensayo. La matriz así
definida (5x32) permite representar las muestras en un espacio definido por dos ejes
principales, que absorben un porcentaje de varianza del 71.05 % y 23.02 %, respectivamente
para el ACP de Namoi y del 71.97 % y 23.48 % para el de Látigo. Por tanto, la ordenación se
refiere en ambos casos a estos dos ejes principales que absorben un 94.07 % de la varianza
total en el caso de Namoi y un 95.45 % en el de Látigo.
120
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
4
Bc 12
Bc 8
3
Bc 4 Bc 14
Bc 7
Bc 9
Bc 15
Bc 11
Bc 2 Bc 1
Bc 6
C
Bc 5
Bc 13
Bc 3
Ps 6
Eje II
2
1
Bc 10
Ps 16
Ps 2
Ps 3 Ps 10
Ps 23
Ps 17 Ps 11
Ps 9
Ps 4
Ps 12
Ps 18 Ps 8
0
-1
Ps 7
Ps 15
Ps 19
-2
-1
0
1
2
Eje I
3
4
5
6
Figura 4.24. Representación del ACP de los resultados de germinación de semillas de Namoi. El nombre de
cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps) seguido del número del
grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
En la Figura 4.24 se representa la ordenación de las cepas bacterianas ensayadas,
según el ACP efectuado con los datos de germinación de las semillas de la variedad Namoi.
Como se puede apreciar en la Figura 4.24, existe una clara segregación de dos grupos:
el formado por las cepas pertenecientes al género Bacillus y el control, que se sitúan en los
valores más bajos del eje I y positivos del eje II; y un segundo grupo integrado por las
bacterias del género Pseudomonas, situados en los valores más altos del eje I y más bajos del
eje II.
121
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
6
Ps 8
4
Ps 10
Ps 6
Eje II
2
Ps 9Ps 15 Ps 12
Ps 7
Ps 3
Ps 16
Ps 17
Ps 2
Ps 4
Ps 18
Ps 19
Ps 11
Ps 23
0
Bc 14
-2
Bc 15
Bc 5
Bc 11
Bc 10
Bc
3
Bc 6
Bc 13 Bc 4
Bc 9
C
Bc 1
Bc 12 Bc 8
Bc 2
Bc 7
-4
-2
0
2
4
6
8
Eje I
Figura 4.25. Representación del ACP de los resultados de germinación de semillas de Látigo. El nombre de
cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps) seguido del número del
grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
En la Figura 4.25 se representa la ordenación de las cepas bacterianas ensayadas,
según el ACP efectuado con los datos de germinación de las semillas de la variedad Látigo.
De nuevo, apreciamos dos grupos: uno constituido por las cepas del género Bacillus y
el control, que se ordenan hacia los valores negativos del eje II y un segundo grupo
constituido por las cepas del género Pseudomonas, agrupadas hacia los valores positivos de
ambos ejes.
4.6. Efectos de las rizobacterias mayoritarias sobre el crecimiento de V. villosa.
Los resultados de las medidas biométricas y químicas se exponen en las Tablas 4.IV,
4.V, 4.VI, 4.VII, 4.VIII y 4.IX. Todos ellos son el resultado de la media aritmética de tres
réplicas.
122
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.IV. Resultados de las medidas biométricas efectuadas sobre las raíces de V. villosa variedad Namoi
creciendo en presencia del medio de cultivo de las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria
indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que
pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra
que indica la significación de las diferencias (p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indican la
ausencia de diferencias significativas; (b) significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Bacteria
Peso
Bc 1
(g)
0.0081 a
(cm2)
1.74 a
(cm)
16.31 a
Ps 2
(g)
0.0124 b
(cm2)
2.10 a
(cm)
23.84 b
Bc 2
0.0080 a
1.53 a
18.69 a
Ps 3
0.0068 a
2.40 a
24.43 b
Bc 3
0.0074 a
1.18 a
16.99 a
Ps 4
0.0056 a
1.68 a
29.56 b
Bc 4
0.0080 a
1.55 a
22.18 a
Ps 6
0.0087 a
2.62 b
23.12 a
Bc 5
0.0092 b
1.94 a
27.28 b
Ps 7
0.0071 a
1.63 a
36.30 b
Bc 6
0.0108 b
2.05 a
24.62 b
Ps 8
0.0087 a
4.04 b
28.01 b
Bc 7
0.0176 b
1.63 a
32.63 b
Ps 9
0.0054 a
2.16 a
21.25 a
Bc 8
0.0080 a
1.89 a
22.35 a
Ps 10
0.0068 a
1.79 a
17.47 a
Bc 9
0.0079 a
1.69 a
21.14 a
Ps 11
0.0096 a
2.75 b
22.52 a
Bc 10
0.0143 b
2.39 a
21.67 a
Ps 12
0.0077 a
2.62 b
27.64 b
Bc 11
0.0090 a
1.73 a
18.86 a
Ps15
0.0037 a
2.37 a
24.25 b
Bc 12
0.0079 a
1.81 a
30.01 b
Ps 16
0.0069 a
2.83 b
25.26 b
Bc 13
0.0075 a
1.74 a
20.84 a
Ps 17
0.010 a
2.92 b
23.50 b
Bc 14
0.0093 a
2.18 a
25.06 b
Ps 18
0.0063 a
1.93 a
24.59 b
Bc 15
0.0074 a
1.72 a
20.52 a
Ps19
0.0083 a
2.79 b
22.92 a
Control
0.0067 a
1.40 a
15.80 a
Ps 23
0.0073 a
2.41 b
23.02 a
Superficie Longitud
Superficie Longitud
Las medidas de crecimiento radical indican que sólo cuatro cepas pertenecientes al
género Bacillus (Bc 5, Bc 6, Bc 7 y Bc 10) y una del género Pseudomonas (Ps 2), alteran de
forma significativa el peso de las raíces. Dicho parámetro experimenta en estos tratamientos
incrementos significativos con respecto al control situados en torno al 100 %. El incremento
de la superficie fue también muy acusado, aunque las diferencias no fueron significativas con
respecto al control. Excepto en Bc 10, la longitud radical también aumenta
significativamente. El resto de las cepas pertenecientes al género Pseudomonas no
demuestran ningún efecto activador sobre el peso, incluso algunas plantas presentan un valor
123
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
menor que el control, hecho que no se producía en los tratamientos con cepas del género
Bacillus en ningún caso. Sin embargo, es destacable el incremento de la superficie y de la
longitud radical, aun como ya se ha indicado antes, sin mostrar efectos sobre el peso. Este
aspecto es más evidente en las cepas Ps 8, Ps 12, Ps 16 y Ps 17 y un efecto predominante
sobre la longitud radical de Ps 4, Ps 7 y Ps 15.
Con los datos expuestos en la Tabla 4.IV, se realizó un ACP. La matriz constituida
por las cepas bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar
las muestras en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de
varianza del 99.25 % y 0.75 %, respectivamente. Por tanto, la ordenación de las muestras se
refiere a los dos primeros ejes que absorben el 100 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.V.
Tabla 4.V. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Radical
25.907
-0.198
Superficie Radical
0.032
0.188
Longitud Radical
1.111
4.611
124
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
10
Ps 7
Ps 4
Ps 15
Bc 12
5
Eje II
Ps 18
Ps 9 Ps 16
Ps 3
Ps 12
Ps 8 Ps 11
Ps 23 Bc 4
Bc 5
Bc 8 Bc 14
Bc 13
Ps 19
Bc 15 Bc 9
0
Ps 6
Ps 10
Bc
2 Ps 17
C Bc 3
Bc 6
Bc 1 Bc 11
Ps 2
-5
Bc 7
Bc 10
-10
0
20
40
60
80
100
Eje I
Figura 4.26. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos radicales de V. villosa variedad
Namoi, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus
(Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado
4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP distribuye las muestras en función de los dos factores de carga con más peso
sobre el eje I (peso y longitud radical), detectándose claramente tres grupos. En el primer
grupo constituido por Ps 4, Ps 7 y Ps 15, el efecto predominante es un incremento de la
longitud radical; en el segundo, formado por Ps 2, Bc 7 y Bc 10, un aumento del peso. El
ACP no discrimina las cepas y el control en el tercer grupo; sin embargo, se puede observar
un efecto predominante de las cepas del género Pseudomonas sobre la longitud, mientras
Bacillus influye fundamentalmente sobre el peso radical.
125
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.VI. Resultados de las medidas biométricas efectuadas sobre la parte aérea de V. villosa variedad Namoi
creciendo en presencia del medio de cultivo de las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria
indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que
pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra
que indica la significación de las diferencias (p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indican la
ausencia de diferencias significativas; (b) significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Bacteria
Peso
Bc 1
(g)
0.0413 a
(cm2)
12.32 a
(cm)
38.77 a
Ps 2
(g)
0.0339 a
(cm2)
14.19 a
(cm)
32.54 a
Bc 2
0.0374 a
14.36 a
37.24 a
Ps 3
0.0328 a
15.96 a
38.49 a
Bc 3
0.0352 a
11.57 a
37.90 a
Ps 4
0.0329 a
15.68 a
36.96 a
Bc 4
0.0401 a
17.88 b
39.74 a
Ps 6
0.0364 a
17.50 b
35.03 a
Bc 5
0.0408 a
11.39 a
36.96 a
Ps 7
0.0398 a
15.31 a
33.69 a
Bc 6
0.0385 a
12.16 a
36.63 a
Ps 8
0.0368 a
15.22 a
36.09 a
Bc 7
0.0496 b
14.88 a
38.94 a
Ps 9
0.0389 a
17.40 b
37.93 a
Bc 8
0.0412 a
14.01 a
38.99 a
Ps 10
0.0303 a
14.68 a
37.82 a
Bc 9
0.0342 a
14.36 a
38.22 a
Ps 11
0.0364 a
14.27 a
35.61 a
Bc 10
0.0456 a
19.46 b
41.07 a
Ps 12
0.0355 a
17.26 b
38.85 a
Bc 11
0.0389 a
16.65 b
38.19 a
Ps15
0.0251 a
14.57 a
35.11 a
Bc 12
0.0378 a
15.13 a
38.49 a
Ps 16
0.0324 a
14.47 a
35.94 a
Bc 13
0.0387 a
17.74 b
40.98 a
Ps 17
0.0420 a
18.03 b
36.98 a
Bc 14
0.0335 a
12.19 a
36.93 a
Ps 18
0.0308 a
13.99 a
37.05 a
Bc 15
0.0340 a
17.27 b
40.97 a
Ps19
0.0325 a
14.02 a
34.69 a
Control
0.0330 a
12.23 a
36.42 a
Ps 23
0.0392 a
16.51 b
39.72 a
Superficie Longitud
Superficie Longitud
El efecto de las bacterias sobre la parte aérea de V. villosa variedad Namoi se centró
principalmente en la superficie. La superficie aumenta con Bc 4, Bc 10, Bc 11, Bc 13, Bc 15,
Ps 6, Ps 9, Ps 12, Ps 17 y Ps 23. Sin embargo, no existen diferencias significativas entre
tratamientos y control para la longitud y el peso salvo para las plantas tratadas con el medio
de cultivo de Bc 7, en las que se detecta un aumento significativo del peso. En las plantas
tratadas con Bc 10 se obtienen los valores más altos de los tres parámetros salvo en el peso,
que sólo es superado por el tratamiento con Bc 7. También se detectan aumentos apreciables,
aunque no significativos según el ANOVA, en los tratamientos con las cepas Bc 1, Bc 5, Bc 6
126
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
y Bc 8. Ps 2 y Ps 15, aunque no de forma significativa, disminuyen el peso y la longitud de la
parte aérea, obteniéndose para este tratamiento los valores más bajos.
Con los datos de la Tabla 4.VI se realizó un ACP. La matriz definida por las cepas
bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar las muestras
en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de varianza del
97.15 % y 2.85 %, respectivamente. Por tanto, la ordenación de las muestras se refiere a los
dos primeros ejes que absorben el 99.9 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.VII.
Tabla 4.VII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Aéreo
4.796
-0.495
Superficie Aérea
0.608
1.734
Longitud Aérea
1.000
1.318
127
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
10
Bc 7
5
Eje II
Ps 7
Ps 17
Bc 5
Bc 10
Bc 8
Ps 11
Bc 11
Bc 2 Bc 6
Bc 4 Ps 23
Ps 19 Ps 12 Bc 13
Bc 12
Bc 3
C
Ps 4
Ps 16
Bc 14
Ps 3
Bc 9
Ps 18
Bc
15
Ps 10
Ps 6
0
Ps 9
Ps 2 Ps 8
Bc 1
Ps 15
-5
8
10
12
Eje I
14
16
18
Figura 4.27. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos de la parte aérea de V. villosa
variedad Namoi, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del
género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps) seguido del número del grupo al que pertenecen según los
establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP demuestra un efecto predominante de las cepas de Bacillus sobre el peso,
mostrándose dicho efecto con mayor evidencia en las cepas Bc 1, Bc 5, Bc 6, Bc 7, Bc 8 y Bc
10, en las que además se observa un desplazamiento hacia los valores positivos del eje II
debido al incremento de la longitud y la superficie, fundamentalmente en la cepa Bc 7. Las
cepas del género Pseudomonas se separan de las del género Bacillus en función del peso, ya
que aunque se detectan aumentos en los valores de la superficie y de la longitud, dichas
variables presentan escasa incidencia en la ordenación de las muestras tanto sobre el eje I
como sobre el eje II.
128
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.VIII. Resultados del peso total de la planta y de las medidas de N total expresadas como mg de N/g de
planta y como mg de N por planta de V. villosa variedad Namoi creciendo en presencia del medio de cultivo de
las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus
(Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado
4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra que indica la significación de las diferencias
(p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indican la ausencia de diferencias significativas; (b)
significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Total (g)
N Total
N Total
(mg/g de planta)
(mg/planta)
Bacteria
Peso
Total (g)
N Total
N Total
(mg/g de planta)
(mg/planta)
Bc 1
0.0491 a
67.27 b
3.10 b
Ps 2
0.0431 a
52.41 a
2.18 a
Bc 2
0.0485 a
52.52 a
1.49 c
Ps 3
0.0396 a
66.41 b
2.62 a
Bc 3
0.0430 a
44.66 a
1.89 a
Ps 4
0.0439 a
56.31 a
2.50 a
Bc 4
0.0476 a
46.83 a
2.30 a
Ps 6
0.0461 a
65.75 b
3.03 b
Bc 5
0.0500 a
43.89 a
1.85 a
Ps 7
0.0491 a
54.37 a
2.83 b
Bc 6
0.0418 a
59.92 a
3.03 b
Ps 8
0.0368 a
50.37 a
2.05 a
Bc 7
0.0678 b
55.28 a
3.13 b
Ps 9
0.0436 a
66.27 b
3.00 b
Bc 8
0.0491 a
42.18 a
2.03 a
Ps 10
0.0371 a
61.82 a
2.36 a
Bc 9
0.0413 a
44.74 a
1.46 c
Ps 11
0.0467 a
54.45 a
2.44 a
Bc 10
0.0471 a
53.06 a
2.63 a
Ps 12
0.0434 a
50.76 a
2.32 a
Bc 11
0.0483 a
45.88 a
1.84 a
Ps15
0.0320 a
68.56 b
2.15 a
Bc 12
0.0469 a
53.65 a
2.49 a
Ps 16
0.0393 a
65.36 b
2.47 a
Bc 13
0.0452 a
43.05 a
2.50 a
Ps 17
0.0483 a
24.24 c
1.80 a
Bc 14
0.0428 a
25.18 c
1.00 c
Ps 18
0.0365 a
61.08 a
2.14 a
Bc 15
0.0414 a
55.32 a
2.33 a
Ps19
0.0431 a
56.47 a
2.32 a
Control
0.0406 a
52.76 a
2.09 a
Ps 23
0.0589 b
69.76 b
2.70 b
Los resultados de nitrógeno total por planta, así como de la concentración de
nitrógeno por gramo de planta y el peso de las mismas aparecen en la Tabla 4.VIII. Como se
puede apreciar, bajo el efecto de las cepas de Bacillus sólo se detecta una disminución de la
concentración de nitrógeno/g de planta bajo el efecto de la cepa Bc 14 y un aumento de dicha
concentración bajo la cepa Bc 1. Dichas variaciones van acompañadas de una disminución y
un aumento, respectivamente, de la cantidad de nitrógeno por planta. Con respecto a la cepa
Bc 7 cabe destacar un aumento de los tres parámetros, aunque estadísticamente no resultó
129
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
significativo el incremento de nitrógeno/g de planta. Con las cepas del género Pseudomonas
se produce un aumento muy significativo en la concentración de nitrógeno/g de planta en los
tratamientos con las cepas Ps 9 y Ps 23, aumentando también significativamente el peso en Ps
23. Con respecto a Ps 17, resulta de interés ver cómo en Bc 14, la significativa disminución
de la concentración de nitrógeno/g de planta, junto con un aumento del peso y del
nitrógeno/planta. En las cepas Ps 3, Ps 6 y Ps 9 se detecta un significativo aumento en la
concentración de nitrógeno junto con un aumento del peso total de la planta, aunque dichas
diferencias no fueron significativas.
Con los datos de la Tabla 4.VIII se realizó un ACP. La matriz definida por las cepas
bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar las muestras
en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de varianza del
95.00 % y 5.00 %, respectivamente. Por tanto la ordenación de las muestras se refiere a los
dos primeros ejes que absorben el 100 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.IX.
Tabla 4.IX. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Total
-1.318
6.438
N Total (mg/g planta)
10.985
0.766
N Total (mg/planta)
0.331
0.225
130
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
20
Ps 17
Bc 14
Bc 7
10
Eje II
Bc 8
Bc 5
Bc 11
Bc 13
Bc 4 Bc 2
Bc 3
Bc 10
Bc 9
Ps 7
Ps 12 Bc 12 Ps 11
Ps 2
Ps 4
C
Ps 8 Bc 15
Ps 19 Ps 6
Bc 1
Ps 18 Bc 6
Ps 9
Ps 16
Ps 10
Ps 3
0
-10
Ps 23
Ps 15
-20
15
20
25
30
35
40
Eje I
Figura 4.28. Representación del ACP efectuado con los resultados del peso total de la planta y las medidas de N
total de V. villosa variedad Namoi, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de
una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según
los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP demuestra un efecto claramente diferenciado del nitrógeno/g de planta sobre
la distribución de las muestras. El aumento del peso total de las plantas va acompañado de
una disminución de la concentración de nitrógeno en los tejidos y de un aumento del
nitrógeno total por planta. Este efecto es especialmente acusado en las cepas Ps 17 y Bc 14.
Sin embargo, es necesario destacar la separación de las cepas Bc 7, Ps 15 y Ps 23. En Bc 7 y
Ps 23 se produce un aumento del peso y de la concentración de nitrógeno/g de planta. Sin
embargo, en la cepa Ps 15 la separación se debe a un efecto claramente distinto. El
tratamiento con esta cepa aumenta tanto la concentración de nitrógeno/g de planta como la
concentración de nitrógeno/planta a pesar de disminuir el peso seco total.
Los resultados obtenidos en estas pruebas biológicas resaltan el efecto generalizado de
la cepa Bc 7 y Bc 10 sobre el desarrollo de V. villosa variedad Namoi, tanto a nivel de la parte
aérea como radical, y los efectos selectivos de las cepas pertenecientes al género
Pseudomonas sobre el crecimiento de las plantas, especialmente a nivel radical.
131
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.X. Resultados de las medidas biométricas efectuadas sobre las raíces de V. villosa variedad Látigo
creciendo en presencia del medio de cultivo de las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria
indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que
pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra
que indica la significación de las diferencias (p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indica que no
existen diferencias significativas; (b) significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Bacteria
Peso
Bc 1
(g)
0.0042 a
(cm2)
0.87 a
(cm)
14.23 a
Ps 2
(g)
0.0040 c
(cm2)
1.50 a
(cm)
27.08 b
Bc 2
0.0052 a
1.06 a
15.25 a
Ps 3
0.0057 a
1.64 a
21.86 a
Bc 3
0.0058 a
1.20 a
17.71 a
Ps 4
0.0037 c
1.38 a
25.70 b
Bc 4
0.0068 a
1.39 a
18.28 a
Ps 6
0.0060 a
2.21 b
38.59 b
Bc 5
0.0053 a
1.26 a
13.55 a
Ps 7
0.0049 a
2.43 b
26.62 b
Bc 6
0.0048 a
1.18 a
16.35 a
Ps 8
0.0055 a
1.52 a
29.29 b
Bc 7
0.0051 a
1.30 a
14.47 a
Ps 9
0.0059 a
2.90 b
25.38 b
Bc 8
0.0059 a
1.63 a
16.71 a
Ps 10
0.0060 a
2.52 b
24.01 b
Bc 9
0.0057 a
1.11 a
14.85 a
Ps 11
0.0049 a
1.66 a
16.46 a
Bc 10
0.0075 a
2.18 b
32.71 b
Ps 12
0.0050 a
1.27 a
25.81 b
Bc 11
0.0056 a
2.25 b
14.55 a
Ps15
0.0056 a
2.23 b
21.40 a
Bc 12
0.0070 a
1.43 a
22.61 b
Ps 16
0.0042 a
1.48 a
23.31 b
Bc 13
0.0047 a
1.05 a
12.97 a
Ps 17
0.0043 a
1.39 a
22.47 b
Bc 14
0.0062 a
1.37 a
17.43 a
Ps 18
0.0046 a
1.60 a
15.70 a
Bc 15
0.0053 a
1.44 a
20.41 a
Ps19
0.0057 a
1.78 b
27.55 b
Control
0.0058 a
1.07 a
15.87 a
Ps 23
0.0079 b
2.27 b
20.56 a
Superficie Longitud
Superficie Longitud
Las pruebas efectuadas sobre la variedad Látigo, muestran resultados semejantes a los
obtenidos con la variedad Namoi en lo relativo al efecto más acusado de las cepas de
Pseudomonas (fundamentalmente sobre la superficie y la longitud radical) que de Bacillus.
En cuanto al peso radical, el ANOVA no detecta variaciones significativas con respecto al
control bajo el efecto de las cepas del género Bacillus. Los tratamientos con Bc 4, Bc 10 y Bc
12 aumentan significativamente este parámetro. Con respecto a las cepas del género
Pseudomonas, Ps 23 aumenta el peso radical significativamente, y Ps 2 y Ps 4 lo disminuyen.
Cabe destacar el hecho de que Ps 2 ejerza un efecto contrario en las dos variedades. En
132
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
cuanto a la superficie radical, observamos que dos cepas de Bacillus, Bc 10 y Bc 11 y 6 de
Pseudomonas, Ps 6, Ps 7, Ps 9, Ps 10, Ps 15, y Ps 23, provocan un incremento positivo con
respecto al control. Este incremento de la superficie radical va acompañado de un aumento
significativo de la longitud en todos los casos salvo en las cepas Bc 11, Ps 15 y Ps 23, casos
en los que también se detecta un aumento, no significativo de la longitud radical. Es
interesante señalar que las cepas Ps 4, Ps 8 y Ps 12 inducen un aumento de la longitud radical,
sin que dicho aumento se corresponda con un efecto activador de la superficie.
Con los datos de la Tabla 4.X se realizó un ACP. La matriz definida por las cepas
bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar las muestras
en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de varianza del
98.26 % y 1.74 % respectivamente. Por tanto la ordenación de las muestras se refiere a los
dos primeros ejes que absorben el 100 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.XI.
Tabla 4.XI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Radical
9.577
-1.026
Superficie Radical
0.217
0.211
Longitud Radical
1.647
5.941
133
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
10
5
Bc 13
Eje II
Bc 11
Bc 5
Ps 18
Bc 1
0
Bc 7 C
Bc 2
Ps 11 Bc 3
Bc 6
Ps 15
Bc 15
Ps 17
Ps 16
-5
Ps 4
Ps 23
Bc 9
Bc 8
Bc 4
Bc 14
Bc 12
Ps 10
Ps 9
Ps 3
Bc 10
Ps 7
Ps 12
Ps 8
Ps 19
Ps 2
Ps 6
-10
15
20
25
30
35
40
Eje I
Figura 4.29. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos de las raíces de V. villosa
variedad Látigo, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género
Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el
Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP permite separar tres grandes grupos en función de su efecto sobre el peso
radical. Las muestras se distribuyen a lo largo del eje I, de forma que aquellas bacterias con
un efecto positivo sobre el peso radical, se desplazan hacia los valores más altos de este eje
(Bc 4, Bc 10, Bc 12 y Ps 23), mientras que las que presentan valores más bajos de dicho
parámetro, todas pertenecientes al género Pseudomonas, se distribuyen hacia los valores más
bajos del eje I. Las medidas de longitud y peso radical no tienen una influencia decisiva sobre
la distribución de las muestras. Cabe destacar que las cepas Bc 10 y Ps 23 presentan también
valores altos tanto de la superficie como de la longitud radical.
134
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.XII. Resultados de las medidas biométricas efectuadas sobre la parte aérea de V. villosa variedad Látigo
creciendo en presencia del medio de cultivo de las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria
indica si se trata de una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que
pertenecen según los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra
que indica la significación de las diferencias (p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indican la
ausencia de diferencias significativas; (b) significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Bacteria
Peso
Bc 1
(g)
0.0190 a
(cm2)
8.93 a
(cm)
30.15 b
Ps 2
(g)
0.0187 a
(cm2)
11.17 a
(cm)
27.64 a
Bc 2
0.0259 a
9.19 a
29.53 b
Ps 3
0.0267 a
11.83 b
29.31 b
Bc 3
0.0307 b
10.53 a
30.59 b
Ps 4
0.0197 a
11.39 b
30.62 b
Bc 4
0.0264 a
10.82 a
29.33 b
Ps 6
0.0231 a
12.95 b
30.90 b
Bc 5
0.0273 a
11.17 a
31.35 b
Ps 7
0.0245 a
11.43 b
28.54 a
Bc 6
0.0258 a
11.54 b
29.78 b
Ps 8
0.0261 a
12.08 b
31.66 b
Bc 7
0.0248 a
9.10 a
29.11 a
Ps 9
0.0235 a
10.84 a
26.88 a
Bc 8
0.0260 a
9.93 a
27.39 a
Ps 10
0.0267 a
13.16 b
31.54 b
Bc 9
0.0303 b
12.88 b
32.10 b
Ps 11
0.0256 a
10.84 a
30.24 b
Bc 10
0.0252 a
10.81 a
29.98 b
Ps 12
0.0187 a
10.18 a
28.29 a
Bc 11
0.0298 b
11.77 b
32.02 b
Ps15
0.0198 a
10.19 a
27.98 a
Bc 12
0.0272 a
11.21 b
28.82 a
Ps 16
0.0216 a
10.19 a
29.72 b
Bc 13
0.0232 a
9.75 a
28.03 a
Ps 17
0.0202 a
11.98 b
29.66 b
Bc 14
0.0231 a
10.39 a
28.80 a
Ps 18
0.0254 a
12.25 b
30.22 b
Bc 15
0.0276 a
9.94 a
29.57 b
Ps19
0.0199 a
13.03 b
30.61 b
Control
0.0226 a
8.60 a
26.49 a
Ps 23
0.0244 a
11.27 b
29.83 b
Superficie Longitud
Superficie Longitud
El efecto de las bacterias sobre la parte aérea de la variedad Látigo es más
pronunciado que sobre la variedad Namoi. Las cepas de Bacillus tienen un efecto a nivel
aéreo más acusado que a nivel radical. El aumento de peso en la parte aérea fue significativo
bajo el efecto de las cepas Bc 3, Bc 9 y Bc 11. A nivel radical no se detectó efecto en ningún
caso. Las tres cepas mencionadas incrementan significativamente todos los parámetros
estudiados salvo la superficie bajo Bc 3. El parámetro que sufre alteración bajo un mayor
número de cepas es la longitud, que aumenta significativamente con 10 de las 15 cepas
estudiadas, mientras que la superficie sólo aumenta bajo el efecto de 4 cepas de las que tres,
135
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Bc 6, Bc 9 y Bc 11 coinciden en su efecto sobre la longitud. De nuevo, el efecto de
Pseudomonas parece más selectivo, ya que en muchos casos se detectó un incremento de la
superficie y la longitud aérea, coincidiendo con efectos semejantes a nivel radical. El peso a
nivel aéreo no presentó modificaciones significativas en ningún caso, aunque bajo Ps 2, Ps 4,
Ps 12, Ps 15, Ps 17 y Ps 19, el peso disminuye con respecto al control.
Con los datos de la Tabla 4.XII se realizó un ACP. La matriz definida por las cepas
bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar las muestras
en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de varianza del
97.01 % y 2.99 % respectivamente. Por tanto, la ordenación de las muestras se refiere a los
dos primeros ejes que absorben el 100 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.XIII.
Tabla 4.XIII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Aéreo
3.327
-0.348
Superficie Aérea
0.325
0.605
Longitud Aérea
0.743
-0.520
136
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
4
Bc 3
3
2
Bc 8
Bc 12
Ps 3
Bc 15
Bc 11
Bc 4
Bc 2
Bc
5
C
Ps 9
Ps 11
Bc 7
Ps 7
Bc 13
Bc 10
Ps 18
Ps 10
Ps 8
Ps
23
Bc 6
Bc 14
1
Eje II
Bc 9
0
-1
Ps 6 Ps 16
Ps 15
-2
Ps 2
Ps 17
-3
Ps 12
Ps 4
Ps 19
Bc 1
-4
7
8
9
Eje I
10
11
12
Figura 4.30. Representación del ACP efectuado con los resultados biométricos de la parte aérea de V. villosa
variedad Látigo, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género
Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el
Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP sólo discrimina el efecto de las cepas de Bacillus y de Pseudomonas sobre el
peso de la parte aérea. Hacia los valores menores del eje I se sitúan todas las cepas bajo cuyo
efecto se detecta una disminución del peso, en todos los casos dichas cepas pertenecían al
género Pseudomonas. Hacia los valores más altos del mismo eje se sitúan las cepas bajo cuyo
efecto aumenta el peso de la parte aérea, pertenecientes todas ellas al género Bacillus.
137
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 4.XIV. Resultados del peso total de la planta y de las medidas de N total expresadas como mg de N/g de
planta y como mg de N por planta de V. villosa variedad Látigo creciendo en presencia del medio de cultivo de
las cepas bacterianas y el control. El nombre de cada bacteria indica si se trata de una cepa del género Bacillus
(Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según los establecidos en el Apartado
4.4.1, Figura 4.22 y 4.23. Junto a cada dato aparece una letra que indica la significación de las diferencias
(p<0.05) con respecto al control. Letras iguales (a) indican la ausencia de diferencias significativas; (b)
significativamente mayor y (c) significativamente menor.
Bacteria
Peso
Total (g)
N Total
N Total
(mg/g de planta)
(mg/planta)
Bacteria
Peso
Total (g)
N Total
N Total
(mg/g de planta)
(mg/planta)
Bc 1
0.0255 a
42.40 c
1.03 c
Ps 2
0.0243 a
55.18 a
1.29 c
Bc 2
0.0300 a
55.32 c
1.43 c
Ps 3
0.0366 b
35.94 c
1.40 c
Bc 3
0.0371 b
47.75 c
1.63 c
Ps 4
0.0257 a
70.63 a
1.71 a
Bc 4
0.0290 a
63.01 a
2.03 a
Ps 6
0.0292 a
54.06 c
1.42 c
Bc 5
0.0326 b
47.83 c
1.55 c
Ps 7
0.0280 a
71.67 a
2.43 b
Bc 6
0.0288 a
40.80 c
1.23 c
Ps 8
0.0315 a
53.04 c
1.97 a
Bc 7
0.0305 a
38.10 c
1.06 c
Ps 9
0.0279 a
58.59 a
1.83 a
Bc 8
0.0317 a
60.41 a
1.61 c
Ps 10
0.0310 a
72.45 a
2.45 b
Bc 9
0.0363 b
53.39 c
1.56 c
Ps 11
0.0301 a
73.63 a
2.17 a
Bc 10
0.0329 b
52.00 c
1.51 c
Ps 12
0.0237 a
67.37 a
1.99 a
Bc 11
0.0352 b
65.52 a
2.31 a
Ps15
0.0254 a
45.17 c
1.23 c
Bc 12
0.0284 a
56.44 a
1.92 a
Ps 16
0.0271 a
78.30 a
2.35 a
Bc 13
0.0286 a
68.08 a
1.95 a
Ps 17
0.0245 a
75.52 a
1.77 a
Bc 14
0.0293 a
51.44 a
1.52 c
Ps 18
0.0302 a
40.56 c
1.32 c
Bc 15
0.0319 a
59.28 a
1.78 a
Ps19
0.0312 a
66.60 a
1.66 a
Control
0.0266 a
67.80 a
2.02 a
Ps 23
0.0322 a
53.96 c
1.73 a
Los resultados de nitrógeno total por planta, así como la concentración de nitrógeno
por gramo de planta y el peso de la misma aparecen en la Tabla 4.XIV. En este caso, es
importante señalar que cuatro de las quince cepas de Bacillus ensayadas provocan una
disminución en la concentración de nitrógeno total, a pesar de que el peso aumenta
significativamente. Lo mismo podemos indicar de la cepa Ps 3. En general, ninguna de las
138
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
cepas, ni del género Bacillus ni de Pseudomonas, incrementan significativamente el
contenido en nitrógeno total de la planta.
Con los datos de la Tabla 4.XIV se realizó un ACP. La matriz definida por las cepas
bacterianas ensayadas y las tres variables estudiadas (32x3) permite representar las muestras
en un espacio definido por dos ejes principales que absorben un porcentaje de varianza del
97.64 % y 2.36 %, respectivamente. Por tanto, la ordenación de las muestras se refiere a los
dos primeros ejes que absorben el 100 % de la varianza total.
Los factores de carga sobre estos dos ejes se indican en la Tabla 4.XV.
Tabla 4.XV. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Peso Total
-1.276
3.307
N Total
11.683
0.358
N Total
0.312
0.122
139
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
15
10
Eje II
5
Ps 3
Bc 3
Bc 7
Ps 18
Bc 6
Bc 1
Ps 15
0
Bc 9
Bc 5
Bc 10
Ps 8
Ps 23
Bc 14
Bc 2
Ps 6
Bc 12
Ps 2
-5
-10
15
Bc 15
Bc 8
Ps 9 Bc 4 Ps 19
Ps 10
Bc 13
Ps 11
C
Ps 7
Ps 12
20
25
30
Eje I
Bc 11
Ps 4
Ps 16
Ps 17
35
40
Figura 4.31. Representación del ACP efectuado con los resultados del peso total de la planta y las medidas de N
total de V. villosa variedad Látigo, sobre los dos primeros ejes. El nombre de cada bacteria indica si se trata de
una cepa del género Bacillus (Bc) o Pseudomonas (Ps), seguido del número del grupo al que pertenecen según
los establecidos en el Apartado 4.4.1, Figura 4.22 y 4.23.
El ACP provoca una distribución de las muestras en las que se detecta claramente el
efecto de la variable nitrógeno/g de planta sobre el eje I. Los tratamientos se disponen hacia
los valores más bajos de dicho eje y más altos del eje II, según aumenta el peso y disminuye
la concentración de nitrógeno total.
140
5. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA DINÁMICA DEL
CICLO DEL NITRÓGENO BAJO V. villosa
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.1. Resultados obtenidos en las experiencias realizadas en condiciones controladas de
laboratorio
5.1.1. Elección de las dos variedades estudiadas.
Con el fin de seleccionar dos variedades adecuadas, según la hipótesis planteada en el
punto 1.4, se realizó un estudio sobre las características de crecimiento de tres variedades de
extendido uso agrícola: Namoi, Látigo y Sita.
Se sembraron 196 semillas de cada variedad en vermiculita termita (nº 3).
Transcurridos 15 días desde el momento de la siembra, período en que se mantuvieron con 14
horas de luz a 25 °C y 10 horas en oscuridad a 18 °C, se midió en todas ellas longitud,
número de foliolos y peso seco. Con las 196 plantas se hicieron 28 grupos de 7 plantas cada
uno, y con la media de dichos grupos se hizo un análisis de componentes principales (Figura
5.1), la varianza absorbida por los dos primeros ejes fue del 100 % (Tabla 5.I).
Tabla 5.I. Porcentaje de varianza absorbida por los ejes.
% Varianza
% Acumulada
Eje I
99.43
99.43
Eje II
0.57
100
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.II. Hay que destacar,
en primer lugar, el efecto prácticamente nulo de la variable peso seco, mientras que longitud y
número de foliolos determinan la ordenación de las muestras. Sobre el eje I las variables
longitud y número de foliolos provocan un desplazamiento de las muestras de la variedad
Namoi hacia los valores más positivos del eje. Los puntos correspondientes a la variedad
Látigo tienden hacia los valores más bajos y los puntos de la variedad Sita se colocan de
forma homogénea a lo largo del eje. La información que aporta el eje II es escasa debido a
que únicamente absorbe un 0.57 % de la varianza total.
142
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 5.II. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Longitud
0.745
-0.667
Nº de foliolos
0.667
0.745
Peso seco
0.001
0
Estos resultados sugieren una dependencia entre las variables estudiadas, ya que la
variedad Namoi muestra, en todas ellas, valores superiores a los encontrados en la variedad
Látigo.
Por esta razón se sometieron a análisis de imagen 62 foliolos, 31 de la variedad Namoi
y 31 de Látigo para medir su superficie. A continuación se realizó un ANOVA que indicó
diferencias significativas entre las dos variedades (F=18.33; P=6.81x10-5), siendo la
superficie foliar de las plantas de la variedad Látigo significativamente mayor.
Para comprobar el significado estadístico de las diferencias entre variedades, se
hicieron ANOVAs unidireccionales con réplicas para cada variable. Las diferencias de
longitud (F=15.60; P=1.86x10-6), número de foliolos (F=5.70; P=4.83x1-3) y peso seco
(F=16.41; P=1.04x10-6) fueron significativas.
Las diferencias entre Namoi y las otras dos variedades en cuanto a la longitud y
número de foliolos resultaron significativas a nivel p<0.01, mientras que las variedades
Látigo y Sita no mostraron diferencias significativas. El LSD del peso seco reveló diferencias
significativas a nivel p<0.01 entre Látigo y Namoi y Látigo y Sita, aunque entre Namoi y Sita
las diferencias se establecen a nivel p<0.05.
143
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Como consecuencia de los resultados obtenidos, se eligieron las variedades Namoi y
Látigo para desarrollar las experiencias posteriores.
Figura 5.1. Ordenación de las muestras según el ACP efectuado con los resultados obtenidos de longitud,
número de foliolos y peso seco en las tres variedades estudiadas, sobre los dos primeros ejes.
5.1.2. Caracterización de los suelos empleados
5.1.2.a. Características fisicoquímicas
El suelo empleado en el presente trabajo se caracterizó fisicoquímicamente. Los
resultados se muestran en la Tabla 5.III. Todos ellos son el resultado de la media de tres
réplicas y tres repeticiones por réplica.
Tabla 5.III. Caracterización fisicoquímica del suelo empleado. A la derecha de cada dato, en cursiva, aparece
el error estándar.
TIEMPO
NH4+
NO3µg/g de suelo
Ntotal
mg/g de suelo
CO
%
pH
µg/g de suelo
4.05 ± 0.22
18.56 ± 2.25
1.00 ± 0.12
0.84 ± 0.02
6.36 ± 0.06
144
CIC
P
meq/100 g de
suelo
µg/g de suelo
7.43 ± 0.26
22.50 ± 1.08
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
La textura y la CRM se midieron únicamente en el primer muestreo. La CRM resultó
ser de 0.5 mL/g de suelo y la textura franco arcillo-arenoso, con un porcentaje de 53 % de
arena, 24 % de arcilla y 23 % de limos.
5.1.2.b. Actividades potenciales de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2
La caracterización biológica hace referencia a la actividad de los grupos fisiológicos
del ciclo del nitrógeno y a la actividad biológica total medida como producción de CO2. Los
resultados obtenidos corresponden a actividades potenciales; éstos se muestran en la Tabla
5.IV. Todos ellos son el resultado de la media aritmética de tres réplicas y tres repeticiones
por réplica.
Tabla 5.IV. Actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2. A
la derecha de cada dato, en cursiva, aparece el error estándar.
ARA
nmol etileno/g suelo h
TIEMPO
34.08 ±2.61
Amonificación
µg NH4+/g suelo
Nitrificación
Desnitrificación
µg NO3-/g suelo día
nmol N2O/g suelo h
23.03 ±0.42
-0.015 ±0.058
0.00 ±0.00
CO2
nmol CO2/g suelo
279.88 ±5.40
Estos resultados se utilizaron como datos de tiempo cero (T0), antes de introducir en
dicho suelo, las variedades objeto de estudio.
5.1.3. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre parámetros fisicoquímicos
edáficos durante el ciclo fenológico de las plantas
5.1.3.a. Nitrógeno amonio
Las concentraciones nitrógeno amonio detectadas en los suelos donde se desarrollaron
las plantas, y en el control, en los cuatro tiempos de muestreo, se exponen en el Apéndice 1,
Tabla I y en la Figura 5.2. El ANOVA indica diferencias significativas entre variedades y
control (F=6.30; P=6.31x10-3). También es significativa la interacción entre las variedades y
el tiempo de muestreo (F=33.36; P=0.00).
145
h
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Considerando globalmente las concentraciones de amonio en los cuatro tiempos de
muestreo, los valores son mayores en el control que en los suelos donde crecen las plantas, y
entre éstas la concentración de amonio fue mayor en los suelos bajo la influencia de Látigo;
sin embargo, el test LSD sólo detecta diferencias significativas (p<0.01) entre el control y las
dos variedades.
Las interacciones contrastadas mediante el test LSD son las que se dan entre las
variedades y el control en cada tiempo de muestreo, y entre los tiempos de muestreo en cada
variedad y el control por separado.
Como aspecto más sobresaliente respecto a las variaciones en la concentración de
amonio, se puede señalar que las diferencias en cada época de muestreo se van tornando más
acusadas desde T0 hasta fructificación (T3) (Figura 5.2), momento en el cual las diferencias
entre las tres muestras son significativas. Por otra parte a lo largo del ciclo se detecta un
aumento en la concentración de amonio en todos los casos, más progresiva y menos acusada
en los suelos bajo la influencia de las plantas (Figura 5.2).
µg amonio/g de suelo
80
60
Control a-a-a-b
Namoi a-a-b-c
Látigo a-ab-b-c
40
20
0
T0
T1
aaa
T2
aba
T3
abc
Figura 5.2. Concentraciones de amonio (µg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras
que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican
la ausencia de diferencias significativas.
146
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.1.3.b. Nitrógeno nitrato
El nitrógeno nitrato detectado en los suelos de las dos variedades de V. villosa y el
control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla II y Figura 5.3.
El ANOVA indica diferencias significativas entre las variedades (F=54.58; P=0.00). También
es significativa la interacción entre las variedades y los tiempos de muestreo (F=13.76;
P=9.54x10-7).
Considerando globalmente la concentración de nitrato en los cuatro tiempos de
muestreo, los valores son mayores en el control que en los suelos donde crecen las plantas, y
entre éstas la concentración de nitrato fue mayor en los suelos bajo la variedad Látigo; el test
LSD detectó diferencias significativas (p<0.01) en todos los casos.
La tendencia general (Figura 5.3) observada durante el crecimiento de la planta antes
de la floración es un aumento en las concentraciones de nitrato más acusada en el control que
en el resto. En este momento se detecta más nitrato en el suelo bajo la influencia de Látigo
que en el que está bajo la influencia de Namoi. Al alcanzar la floración, las concentraciones
de nitrato descienden significativamente en los suelos que soportan el crecimiento de las dos
variedades, y además las diferencias entre ambas no son significativas; por el contrario, en el
control la concentración de nitrato permanece estable. Desde la floración hasta la
fructificación no hay variaciones significativas en el control ni en el suelo bajo la variedad
Namoi, pero no ocurre lo mismo bajo la variedad Látigo donde se produce un significativo
incremento.
147
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
120
µg nitrato/g de suelo
100
80
Control a-b-b-b
Namoi a-b-ac-c
Látigo a-b-a-b
60
40
20
0
T0
T1
a b ab
T2
abb
T3
aba
Figura 5.3. Concentraciones de nitrato (µg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican
la ausencia de diferencias significativas.
5.1.3.c. Nitrógeno total
El nitrógeno total detectado en los suelos de las dos variedades de V. villosa y el
control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla III y Figura
5.4. El ANOVA indica diferencias significativas entre las variedades (F=6.00; P=7.71X10-3).
También es significativa la interacción entre las variedades y los tiempos de muestreo
(F=5.11; P=1.66X10-3).
Considerando globalmente la concentración de nitrógeno total en los cuatro tiempos
de muestreo, los valores son mayores en los suelos donde crecen las plantas y menor en el
control. El test LSD detectó diferencias significativas (p<0.01) entre el control y las dos
variedades de veza, pero no entre variedades.
Las variaciones en la concentración de nitrógeno total, en los tres suelos ensayados
aparecen en la Figura 5.4. En los suelos bajo la influencia de las plantas se aprecia un
148
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
significativo incremento durante el desarrollo vegetativo, y a continuación, en floración y
fructificación una disminución. La tendencia señalada es igual en las dos variedades de veza y
en el control; sin embargo, en este último, hay una pérdida neta de nitrógeno, considerando el
principio y el final del experimento y el incremento entre T0 y T1 no es significativo.
3
mg N/g de suelo
2,5
2
Control a-a-a-a
Namoi a-b-b-a
Látigo a-b-c-a
1,5
1
0,5
0
T0
T1
abb
T2
abb
T3
aaa
Figura 5.4. Concentración de N total (mg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican
la ausencia de diferencias significativas.
5.1.3.d. Carbono orgánico
El carbono orgánico detectado en los suelos de las dos variedades de V. villosa y el
control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla IV y Figura
5.5. El ANOVA indica diferencias significativas entre las variedades (F=65.24; P=1.19x10-7).
También es significativa la interacción entre las variedades y los tiempos de muestreo
(F=8.13; P=7.33x10-5).
Considerando globalmente la concentración de carbono orgánico en los cuatro
tiempos de muestreo, los valores son mayores en los suelos donde crecieron las plantas, y
149
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
entre éstos, donde había crecido la variedad Látigo, el control mostraba el valor más bajo;
asimismo, el test LSD detectó diferencias significativas (p<0.01) en todos los casos.
Las concentraciones de carbono orgánico prácticamente no varían durante todo el
período de muestreo bajo la influencia de Namoi (Figura 5.5). En la variedad Látigo las
variaciones son más acusadas, aunque también escasas, con un máximo durante el período
vegetativo. La situación en el suelo control es diferente, de manera que los niveles de carbono
orgánico van disminuyendo hasta T2 produciéndose un ligero incremento en T3. Tanto en
floración como en fructificación las diferencias entre los tres suelos son significativas.
1,2
1,1
% CO
1
Control a-ac-b-c
Namoi a-a-a-a
Látigo a-b-ac-bc
0,9
0,8
0,7
0,6
T0
T1
aab
T2
abc
T3
abc
Figura 5.5. Resultados de carbono orgánico (%) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que indican la
significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo la
significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican la ausencia
de diferencias significativas.
5.1.3.e. pH
El valor de pH detectado en los suelos de las dos variedades de V. villosa y el control
en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla V y Figura 5.6. El
ANOVA indica que no existen diferencias significativas entre las variedades; sin embargo, es
150
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
significativa la interacción entre las variedades y los tiempos de muestreo (F=16.30;
P=1.19x10-7).
La tendencia general detectada durante el período de muestreo es una disminución de
pH en todos los casos (Figura 5.6). La disminución es más progresiva en los suelos
cultivados, que mostraron siempre un pH significativamente mayor que el control salvo de T0
a T1, período durante el cual el pH en el suelo control permanece prácticamente estable y
bajo las plantas se produce un acusado descenso del mismo. En la variedad Namoi también
hay un significativo descenso de T2 a T3. Sin embargo, en el suelo control el descenso más
importante, casi una unidad de pH, ocurre de T1 a T2.
6,4
6,2
pH
6
Control a-a-b-b
Namoi a-b-b-c
Látigo a-b-bc-c
5,8
5,6
5,4
5,2
5
T0
T1
abb
T2
abb
T3
aab
Figura 5.6. Resultados de pH en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el control en los
cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que indican la significación
de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo la significación de
las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican la ausencia de diferencias
significativas.
5.1.3.f. Capacidad de intercambio catiónico (CIC)
La capacidad de intercambio catiónico (CIC) detectada en los suelos de las dos
variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el
151
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Apéndice 1, Tabla VI y Figura 5.7. El ANOVA indica que no existen diferencias
significativas entre las variedades, aunque sí es significativa la interacción entre las
variedades y los tiempos de muestreo (F=5.71; P=8.38x10-4).
Las tendencias en la variación de CIC (Figura 5.7) en los suelos cultivados son muy
parecidas y sólo se detectan diferencias en la fructificación. Durante el desarrollo vegetativo
se produce una significativa disminución y posteriormente un incremento especialmente
acusado en la transición de floración a fructificación. En el suelo control la tendencia de T0 a
T2 es la misma que en los suelos cultivados, aunque el aumento de CIC de T1 a T2 es mucho
más acusado. Sin embargo, de T2 a T3 la tendencia se invierte sin ser significativa la
diferencia en dicho período.
meq/100 g de suelo
8
7
Control a-b-c-c
Namoi a-b-c-d
Látigo a-bc-c-a
6
5
4
T0
T1
aaa
T2
abb
T3
aab
Figura 5.7. Resultados de CIC (meq/100 g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa
y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican
la ausencia de diferencias significativas.
152
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.1.3.g. Fósforo
El fósforo detectado en los suelos de las dos variedades de V. villosa y el control en
los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla VII y Figura 5.8. El
ANOVA indica diferencias significativas entre las variedades (F=22.21; P=3.40x10-6).
También es significativa la interacción entre las variedades y el tiempo de muestreo (F=7.16;
P=1.83x10-4).
Considerando globalmente la concentración de fósforo en los cuatro tiempos de
muestreo, los valores son mayores en los suelos donde crecieron las plantas y entre éstas el
valor más alto aparece bajo la influencia de Látigo. El test LSD detectó diferencias
significativas (p<0.01) entre el control y la variedad Látigo y entre las dos variedades, no se
detectaron entre el control y la variedad Namoi.
En la Figura 5.8 se puede apreciar que los valores de fósforo varían de forma
completamente distinta bajo las plantas que en el suelo control. Por otra parte, otro hecho
destacable es que las concentraciones de fósforo en los suelos bajo la variedad Látigo
aumentan sistemáticamente desde el comienzo hasta el final del experimento, aunque las
variaciones entre T1, T2 y T3 no resultaron significativas, pero sí la concentración entre el
comienzo y el final del experimento. Bajo la variedad Namoi la concentración de fósforo sólo
presenta una variación significativa desde el estado de crecimiento vegetativo hasta la
floración; el resto de las medidas no presentaron diferencias significativas entre sí. Los
resultados obtenidos en el suelo control son, a pesar de las variaciones, estables desde un
punto de vista estadístico, pues las diferencias no fueron significativas.
153
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
29
µg fósforo/g de suelo
27
25
Control a-a-a-a
Namoi ac-c-a-c
Látigo a-ab-b-b
23
21
19
17
15
T0
T1
abb
T2
aab
T3
aab
Figura 5.8. Resultados de fósforo (µg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento aparecen letras que indican
la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo la
significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras iguales indican la ausencia
de diferencias significativas.
5.1.4. Análisis de componentes principales realizado con los datos fisicoquímicos
analizados durante el experimento
Con los resultados fisicoquímicos obtenidos en los cuatro muestreos, se hizo un
análisis de componentes principales (ACP), y la varianza absorbida por los dos primeros ejes
fue del 98.70 % (Tabla 5.V).
Tabla 5.V. Porcentaje de varianza absorbida por los ejes.
% Varianza
% Acumulada
Eje I
93.16
93.16
Eje II
5.53
98.70
154
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.VI. Es destacable el
agrupamiento de los puntos correspondientes a T1, a este grupo se une el control a T2. Los
restantes puntos se reúnen en dos grupos: por una parte, Namoi y Látigo a T2 con Namoi a
T3; y por otra, control y Látigo a T3 (Figura 5.9). Las variables determinantes de esta
distribución son el nitrato sobre el eje I
y el amonio sobre el eje II; las muestras
correspondientes a T1, y control a T2, se encuentran desplazadas hacia los valores más
positivos del eje, mientras que Namoi a T2, Látigo a T2 y Namoi a T3 se sitúan hacia los
valores menos positivos (Figura 5.9) lo que se debe fundamentalmente a la progresiva
disminución en la concentración de nitrato y al aumento en la concentración de amonio. Las
muestras de control a T3 y Látigo a T3 presentan unos valores elevados para ambos iones.
Tabla 5.VI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
pH
0.063
0.015
Amonio
0.271
0.944
Nitrato
0.924
-0.310
N Total
0.017
-0.006
CO
0.009
0.004
CIC
0.062
0.039
Fósforo
0.256
0.108
155
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
CONTROL T3
37.50
LÁTIGO T3
Eje II
NAMOI T3
NAMOI T2
LÁTIGO T2
0
TIEMPO 0
Eje I
118.08
NAMOI T1
LÁTIGO T1
CONTROL T2
CONTROL T1
-25.72
Figura 5.9. Representación de las muestras según el ACP efectuado con los resultados fisicoquímicos, sobre los
dos primeros ejes.
5.1.5. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno y producción de CO2 a nivel edáfico
5.1.5.a. ARA potencial
Los resultados del ARA potencial de los suelos bajo las dos variedades de V. villosa y
el control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla VIII y en la
Figura 5.10.
Los ANOVAs unidireccionales realizados indican diferencias entre los tiempos de
muestreo en todos los casos: control (F=80.35; P=2.56x10-6), variedad Namoi (F=87.91;
P=1.79x10-6) y variedad Látigo (F=74.65; P=3.52x10-6). También existen diferencias en los
tiempos de muestreo, T1 (F=11.49; P=8.87x10-3), T2 (F=73.62; P=6.01x10-5) y T3 (F=36.68;
P=4.32x10-4).
La tendencia general de ARA potencial es la misma en los tres suelos a lo largo del
experimento (Figura 5.10). Sólo es destacable una mayor disminución de ARA en el suelo
control desde T1 a T3 que en los suelos bajo la influencia de las plantas.
156
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
40
nmol etileno/g de suelo y hora
35
30
25
Control a-b-c-c
Namoi a-b-b-b
Látigo a-b-b-b
20
15
10
5
0
T0
T1
a bc c
T2
aab
T3
aab
Figura 5.10. Resultados de ARA (nmol etileno/g suelo hora) potencial en el suelo donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento
aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras
iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.1.5.b. Amonificación potencial
Los resultados del potencial amonificante en los suelos de las dos variedades de V.
villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla IX
y Figura 5.11. El ANOVA indica que hay diferencias significativas entre las variedades
(F=6.53; P=5.45x10-3). También es significativa la interacción entre las variedades y el
tiempo de muestreo (F=3.54; P=1.18x10-2).
Considerando globalmente la amonificación potencial en los cuatro tiempos de
muestreo, el valor más alto aparece en el suelo donde creció la variedad Látigo, seguido del
control y por último el suelo de la variedad Namoi. El test LSD
detectó diferencias
significativas (p<0.01) entre las variedades, pero no entre el control y las variedades.
La tendencia general de la amonificación potencial a lo largo del tiempo es a aumentar
en todos los suelos (Figura 5.11). Este aumento se hace muy acusado a partir de T1, sobre
157
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
todo en el control y en el suelo bajo la influencia de Látigo, mientras que bajo Namoi
experimenta una subida hasta T2 menos acusada.
µg amonio/g de suelo y día
170
120
Control a-a-b-c
Namoi a-a-b-c
Látigo a-a-b-c
70
20
T0
T1
aaa
T2
aba
T3
a ab b
Figura 5.11. Resultados de amonificación potencial (µg/g suelo día de incubación) en el suelo donde crecieron
las dos variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje
X, bajo cada momento de muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo
(p<0.05). Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.1.5.c. Nitrificación potencial
Los resultados del potencial nitrificante de los suelos de las dos variedades de V.
villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla X y
Figura 5.12. El ANOVA se realizó con los datos transformados, sumando a todos los valores
el número negativo con mayor valor absoluto. Dicho ANOVA indica diferencias
significativas entre las variedades (F=30.23; P=2.38x10-7). También es significativa la
interacción entre las variedades y el tiempo de muestreo (F=53.49; P=1.19x10-7).
Considerando globalmente la nitrificación potencial en los cuatro tiempos de
muestreo, el valor más alto se produce en el suelo control. En los suelos donde crecieron las
158
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
plantas el valor más alto aparece bajo la variedad Namoi, el test LSD detectó diferencias
significativas (p<0.01) entre el control y las dos variedades, pero no entre ellas.
En la Figura 5.12 se puede observar la tendencia que sigue la nitrificación potencial a
lo largo del tiempo. Bajo la influencia de las plantas, la variación es muy pequeña,
manteniéndose durante todo el experimento en valores cercanos a cero. En el suelo control
disminuye la nitrificación potencial hasta T2, momento a partir del cual aumenta de forma
muy acusada hasta T3.
14
µg nitrato/g de suelo y día
12
10
8
Control a-a-a-b
Namoi a-a-b-ab
Látigo ab-ab-a-b
6
4
2
0
-2
-4
T0
T1
aaa
T2
abb
T3
abb
Figura 5.12. Resultados de nitrificación potencial (µg/g suelo día incubación) en el suelo donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje
X, bajo cada momento de muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo
(p<0.05). Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.1.5.d. Desnitrificación potencial
El óxido nitroso producido por los suelos de las dos variedades de V. villosa y el
control en los cuatro tiempos de muestreo, se exponen en el Apéndice 1, Tabla XI y Figura
159
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.13. El ANOVA indica diferencias significativas entre las variedades (F=57.39; P=5.96x108
). También es significativa la interacción entre las variedades y el tiempo de muestreo
(F=29.72; P=5.96x10-8).
Considerando globalmente la producción de N2O en los cuatro tiempos de muestreo,
el valor más alto aparece en el suelo control y en el suelo donde creció Namoi, el test LSD
detectó diferencias significativas (p<0.01) en todos los casos.
En la Figura 5.13 se observa como la tendencia de los suelos que soportan las plantas
es diferente al suelo control. En el suelo control la desnitrificación potencial va aumentando
progresivamente hasta el final del experimento; no obstante, en los suelos bajo la influencia
de las plantas hay una subida inicial, volviendo después al mismo nivel de T0. Bajo la
variedad Namoi el máximo se alcanza en T2 y en la variedad Látigo en T1.
nmol N2 O/g de suelo h
4
3
Control a-bc-c-d
Namoi a-a-b-a
Látigo a-a-a-a
2
1
0
T0
T1
aaa
T2
aab
T3
abb
Figura 5.13. Resultados de desnitrificación potencial (nmol N2O/g suelo hora) en el suelo donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje
X, bajo cada momento de muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo
(p<0.05). Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.1.5.e. Producción de CO2.
El CO2 producido por los suelos de las dos variedades de V. villosa y el control en los
cuatro tiempos de muestreo se exponen en el Apéndice 1, Tabla XII y Figura 5.14. El
160
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
ANOVA indica que hay diferencias significativas entre las variedades (F=6.94; P=4.18x10-3).
También es significativa la interacción entre las variedades y el tiempo de muestreo (F=4.62;
P=2.97x10-3).
Considerando globalmente la producción de CO2 potencial en los cuatro tiempos de
muestreo, el valor más alto se detecta en el suelo donde creció la variedad Látigo, seguido del
control y por último el suelo bajo Namoi; el test LSD permitió detectar diferencias
significativas (p<0.01) y entre el control y la variedad Namoi, y no existieron diferencias
entre el control y la variedad Látigo.
En todos los casos hay una disminución en la producción de CO2 durante el
experimento (Figura 5.14), aunque lo más destacable es la mayor disminución que se produce
en el suelo Namoi hasta T2; posteriormente la producción de CO2 se iguala en todos los
suelos.
nmol CO2 /g de suelo y hora
300
250
200
Control a-b-c-c
Namoi a-b-c-d
Látigo a-b-c-d
150
100
50
0
T0
T1
aba
T2
aaa
T3
aaa
Figura 5.14. Resultados de producción de CO2 (nmol CO2/g suelo hora) en el suelo donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y el control en los cuatro tiempos de muestreo. En la leyenda junto a cada tratamiento
aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre tiempos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo la significación de las diferencias entre tratamientos para cada tiempo (p<0.05). Letras
iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.1.6. Análisis de componentes principales realizado con los datos de actividad potencial
de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2
161
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Con los datos, obtenidos en los cuatro muestreos se hizo un análisis de componentes
principales (ACP), de modo que la varianza absorbida por los dos primeros ejes fue del
99.86 % (Tabla 5. VII).
Tabla 5.VII. Porcentaje de varianza absorbida por los ejes.
% Varianza
% Acumulada
Eje I
78.36
78.36
Eje II
21.50
99.86
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.VIII. Se puede
observar con claridad cómo se han formado tres grupos de puntos (Figura 5.15), coincidiendo
cada uno con los tiempos de muestreo, T0 tiende a agruparse con los puntos de T1. Sobre el
eje I la variable CO2 es la que más peso tiene y desplaza los puntos hacia los valores más
positivos del eje; la desnitrificación potencial ejerce el efecto contrario sobre este mismo eje.
Sobre el eje II la variable amonificación potencial es la que más peso tiene y desplaza los
puntos hacia los valores más positivos del eje, siendo de nuevo la variable CO2 la que
provoca el efecto contrario sobre dicho eje (Figura 5.15).
Tabla 5.VIII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Amonificación
0.420
0.907
Nitrificación
0.002
0.019
CO2
0.906
-0.418
N2O
0.005
0.006
ARA
0.059
-0.045
162
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Eje II
144.23
LÁTIGO T3
NAMOI T3
CONTROL T3
CONTROL T2
LÁTIGO T2
NAMOI T2
Eje I
0
NAMOI T1
LÁTIGO T1
CONTROL T1
-97.57
TIEMPO 0
Figura 5.15. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados de las actividades biológicas,
sobre los dos primeros ejes.
5.1.7. Resultados de los análisis biométricos, nitrógeno total y ARA de los nódulos en las
dos variedades de V. villosa
5.1.7.a. Medidas biométricas
Los resultados de las distintas variables biométricas estudiadas en las dos variedades
aparecen en la Tabla 5.IX. Todos ellos corresponden a la media aritmética de tres réplicas y
tres repeticiones por réplica.
Tabla 5.IX. Resultados de las medidas biométricas de la parte radical y aérea de las dos variedades de V. villosa
en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
163
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
NAMOI
T1
T2
LÁTIGO
T3
0.08 ±0.01
0.23 ±0.04
0.23 ±0.04
Biomasa
(parte aérea)(g)
4.69 ±0.30
6.20 ±1.10
8.88 ±0.90
Superficie
2
Radical (cm )
25.66 ±2.29 35.21 ±5.27
28.55 ±1.17
Longitud
Radical (cm)
18.78 ±0.24 24.07 ±4.56 45.73 ±2.97
Superficie
2
Aérea (cm )
52.00 ±0.87 76.27 ±13.86 96.66 ±5.68
Longitud
Aérea (cm)
T1
T2
T3
0.07 ±0.01
0.28 ±0.04
0.48 ±0.08
4.99 ±1.33
±4.12
14.05 ±0.58
26.33 ±6.14 39.29 ±11.41
39.96 ±1.05
14.39 ±1.55
33.64 ±5.48
53.42 ±10.46
37.23 ±1.87
77.80 ±3.91
104.49 ±7.12
9.77
Para detectar las posibles diferencias de biomasa entre variedades en cada tiempo de
muestreo se realizó un ANOVA unidireccional con réplicas en cada uno de ellos. En ningún
caso aparecieron diferencias significativas.
A T1 la mayor biomasa corresponde a la variedad Namoi (dato ya constatado
previamente); sin embargo, posteriormente la variedad Látigo supera a Namoi,
manteniéndose esta tendencia hasta el final del experimento.
El ANOVA unidireccional con réplicas realizado sobre las medidas de superficie
radical medida en las dos variedades de V. villosa en los tres tiempos de muestreo sólo
detectó diferencias significativas en T3 entre ambas variedades (F=15.56; P=0.02).
Es destacable la progresiva divergencia que se produce entre las dos variedades al
medir este parámetro. La variedad Látigo tiene siempre mayor superficie radical que Namoi.
La longitud radical de la variedad Látigo es, en todos los muestreos, superior a la de
Namoi, aunque las diferencias entre ambas variedades sólo resultaron significativas en T3,
momento en el cual el ANOVA detecta diferencias a nivel de p< 0.01 (F=35.15; P=0.00).
La longitud aérea es significativamente mayor (p<0.01) en la variedad Namoi en T1
(F=34.05; P=0.00), mientras que, en T2 y T3 es Látigo la variedad que presenta valores
superiores. La superficie aérea sigue la misma tendencia, aunque para esta variable el
ANOVA no detecta diferencias significativas en ningún caso.
5.1.7.b. Nitrógeno total de la parte aérea y ARA nodular
164
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Los resultados de nitrógeno total de la parte aérea y radical y los datos de ARA
nodular aparecen en la Tabla 5.X. Los valores son el resultado de la media aritmética de tres
réplicas y tres repeticiones por réplica.
Tabla 5.X. Resultados de nitrógeno total de parte aérea, radical y ARA de los nódulos de las dos variedades de
V. villosa en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
NAMOI
N Total Aéreo
LÁTIGO
T1
T2
T3
T1
T2
T3
43.33 ±2.72
30 ±0.94
33.33 ±2.72
33.33 ±2.72
40 ±1.41
26.67 ±2.72
13.33 ±2.72
10 ±0.94
10 ±0.82
10 ±1.41
10 ±0.47
16.67 ±5.44
0.00 ±0.00
4181.06
±583.27
23439.85
±5155.15
0.00 ±0.00
(mg/g planta)
N Total Radical
(mg/g planta)
ARA Nodular
2871.25 ±369.36 0.00 ±0.00
(nmol de etileno/g h)
El nitrógeno total de la parte aérea encontrado en las dos variedades de V. villosa en
los tres tiempos de muestreo se expone en la Tabla 5.X. Para detectar las posibles diferencias
en cada tiempo de muestreo se realizó un ANOVA unidireccional con réplicas en cada uno de
ellos, sólo a T2 se detectaron diferencias significativas (F=23.08; P=8.63x10-3). Cabe señalar
que las variaciones de nitrógeno total en la parte aérea de la planta son opuestas en una y otra
variedad.
El nitrógeno total de la parte radical no presentó en ningún caso diferencias
significativas. Es destacable el comportamiento de una y otra variedad, de tal forma que
mientras Namoi sufre una bajada hasta T2, manteniéndose hasta el final, la variedad Látigo se
mantiene hasta T2, experimentando una subida en T3.
En cuanto al ARA nodular lo más destacable es el gran aumento que se produce en la
variedad Látigo a T2, que contrasta con el valor 0 obtenido en la variedad Namoi en el mismo
tiempo.
5.1.8. Análisis de componentes principales realizado con los datos biométricos obtenidos
a lo largo del experimento
165
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Con los datos biométricos se hizo un análisis de componentes principales (ACP), la
varianza absorbida por los dos primeros ejes fue del 100 % (Tabla 5.XI).
Tabla 5.XI. Porcentaje de varianza absorbida por los ejes.
% Varianza
% Acumulada
Eje I
99.99
99.99
Eje II
0.01
100
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.XII. Sobre el eje I la
variable ARA de los nódulos es la que más peso tiene y desplaza las muestras hacia los
valores más positivos de dicho eje, y por esta razón Látigo a T2 está muy separado del resto
de los puntos.
Sobre el eje II se puede observar una clara diferenciación de los tiempos de muestreo,
excepto Látigo a T2 que debido a su valor de ARA nodular está desplazado. Esta ordenación
a lo largo del eje II se debe a la variable longitud de la parte aérea, por ser la que más peso
tiene sobre este eje (Figura 5.16).
Tabla 5.XII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
166
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Eje I
Eje II
Biomasa
0
0.003
Nitrógeno (Aérea)
0.002
0.306
Nitrógeno (Radical)
0.001
0.121
Longitud Radical
0
0.086
Superficie Radical
0.002
0.315
Superficie Aérea
0.002
0.359
Longitud Aérea
0.004
0.810
ARA Nodular
1
-0.005
127.78
LÁTIGO T3
NAMOI T3
Eje II
NAMOI T2
NAMOI T1
LÁTIGO T1
Eje I
23440.06
-13.40
LÁTIGO T2
Figura 5.16. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados biométricos, sobre los dos
primeros ejes.
167
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.2. Resultados de los estudios de campo previos sobre la influencia de V. villosa en la
dinámica del ciclo del nitrógeno
5.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos
Los resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos se muestran en el apéndice
2, Tabla I y se representan en la Figura 5.17. Todos ellos corresponden a la media aritmética
de tres réplicas (parcelas) y tres repeticiones por réplica.
25
a
20
a
15
a
T0
Floración
Fructificación
10
b
a
b
5
a
a a
a
a
a
a
a
a
0
Amonio
Nitrato
pH
CO
Nitrógeno
Total
Figura 5.17. Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos. Unidades: Amonio (µg/g
suelo); Nitrato (µg/g suelo x 10-2); Carbono Orgánico (CO)(%); N Total (mg/g suelo). Sobre
cada columna y en su color correspondiente aparece una letra que indica la significación de
las diferencias (p<0.05) entre muestreos para cada variable. Letras iguales indican la ausencia
de diferencias significativas.
Las concentraciones de nitrógeno amonio aumentan a lo largo del experimento,
alcanzando sus máximos durante la fructificación; sin embargo, el aumento no resultó
significativo en ningún caso (F=10.61; P=0.57). El nitrógeno total, tiene una tendencia
inversa, descendiendo, aunque no de forma significativa, durante la fructificación.
168
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
La concentración de nitrógeno nitrato aumenta significativamente en floración y
fructificación (F=13.69; P=0.01). Los niveles de esta forma de nitrógeno son altos en todos
los muestreos, llegando a un valor de 768.27 µg/g de suelo en fructificación, momento en el
que esta variable alcanza los valores más altos.
En cuanto a pH y carbono orgánico, no presentan variaciones significativas (F=1.15;
P=0.38 para el pH; F=0.99; P=0.42 para el carbono orgánico). Como se puede observar, el pH
es ácido oscilando entre 5.18 en T0 y 4.88 en fructificación. El carbono orgánico se mantiene
en valores en torno al 3 %, aumentando en floración.
La textura y la capacidad de retención máxima (CRM) se midieron únicamente en el
primer muestreo. La CRM resultó ser de 0.7 mL/g de suelo y la textura arcillosa limosa con
un porcentaje de 42 % de arcilla, 46 % de limos y 12 % de arena.
5.2.2. Resultados de las actividades del ciclo del nitrógeno en condiciones potenciales y
de campo
En la Figura 5.18 se representan tres de las actividades potenciales del ciclo del
nitrógeno, amonificación, nitrificación y ARA. Los resultados aparecen en el apéndice 2,
Tabla II.
Como se puede observar en la Figura 5.18 la amonificación potencial desciende a lo
largo del experimento, alcanzando los valores mínimos en fructificación. El ANOVA
unidireccional con réplicas (F=4.18; P=0.07) no detectó diferencias significativas en ningún
caso.
El potencial nitrificante desciende en floración y fructificación significativamente,
presentando en dichos muestreos valores negativos. Las diferencias entre T0 y floración y
fructificación resultaron significativas a nivel de p<0.01 (F=11.01; P=0.01).
La actividad reductora de acetileno potencial del suelo se mantiene en valores bajos,
llegando a cero en floración y recuperándose posteriormente en fructificación, momento en el
que presenta los valores más altos.
169
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
40
a
30
a
a
20
10
a
b
0
a
b
b
a
T0
Floración
Fructificación
-10
-20
-30
Amonificación
Nitrificación
ARA
Figura 5.18. Resultados de la amonificación (µg NH4+/g suelo día x 10-1), nitrificación (µg
NO3-/g suelo día) y actividad reductora de acetileno (nmol etileno/g suelo h) potenciales.
Sobre cada columna y en su color correspondiente aparece una letra que indica la
significación de las diferencias (p<0.05) entre muestreos para cada potencial. Letras iguales
indican la ausencia de diferencias significativas.
La actividad desnitrificante, ARA y producción de CO2 en condiciones de campo y
potenciales aparecen en el apéndice 2, Tabla III. En la Figura 5.19 se representan dichos
resultados. No se detectó actividad ARA en ninguno de los muestreos.
En la Figura 5.19 observamos que la producción de CO2 en condiciones de campo y el
potencial no siguen la misma tendencia. La producción de CO2 potencial desciende en
floración, para luego recuperarse en fructificación, momento en el que alcanza los valores
más altos. Las diferencias entre los momentos de muestreo no resultaron significativas (F=
4.47; P=0.07). Sin embargo, en condiciones de campo, la producción de CO2 aumenta a lo
largo del experimento. El ANOVA unidireccional con réplicas detectó diferencias
significativas entre tiempos de muestreo (F=20.90; P=0.00). El incremento de esta variable de
T0 a floración es significativo a nivel de p<0.01, posteriormente, las variaciones no son
significativas.
170
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Al igual que en la producción de CO2 la desnitrificación potencial y de campo se
comporta de manera distinta. La desnitrificación potencial aumenta a lo largo del
experimento, sin que el ANOVA muestre diferencias significativas entre tiempos (F=4.47;
P=0.07). En el caso de la desnitrificación de campo, los valores más altos aparecen en
floración, superando incluso los niveles de N2O de los potenciales. El ANOVA (F=17.95;
P=0.00) detectó diferencias significativas entre la floración y los otros dos muestreos.
300
a
b
b
250
b
200
a
150
100
50
a
a
a
T0
Floración
Fructificación
a
a
a
a
0
Potenciales Campo
Producción de CO 2
Potenciales Campo
Desnitrificación x 10
Figura 5.19. Resultados de la producción de CO2 y desnitrificación en condiciones
potenciales y de campo en los tres tiempos de muestreo. Sobre cada columna y en su color
correspondiente aparece una letra que indica la significación de las diferencias (p<0.05) entre
muestreos para cada actividad. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
171
5.3. Resultados de los estudios de campo realizados en las parcelas de experimentación
de Montepríncipe sobre la influencia de V. villosa en la dinámica del ciclo del nitrógeno
5.3.1. Caracterización de los suelos empleados
5.3.1.a. Características fisicoquímicas
El suelo de las parcelas empleadas en el presente trabajo se caracterizó
fisicoquímicamente. Los resultados se muestran en la Tabla 5.XIII. Todos ellos son el
resultado de la media aritmética de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
Tabla 5.XIII. Caracterización fisicoquímica del suelo de las parcelas. A la derecha de cada dato, en cursiva
aparece el error estándar.
T0
T0
NH4+
NO3µg/g de suelo
Ntotal
mg/g de suelo
C Orgánico
µg/g de suelo
5.19 ±0.58
25.78 ±1.49
1.07 ±0.08
0.22 ±0.02
pH
%
8.01 ±0.02
CIC
Potasio
Calcio
Magnesio
Fósforo
meq/100g de suelo
µg/g de suelo
µg/g de suelo
µg/g de suelo
µg/g de suelo
31.30 ±2.03
125.0 ±0.00
5649.7 ±101.6
260.9 ±5.22
18.33 ±2.27
La textura y la CRM se midieron únicamente en el primer muestreo. La CRM resultó
ser de 0.36 mL/g de suelo y la textura franco arcillosa arenosa, con un porcentaje de 53 % de
arcilla, 24 % de limos y 23 % de arena.
5.3.1.b. Actividades potenciales de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2
La caracterización biológica hace referencia a la actividad de los grupos fisiológicos
del ciclo del nitrógeno y a la actividad biológica total medida como producción de CO2. Los
resultados obtenidos corresponden a actividades potenciales y éstos aparecen en la Tabla
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.XIV. Todos ellos son el resultado de la media aritmética de tres réplicas y tres repeticiones
por réplica.
Tabla 5.XIV. Actividades potenciales de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2. A
la derecha de cada dato, en cursiva, aparece el error estándar.
ARA
T0
nmol etileno/g h
µg NH4+/g de suelo día
Amonificación Nitrificación
µg NO3-/g suelo día
Desnitrificación
nmol N2O/g suelo h
CO2
nmol CO2/g suelo h
2.12 ±0.05
57.66 ±5.00
3.54 ±0.20
2.12 ±0.05
33.83 ±1.58
Estos resultados se utilizaron como datos de Tiempo cero, antes de sembrar en dicho
suelo, las variedades objeto de estudio.
5.3.2. Efectos de las dos variedades de V. villosa sobre los parámetros fisicoquímicos
edáficos durante el ciclo fenológico de las plantas
Los resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos se exponen a continuación.
En ellos aparecen cuatro tratamientos: suelo bajo la influencia de la variedad Namoi; suelo
bajo la influencia de Látigo y dos controles. Los controles son iguales en todos los momentos
de muestreo salvo en floración, debido a que existía un desfase temporal entre la floración de
una y otra variedad.
5.3.2.a. Nitrógeno amonio
Las concentraciones de amonio se muestran en el Apéndice 3, Tabla I y en la Figura
5.20. El ANOVA bidireccional con réplicas de muestra que existen diferencias significativas
entre tratamientos (F=10.80; P=0.00), tiempos de muestreo (F=142.47; P=0.00) y en la
interacción (F=6.52; P=0.00). La tendencia general de los cuatro tratamientos es la misma.
Las concentraciones de amonio en el suelo descienden de forma significativa de T0 al período
vegetativo de la planta. A continuación en floración, estos niveles aumentan, hecho más
destacable en el caso del control de Namoi en el que llegan a recuperarse los valores de T0.
En fructificación los niveles vuelven a descender, igualándose las concentraciones en este
momento con las del período vegetativo. Finalmente, tras enterrar la planta los niveles de
173
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
amonio aumentan en todos los tratamientos, pero especialmente en los controles y en el suelo
en el que se enterró la variedad Namoi. Sin embargo, el incremento de amonio en el suelo en
el que se enterró Látigo es significativamente menor que en el resto de los tratamientos.
µg/g de suelo
8
6
Control Namoi a-b-a-b-c
Namoi a-b-c-b-d
Control Látigo a-b-c-b-d
Látigo a-b-b-b-c
4
2
0
T0
Vegetativo
aaaa
Floración
baaa
Fructificación
aaaa
T4
aaab
Figura 5.20. Resultados de amonio (µg/ g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.b. Nitrógeno nitrato
Los resultados de las concentraciones de nitrato en los cinco momentos de muestreo
se muestran en el Apéndice 3, Tabla II y en la Figura 5.21. El ANOVA mostró diferencias
significativas entre tratamientos (F=23.01; P=0.00), momentos de muestreo (F=352.67;
P=0.00) y en la interacción (F=28.98; P=0.00). Las concentraciones de nitrato descienden
significativamente durante el período vegetativo. En floración Namoi y su control se
mantienen, mientras que Látigo y su control aumentan de forma significativa. Esta respuesta
distinta en floración provoca diferencias significativas entre estos dos grupos de tratamientos.
En fructificación, las concentraciones de nitrato aumentan en todos los tratamientos salvo en
174
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
el suelo bajo la influencia de la variedad Látigo. En este momento de muestreo, los suelos
control presentan concentraciones significativamente mayores que los suelos bajo la
influencia de las plantas. Tras enterrar las plantas, el aumento de nitrato es significativamente
mayor en los suelos donde se enterraron las plantas, fundamentalmente en el suelo donde se
enterró la variedad Látigo.
80
µg/g de suelo
60
Control Namoi a-b-b-a-c
Namoi a-b-b-c-d
Control Látigo a-b-c-a-d
Látigo a-b-c-d-e
40
20
0
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
bbaa
abab
T4
acab
Figura 5.21. Resultados de nitrato (µg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.c. Nitrógeno total
Las concentraciones de nitrógeno total aparecen en el Apéndice 3, Tabla III y en la
Figura 5.22. El ANOVA unidireccional detectó diferencias significativas entre tratamientos
en floración y fructificación y entre tiempos en todos los tratamientos. Los niveles de
nitrógeno en el suelo se mantienen durante el período vegetativo; en floración disminuyen
significativamente en todos los tratamientos. En el suelo bajo la influencia de Látigo, esta
bajada es significativamente menor que en el resto de los tratamientos. En fructificación los
niveles de nitrógeno total aumentan, especialmente en los suelos bajo la influencia de las
plantas, donde las concentraciones de nitrógeno alcanzan de nuevo los valores de T0. En T4,
175
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
los niveles de nitrógeno se igualan en todos los tratamientos, puesto que sufren una
disminución significativa en los suelos bajo la influencia de las plantas y un descenso menos
acusado (no significativo) en el caso de los suelos control.
1,4
mg/g de suelo
1,2
1
Control Namoi a-a-b-c-bc
Namoi a-a-b-a-c
Control Látigo a-a-b-c-bc
Látigo a-a-b-a-b
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T0
Vegetativo
aaaa
Floración
aaab
Fructificación
abab
T4
aaaa
Figura 5.22. Resultados de nitrógeno total (mg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de
V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.d. Carbono orgánico
El porcentaje de carbono orgánico de los suelos en los cinco momentos de muestreo
aparecen en el Apéndice 3, Tabla IV y en la Figura 5.23. Los ANOVAs unidireccionales no
muestran diferencias significativas ni entre tiempos ni entre tratamientos. En la Figura 5.23 se
puede observar que los niveles de carbono orgánico en los suelos control se mantienen
estables a lo largo del experimento, con una ligera disminución durante el período vegetativo,
la floración y la fructificación. En los suelos bajo la influencia de las plantas se produce
también un descenso en floración, aunque como ya se ha indicado, las diferencias entre
tiempos no resultaron significativas.
176
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
0,3
0,25
%
0,2
Control Namoi a-a-a-a-a
Namoi a-a-a-a-a
Control Látigo a-a-a-a-a
Látigo a-a-a-a-a
0,15
0,1
0,05
0
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
aaaa
aaaa
T4
aaaa
Figura 5.23. Resultados de carbono orgánico (%) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa
y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.e. pH
Los resultados de pH de los suelos se muestran en el Apéndice 3, Tabla V y en la
Figura 5.24. El pH del suelo se mantiene a lo largo del experimento en valores básicos,
variando entre 7.88 y 8.30. El ANOVA bidireccional con réplicas muestra diferencias
significativas entre tratamientos (F=5.87; P=0.00), tiempos de muestreo (F=28.68; P=0.00) y
en la interacción (F=7.47; P=0.00). En el segundo muestreo, el pH aumenta, de forma
significativa en todos los tratamientos. Paralelamente, la tendencia general es una
disminución del pH, con variaciones más acusadas bajo la variedad Látigo (especialmente en
floración); las diferencias entre fructificación y T0 no fueron significativas.
177
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
9
Unidades de pH
8,5
Control Namoi a-b-b-c-ac
Namoi ad-b-bc-ac-d
Control Látigo a-b-a-c-ac
Látigo a-b-c-a-a
8
7,5
7
T0
Vegetativo
acab
Floración Fructificación
bbac
abab
T4
aaaa
Figura 5.24. Resultados de pH en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en
los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras que indican la
significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre
tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.f. Capacidad de intercambio catiónico (CIC)
La CIC de los suelos en los cinco momentos de muestreo aparecen en el Apéndice 3,
Tabla VI y en la Figura 5.25. La CIC baja significativamente en todos los tratamientos en el
segundo muestreo. Posteriormente se aprecia una recuperación desde el período vegetativo
hasta el final del experimento, aunque las diferencias no son significativas. Cabe destacar que
la capacidad de intercambio del suelo bajo la influencia de la variedad Namoi es
significativamente menor que la del resto de los suelos en el segundo muestreo y que
posteriormente aumenta, llegando en T4 a superar, aunque no de forma significativa a los
controles.
178
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
35
meq/g de suelo
30
Control Namoi a-b-b-b-b
Namoi a-b-b-b-b
Control Látigo a-b-b-b-b
Látigo a-b-b-b-b
25
20
15
10
T0
Vegetativo
abaa
Floración
aa aa
Fructificación
aaaa
T4
aaaa
Figura 5.25. Resultados de CIC (meq/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa
y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.g. Potasio
Los resultados de concentración de potasio en los suelos en los cinco momentos de
muestreo aparecen en el Apéndice 3, Tabla VII y en la Figura 5.26. El ANOVA bidireccional
con réplicas mostró diferencias significativas entre tratamientos (F= 4.12; P=0.01), entre
tiempos de muestreo (F=33.40; P=0.00) y en la interacción (F=3.22; P=0.00). Los niveles de
potasio bajan al empezar el experimento sin llegar a recuperarse en ningún caso, salvo en el
suelo bajo la influencia de Látigo en T4. Látigo parece afectar de forma distinta a las
concentraciones de este nutriente que el resto de los tratamientos, puesto que la subida, que se
detecta en todos los suelos, en floración es significativamente mayor en este suelo. En
fructificación desciende, igualándose al resto de los suelos, y después de enterrar la planta, los
niveles de potasio vuelven a subir significativamente a diferencia del resto de los suelos que
sufren un descenso no significativo.
179
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
µg/g de suelo
127
107
Control Namoi a-b-b-b-b
Namoi a-b-b-b-b
Control Látigo a-bc-b-bc-c
Látigo a-b-a-c-a
87
67
47
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
a a ab b
aaaa
T4
aaab
Figura 5.26. Resultados de potasio (µg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.h. Calcio
La concentración de calcio en los suelos en los cinco momentos de muestreo aparecen
en el Apéndice 3, Tabla VIII y en la Figura 5.27. Las concentraciones de calcio no varían
significativamente entre momentos de muestreo ni entre tratamientos dentro de cada tiempo,
salvo el suelo donde se enterró Namoi (T4). En este suelo, la concentración de calcio
desciende significativamente respecto a las de muestreos anteriores y frente al resto de los
tratamientos.
180
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
6000
µg/g de suelo
5500
Control Namoi a-a-a-a-a
Namoi a-a-a-a-b
Control Látigo a-a-a-a-a
Látigo a-a-a-a-a
5000
4500
4000
T0
Vegetativo Floración Fructificación
T4
aaaa
aaaa
aaaa
abaa
Figura 5.27. Resultados de calcio (µg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa
y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras que
indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.i. Magnesio
La concentración de magnesio en los suelos en los cinco momentos de muestreo
aparecen en el Apéndice 3, Tabla IX y en la Figura 5.28. Los tratamientos no muestran
diferencias significativas entre sí en cada momento de muestreo. Las concentraciones de
magnesio descienden de forma significativa en todos los suelos de T0 al segundo muestreo,
posteriormente se mantienen, para descender de forma significativa después de enterrar las
plantas.
181
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
300
µg/g de suelo
250
Control Namoi a-b-b-b-c
Namoi a-b-b-b-c
Control Látigo a-bc-b-c-d
Látigo a-b-b-b-c
200
150
100
50
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
aaaa
aaaa
T4
aaaa
Figura 5.28. Resultados de magnesio (µg/g de suelo) en los donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
los controles suelos en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras
que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de
muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.2.j. Fósforo
La concentración de fósforo en los suelos en los cinco momentos de muestreo
aparecen en el Apéndice 3, Tabla X y en la Figura 5.29. Las concentraciones de este nutriente
descienden significativamente durante el estado vegetativo de la planta, siendo mayor este
descenso en el suelo bajo las plantas que en los controles. Posteriormente los niveles se
mantienen estables hasta el final de la experiencia.
182
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
20
µg/g de suelo
15
Control Namoi a-b-b-b-b
Namoi a-b-b-b-b
Control Látigo a-b-b-b-b
Látigo a-b-b-b-b
10
5
0
T0
Vegetativo
a b a ab
Floración
aaaa
Fructificación
aaaa
T4
aaaa
Figura 5.29. Resultados de fósforo (µg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada
momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
5.3.3. Análisis de componentes principales realizado con las variables fisicoquímicas
analizadas durante el experimento
Con los datos de los resultados fisicoquímicos, obtenidos en los muestreos, excluido
el tiempo cero, se hizo un análisis de componentes principales (ACP) (Figura 5.30), y la
varianza absorbida por los dos primeros ejes se muestra en la Tabla 5.XV.
Tabla 5.XV. Porcentaje de varianza absorbido por los ejes
%Varianza
% Acumulada
Eje I
96.827
96.827
Eje II
2.882
99.709
183
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.XVI. Es destacable el
agrupamiento de los puntos correspondientes a T4, que quedan situados hacia los valores más
bajos del eje I. Sobre este eje, el factor de carga con más peso es el magnesio, así las muestras
con mayores concentraciones de magnesio aparecen hacia los valores más altos de este eje.
De esta forma, aparecen agrupados no solo los muestreos de T4, sino también los de floración
de Látigo y su control, que lo hacen hacia los valores más altos del primer eje. Otros factores
determinantes en la agrupación de las muestras son el nitrato y el potasio. Las muestras del
período vegetativo aparecen agrupadas hacia los valores más positivos del eje II y I. En ellas
podemos observar que los controles se desplazan ligeramente con respecto a los suelos bajo la
influencia de las plantas debido sobre todo a una mayor concentración de magnesio y potasio.
Por tanto, se puede concluir que los suelos en tiempo 4 se agrupan debido a las bajas
concentraciones de magnesio y potasio y a altas de nitratos, y los muestreos de floración de
Látigo y su control, sobre todo por las elevadas concentraciones de magnesio y potasio. Por
último, las muestras del período vegetativo se separan del resto por ser las que poseen las
menores concentraciones de nitrato y amonio así como de magnesio.
Tabla 5.XVI. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
Amonio
-1.824
0.428
Nitrato
-15.678
-9.545
Nitrógeno Total
0.084
0.078
CO
-0.011
0.006
pH
0.053
0.062
CIC
-0.539
-0.988
Potasio
2.028
-13.558
Calcio
0.087
-0.052
Magnesio
29.354
-4.153
Fósforo
0.235
0.062
184
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
10
C Lat Veg
C Nam Veg
Lat Veg
Nam Veg
Lat Fr
C Nam Fl
Nam Fl
C Lat Fl
Nam Fr
0
Lat Fl
Eje II
C Lat Fr
C Nam Fr
-10
C Lat T4
C Nam T4
Nam T4
-20
Lat T4
-30
30
40
50
60
Eje I
Figura 5.30. Representación de las muestras según el ACP efectuado con los resultados fisicoquímicos, sobre
los dos primeros ejes.
185
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.3.4. Efecto de las dos variedades de V. villosa sobre los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno y producción de CO2 a nivel edáfico
5.3.4.a. ARA potencial
Los resultados de ARA potencial aparecen en el Apéndice 3, Tabla XI y en la Figura
5.31. El ANOVA reveló diferencias significativas entre tratamientos (F=5.54; P=0.00),
tiempos de muestreo (F=252.76; P=0.00) y en la interacción (F=6.34; P=0.00). En todos los
casos el valor de ARA potencial desciende en el segundo muestreo. En floración, Látigo y su
control aumentan significativamente, aumento que en el caso de Namoi y su control se retrasa
al período fructificación. En dicho período los suelos bajo la influencia de Látigo
experimentan un acusado descenso del ARA y mantienen estos niveles hasta T4. El control de
Látigo mantiene su actividad durante la fructificación y baja como en el suelo de Namoi y su
control en T4. En el último muestreo, el ARA entre los distintos tratamientos no difiere
significativamente.
nmol etileno/g de suelo h
15
10
Control Namoi a-b-b-c-b
Namoi a-b-b-c-b
Control Látigo a-b-c-c-b
Látigo a-b-b-c-b
5
0
T0
Vegetativo
aa aa
Floración
b b aa
Fructificación
a b a ab
T4
aa aa
Figura 5.31. Resultados del ARA potencial (nmol de etileno/g de suelo y hora) en los suelos donde crecieron
las dos variedades de V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el
eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias
significativas.
186
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
5.3.4.b. Amonificación potencial
Los resultados del potencial amonificante se muestran en el Apéndice 3, Tabla XII y
en la Figura 5.32. El ANOVA bidireccional con réplicas reveló diferencias significativas
entre tratamientos (F= 8.88; P=0.00), tiempos de muestreo (F=11.66; P=0.00) y en la
interacción (F=2.29; P=0.03). Todos los tratamientos siguen la misma tendencia a excepción
del control de Látigo que no presenta variaciones significativas. El resto de los tratamientos
experimentan una subida significativa en floración para descender posteriormente en
fructificación, manteniéndose los niveles después de enterrar las plantas. El potencial
amonificante es significativamente mayor en los suelos control que en los suelos bajo la
influencia de las plantas, a excepción del control de Látigo en floración, que no difiere de los
tratamientos con las variedades de V. villosa.
4
µg NH+ /g de suelo día
87
67
Control Namoi ac-a-b-ac-c
Namoi ab-b-a-b-b
Control Látigo a-a-a-a-a
Látigo ab-ac-b-ac-c
47
27
7
T0
Vegetativo
abab
Floración Fructificación
baaa
abab
T4
abab
Figura 5.32. Resultados del potencial amonificante (µg NH4+/g de suelo y día) en los suelos donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el
eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias
significativas.
5.3.4.c. Nitrificación potencial
187
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Los resultados del potencial nitrificante en los cinco momentos de muestreo aparece
en el Apéndice 3, Tabla XIII y en la Figura 5.33. El ANOVA bidireccional con réplicas reveló
diferencias significativas entre tratamientos (F=7.31; P=0.00), tiempos de muestreo (F=23.57;
P=0.00) y en la interacción (F=5.91; P=0.00). Los tratamientos con ambas variedades de veza
provocan un descenso en la nitrificación potencial en el período de crecimiento vegetativo.
Entre dicho período y la fructificación, la actividad nitrificante potencial no varía
significativamente, pese al ligero aumento detectado en floración. Una vez enterradas las
plantas, este potencial aumenta significativamente recuperando los niveles iniciales. El
comportamiento de los suelos control es distinto al de los otros dos tratamientos. El control
de Látigo no varía significativamente a lo largo del experimento, y en el control de Namoi
sólo se detecta un incremento en floración. Los suelos control siempre mantienen niveles de
nitrificación mayores y más estables que los tratados con las plantas salvo en T4, momento en
que los suelos donde se enterraron las plantas presentan una mayor nitrificación
6
Control Namoi ab-ab-b-a-ab
Namoi a-bc-b-c-d
Control Látigo a-a-a-a-a
Látigo a-b-b-b-a
4
3
µg NO- /g
de suelo día
3
8
2
0
T0
Vegetativo
abab
Floración
baaa
Fructificación
abab
T4
abaa
Figura 5.33. Resultados del potencial nitrificante (µg NO3-/g de suelo y día) en los suelos donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el
eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de diferencias
significativas.
5.3.4.d. Potencial desnitrificante
188
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Los resultados del potencial desnitrificante aparecen en el Apéndice 3, Tabla XIV y en
la Figura 5.34. El ANOVA presenta diferencias significativas entre tratamientos (F=5.80;
P=0.00), tiempos de muestreo (F=296.95; P=0.00) y en la interacción (F=5.80; P=0.00).
Durante el segundo tercer y cuarto muestreo no se detectó actividad desnitrificante en ningún
suelo. En T4 se detecta esta actividad, que en el caso de los controles, recupera los niveles de
T0 y en los suelos donde se enterraron las plantas, supera los valores iniciales, siendo más
alta la actividad desnitrificante en el suelo donde se enterró la variedad Látigo.
nmol N2 O/g de suelo h
8
6
Control Namoi a-b-b-b-a
Namoi a-b-b-b-c
Control Látigo a-b-b-b-a
Látigo a-b-b-b-c
4
2
0
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
aaaa
aaaa
T4
abab
Figura 5.34. Resultados del potencial desnitrificante (nmoles de N2O/g de suelo y hora) en los suelos donde
crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo. En la leyenda,
junto a cada tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de
muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de
diferencias significativas.
5.3.4.e. Producción potencial de CO2
Los resultados de la producción de CO2 potencial aparecen en el Apéndice 3, Tabla
XV y en la Figura 5.35. El ANOVA reveló diferencias significativas entre tratamientos
(F=54.71; P=0.00), tiempos de muestreo (F=57.03; P=0.00) y en la interacción (F=12.66;
P=0.00). En los cuatro tratamientos, la producción de CO2 desciende en el segundo muestreo
189
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
y posteriormente aumenta a lo largo de la experiencia hasta la fructificación. Todos los suelos
presentan la máxima producción en fructificación, destacando el suelo bajo la influencia de
las plantas frente a los controles, principalmente el
de la variedad Látigo. En T4 la
producción de CO2 desciende, pero es superior a la de T0 salvo en los controles en los que no
se detectan diferencias significativas entre T0 y T4.
nmol CO2 /g de suelo h
157
Control Namoi ab-a-a-b-ab
Namoi ac-a-a-b-c
Control Látigo ab-a-b-b-ab
Látigo ac-a-a-b-c
107
57
7
T0
Vegetativo
aaaa
Floración Fructificación
bbac
abac
T4
aaab
Figura 5.35. Resultados de la producción de CO2 potencial (nmol de CO2 /g de suelo y hora) en los suelos en
los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los cinco momentos de muestreo.
En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre
momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican
la ausencia de diferencias significativas.
5.3.5. Análisis de componentes principales realizado con los datos de actividad potencial
de los grupos fisiológicos del ciclo del nitrógeno y producción de CO2
Con los datos de los muestreos a excepción del tiempo cero, se hizo un análisis de
componentes principales (ACP) (Figura 5.36), y la varianza absorbida por los dos primeros
ejes aparece en la Tabla 5.XVI.
Tabla 5.XVI. Porcentaje de varianza absorbida por los ejes.
190
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
%Varianza
% Acumulada
Eje I
75.926
75.926
Eje II
23.866
99.792
Los factores de carga en estos dos ejes se indican en la Tabla 5.XVII. La producción
de CO2 es la variable con más peso sobre el eje I. Lo más destacable en la ordenación de las
muestras es la separación de los muestreos correspondientes a los suelos bajo la influencia de
la variedad Látigo en floración, fructificación y T4. Esta distribución viene determinada por la
elevada producción de CO2 en estos suelos. El resto de las muestras se agrupan en los valore
más altos del eje II y más bajos del I
debido a una alta tasa de amonificación potencial.
Tabla 5.XVII. Factores de carga de las variables en los dos primeros ejes.
Eje I
Eje II
ARA
2.291
0.759
Amonificación
-6.263
9.927
Nitrificación
-0.332
-0.071
Desnitrificación
0.549
-0.800
CO2
48.714
1.249
191
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
30
20
C Nam Fl
C Lat Veg
C Nam Veg
Nam Fl
Lat Veg C Lat T4
Nam Veg
C Nam T4
C Lat Fr
C Lat Fl
C Nam Fr
10
Eje II
Nam T4
Lat Fl
0
Nam Fr
Lat T4
-10
-20
Lat Fr
-30
-40
10
20
30
40
Eje I
50
60
70
80
Figura 5.36. Representación de las muestras del ACP efectuado con los resultados de las actividades biológicas,
sobre los dos primeros ejes.
5.3.6. Resultados de las medidas biométricas y bioquímicas de las dos variedades de V.
villosa
Los resultados de la producción de biomasa en los tres momentos de muestreo
aparecen en el Apéndice 3, Tabla XVI y en la Figura 5.37. Los ANOVAs unidireccionales no
muestran diferencias significativas entre las dos variedades salvo en el estado vegetativo. La
biomasa de Namoi es siempre superior a la de Látigo salvo en fructificación. Cabe destacar el
hecho de que Namoi estabiliza la producción de biomasa en floración, mientras Látigo,
incrementa su biomasa de forma significativa de floración a fructificación.
192
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
70
60
g/m2
50
Namoi a-b-b
Látigo a-b-c
40
30
20
10
0
Vegetativo
ab
Floración
aa
Fructificación
aa
2
Figura 5.37. Resultados de la producción de biomasa (g/m ) de las dos variedades de V.
villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento aparecen
letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y en el eje
X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la ausencia de
diferencias significativas.
La concentración de nitrógeno en las raíces (Apéndice 3, Tabla XVII y Figura 5.38)
desciende durante el ciclo biológico de la variedad Látigo, mientras que en Namoi, este
descenso se produce sólo en la transición de floración a fructificación. Los ANOVAs sólo
presentaron diferencias significativas durante el ciclo biológico en ambas variedades.
193
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
30
mg N/g planta
25
20
Namoi a-a-b
Látigo a-ab-b
15
10
5
0
Vegetativo
aa
Floración
aa
Fructificación
aa
Figura 5.38. Resultados de la concentración de nitrógeno en las raíces (mg/g de planta) de
las dos variedades de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de
muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales
indican la ausencia de diferencias significativas.
La concentración de nitrógeno de la parte aérea de las dos variedades de veza aparece
en el Apéndice 3, Tabla XVIII y en la Figura 3.39. Los ANOVAs unidireccionales no
detectan diferencias significativas entre variedades. En ambas la concentración de nitrógeno
se mantiene hasta la floración, y desde este momento hasta la fructificación desciende
significativamente.
194
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
35
30
mg N/g planta
25
Namoi a-a-b
Látigo a-a-b
20
15
10
5
0
Vegetativo
aa
Floración
aa
Fructificación
aa
Figura 5.39. Resultados de la concentración de nitrógeno en la parte aérea (mg/g de planta)
de las dos variedades de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a
cada tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre
momentos de muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos.
Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
El porcentaje de alcaloides en las dos variedades de V. villosa aparecen en el
Apéndice 3, Tabla XIX y en la figura 5.40. Este parámetro difiere claramente en las dos
variedades, no solo en cuanto a concentración, sino a la evolución del mismo a lo largo de la
vida de la planta. El ANOVA bidireccional no muestra diferencias entre variedades (F=1.95;
P=0.19), pero sí entre tiempos (F=48.50; P=0.00) y en la interacción (F=15.69; P=0.00). La
variedad Látigo muestra porcentajes superiores a los de la variedad Namoi en todos los
momentos de muestreo. La concentración de alcaloides en esta variedad disminuye a lo largo
de su ciclo biológico hasta igualarse con el porcentaje de la variedad Namoi en fructificación.
En las plantas de la variedad Namoi, el porcentaje de alcaloides desciende del estado
vegetativo a lafloración. Sin embargo, se produce un aumento significativo en el porcentaje
de alcaloides de floración a fructificación.
195
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
0,04
% de alcaloides
0,03
Namoi a-b-b
Látigo a-b-c
0,02
0,01
0
Vegetativo
ab
Floración
ab
Fructificación
aa
Figura 5.40. Resultados del porcentaje de alcaloides en la parte aérea (%) de las dos
variedades de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de
muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales
indican la ausencia de diferencias significativas.
Los resultados del porcentaje de azúcares aparece en el Apéndice 3, Tabla XX y en la
Figura 5.41. El ANOVA bidireccional con réplicas mostró diferencias significativas entre
variedades (F=8.20; P=0.01), tiempos de muestreo (F=24.02; P=0.00) y en la interacción
(F=7.20; P=0.01). En ambas variedades aumentan el porcentaje de azúcares durante la
floración, siendo éste el único muestreo en el que no existen diferencias entre variedades.
Tanto en estado vegetativo como en fructificación la concentración de azúcares fue mayor en
la variedad Látigo.
196
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
10
% de azúcares
8
Namoi a-b-c
Látigo a-ab-b
6
4
2
0
Vegetativo
ab
Figura 5.41.
Floración
aa
Fructificación
ab
Resultados del porcentaje de azúcares en la parte aérea (%) de las dos
variedades de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de
muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales
indican la ausencia de diferencias significativas.
Los resultados del porcentaje de pentosas aparece en el Apéndice 3, Tabla XXI y en la
Figura 5.42. El ANOVA bidireccional no muestra diferencias entre variedades (F=4.16;
P=0.06) y sí entre tiempos de muestreo (F=40.94; P=0.00) y en la interacción (F=19.16;
P=0.00). El porcentaje de pentosas de la variedad Látigo es superior a la de Namoi en el
primer muestreo, en floración se igualan y en fructificación presenta valores
significativamente menores que Namoi. Ambas variedades presentan su máxima
concentración de pentosas en floración.
197
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
0,8
% de pentosas
0,6
Namoi a-b-c
Látigo a-a-b
0,4
0,2
0
Vegetativo
ab
Figura 5.42.
Floración
aa
Fructificación
ab
Resultados del porcentaje de pentosas en la parte aérea (%) de las dos
variedades de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada
tratamiento aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de
muestreo y en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales
indican la ausencia de diferencias significativas.
Los resultados del porcentaje de FAD aparece en el Apéndice 3, Tabla XXII y en la
Figura 5.43. El ANOVA bidireccional no muestra diferencias entre variedades (F=20.99;
P=0.00) y sí entre tiempos de muestreo (F=79.83; P=0.00) y en la interacción (F=13.39;
P=0.00). La cantidad de FAD fue siempre mayor en la variedad Látigo, estableciéndose
diferencias significativas en el período de floración.
198
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
50
% de FAD
40
Namoi a-a-b
Látigo a-b-b
30
20
10
0
Vegetativo
aa
Floración
ab
Fructificación
aa
Figura 5.43. Resultados del porcentaje de fibra ácido detergente (%) de las dos variedades
de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento
aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y
en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la
ausencia de diferencias significativas.
Los resultados del porcentaje de FND aparece en el Apéndice 3, Tabla XXIII y en la
Figura 5.44. El ANOVA bidireccional muestra diferencias entre variedades (F=6.37; P=0.03)
entre tiempos de muestreo (F=33.97; P=0.00) y en la interacción (F=6.73; P=0.01). Como en
el caso anterior la cantidad de FND fue mayor en la variedad Látigo en estado vegetativo, en
floración, mientras que en fructificación los valores se invierten, pero las diferencias no son
significativas. De nuevo sólo las diferencias en floración fueron significativas.
199
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
60
50
% de FND
40
Namoi a-a-b
Látigo a-b-b
30
20
10
0
Vegetativo
aa
Floración
ab
Fructificación
aa
Figura 5.44 Resultados del porcentaje de fibra neutro detergente (%) de las dos variedades
de V. villosa en los tres momentos de muestreo. En la leyenda, junto a cada tratamiento
aparecen letras que indican la significación de las diferencias entre momentos de muestreo y
en el eje X, bajo cada momento de muestreo entre tratamientos. Letras iguales indican la
ausencia de diferencias significativas.
5.3.7. Resultados de los análisis bioquímicos efectuados a los frutos de las dos
variedades de V. villosa
Los resultados del porcentaje de alcaloides, azúcares, pentosas y concentración de
nitrógeno en los frutos y semillas de las dos variedades de V. villosa aparecen en la Tablas
5.XVIII. Todos ellos son el resultado de la media de tres réplicas.
200
Estudio de las rizobacterias de V.villosa: optimización de la productividad.- RESULTADOS
Tabla 5.XVIII. Resultados del porcentaje de alcaloides, azúcares, pentosas y concentración
de nitrógeno en los frutos y semillas de las dos variedades de V. villosa. A la derecha de cada
dato, en cursiva, aparece el error estándar y una letra que indica la significación de las
diferencias entre variedades.
NAMOI
%
Frutos
LÁTIGO
Semillas
Alcaloides 0.005 ±0.0006 0.007 ±0.0006
(%)
a
a
Azúcares 5.52 ±0.36 a
6.29 ±0.58 a
(%)
Pentosas
0.53 ±0.04 a
0.51 ±0.04 a
(%)
N
13.33 ±1.37 a 15.11 ±0.18 a
(mg/g)
Frutos
Semillas
0.007 ±0.0005 0.009 ±0.001 a
a
8.96 ±2.00 a
5.82 ±0.21 a
0.83 ±0.18 a
0.51 ±0.04 a
16.44 ±1.61 a
17.11 ±0.48 b
Únicamente aparecen diferencias significativas en lo referente a la concentración de
nitrógeno entre las semillas de ambas variedades, siendo Látigo la variedad con mayor
concentración.
201
6. DISCUSIÓN DEL ANÁLISIS DE LA RIZOSFERA DE
V. villosa
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
En este trabajo se realiza un estudio sobre la composición rizobacteriana y los
cambios, a lo largo del ciclo fenológico de la planta, de los géneros bacterianos asociados a la
rizosfera de V. villosa, así como su función en el ciclo del nitrógeno.
En la caracterización de los suelos ensayados se han incluido parámetros generales,
pero íntimamente relacionados con la dinámica del nitrógeno, como el nitrógeno total o el
carbono orgánico, apropiados para considerar la cantidad y naturaleza de la materia orgánica
presente en el sustrato. Se han incluido también parámetros más específicos como el
nitrógeno amonio y nitrógeno nitrato. Ambos compuestos pueden aportar información sobre
la actividad biológica de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno, bien porque los
utilizan como fuente energética para su desarrollo o porque los producen mediante su
actividad metabólica.
El método seguido para el aislamiento bacteriano, mediante suspensiones diluciones y
posterior siembra de los mismos en medios enriquecidos, es un procedimiento estándar en los
estudios de microbiología del suelo (Probanza et al., 1996; Gutiérrez Mañero et al., 1996).
Debido a la complejidad y variabilidad del ambiente radical, ningún medio de cultivo es lo
suficientemente complejo para el crecimiento de todas las especies edáficas, puesto que se
desconocen los requerimientos nutricionales de muchas cepas. Por tanto, cuando hablamos
del total de bacterias en la muestra de suelo nos referimos a una fracción del total. Sin
embargo, al ser éste un método seguido por muchos investigadores podemos comparar
nuestros datos con los obtenidos por otros autores.
Para la determinación de los géneros bacterianos, se siguió el esquema diagnóstico de
Acero et al. (1994), que se desarrolla mediante pruebas bioquímicas y siembra en medios de
cultivo selectivos.
Bacillus y Pseudomonas aparecen en este estudio como géneros predominantes en la
rizosfera de V. villosa. Considerando globalmente los análisis realizados en todas las parcelas
y momentos de muestreo, las cepas pertenecientes a ambos géneros bacterianos superan el 50
% del total de las cepas muestreadas, y de estos géneros, Pseudomonas representa el 31 % del
total. Las bacterias Gram negativas, especialmente especies del género Pseudomonas, son por
lo general las rizobacterias más abundantes (Kloepper, 1993). Mientras que los bacilos Gram
positivos esporulados y no esporulados, así como los cocos Gram positivos no esporulados
son menos abundantes en esta zona (Rovira et al., 1974; Campbell, 1985). Otros autores
como Chan et al. (1963), Gómez y Sargadoy (1985), Salerno y Sargadoy (1990) han indicado
que Bacillus es mayoritaria en el espacio no rizosférico. Bowen y Foster (1978), observan que
203
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
Pseudomonas sp. en la interfase raíz-suelo tiene una generación de 5.2 h, mientras que
Bacillus sp. cada 39 h. Podemos por lo tanto sugerir que, cuando las condiciones de humedad,
temperatura y nutricionales son las adecuadas Pseudomonas presenta una tasa de crecimiento
mayor que la de Bacillus. Según Frederickson y Elliott (1985) y Bolton et al. (1993)
Pseudomonas es muy competitiva en el ambiente rizosférico debido a su versatilidad
metabólica. Por ejemplo, varias especies de este género encontradas en ambientes rizosféricos
presentan en sus membranas enzimas capaces de la conversión extracelular de glucosa en
gluconato y 2-cetogluconato (Gottschalk, 1986) que permiten su incorporación en rutas
alternativas a la glicolisis. La incapacidad de la mayor parte de los microorganismos para
utilizar estos compuestos confieren a las Pseudomonas una considerable ventaja competitiva
(Murphy et al. 1995). Nuestros resultados coinciden con los de Kloepper (1993), si bien
encontramos una alternancia a lo largo del ciclo fenológico de la planta que responde a
factores que trataremos a continuación.
La mayor parte de los géneros bacterianos encontrados en la rizosfera de V. villosa
muestran variaciones durante el ciclo fenológico de las plantas. Son muchos los factores,
tanto bióticos como abióticos que influyen en la dinámica de exudación radical y que, por lo
tanto, alteran la composición bacteriana rizosférica (Grayston et al., 1996). Nuestros
resultados muestran cómo durante la fructificación aumenta considerablemente el número de
géneros bacterianos presentes en la rizosfera de V. villosa. Además, en este momento se
produce un acusado descenso del género Bacillus. Estos resultados sugieren una alteración de
la composición cualitativa y cuantitativa de los productos liberados por las raíces. Entre los
factores que más afectan a la exudación radical podemos citar la edad y el estado de
desarrollo de la planta (Hale et al., 1978). Las variaciones de los patrones de exudación según
el estado fenológico de la planta (Waschütza et al., 1992; Mozafar et al., 1992), puede
modificar los patrones de crecimiento de la población rizosférica así como su actividad
fisiológica (Griffin et al., 1976; Foster, 1982; Newman, 1985). Hay que tener en cuenta que
cuando hablamos de exudación nos referimos en conjunto a productos liberados por secreción
activa (Hale et al., 1978) y pasiva, exudados propiamente dichos (Bowen y Rovira, 1991) y
lisados, productos liberados por autolisis y necrosis celular (Whipps, 1990). Precisamente,
estos últimos pueden aumentar considerablemente durante el período de fructificación debido
a los fuertes procesos necróticos que se producen durante esta etapa del crecimiento de la
planta, como así lo indicaban los reconocimientos visuales durante el muestreo y la nula
actividad reductora de acetileno encontrada en los nódulos de las plantas, a diferencia de los
204
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
dos muestreos anteriores en los que se encontraron valores de 7543.63 nmol etileno/g de
suelo h en el vegetativo y 8795.4767 nmol etileno/g de suelo h en floración. Este cambio en la
exudación radical, afecta no sólo a la densidad de la población bacteriana, sino también a su
actividad fisiológica (Marschner y Crowley, 1996).
El aumento en la producción de antibióticos y sideróforos por parte de ciertas cepas
rizobacterianas, tiene una influencia decisiva en los fenómenos de competencia (Marschner y
Crowley, 1996). Este hecho explicaría, en parte, el descenso del número de cepas
pertenecientes al género Bacillus encontrados en este momento de muestreo (Oliveira et al.,
1995). Por otra parte, conviene considerar la influencia de factores abióticos como pH,
temperatura, disponibilidad de agua y concentración de oxígeno. Los muestreos durante el
período de fructificación se realizan en la época en que la evapotranspiración potencial se
aproxima a la precipitación, es decir, justo antes de entrar en el período de sequía. En estas
condiciones se favorece la aparición de microambientes aerobios, con unas condiciones de
humedad y temperatura muy apropiadas para el desarrollo de microorganismos con alta tasa
de crecimiento y al mismo tiempo favorable al desarrollo de un gran número de
microorganismos. En estas condiciones Pseudomonas compite favorablemente frente a
Bacillus, así como el resto de los géneros bacterianos encontrados, que como ya se indicó
anteriormente, aumentan durante este período. La ausencia de variaciones en la concentración
de carbono orgánico y nitrógeno total sugieren que los cambios en los patrones de exudación
son fundamentalmente cualitativos, hecho ya comentado por diversos autores en otras
especies tanto herbáceas (Hamlen et al., 1972), como leñosas (Smith, 1976).
La capacidad de las especies del género Bacillus para esporular cuando las
condiciones ambientales son poco favorables, nos permite suponer que la población de
Bacillus permanecería constante a lo largo del año, sin embargo, como ya se indicó
anteriormente, se observa un acusado descenso durante fructificación. Dicho descenso podría
estar motivado entre otros factores por una predación por parte de nemátodos y otros
organismos presentes en la rizosfera (Griffiths, 1986).
Pseudomonas muestra una estabilidad poblacional a lo largo de todo el ciclo biológico
de la planta. Dicha estabilidad indica una acomodación a los factores tanto bióticos como
abióticos, que mediante su interacción modifican la densidad de las distintas poblaciones
bacterianas. Las bacterias de este género tienen una importancia vital en los procesos de
antagonismo microbiano y en la regulación de la composición de la comunidad edáfica,
debido a su capacidad para sintetizar y liberar metabolitos capaces de inhibir el crecimiento
205
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
de otros microorganismos, como por ejemplo sideróforos (Marschner y Crowley, 1997) y
antibióticos (Kropp et al., 1996). Por ello, es notable su importancia en la eliminación de
patógenos o microorganismos deletéreos de plantas. Es posible que la estabilidad de
Pseudomonas se relacione con el hecho de poder eliminar competidores mediante la
producción de tales sustancias. No obstante, a este género pertenecen la mayor parte de las
bacterias DRBs identificadas hasta el momento. Bakker y Schippers (1987) proponen que la
producción de cianhídrico es uno de los principales factores de inhibición encontrados en
bacterias deletéreas. Su hipótesis se basa en el hecho de que el 50 % de las Pseudomonas
rizosféricas estudiadas por ellos, producen cianhídrico in vitro.
El género Erwinia, que se ha citado en la rizosfera de distintas plantas (Lievens et al.,
1989),
incluye
potencialmente
especies
patógenas
(Kloepper,
1983)
y
aparece
fundamentalmente en floración y fructificación, momentos en los que en general se
desarrollan los procesos infecciosos. Lo mismo podemos decir del género Xanthomonas, que
aparece en fructificación y que también incluye especies fitopatógenas. Componentes de los
exudados pueden afectar directamente la expresión de genes implicados en la simbiosis y
patogeneidad (Peters et al., 1986; Redmond et al., 1986; Shearman et al., 1986 y Zaat et al.,
1987).
Todas las cepas estudiadas tienen la capacidad de comportarse como amonificantes.
Este dato confirma lo ya indicado por otros autores en el sentido de que la rizosfera de las
plantas diazotrofas es rica en nitrógeno fácilmente mineralizable (Gutiérrez Mañero et al.,
1994). Estudios recientes con la técnica de
15
N han demostrado el papel decisivo de los
microorganismos edáficos en la movilización y transferencia del nitrógeno fijado por
leguminosas en la rizosfera (Van Kessel et al., 1985). Por tanto, la disponibilidad de estos
compuestos y el proceso de adaptación natural que tiene lugar en la rizosfera pueden
contribuir al hecho de que todas las cepas aisladas en este estudio fueran amonificantes. Los
resultados obtenidos respaldan la teoría de que la planta selecciona sus bacterias rizosféricas
(Wiehe y Höflich, 1995b); y probablemente en esta selección tiene mayor importancia la
compatibilidad metabólica, propuesta por Hall y Chanway (1992), que la coexistencia natural
propuesta por Sumner (1990).
El análisis de las actividades funcionales del ciclo del nitrógeno de las cepas
muestreadas revela datos importantes sobre el papel de las cepas mayoritarias en la rizosfera
de V. villosa. Aproximadamente la mitad de las cepas fueron capaces de realizar otra
actividad además de la amonificación. Dichas actividades (fijación de nitrógeno aerobia y
206
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
anaerobia y desnitrificación) requieren condiciones similares: un elevado contenido de
materia orgánica y presiones bajas de O2. Nuestros resultados son indicadores del tipo de
mineralización que se produce a este nivel. La estructura edáfica y la humedad determinan la
aparición de microespacios aerobios y anaerobios que permiten la actividad de bacterias
aerobias, anaerobias y microaerófilas, predominando un tipo de mineralización aerobia. Los
resultados confirman lo ya indicado por otros autores: el suelo es un sistema de gran
complejidad en el que las interacciones biológicas, junto con el sustrato físico, condicionan la
aparición de hábitats de características muy distintas, incluso opuestas, que pueden coexistir,
permitiendo el desarrollo de organismos con metabolismo y requerimientos diferentes.
La considerable densidad de bacterias capaces de realizar exclusivamente la
amonificación durante la fructificación, va acompañada de una menor densidad de
microorganismos de otros grupos funcionales del ciclo del nitrógeno, lo cual sólo puede ser
explicado por relaciones de competencia. Por otro lado, durante el período vegetativo la
densidad de bacterias desnitrificantes es apreciablemente superior que en floración y
fructificación. Struwe y Kjoller (1990) encuentran Bacillus y Pseudomonas capaces de
desnitrificar siendo más abundante este último género. Nuestros resultados indican
claramente que el principal género responsable de la desnitrificación en la rizosfera de V.
villosa es Bacillus. Durante el período vegetativo el 32 % de los Bacillus encontrados eran
capaces de desnitrificar; sin embargo, sólo el 19 % de las Pseudomonas presentes en la
rizosfera eran capaces de realizar el proceso. Por este motivo la caída en la densidad de
Bacillus durante el período de fructificación conduce a una disminución de la desnitrificación
en el sistema rizosférico de V. villosa.
A pesar de que todas las bacterias pertenecientes a los géneros Pseudomonas y
Bacillus muestran actividad amonificante en todas las épocas de muestreo hay una diferencia
cualitativa importante entre el período de fructificación y el resto. Durante el período
vegetativo y de floración aparecen cepas que además de amonificar, desnitrifican y las
bacterias fijadoras de nitrógeno aerobias y anaerobias alcanzan sus máximas densidades.
Estos datos indican un cambio en el tipo de mineralización durante la fructificación. Mientras
que en período vegetativo y floración el metabolismo debe ser básicamente microaerófilo, en
fructificación la variedad de microhábitats aumenta lo que permite la aparición de zonas
aerobias, anaerobias y microaerófilas. Estos datos concuerdan con los anteriormente
comentados, disminución de Bacillus durante el período de fructificación, con la consiguiente
pérdida de actividad desnitrificante.
207
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
La floración es la etapa del desarrollo de la planta en cuya rizosfera encontramos el
mayor número de cepas capaces de realizar simultáneamente más funciones dentro del ciclo
del nitrógeno, coincidiendo con el aumento más llamativo en el número de bacterias
Coryneformes. Sin embargo, dichas bacterias aparecen bien representadas durante el período
vegetativo y fructificación por lo que no podemos inferir ninguna deducción al respecto.
Los resultados obtenidos en el estudio de los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno deben ser tomados con las debidas precauciones, ya que una bacteria aislada en
medios de cultivo sintéticos puede mostrar actividades difíciles de interpretar en su sustrato
natural si consideramos dichas actividades simultáneamente. Ahora bien, no cabe duda de que
si muestra su capacidad metabólica in vitro, en condiciones naturales puede realizarla aunque
no entremos a considerar en que medida.
La clasificación e identificación de las cepas rizosféricas ha constituido históricamente
un problema, debido a que en muchas ocasiones los métodos bioquímicos tradicionales no
permitían diferenciar cepas de una misma especie aún con diferentes capacidades
metabólicas. En el ambiente rizosférico el papel fisiológico de las cepas bacterianas es
función de sus capacidades metabólicas, lo que a su vez puede venir determinado por
procesos de adaptación, constituyendo una ventaja competitiva (Martin-Kearley et al., 1994).
Este hecho es frecuente por la fuerte presión que impone el ambiente radical en los procesos
de adaptación y selección y de manera directa o indirecta puede alterar decisivamente la
fisiología de las plantas (van Overbeek y van Elsas, 1992).
La información bioquímica que proporcionan las pruebas taxonómicas clásicas (Gram,
capacidad de esporulación, capacidad de crecer en aerobiosis, morfología celular y de la
colonia o respuesta a test bioquímicos), es útil para obtener información sobre la fisiología de
los microorganismos, y a través de ésta de su interacción con el ambiente. Sin embargo,
numerosos estudios revelan una diversidad genética elevada entre cepas cuyas características,
permiten integrarlas dentro de una misma especie (Selander et al., 1986). Estas características
bioquímicas y morfológicas se han conservado, mientras ha habido una divergencia de su
ADN y de la secuencia de aminoácidos (Bell y Friedman, 1994). Este hecho es habitual entre
los saprófitos del suelo, por ello, parece imprescindible el uso de técnicas genéticas que nos
permitan diferenciar cepas rizosféricas de la misma especie. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1985) se ha convertido en una útil herramienta en estudios de
microecología. Las aplicaciones de la PCR han aumentado considerablemente en estos
últimos años. Una de estas aplicaciones consiste en la amplificación del ADN con cebadores
208
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
(“primers”) de secuencia arbitraria, de forma que la amplificación rinde fragmentos de ADN
de un peso molecular característico del genoma objeto de estudio. Welsh y McClelland
(1990) y Williams et al. (1990) desarrollaron este método de forma independiente y
simultánea y se ha denominado RAPDs. El patrón de bandas resultante de la amplificación
genómica es altamente reproducible y puede ser utilizado como “huella dactilar” para: a)
identificación de variedades y determinación de parentescos (Welsh et al., 1991a, 1992); b)
mapeo genético, ya que responde a una genética mendeliana (Williams et al., 1990 y Welsh et
al., 1991b) y c) para generar árboles filogenéticos, especialmente a nivel intraespecífico
(Welsh et al., 1992).
Son abundantes los estudios sobre la fiabilidad del método RAPDs-PCR (Meunier y
Grimont, 1993). Uno de los aspectos sobre los que más se ha incidido es en la
reproducibilidad del método. Este problema ha sido estudiado en profundidad por
McClelland
y Welsh
(1994).
La
variabilidad
intraexperimental
puede
centrarse
fundamentalmente en la inadecuada purificación del ADN. La resolución de este problema
pasa por comprobar la repetitividad de los resultados sobre una serie de diluciones de ADN
(McClelland y Welsh, 1994). Por esta razón es conveniente comprobar el grado de
purificación del ADN tras el aislamiento, por lo que se amplificó sistemáticamente el ADN
de cada cepa en dos diluciones con uno de los “primers” empleados. El método de
aislamiento y purificación de ADN empleado por nosotros se ha mostrado muy eficaz dada la
repetitividad que se obtenía al realizar los controles anteriormente mencionados. Según los
autores anteriormente citados, las variaciones encontradas entre días y laboratorios se deben a
variaciones en las características de los tampones, calidad de los enzimas y preparación de los
“primers”.
El empleo de varios “primers” a la hora de calcular la divergencia genética según los
patrones de bandas obtenidos, es uno de los factores señalados por Clark y Lanigan (1993)
como decisivos. Si en la secuencia que reconoce el “primer” (10 nucleótidos) el número de
sustituciones es mayor que uno, la técnica lo reconocería como una sola sustitución. Por este
motivo, resulta absolutamente imprescindible el empleo de varios “primers” que nos permitan
un cálculo de divergencia independiente, para posteriormente integrar dicha información.
Esta metodología se utiliza en estudios de microecología resolviendo una serie de
problemas que han hecho muy difícil el progreso de esta disciplina. Mediante esta técnica se
puede identificar con un alto nivel de exactitud las cepas que colonizan la rizosfera (Sellstedt
et al., 1992) de forma que se hacen posibles los estudios comparativos de la composición
209
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
rizobacteriana entre especies vegetales. Por otra parte, permite abordar estudios de
colonización debido a que las cepas inoculadas se podrán identificar con exactitud entre la
comunidad rizobacteriana natural, evitando el empleo de metodologías con graves
limitaciones, como el uso de mutantes de determinadas actividades enzimáticas para
identificar cepas concretas (Oullet y Seifert, 1993).
Como se puede apreciar en la Figura 4.22, las poblaciones de Bacillus encontradas en
la rizosfera de V. villosa, se pueden clasificar en 15 grupos. Al nivel del 70 % de similitud se
establecen dos grandes grupos, el primero constituido por los grupos 13, 14 y 15 y el segundo
por el resto. En este último, con un 72 % de similitud vuelven a establecerse dos grupos
constituidos uno por los grupos 1,2 y 3, y otro por el resto.
Aunque diferencias de un 10 % en la divergencia genética podrían hacer pensar en
capacidades metabólicas diferentes como producción de hormonas, resistencia y producción
de antibióticos, etc., hemos establecido esta barrera debido a que las especies del género
Bacillus son genéticamente muy heterogéneas, alcanzando diferencias interespecíficas de más
de un 30 % en la cantidad total de G+C (Claus y Berkeley, 1986). El porcentaje de G+C más
bajo, dentro de las especies que aparecen en el suelo, se ha descrito en B. cereus (31.7 mol %
G+C) (McDonald et al., 1963) y el más alto es de un 61 mol % de G+C para B. circulans
(Claus y Berkeley, 1986). Como ejemplo a nivel intraespecífico podemos citar el hecho de
que en un estudio realizado entre 123 cepas pertenecientes a B. circulans se han encontrado
variaciones de hasta un 24 mol % G+C (Nakamura y Swezey, 1983), y en un estudio
realizado sobre 120 cepas de B. mycoides, mediante la técnica RFLPs, Bell y Friedman (1994)
detectan divergencias genéticas de hasta un 50 %, empleando el algoritmo de Nei y Miller
(1990). Estos datos apoyan los resultados anteriormente comentados sobre la heterogeneidad
genética del grupo. Por lo tanto, el porcentaje límite elegido para el establecimiento de grupos
nos permite asumir que las actividades metabólicas de cepas con una divergencia menor del
10 % deben ser escasas. Esta es la razón por la cual se selecciona una cepa al azar de cada
grupo, con la cual se realizan las pruebas biológicas que se discuten posteriormente. Es
interesante mencionar el hecho de que cepas recogidas de distintas parcelas en el mismo
momento de muestreo presenten un nivel de similitud del 100 %, como es el caso de las cepas
que integran el grupo 14. Esta línea de razonamiento es extensible tanto a Bacillus como a
Pseudomonas, pero en este último género, con niveles de similitud comprendidos entre el 90
y el 100 %. Este es el caso de los grupos 2, 6, 11, 12 y 18 en Pseudomonas.
210
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
El análisis del género Pseudomonas nos permite distinguir 23 grupos dentro de los
cuales la divergencia genética es menor o igual al 10 %. La divergencia genética máxima se
alcanza entre los grupos 21, 22 y 23, alcanzando el 42 % con respecto al resto. De nuevo en
este grupo se ha establecido el límite del 10 % de divergencia genética para la formación de
grupos, aun a pesar de que en este género el rango de variación interespecífica en el mol %
G+C es menor. Mediante los resultados obtenidos por los autores anteriormente citados se
deduce que la heterogeneidad genética dentro del género Bacillus es superior a la de
Pseudomonas. Sin embargo, la técnica de RAPDs nos permite establecer un número
semejente de grupos, a nivel de un 90 % de similitud, aun cuando el número de cepas
muestreadas pertenecientes al género Pseudomonas fue mayor que el de Bacillus. Además, la
máxima divergencia genética en Bacillus fue del 30 % mientras que en Pseudomonas fue del
42 %.
Por lo tanto, y a falta de estudios con otras poblaciones, no sólo de V. villosa sino de
otras leguminosas, nuestros resultados sugieren lo ya apuntado por otros autores, en el sentido
de que la capacidad de colonización de determinadas cepas rizosféricas puede ser el resultado
de una compatibilidad metabólica debida a determinados patrones de exudación, que a su vez
vienen determinados genéticamente (Hedges y Messens, 1990; Bolton et al., 1993), lo que
sugiere un alto grado de coevolución entre plantas y rizobacterias (Nehl et al., 1996). Más
concretamente y refiriéndonos a PGPRs, Chanway y Nelson (1991) sugieren un alto grado de
especificidad entre los genotipos de plantas y rizobacterias con respecto a la capacidad de
estos últimos de promover el crecimiento vegetal. Esta hipótesis está respaldada por los
trabajos de Wiehe y Höflicht (1995b), en los que demuestran que la colonización de la
rizosfera por parte de bacterias seleccionadas está fuertemente influida por la especie de la
planta. Así, bacterias aisladas de la rizosfera de leguminosas, colonizan mejor plantas de la
familia Fabaceae que otras pertenecientes a familias como Brassicaceae o Poaceae. Por lo
tanto, existe algún tipo de especificidad entre la planta y las bacterias, probablemente
adaptativa y resultado de la coexistencia natural de plantas y bacterias (Chanway et al.,
1988a; 1988b; Sumner, 1990), y de la compatibilidad metabólica entre planta y bacteria que
es independiente de la coexistencia de estos organismos (Chanway et al., 1989).
El empleo de la técnica PCR-RAPDs nos ha permitido disponer de un criterio para la
selección de posibles cepas PGPRs y DRBs, aspecto que en sí mismo supone un considerable
avance en la búsqueda de este tipo de rizobacterias. Sin embargo, es importante señalar que
las aplicaciones de esta técnica pueden aportar considerable información sobre los procesos
211
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
adaptativos y coevolución de las rizobacterias y las plantas con las que establecen su relación.
En este sentido cabe destacar los trabajos realizados por Martin-Kearley et al. (1994) que
aplican esta técnica para la comparación de cepas bacterianas con distintas procedencias.
Nuestros resultados se podrán comparar no solamente con cepas aisladas de otras poblaciones
de V. villosa si no también con las de otras leguminosas y junto con estudios fisiológicos
relativos al tipo de exudación de las plantas, en función de su genotipo, intentar esclarecer los
mecanismos de la interacción planta-rizobacteria. Por otra parte, esta técnica puede sustituir
al empleo de cepas mutantes (Marschner y Crowley, 1996) como técnica de localización para
determinar la capacidad de colonización bacteriana en el ambiente rizosférico.
Desde la definición de la rizosfera por Hiltner en 1904, se ha profundizado
extraordinariamente en el conocimiento de la estructura y función de este sistema. Quizá el
aspecto más importante que debemos resaltar es el importante papel del sistema rizosférico
sobre la producción primaria y la capacidad productiva del suelo. A partir de la década de los
sesenta se comenzaron a realizar experiencias sobre la incidencia de las bacterias rizosféricas
en diversos aspectos de la fisiología de las plantas. Actualmente, entre los sistemas
biotecnológicos empleados en la mejora de la producción vegetal cabe destacar el empleo de
inóculos fúngicos y bacterianos sobre el sustrato edáfico en el que se desarrollan las plantas, o
sobre las semillas antes de la siembra. El empleo de PGPRs se muestra como uno de los
sistemas más prometedores para mejorar los rendimientos de producción de biomasa vegetal,
evitando o aminorando los efectos secundarios de los métodos actuales de fertilización y
protección frente a plagas (Schippers, 1992; Cook, 1993; Zhoinska et al., 1992; Selvadurai et
al., 1991). Los planteamientos del diseño experimental en estos trabajos se pueden resumir
en:
- Selección de bacterias rizosféricas de una especie de interés agronómico o forestal y
ensayos biológicos (p.e. Kloepper et al., 1980) en condiciones estériles o de campo.
- Crecimiento in vitro de cepas beneficiosas o patógenas con el fin de establecer que
agente es el responsable de dicho efecto (p.e. Fuentes-Ramírez et al., 1993).
La problemática experimental que se aprecia en todos estos trabajos es compleja pues
la forma de establecer la relación entre la cepa o cepas objeto del ensayo con la planta es muy
variable. Este tipo de estudios debe de tener dos vertientes: una primera, en la que se
determine la potencialidad bacteriana para producir metabolitos perjudiciales o beneficiosos;
y otra posterior, en la que se estudien aspectos como la capacidad de colonización de dichas
bacterias sobre el sistema radicular, considerando los problemas de competencia con otros
212
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
organismos, tipo de inóculo, permanencia en el sustrato edáfico, etc. Por este motivo, se
planteó el diseño experimental de esta parte del presente trabajo desde el primer punto de
vista, ensayando el medio de crecimiento de cepas bacterianas recolectadas de la rizosfera de
poblaciones naturales de V. villosa, sobre plantas de dicha especie, técnica utilizada por
numerosos autores como Sarathchandra et al. (1996) o Selvadurai et al. (1991).
En lo que respecta a la metodología para los ensayos de germinación, hay que señalar
que permite una eficiente y rápida constatación del proceso y por otra un manejo aséptico de
las semillas, minimizando la posible contaminación de las mismas. Otros autores han
empleado otros soportes diferentes al agar, tales como vermiculita o arena, si bien hay que
señalar que en estos ensayos biológicos se probaba el efecto directo de bacterias (no del
medio de crecimiento de éstas) sobre plantas ya germinadas. Otra ventaja adicional es que el
soporte
permite la difusión de los compuestos presentes en los medios bacterianos
ensayados.
Los resultados obtenidos en los ensayos de germinación muestran dos aspectos
importantes. En primer lugar, el período óptimo de germinación es más estrecho en la
variedad Látigo que en la Namoi. En segundo lugar, se detecta un claro efecto de las cepas de
Pseudomonas sobre la germinación, efecto que se puede concretar en el adelanto de la misma.
Bajo el efecto de los medios de cultivo procedentes de Pseudomonas, la germinación de las
semillas de la variedad Látigo y Namoi se detecta con claridad desde el primer día, mientras
que en los tratamientos con las cepas de Bacillus y en el tratamiento control, los mayores
porcentajes de germinación ocurren entre el segundo y el tercer día en la variedad Látigo, y
entre el segundo y el cuarto para la variedad Namoi. No se detectó inhibición bajo el efecto de
ninguna de las cepas ensayadas. Sin embargo, los ACPs, que muestran una clara
discriminación de efectos bajo Pseudomonas y Bacillus en ambas variedades, nos permiten
identificar tres cepas: Bc 12 y Bc 8 con un claro efecto retardante de la germinación sobre la
variedad Namoi y Bc 7 sobre la variedad Látigo. Un efecto contrario podemos encontrarnos
con la cepa Ps 19 en Namoi y Ps 8 en Látigo.
Indudablemente, la activación detectada en presencia del medio de cultivo en el que
crecieron las cepas del género Pseudomonas, se debe a la presencia en el mismo de
metabolitos responsables del efecto, que pueden actuar individualmente o de forma
combinada. Bacterias de este género ya han sido descritas como promotoras de la
germinación del trigo (DeFreitas y Germida, 1992a, b; Gagné et al., 1993) debido a la
combinación de múltiples factores. Existen citas sobre la producción de giberelinas en
213
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
especies del género Azospirillum (Bottini et al., 1989) y Bacillus (Gutiérrez Mañero com
pers.) que tienen efecto sobre este proceso, aunque dicho efecto puede actuar sinérgicamente
con otros metabolitos, como agentes quelantes, otras hormonas, etc. (Glick, 1995). Por lo
tanto la causa directa de la activación de la germinación siempre será difícil de determinar, ya
que estas sustancias pueden actuar en combinación con otras. Por otra parte, la demostración
in vitro de este efecto es un punto de referencia obligado antes de acometer ensayos de campo
en los cuales el número de variables que inciden sobre el metabolismo bacteriano tipo de
sustrato orgánico, textura del suelo y su incidencia en la distribución de nutrientes y oxígeno,
competencia con otros organismos, etc. es tan elevada que cada experiencia constituye por sí
misma un dato irrepetible en función, básicamente, del componente edáfico. Por esta razón,
las experiencias de campo se deben efectuar con bacterias previamente seleccionadas según
pruebas específicas para el efecto que se busca.
Son abundantes las citas bibliográficas que hacen referencia a numerosos
microorganismos edáficos productores de hormonas vegetales (Brown, 1972). Sin embargo,
tal y como se discutirá más adelante, la mayor parte de estos estudios se interesan en el efecto
de las hormonas sobre crecimiento y desarrollo y muy pocos del efecto sobre la germinación
(Lynch, 1990).
Las principales fitohormonas implicadas en la germinación de un modo directo son
giberelinas (GBs), citoquininas (CKs) y etileno. El efecto de estas hormonas se ha
corroborado no sólo por su acción endógena (producida por la propia semilla a causa de
determinadas condiciones ambientales), sino también exógeno (en experiencias in vitro).
Podemos considerar fundamentalmente las GBs y CKs como posibles candidatas a estar
presentes en los medios de crecimiento bacteriano, y descartar la presencia de etileno,
principalmente por su naturaleza gaseosa. Otro grupo hormonal numerosas veces citado
como metabolito de bacterias son las auxinas. Éstas no ejercen un efecto directo sobre la
germinación, sino sobre procesos de crecimiento por elongación (Selvadurai et al., 1991). Se
puede suponer que de estar presentes este tipo de metabolitos en los medios de crecimiento
ensayados, se detectaría, probablemente, una aparente aceleración del proceso de emergencia
de la radícula y por ello una aceleración de la germinación. Abundando en esto, como
discutiremos más adelante, en los resultados de los ensayos de crecimiento con Bacillus
parece posible que existan algunas cepas productoras de auxinas.
Un último aspecto a considerar como un factor más que podría estar implicado en los
procesos descritos son algunos compuestos de bajo peso molecular como el CN-, producido
214
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
por bacterias, que si bien desde otros puntos de vista definitivamente es tóxico, se ha
demostrado que a bajas concentraciones actúa como un eficaz acelerador del final del proceso
de dormición .
En las pruebas biológicas sobre el crecimiento de V. villosa, se emplearon plantas
jóvenes en los ensayos, fundamentalmente por detectarse de un modo rápido y claro cualquier
efecto inducido, más nítidamente que en plantas desarrolladas (Geels et al., 1986). Asimismo,
Hoflich et al. (1994) demuestran que el hecho de que una bacteria estimule el crecimiento de
plantas jóvenes es indispensable para poder observar una estimulación del crecimiento
vegetal en experimentos de campo.
Entre los soportes físicos empleados para el crecimiento del vegetal en condiciones de
laboratorio los más habituales son arena, soportess sintéticos o cultivos hidropónicos. En este
caso se utilizó vermiculita como soporte que es empleada frecuentemente por otros autores.
Se eligió dicho soporte por un doble motivo: en primer lugar, porque mantiene de un modo
constante la humedad sin que sea excesivamente baja la pO2, que como es sabido incide en la
funcionalidad de nódulos (Arrese-Igor et al., 1993) y raíces; y en segundo lugar, por no
afectar nutricionalmente a las plantas al tratarse de un soporte inerte. En lo que respecta al
medio nutritivo para las plantas se ha empleado un medio simple, Crone, de eficacia bien
contrastada en numerosos estudios en los que están implicadas plantas diazotrofas (Bermúdez
de Castro, 1976; Probanza et al., 1996).
En términos generales el primer efecto que cabe destacar es que tanto en la variedad
Namoi como en la Látigo, los ACPs de las variables referidos al sistema radical, reflejan una
separación evidente de cepas tanto inhibidoras como activadoras. En función de los factores
de carga y de la varianza absorbida por los componentes principales, son la longitud total del
sistema radical y el peso del mismo los dos factores clave que permiten una discriminación de
las cepas estudiadas. Sin embargo, es importante considerar la relación de las variaciones de
la longitud y la superficie radical, ya que ambas determinan las características del mismo. En
este sentido, Germida y Walley (1996) sugieren que las PGPRs y DRBs tienen una gran
influencia sobre el patrón de crecimiento radical y como consecuencia alteran la capacidad de
captación de nutrientes y agua, lo que afecta decisivamente al crecimiento de la planta. Las
cepas Bc 6, Bc 7 y Bc 10 del género Bacillus y sólo Ps 2, de Pseudomonas, provocan un
incremento significativo del peso de las raíces de Namoi y se desplazan considerablemente en
función de esta variable a lo largo del eje I. En todas estas cepas, salvo en Bc 10, se produce
un significativo aumento de la longitud radical, junto con un aumento de la superficie. Sin
215
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
embargo, en la cepa Bc 7 se detecta un aumento de la longitud muy acusado y en Bc 6, la
cepa más alejada de Bc 7 dentro del grupo marcado en el ACP (Figura 5.26) presenta una
relación longitud/superficie menor, es decir, el sistema radical de Bc 7 es un sistema radical
que profundiza más y presenta menos raíces laterales, y el de Bc 6, en cambio, presenta raíces
más ramificadas y menos profundas, de forma que éstas toman contacto con un volumen de
medio de crecimiento menos profundo y más extendido en superficie. En Ps 4 y Ps 7 se
detecta un efecto semejante al detectado en Bc 7 con respecto a la longitud y superficie
radical, pero el peso de las raíces no aumenta significativamente, razón por la cual se
desplazan hacia los valores más bajos del eje I (Figura 4.26). Su situación, hacia los valores
más positivos del eje II, indica el marcado efecto sobre la longitud radical. En las pruebas
efectuadas sobre la variedad Látigo, aparecen también dos grupos bien diferenciados, Ps 2 y
Ps 4, en los cuales se detecta un aumento de la relación longitud/superficie, y Bc 10 y Ps 23,
las cuales provocan una disminución de dicha relación; en el primer grupo, además,
disminuye significativamente el peso. Considerando todas las variables estudiadas, nuestros
resultados indican que el efecto sobre la parte radical se puede concretar fundamentalmente
en cinco de las 31 cepas estudiadas, Bc 6, Bc 7, Bc 10, Ps 2 y Ps 4. El efecto diferencial sobre
el crecimiento radical de ambas variedades observado en algunas cepas, puede deberse a
diferencias en la susceptibilidad de una y otra frente a los metabolitos bacterianos
(Sarathchandra et al., 1996). Además, y como ya se ha comentado anteriormente, existe un
cierto grado de especificidad entre bacterias y planta, a nivel de genotipos (Rennie y Larson,
1979; Chanway et al., 1988a) o de variedades de plantas (Chanway et al., 1988b, 1989).
Los efectos indicados se deducen fundamentalmente de los grupos establecidos por el
ACP, sin embargo debemos destacar los efectos provocados por ciertas cepas como Ps 9, Ps
10 y Ps 11, que son menos llamativos al estudiar el resultado del ACP tanto en Namoi como
en Látigo, debido a que dichas cepas actúan escasamente sobre el peso radical, factor de carga
con más incidencia en la separación de las muestras. Al observar los resultados del ANOVA,
se pueden observar, con respecto a las tres cepas mencionadas, una considerable disminución
de la relación longitud/superficie en ambas variedades. El mismo efecto se observa en Ps 23,
pero ya se comentó anteriormente puesto que afecta al peso radical de la variedad Látigo de
forma significativa.
Aunque la morfología de la raíz es controlada genéticamente, también influyen los
factores ambientales y el entorno edáfico (Klepper, 1987). Está claramente determinado el
efecto de la humedad y de la disponibilidad de nutrientes sobre el desarrollo del sistema
216
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
radical: por lo general la relación superficie radical/superficie aérea es mayor cuando el suelo
está húmedo y el mismo efecto parece tener la abundancia de nutrientes, es decir, las raíces
proliferan de forma extensiva cuando no existen deficiencias (Drew, 1975, 1987; Granato y
Raper, 1989). El agotamiento de éstos o dificultades para su absorción hace que el sistema
radical cambie su patrón de ramificación, la raíz aumenta su longitud profundizando más y
disminuye su superficie ramificándose menos. La forma filamentosa de las raíces, es decir el
aumento de superficie radical, permite explorar un volumen de suelo mucho mayor (Wiebe,
1978). La deficiencia en determinados nutrientes, bien por incapacidad para su absorción, o
bien por su escasa concentración en el sustrato, provoca efectos variables dependiendo del
tipo de nutriente. Así, un exceso de nitrógeno conduce a un escaso desarrollo del sistema
radical y por el contrario, un extraordinario desarrollo de la parte aérea; los efectos se
invierten cuando hay deficiencia en nitrógeno. Sin embargo, un exceso de fósforo tiene
efectos radicalmente opuestos a lo mencionados para el nitrógeno (Grundon, 1987). Bugbee y
Salisbury (1988) detectan que cuando las plantas están estresadas por una deficiencia de agua
o nutrientes, hasta un 90 % de la biomasa vegetal se encuentra en las raíces. Van Noordwijk
et al. (1994) encuentran como efecto más generalizado un aumento de la superficie radical
como consecuencia de un déficit nutricional. También se ha descrito un claro efecto sobre el
desarrollo del sistema radical la presencia de metales pesados y la concentración de hormonas
(Lonegan, 1975; Ozolina, 1991).
Algunas rizobacterias afectan negativamente al crecimiento de plántulas y
particularmente al desarrollo de la raíz (Fredrickson y Elliott, 1985). La información
disponible sobre la capacidad de estas bacterias para producir metabolitos tóxicos en la
rizosfera de las plantas es escasa, debido a la falta de síntomas identificables en la parte aérea,
pasando inadvertidas. Las DRBs reducen el crecimiento radical mediante la producción de
metabolitos tóxicos (Woltz, 1978; Fredrickson y Elliott, 1985), que provienen del
metabolismo secundario de estas bacterias (Durbin, 1983). El género Pseudomonas incluye
gran cantidad de cepas DRBs, perteneciendo a este género la mayor parte de las bacterias
deletéreas (Elliott y Lynch, 1984); de hecho, Brown et al., (1994) observan que el 40 % de las
bacterias pertenecientes a Pseudomonas de la rizosfera del trébol inhiben el crecimiento
radical.
La producción de cianhídrico puede ser una de las causas que modifican el patrón de
crecimiento radical. Este compuesto ha sido detectado en los medios de cultivo de numerosas
cepas del género Pseudomonas (Bakker y Schippers, 1987; Gutiérrez Mañero et al., 1996) y
217
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
su acción negativa sobre el metabolismo vegetal se debe a su capacidad para bloquear el
funcionamiento de enzimas implicadas en la respiración celular y, por lo tanto, en la
obtención de energía. El aumento de la longitud radical puede ser el resultado de una
dificultad por parte de la planta para absorber nutrientes, ya que, como se ha indicado
anteriormente, el agotamiento de nutrientes o su dificultad para la absorción puede hacer que
el sistema radical cambie su patrón de ramificación en este sentido. Cuando se observa un
aumento de la longitud radical junto con una disminución de la superficie radical o una
ausencia de efecto sobre la última variable, podemos descartar la presencia de auxinas, dado
que de forma directa o indirecta dichas hormonas inhiben el crecimiento longitudinal del
aparato radical (Chadwick y Bury, 1987).
Por el contrario, el incremento de la superficie radical, bajo el efecto de las cepas
mencionadas nos sugiere la presencia de algún compuesto en los medios de cultivo
bacterianos que induce la formación de raíces laterales.
La familia de compuestos con mayor probabilidad de ser responsables de estos efectos
son las auxinas. La capacidad de síntesis de auxinas ha sido descrita en diferentes bacterias
epifíticas (Libbert y Rich, 1969) y microorganismos edáficos (Brown, 1972; Prikryl et al.,
1985). Los efectos inducidos se detectan, como es este caso, con mayor claridad en plantas en
los primeros estadíos de desarrollo (Geels et al., 1986). El caso de las auxinas sería lo que se
podría considerar como un activador directo, es decir que afecta precisamente a los procesos
fisiológicos que conducen al crecimiento de la planta. Se ha comprobado la producción de
AIA por parte de cepas tanto del género Bacillus como Pseudomonas, así como la producción
de indol-3-etanol (IEt). En estos trabajos, Selvadurai et al. (1991) demuestran que AIA
incrementa la longitud radical y la de raíces secundarias, únicamente a bajas concentraciones,
detectándose el efecto contrario a concentraciones altas (Gutiérrez Mañero et al., 1996). Por
ello, la producción de IEt puede ser de gran importancia, ya que la planta lo utiliza como
precursor de AIA, regulando a través de sus propias enzimas los niveles de dicha hormona
(Brown y Purves, 1976). De esta manera, la bacteria activa el desarrollo radical y se evita el
efecto tóxico que pudieran tener las altas concentraciones de AIA.
Los análisis realizados sobre la parte aérea muestran un claro efecto diferencial de las
cepas de Bacillus y Pseudomonas. En general, podemos indicar que en ambas variedades las
cepas pertenecientes al género Bacillus provocan un aumento del peso total de la planta y
junto con este aumento se detecta una disminución de la concentración de nitrógeno total de
la misma. De esta tendencia general se puede excluir a las cepas Ps 17, en Namoi, y Ps 3, en
218
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
Látigo. Dentro de esta tendencia general quedan Bc 7, Bc 6 y Bc 10 y Ps 2 y Ps 4, cepas con
un apreciable efecto sobre el desarrollo del aparato radical. Sin embargo, a nivel de la parte
aérea, existen otras cepas además de las mencionadas que afectan a los parámetros
estudiados, fundamentalmente sobre la longitud en la variedad Látigo.
El hecho de encontrar bajas concentraciones de nitrógeno en las plantas ensayadas con
los medios de Bacillus está en relación con el aumento de peso de la planta. Estos resultados
indican que la mayor demanda de nutrientes por la planta que permita el aumento de peso de
la misma no va acompañado de un aumento de la actividad fijadora de nitrógeno; incluso hay
casos en los que se detecta un claro efecto inhibidor, como lo indica la disminución de peso
junto con una disminución en la concentración de nitrógeno, como es el caso de Bc 1. Este
hecho induce a pensar en una pérdida de rendimiento de la actividad nitrogenásica por la
presencia de inhibidores que actúen directa o indirectamente. Indirectamente, como puede ser
la alteración de la estructura nodular, que puede alterar la difusión de oxígeno (Arrese-Igor et
al., 1993); o directamente, por la presencia de agentes quelantes de metales, especialmente el
hierro. El componente I de la nitrogenasa, además de un átomo de molibdeno, presenta entre
24 y 32 átomos de hierro. Así, una supresión exógena de la captación del metal puede reducir
drásticamente el proceso fijador y, por ello, el contenido en nitrógeno de las plantas.
En estas condiciones de baja eficiencia fijadora (por cualquiera de los motivos antes
expuestos), la planta debe recurrir a la captación exógena de nitrógeno mineral. En este
momento, la planta puede responder aumentando la superficie radical (Van Noordwijk et al.
(1994), como es el caso de Bc 10 que provoca sobre la variedad Látigo un significativo
incremento de la superficie radical junto con una significativa disminución de la
concentración de nitrógeno total en la planta. Sin embargo, hemos de destacar que en ningún
caso hemos detectado signos de clorosis, y los contenidos en nitrógeno en términos generales,
justifican la ausencia de la misma.
El conjunto de las consideraciones realizadas en la presente discusión pone de
manifiesto, una vez más, el intrincado conjunto de interacciones multidireccionales que se
verifican en la rizosfera de las plantas y que afectan de un modo capital al crecimiento de
éstas y a la producción primaria de los sistemas naturales, agrícolas o silvícolas. En este
sentido, Steinberg (1947) ya detectó cómo muchas cepas de distintos géneros de rizobacterias
no patogénicas (Pseudomonas, Serratia, Bacillus o Chromobacterium), producen en
determinadas condiciones alteraciones fisiológicas negativas. En el caso de las cepas
dePseudomonas estudiadas en la presente memoria, con efectos negativos sobre la fisiología
219
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
de V. villosa, probablemente en condiciones naturales pueden estar reprimidas como
patógenas por efecto de interacciones con otros microorganismos (que regulen su densidad) o
por mecanismos desarrollados por las plantas a fin de controlar la patogeneidad potencial y
“explotar” sus efectos beneficiosos. Pudiéramos considerar también
que las cepas
promotoras exhiban otros efectos en el medio rizosférico, estando modulada su actividad en
el medio por los mismos factores que reseñábamos en el caso de las cepas inhibidoras.
La falta de conocimiento del sistema rizosférico hace que el efecto de las PGPRs en
condiciones de campo sea difícil de controlar, como así lo indican Schroth y Weinhold
(1986), debido a que la estimulación del crecimiento vegetal es el resultado de una compleja
serie de interacciones bióticas y abióticas. Sin embargo, el hecho de que exista la
potencialidad de mejorar el rendimiento de cosechas con este tipo de bacterias, abre una
puerta a la investigación en este campo, por lo que antes de la extensión de estos métodos a la
gestión forestal o agrícola que en la actualidad se está desarrollando, habrá que profundizar
en mayor grado en los aspectos abordados en el presente trabajo.
220
7. DISCUSIÓN DEL ESTUDIO DE LA DINÁMICA DEL
CICLO DEL NITRÓGENO BAJO V. villosa
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
En la presente memoria se ha realizado un estudio en condiciones de laboratorio que
aporta información sobre las modificaciones inducidas por dos variedades comerciales de V.
villosa Roth. en la dinámica del ciclo edáfico del nitrógeno, así como sobre parámetros
fisicoquímicos relacionados con dicho ciclo. Además, se determina la actividad fisiológica de
las dos variedades a través de parámetros biométricos. Posteriormente, se realizan pruebas de
campo que se complementan con los experimentos de laboratorio y con el estudio de la
composición y actividad de la comunidad bacteriana rizosférica característica de V. villosa.
Los estudios sobre la dinámica del ciclo del nitrógeno se realizan con el objetivo de obtener el
máximo aprovechamiento de la capacidad productiva edáfica y vegetal, por lo que dicho
estudio se debe relacionar con las características nutritivas de la biomasa de V. villosa durante
su ciclo fenológico.
Para evaluar los efectos de las dos variedades de veza sobre los microorganismos
edáficos implicados en el ciclo del nitrógeno, se han usado métodos de extendido manejo.
Estos métodos consideran grupos funcionales o fisiológicos y no entidades taxonómicas
concretas, ya que el objetivo del trabajo es conocer el resultado de un proceso biológico en el
que están involucradas numerosas poblaciones microbianas. Este planteamiento ya ha sido
empleado por diversos autores como Remacle y De Leval (1975), Turner y Franz (1985),
Sprent (1990), Prescott y Preston (1994) y Pozuelo et al. (1995).
Sobre la caracterización de los suelos en cada momento de muestreo se pueden hacer
las mismas consideraciones señaladas en el Apartado 6 de esta memoria. Se miden además
otros parámetros que no influyen directamente sobre el ciclo del nitrógeno, pero que tienen
una gran importancia en la nutrición de las plantas, como son la capacidad de intercambio
catiónico y la concentración de fosfatos.
Para evaluar la fijación de nitrógeno se empleó el método de la actividad reductora del
acetileno (ARA) en las condiciones propuestas por Grant y Binkley (1987), debido a la
rapidez y escasa manipulación de los suelos en el laboratorio. Las limitaciones del método (en
la medida de actividad de nódulos) han sido bien contrastadas, si bien estas limitaciones no
son aplicables a la fijación libre (Minchin com. pers.) y este método es empleado de rutina
por diversos autores (Danso et al., 1992; Trinchant et al., 1994).
Los potenciales amonificante y nitrificante se obtuvieron según el método de Alef y
Kleiner (1986) modificado y Robertson y Vitousek (1981), respectivamente. La nitrificación
requiere tiempos de incubación más largos, pues como indica Alexander (1980), entre otros
222
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
autores, los microorganismos nitrificantes poseen un metabolismo más lento en comparación
con el resto de los microorganismos que integran los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno.
La desnitrificación total se evaluó en las condiciones propuestas por Gutiérrez Mañero
et al. (1995) aplicadas al método de inhibición por acetileno de Yoshinari y Knowles (1976) y
contempla exclusivamente las pérdidas de nitrógeno por desnitrificación. No hay interferencia
con la nitrificación, puesto que como demuestra Klemedtsson et al. (1986) las presiones altas
de acetileno (como el 10% de la atmósfera de incubación) inhiben dicho proceso.
La producción de CO2 se empleó exclusivamente como indicador de la actividad y/o
cuantía de la microflora total. Alexander (1980) apunta en este sentido que la relación entre el
número de microorganismos y la producción de CO2 no está totalmente demostrada,
existiendo sólo cuando la fuente de carbono es única y la microflora monoespecífica. Sin
embargo, para diversos autores la determinación de la producción de CO2 es un método
indirecto muy apropiado para determinar la actividad biológica de un suelo (Benckiser, 1994;
Zechmeister-Boltenstern, 1994; Dilly y Munch, 1995).
Como ya se ha descrito, entre los objetivos del trabajo (1.4) se encuentra determinar el
efecto de variedades comerciales de V. villosa sobre los grupos funcionales del ciclo del
nitrógeno y sobre parámetros fisicoquímicos edáficos relacionados con dicho ciclo.
Abordamos el trabajo seleccionando las tres variedades comerciales más utilizadas y con
ellas, planteamos un experimento destinado a conocer sus características de crecimiento.
El análisis de componentes principales (ACP), llevado a cabo con los datos de
longitud, número de foliolos y peso seco de las tres variedades, después de 15 días de
crecimiento desde el momento de la siembra, indicaron que la variable peso seco incidía muy
poco en la distribución de las muestras, como así lo indicaban sus factores de carga sobre los
ejes (0.001 sobre el primero y 0.00 sobre el segundo). Las otras variables (longitud y número
de foliolos) dan forma a la nube de puntos. La variedad Namoi presenta los valores más altos
en ambas variables y el análisis de varianza indicaba que existían diferencias significativas
entre dicha variedad y las restantes. Sin embargo no existen diferencias entre Látigo y Sita,
que mostraba unos valores intermedios entre la variedad Namoi y Látigo, razón por la cual se
descartó para el estudio, ya que se buscaban variedades diferentes en cuanto a sus
características de crecimiento y que por otra parte tuvieran diferencias derivadas de su ritmo
de producción.
223
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
El ACP no separa las muestras con claridad sobre el eje II, aunque se puede observar
como las muestras de la variedad Namoi tienden hacia los valores negativos de dicho eje,
sobre el que incide con más peso la variable longitud, Látigo tiende hacia los valores
positivos, sobre el que incide con más peso la variable número de foliolos. Sin embargo, el
eje I, que absorbe un 99.43 % de la varianza, discrimina con claridad a la variedad Namoi de
la variedad Látigo en cuanto a longitud y número de foliolos. Puesto que el peso seco, a pesar
de ser significativamente distinto según el ANOVA, incidía escasamente en la distribución de
ambas variedades, pensamos que el aumento de superficie aérea podría compensar las
diferencias de peso previstas entre las variedades.
Por esta razón, mediante análisis de imagen, se midió la superficie de 31 foliolos de
cada variedad. El análisis de la varianza reveló diferencias significativas entre ambas,
exhibiendo la variedad Látigo el valor más alto. Por tanto, parece claro que las dos variedades
tienen unas características de crecimiento muy diferentes. La variedad Látigo crece durante
este período más lentamente, desarrollando menos biomasa que la variedad Namoi, además la
variedad Látigo presenta foliolos con superficie apreciablemente mayor que la variedad
Namoi. De esta forma las diferencias de peso son menos acusadas de lo previsto a partir de
los datos de longitud y número de foliolos. Estos resultados sirvieron de base para la
selección de ambas variedades.
La amonificación potencial aumenta a lo largo de la experiencia (Fig 5.11). Este
proceso no parece estar afectado por las plantas, si bien existen diferencias significativas en
algunos casos, ya que el aumento se produce también en el suelo control. Los resultados
señalan a los factores abióticos como responsables de la regulación de este proceso. Entre
ellos cabe destacar la temperatura, que aumenta a lo largo de la experiencia y es uno de los
factores que afecta decisivamente a la amonificación (Powers, 1990; MacDonald et al.,
1995). Además de la tendencia general ya comentada, es destacable el menor valor de
amonificación potencial que se produce bajo la variedad Namoi a T2 con respecto a Látigo y
al control, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. A T2 el máximo valor de
desnitrificación potencial aparece bajo la variedad Namoi, lo que sugiere el desarrollo de
microambientes anaerobios, ya que el proceso se optimiza en estas condiciones (Weier et al.,
1993; Watson et al., 1994). La baja concentración de oxígeno obliga a algunas bacterias
facultativas a cambiar su metabolismo aerobio por anaerobio, lo que incide en una menor
eficacia metabólica en el proceso de mineralización del nitrógeno (Fyles et al., 1990; Hassink,
224
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
1994).
Sin embargo, en el suelo control se detecta en T3 una desnitrificación acusada no
apreciándose una pérdida de rendimiento mineralizador. La ausencia del aparato radical de las
plantas es el factor que diferencia a este suelo. Los suelos que sustentan el crecimiento
vegetal soportan una densidad elevada de raíces, sin embargo la pauta de desnitrificación es
diferente según la variedad, y por lo tanto no influyen de la misma forma en el proceso. Los
datos biométricos de la parte radical indican una mayor superficie y longitud en la variedad
Látigo con respecto a la Namoi. Las raíces de la primera variedad favorecen el desarrollo de
una estructura edáfica que facilita la oxigenación del suelo, lo que no favorece la
desnitrificación. La buena aireación de las raíces es fundamental para obtener la máxima
absorción de nutrientes, y por tanto un óptimo crecimiento de éstas (Taylor, 1949; Glinski y
Stepniewski, 1985; Kirkham, 1987). Reid y Goss (1981), indican que el crecimiento de las
raíces de Medicago sativa y Lolium perenne va asociado a un incremento en la estabilidad de
los agregados edáficos. Habib et al. (1990) señalan, en este sentido, el papel de los exudados
radicales. La máxima desnitrificación obtenida en el suelo control apoya esta hipótesis, ya que
en este caso la compactación progresiva del suelo se ve claramente favorecida en ausencia de
raíces, lo cual no resulta incompatible con el incremento de la mineralización, ya que en las
zonas superficiales la disponibilidad de oxígeno, junto con el aumento de temperatura
facilitaría el proceso. Conviene señalar que la desnitrificación alcanza sus máximos en estado
vegetativo y floración según la variedad, pero al final del experimento no se detecta actividad
desnitrificante; Monroe y Kladivko (1987) demuestran que durante un período de tiempo,
concretamente en las primeras etapas del desarrollo radical, hay un descenso en la estabilidad
de los agregados, que se recupera posteriormente al mismo tiempo que crecen las raíces y
éstas ejercen una mayor influencia sobre el suelo. En este mismo sentido Monreal et al.
(1995) indican que las raíces estabilizan los macroagregados del suelo (> 250 µm),
caracterizados por una gran diversidad molecular de la materia orgánica.
No podemos descartar una actividad respiratoria diferente en ambas variedades. Es
sabido que, manteniéndose constante la intensidad luminosa y con una concentración de CO2
normal, el aumento de la temperatura no afecta por igual al proceso fotosintético y al
respiratorio (Hawkins y McDonald, 1993; Ziska y Bunce, 1994; Chen et al., 1994). Puede
ocurrir que el aumento de temperatura esté favoreciendo selectivamente el proceso
respiratorio en la variedad Namoi con respecto a Látigo, lo que justificaría que se detecte un
225
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
menor valor de los datos biométricos, una mayor demanda de oxígeno por parte de las raíces,
una disminución de la concentración de oxígeno en el suelo y la aparición de microambientes
anaerobios que estimulan la desnitrificación.
Los valores de amonio en el suelo bajo la variedad Namoi a lo largo del experimento,
sufren un aumento mucho menos acusado que en el resto de los suelos. Esto puede deberse a
la menor eficacia mineralizadora en este suelo, ya comentada anteriormente, y a la mayor
demanda de nitrógeno mineral por parte de esta variedad. En T2 los nódulos de esta variedad
están ya inactivos y el nitrógeno necesario para su crecimiento tiene que obtenerlo del suelo.
La variedad Látigo presenta nódulos funcionales en este momento y una mayor actividad
mineralizadora a nivel rizosférico. El mismo argumento se puede emplear para justificar el
aumento de nitrógeno amonio en el suelo control, ya que no existe demanda vegetal del
amonio mineralizado.
Las variaciones en el potencial nitrificante no justifican las variaciones en la
concentración de nitrato salvo en el suelo control, en el que coinciden el valor más alto de
nitrato con el potencial nitrificante más acusado. Sobre este aspecto inciden autores como
H∅jberg et al. (1996), que comprueban como los niveles de nitrógeno inorgánico en el suelo
están determinados, no sólo por las actividades potenciales del ciclo del nitrógeno como
nitrificación y desnitrificación, sino también por factores como solubilidad, lixiviado,
transporte y asimilación por parte de bacterias y plantas. La elevada tasa de nitrificación y la
ausencia de demanda vegetal de nitrato compensan en el suelo control las pérdidas por
desnitrificación, apreciándose una ganancia neta. Bajo las plantas, la concentración de nitrato
más elevada aparece en la variedad Látigo, lo que confirma la hipótesis de una mayor
demanda de nitrógeno mineral por parte de la variedad Namoi. También debemos tener en
cuenta que la desnitrificación más acusada se detectó en el suelo rizosférico de Namoi.
En los suelos bajo la influencia de las plantas, se produce un aumento del nitrógeno
total durante el desarrollo vegetativo, atribuible a una fuerte capacidad de exudación durante
esta etapa, época en que la actividad fisiológica de las plantas es muy alta, incluida la
actividad fijadora de nitrógeno (Crush, 1994). Sin embargo, posteriormente, la concentración
de nitrógeno total desciende. Este hecho lo podemos atribuir por una parte a la demanda de
nitrógeno por la planta, previsiblemente mayor en la variedad Namoi por las razones
anteriormente expuestas, y por otra, a las perdidas de nitrógeno derivadas de la aceleración
del ciclo del nitrógeno, como así lo demuestran los resultados relativos al potencial
226
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
amonificante, las concentraciones de nitrógeno amonio, y la coincidencia de los valores más
altos de desnitrificación potencial y los más bajos de nitrógeno total. Todo ésto se traduce en
pérdidas de nitrógeno canalizadas, junto con otros factores como la nutrición vegetal, a través
de la desnitrificación. La evolución de la concentración de nitrógeno total en el suelo control
es muy diferente a la que encontramos bajo las plantas; en este caso, la única entrada de
nitrógeno ocurre mediante la fijación libre, por lo que no se produce el incremento inicial
observado bajo las plantas, y el balance neto es una pérdida de nitrógeno por desnitrificacíon.
La nitrificación potencial, determinada como producción de nitrato, muestra un
comportamiento diferente, dependiendo de si soporta o no crecimiento vegetal. Lo que indica
que las plantas están ejerciendo un efecto mucho más marcado que algunos factores físicos
externos como la temperatura. Ninguna de las variedades ejerce una acción diferencial sobre
el proceso y, como ya se indicó anteriormente, las variaciones en la concentración de nitrato
son atribuibles a factores como la demanda de nitrógeno por las plantas y la desnitrificación.
Lo más llamativo del proceso es el brusco incremento que se produce de T2 a T3 en el suelo
control, lo que puede ser debido a un aumento constante de la desnitrificación, que demanda
nitrato para alimentar el proceso. El retraso en el incremento puede ser debido a que en las
primeras etapas, el nitrato no actúa como limitante para el proceso desnitrificante. La
coexistencia de ambos procesos confirma lo ya indicado por distintos autores con respecto a
la complejidad del medio edáfico, que permite la formación simultánea de microambientes
aerobios y anaerobios, viéndose favorecidos los dos procesos (Probanza, 1994).
La fijación libre, medida como actividad reductora de acetileno (ARA) potencial,
muestra en los tres casos una disminución progresiva a lo largo del experimento. El valor más
bajo se detecta en el suelo control, coincidiendo con las concentraciones más bajas de
carbono orgánico; por el contrario, en T2 y T3 Látigo presenta los potenciales de fijación
significativamente más elevados, coincidiendo con las concentraciones de carbono orgánico
más elevadas. Como han evidenciado distintos autores (Child, 1981; Kay y Virginia, 1989)
uno de los factores que más limita la fijación libre es la disponibilidad de materia orgánica,
que podría ser aportada vía exudados (Svennignsson et al., 1990). A la vista de nuestros
resultados parece que la variedad Látigo exuda sustratos más adecuados o más ricos para este
proceso. Otros factores que regulan la fijación de nitrógeno es la concentración de nitrógeno
mineral en el sustrato (Yu et al., 1993) y el pH (Schubert et al., 1990). Según nuestros
resultados las concentraciones de nitrógeno amonio aumentan a lo largo del experimento al
227
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
mismo tiempo que se aprecia una progresiva disminución del pH, siendo ambos hechos
desfavorables para la fijación libre de nitrógeno.
La liberación de CO2 evoluciona de forma semejante en los tres casos. Dicha
evolución parece controlada por la disponibilidad de sustratos carbonados degradables por la
comunidad heterótrofa, que debe ir disminuyendo a lo largo de la experiencia. Probablemente
esta disminución en la producción de CO2 esté motivada por el aprovechamiento intensivo
por parte de la microflora edáfica de las fuentes de carbono, suministradas vía exudación
debido al mantenimiento de unas condiciones de humedad y temperatura óptimas para el
desarrollo de la microflora edáfica durante toda la prueba, ya que las concentraciones de
carbono orgánico no varían significativamente durante la experiencia. Los resultados
sostenidos en condiciones de campo apoyan esta hipótesis y se comentarán más adelante. La
ausencia de efecto por parte de las plantas confirman de nuevo dicha hipótesis.
El estado del complejo adsorbente y sus modificaciones eventuales por intercambio de
iones, tienen una considerable importancia debido a su papel en la regulación del pH,
actividad biológica, estructura y fertilidad mineral de los suelos y resulta considerablemente
afectado por las raíces (Chung y Zasoski, 1993).
El complejo órgano mineral del suelo es capaz de adsorber cationes en solución así
como los ácidos orgánicos, derivados de la actividad metabólica microbiana, sideróforos y
fitosideróforos (Bruckert, 1970; Fox y Comerford, 1990). En muchos, casos los últimos
compuestos mencionados son liberados y vueltos a absorber por el sistema radical de las
plantas con el objeto de adquirir los cationes necesarios para su metabolismo. Este
mecanismo se ha descrito implicando a ácidos orgánicos y aminoácidos (Jones et al., 1994;
Baziramakenga et al., 1995). Incluso podemos citar el caso de Lupinus, que libera y recaptura
activamente fitosideróforos y ácidos orgánicos (Dinkelaker et al., 1989) para mejorar su
nutrición mineral.
Nuestros resultados demuestran un claro efecto sobre la CIC por las plantas, las
diferencias en la evolución de la CIC a lo largo del experimento con respecto al control son
significativas a partir de T1. Bajo las plantas (especialmente en la variedad Látigo) se observa
una recuperación de la CIC hasta casi los niveles iniciales, que no se produce en el suelo
control, a pesar del aumento de este parámetro de T1 a T2. Este fenómeno no se puede
atribuir a alteraciones del complejo coloidal del suelo, ya que éstos son extraordinariamente
lentos, pero sí podemos atribuirlo a la liberación de ácidos orgánicos por las raíces, que
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Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
aportarían las cargas negativas necesarias para mejorar la disponibilidad de los cationes de
cambio implicados en procesos químicos de amortiguación del pH (Jones y Darrah, 1994). En
el suelo donde se produce una mayor recuperación de la capacidad de intercambio catiónico
(bajo la variedad Látigo) se observa la menor disminución del pH; por el contrario, la bajada
más acusada del mismo se observa en el suelo control, donde, como ya se indicó, hay una
pérdida significativa del CIC a lo largo de la experiencia.
Existen trabajos en los que se indica la capacidad de los ácidos orgánicos liberados en
la rizosfera para solubilizar compuestos fosforados inorgánicos, (Illmer y Schinner, 1995). Se
detectan variaciones significativas en las concentraciones de fósforo a lo largo de la
experiencia bajo la variedad Látigo, variedad en la que ya hemos señalado que la CIC se
recupera mejor que en el resto de los casos. Esta observación debe ser tomada con las debidas
precauciones, pues autores como Illmer y Schinner, (1995) señalan lo complejo del tema al
intervenir en los procesos de solubilización del fósforo, la liberación de protones procedentes
de la actividad respiratoria microbiana o la asimilación de amonio por parte de las plantas. En
el suelo control, si bien no es significativo, se produce un aumento en la concentración de
fósforo de T1 a T2, coincidiendo con un aumento de la CIC; esto sólo puede deberse a la
actividad de algunas bacterias capaces de solubilizar fosfatos (Leinhos y Vacek, 1994;
Leinhos, 1994) que contribuyan al aumento de estos parámetros.
Chung y Zasoski, (1993) indican que el amonio afecta a la dinámica de los cationes de
cambio y al pH, disminuyendo ambos parámetros al aumentar la concentración de amonio. En
T3 la cantidad de amonio es muy elevada en el suelo control, así como la amonificación, lo
que puede estar influyendo en la bajada de pH del suelo control en T3. También el proceso de
nitrificación tiene influencia sobre el pH del suelo acidificándolo (Binkley y Sollins, 1990).
En el suelo control hay un aumento de ésta actividad de T2 a T3, que puede estar afectando
también al pH.
Los análisis de componentes principales (ACP) llevados a cabo con los resultados de
las actividades biológicas y producción de CO2 por un lado, y el realizado con los datos
fisicoquímicos por otro, muestran que las variaciones debidas a los cambios fenológicos
tienen un peso más acusado que el debido a las variaciones internas en cada momento de
muestreo. Este hecho es más evidente en el ACP realizado con los resultados de actividades
biológicas. En este caso se observa un claro agrupamiento en función de la época de
muestreo, y son las variables CO2 y amonificación potencial las que más peso tienen y por
229
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
tanto las que más influyen en la ordenación de las muestras sobre los ejes estudiados.
El ACP realizado con los resultados fisicoquímicos muestra un resultado similar al
comentado anteriormente, si bien hay dos muestras, las correspondientes al control en T2 y
Namoi en T3, que se desvían de esta tendencia. La muestra del control a T2 tiene un valor de
nitrato muy elevado, comparable con los valores de las muestras de T1, el nitrato es la
variable que más peso tiene sobre el eje I lo que probablemente condiciona la ubicación de
esta muestra. Como ya se ha indicado anteriormente, las pérdidas de nitrato por
desnitrificación en este suelo, se deben compensar por el aumento de nitrificación y la
ausencia de vegetales que demandan nitrato para su nutrición, por lo que el balance neto es
una pérdida de nitrógeno total. La muestra de Namoi a T3 también se aparta de la tendencia
general, debido a que los valores de amonio y nitrato son bajos en relación a las otras
muestras del mismo tiempo de muestreo; las diferencias en estos parámetros son importantes,
ya que son precisamente los que más peso tienen (nitrato sobre el primer eje y amonio sobre
el segundo). Como ya ha sido descrito anteriormente la menor amonificación a T2 bajo
Namoi junto con la demanda de nitrógeno mineral por las plantas, cuyos nódulos eran
inactivos, condiciona la menor concentración de amonio y nitrato a T3 con respecto al control
y a las muestras que soportaban el crecimiento de la variedad Látigo.
Los datos biométricos (longitud de la parte aérea, biomasa y superficie de la parte
aérea), indican que ya antes de la floración (T2), la variedad Látigo obtiene valores más altos
que la variedad Namoi. Sin embargo, estas diferencias no son significativas, por lo que esta
tendencia debería ser analizada en profundidad en condiciones de campo, con el objeto de
determinar si las alteraciones edáficas detectadas durante el crecimiento de la planta, junto
con los rendimientos finales de biomasa, sugieren dirigir el cultivo de forma diferencial entre
ambas variedades.
Es preciso tener en cuenta el contenido de nitrógeno en la parte aérea de la planta, ya
que suele ser un factor decisivo a la hora de considerar la calidad del forraje. La
concentración de nitrógeno total en ambas plantas sigue una evolución opuesta; así, mientras
que la mayor riqueza de nitrógeno en Látigo se consigue durante la floración, en Namoi la
cantidad de nitrógeno es máxima antes de la floración, para disminuir significativamente en
floración, sin recuperar posteriormente los valores alcanzados en el estado vegetativo. Estos
resultados junto con la menor cantidad de biomasa en Namoi, sugieren momentos de corte
óptimos claramente diferenciados.
230
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
Por otra parte, debemos analizar factores edáficos. En la variedad Namoi la máxima
concentración de nitrógeno en la parte aérea coincide con la máxima concentración de
nitrógeno en la parte radical, lo que repercutirá en una mejora de la calidad del suelo al cortar
antes de que se produzca la traslocación del nitrógeno al fruto. Debemos considerar otro
hecho tan importante o más que el anterior, y es que durante la floración se detecta un
máximo de la desnitrificación de claros efectos perjudiciales sobre la dinámica del nitrógeno
edáfico, como así lo indican los parámetros considerados al respecto.
La situación es claramente diferente en la variedad Látigo, el mayor contenido en
nitrógeno y por consiguiente el mayor contenido proteico se detecta en T2, lo que hace este
momento propicio para el corte, aunque como en el caso anterior debemos considerar otros
factores. En T3 el contenido de nitrógeno es menor pero el aumento de biomasa es
considerable, además en este momento se encuentra el valor más elevado de nitrógeno en la
parte radical, lo que repercute en una mejora de la calidad del suelo que permite una
recuperación del mismo frente a las pérdidas de nitrógeno observadas de T2 a T3. Hay que
tener en cuenta que la disminución de nitrógeno en la parte aérea se refiere a la parte verde
excluido el fruto, en el que se acumulan elevadas cantidades de nitrógeno, que probablemente
haga rentable cortar en este momento a pesar de la pérdida de nitrógeno. En este caso no hay
un aumento de desnitrificación en T2, y en T3 las concentraciones de amonio, nitrato y
fósforo son mayores y se ha producido una apreciable recuperación del CIC.
El ACP realizado con los resultados biométricos muestra de nuevo un agrupamiento
por tiempos de muestreo; sólamente la muestra de Látigo a T2 se separa de la tendencia,
debido al alto valor de fijación (ARA) que tienen los nódulos de esta variedad en este
momento, contrastando con el valor cero de la variedad Namoi.
Como primera aproximación a los estudios de campo se llevó a cabo un experimento
con la variedad comercial más utilizada en nuestro país (Namoi), con objeto de conocer las
modificaciones inducidas por ésta en la dinámica del ciclo del nitrógeno, así como sobre
parámetros fisicoquímicos relacionados con dicho ciclo. El experimento se realizó según lo
especificado en el Apartado 3.2 de Material y Métodos. Las características fisicoquímicas del
suelo utilizado se exponen en la Figura 5.17. Se trata de un suelo rico en nitrógeno (4.22 mg/g
de suelo) y materia orgánica (2.83 %) con pH ácido (5.18) y unas concentraciones de
nitrógeno mineral elevadas tanto en forma de nitrato (154.33 µg/g de suelo) como de amonio
(14.83 µg/g de suelo).
231
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
La amonificación potencial desciende a lo largo del ciclo fenológico de la planta,
aunque dichas diferencias no son significativas. Entre otros factores, como el pH y la
concentración de carbono orgánico, la humedad del suelo tiene un efecto decisivo sobre la
mineralización del nitrógeno (Montagnini y Sancho, 1994). Tanto el pH como la
concentración de carbono orgánico no muestran diferencias significativas a lo largo del
experimento, por lo que las variaciones de humedad a nivel edáfico durante el desarrollo
fenológico de las plantas, probablemente anulen el aumento del potencial amonificante
observado en las experiencias de laboratorio. Nuestros resultados coinciden con los de otros
autores que no encuentran variaciones en la mineralización potencial del nitrógeno bajo un
cultivo de leguminosas (Janzen, 1987).
Las variaciones en la concentración de nitratos y la desnitrificación medida en
condiciones de campo siguen la misma tendencia. En general, los altos niveles de nitratos
favorecen la desnitrificación (Groffman y Tiedje, 1991). La tasa de desnitrificación responde
a la concentración de nitrato de acuerdo con una cinética de Michaelis-Menten (Firestone,
1982), por lo tanto la concentración de nitrato afecta a la cantidad de N2O y N2 producidos
durante la desnitrificación (Swerts et al., 1996). Podemos deducir que el aumento
significativo de la concentración de nitrato, induce por consiguiente un máximo en la
desnitrificación de campo. Sin embargo, los resultados de la desnitrificación potencial
alcanzan sus máximos en fructificación. El suelo empleado para la determinación del
potencial desnitrificante, pese a estar influido por las raíces de las plantas, no era
estrictamente rizosférico. Las diferencias entre estos dos parámetros, así como los resultados
de las experiencias de laboratorio donde también se detectaban máximos en la
desnitrificación potencial durante floración, hacen pensar en una clara influencia de la planta
sobre este proceso. De hecho, la desnitrificación en condiciones de campo es incluso mayor
que la potencial en floración. McKenney et al. (1995) ya citaban los residuos de esta especie
como claros estimulantes de la desnitrificación con respecto a otras leguminosas.
Las leguminosas proporcionan buenas condiciones para la desnitrificación, ya que
aportan al suelo concentraciones elevadas de nitratos y hacen disminuir los niveles de
oxígeno debido a la respiración radical (Tiedje et al., 1984; Christensen et al., 1990).
Además, la materia orgánica procedente de la necrosis nodular constituye puntos calientes
para la desnitrificación (Parkin, 1987; Christensen et al., 1990). Durante la fructificación, los
niveles de nitrato bajan y la necrosis radical es acusada; como resultado, es previsible un
232
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
descenso en el consumo de oxígeno así como el número de espacios anaerobios. El descenso
de la desnitrificación es probablemente debido a un descenso de los espacios anaerobios y de
la concentración de nitratos más que a variaciones en los porcentajes de materia orgánica, que
es elevada en todos los momentos de muestreo.
A lo largo del ciclo fenológico de la planta se detecta una disminución en la
concentración de nitrógeno total; dicha disminución es el resultado de una alta actividad
desnitrificante durante los dos últimos muestreos. Firestone (1982) apunta que el 70 % del
nitrógeno introducido en un sistema agrícola por fertilización, se pierde vía desnitrificación,
lo cual apoya nuestra hipótesis. Por otra parte, el aumento en la concentración de amonio y
nitrato sugiere que las pérdidas de nitrógeno son consecuencia de la aceleración del ciclo del
nitrógeno, que como en el caso de los experimentos de laboratorio se traducen en pérdidas de
nitrógeno canalizadas, junto con otros factores como la nutrición vegetal, a través de la
desnitrificación.
El aumento en la concentración de amonio debería favorecer un aumento en la
nitrificación potencial (Robertson, 1984; Vitousek, 1984; Vitousek y Denslow, 1985;
Montagnini y Buschabacher, 1989). Sin embargo, los valores de nitrificación descienden
hasta valores negativos durante floración y fructificación, debido a la intensa desnitrificación
detectada. Durante estos muestreos las pérdidas de nitrato por desnitrificación son superiores
a las ganancias por nitrificación. En consecuencia, en condiciones potenciales el balance
resulta negativo.
Con respecto a la producción de CO2, en condiciones campo se detecta un aumento
significativo a lo largo del ciclo fenológico de la planta. Debemos destacar el hecho de que la
medida de esta variable en T0 se realiza en suelo libre y que en los otros dos muestreos, el
suelo es rizosférico. El aumento en la producción de CO2 revela un aumento de la biomasa
microbiana o bien de la actividad de la misma, hecho constatado en numerosos trabajos
(Bowen y Foster, 1978; Paul y Clark, 1989; Bowen y Rovira, 1991). Por tanto, nuestros
resultados revelan un cambio cualitativo y/o cuantitativo de la biomasa microbiana como
consecuencia de la presencia de la planta y fundamentalmente de la exudación radical. Este
aumento probablemente sea debido también a condiciones ambientales más favorables. Sin
embargo, en condiciones potenciales, únicamente se detecta un acusado aumento, no
significativo, entre floración y fructificación. El aumento de los potenciales desnitrificante y
ARA durante la fructificación puede estar relacionado con las variaciones de la producción de
233
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
CO2, aunque dichas poblaciones sólo constituyen una parte especializada de la microflora
total.
A la vista de los resultados obtenidos con la variedad Namoi en las parcelas de
Toledo, nos planteamos un estudio más profundo, con las dos variedades comerciales
utilizadas en los estudios de laboratorio.
Partimos de un suelo con concentraciones de nitrógeno semejantes a los del suelo
empleado en los estudios de laboratorio pero con un contenido en materia orgánica
apreciablemente menor, a pH básico , un CIC considerablemente superior y una
concentración de fosfatos menor. Es destacable que la diferente textura encontrada en ambos
suelos, fundamentalmente referida la contenido en arcillas, puede ser la responsable del
diferente CIC de los suelos. Como es propio en los experimentos de campo tenemos que
asumir que no existen dos experiencias iguales debido a la multitud de variables que afectan a
la dinámica de nutrientes, las actividades microbianas y a la producción de las plantas. Por lo
tanto, las experiencias de campo deben ser tomadas con las debidas precauciones, y el apoyo
en las experiencias de laboratorio se deben tener en cuenta a la hora de extraer conclusiones
sobre las modificaciones más importantes de los procesos estudiados. También debemos
considerar que los efectos encontrados en el laboratorio son siempre efectos potenciados dado
el diseño experimental y que en condiciones de campo la amortiguación de dichos efectos
puede enmascarar modificaciones sólo observables a muy largo plazo o imperceptibles con
las metodologías experimentales disponibles.
El análisis de cationes de cambio reveló una significativa disminución de la
concentración de potasio y magnesio, desde el momento de la siembra hasta el período
vegetativo, también disminuyó la concentración de calcio, aunque dicha disminución no fue
significativa. La misma tendencia se detectó para ambas formas de nitrógeno mineral,
nitrógeno-amonio y nitrógeno-nitrato y CIC. Estos efectos se observaron tanto en las parcelas
en los que crecían las plantas como en los suelos control. La falta de respuesta diferencial
entre los suelos donde crecieron las plantas, así como entre estos y el control sugieren un
potente efecto de las condiciones ambientales, las altas precipitaciones que se produjeron
durante los meses previos al muestreo realizado en el período vegetativo (aproximadamente
el doble de la precipitación media de los últimos 40 años en el mismo período, Figura 3.4),
precedidas de una acusada sequía en los tres años anteriores, son probablemente las
responsables de la disminución generalizada en la concentración de nutrientes por lavado de
234
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
los mismos. Por lo tanto, podemos concluir que el suelo en el que crecieron las plantas es
mucho más pobre que aquel en el que inicialmente se sembraron.
La actividad reductora de acetileno, aumenta significativamente en fructificación en el
suelo bajo la influencia de Namoi y en su control. Este aumento es significativamente más
elevado bajo la influencia de la planta, lo que indica que además de unas condiciones
ambientales más favorables durante este período, la planta activa el proceso, liberando
compuestos orgánicos fácilmente degradables vía exudación que promueven el crecimiento
de microorganismos implicados en este proceso (Glick, 1995). Sin embargo la variedad
Látigo, que florece más tarde, muestra su máximo ARA durante la floración y su control
también experimenta una subida significativa, que se mantiene hasta fructificación. No
existen diferencias significativas entre el control y Látigo, pese a que los valores de esta
variable en floración son superiores en este último tratamiento. Por tanto, podemos concluir
que el incremento del ARA está básicamente controlado por factores ambientales; sin
embargo, cuando la situación es favorable el efecto de las plantas sobre el proceso es
considerable en ambas variedades, aunque sólo es estadísticamente significativo en los suelos
bajo la variedad Namoi. Nuestros resultados apoyan lo ya apuntado por Glick (1995), en el
sentido de que la rizosfera es una zona con elevada concentración de compuestos orgánicos
fácilmente degradables debido a la exudación radical, razón por la cual las bacterias fijadoras
libres encuentran en esta zona un lugar apropiado para fijar nitrógeno. Además, se detecta un
efecto diferencial en ambas variedades lo que coincide con lo ya señalado por Rovira (1956) y
Sawicka (1983), que detectan como distintas plantas creciendo en el mismo suelo y bajo las
mismas condiciones climáticas poseen distintas tasas de fijación en su rizosfera, y atribuyen
estas diferencias a la composición específica de los exudados de cada planta. Los resultados
detectados en el laboratorio nos hacen pensar que las condiciones de humedad, temperatura,
tiempo transcurrido entre los momentos de muestreo, concentración de nutrientes y densidad
radical, son factores que en conjunto han podido incidir negativamente en el proceso tanto en
los suelos bajo las plantas como en los controles. En este sentido, cabe hacer especial
mención a la disminución que, en condiciones de campo, sufren tanto el nitrógeno-amonio
como el nitrógeno-nitrato durante el período vegetativo, mientras que en condiciones de
laboratorio la concentración de estos iones aumenta o se mantiene durante este período.
Ambas formas de nitrógeno mineral inciden negativamente en el proceso (Kitoh y Shomi,
1991; Roper et al., 1994).
235
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
Una vez enterradas las plantas (T4), se detecta una acusada disminución de los niveles
de ARA en todos los suelos ensayados. El potencial oscila entre 0.3 y 0.68 nmol de etileno/g
de suelo h. La manipulación de los suelos al enterrar las plantas produce una aireación de los
mismos con una ruptura de agregados y por lo tanto una alteración de la estructura edáfica
que conduce a una disminución de espacios microarófilos, óptimos para la FLN (Hill, 1992).
Este hecho, junto con el incremento de los niveles de nitrato y amonio parecen incidir
negativamente en el proceso, como ocurría en los experimentos de laboratorio.
Los resultados de amonificación potencial y variaciones en la concentración de
amonio en el suelo siguen la misma tendencia durante el ciclo fenológico de la planta. El
suelo control, muestra valores superiores a los de los suelos bajo la influencia de la plantas en
todos los casos salvo en el control de Látigo durante la floración. Esta diferencia entre
controles es atribuible al tiempo transcurrido entre ambos muestreos de floración y por tanto,
a variaciones ambientales, ya que la época de muestreo en el control de Látigo durante la
floración de las plantas se aproxima a la época de muestreo durante la fructificación. Las
diferencias encontradas entre los suelos bajo la variedad Látigo y su control pueden deberse al
efecto amortiguador que esta planta tiene sobre la humedad y la temperatura del suelo al
tratarse de un cultivo de cobertura. Cabe mencionar en este sentido las experiencias de
Holderbaum et al. (1990) y McVay et al. (1989), dichos autores encuentran una
amortiguación en las variaciones diarias de humedad y temperatura que permiten el
mantenimiento de unas condiciones más apropiadas para la actividad de la microflora edáfica;
este efecto probablemente no se detecte bajo la variedad Namoi debido a que el muestreo se
realizó en un período anterior, cuando las diferencias térmicas son menos acusadas. Bajo las
plantas las tasas de amonificación son significativamente menores que en el control, aunque
siguen la misma tendencia, es decir, presentan su máximo en floración y a partir de ese
momento la actividad disminuye. Por tanto podemos suponer que es en este momento cuando
las condiciones de humedad y temperatura son las óptimas para el proceso. Dado que como
ya se ha indicado anteriormente no se detecta un efecto diferencial entre los suelos control y
los suelos bajo las plantas, salvo el ya comentado durante el período de floración en la
variedad Látigo, podemos asumir que las variaciones encontradas durante todo el ciclo
fenológico de las plantas vienen determinadas fundamentalmente por factores ambientales y
no por las plantas. Sin embargo, las diferencias en cada momento de muestreo entre los
tratamientos y los controles, sugieren un efecto por parte de la planta sobre el balance
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Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
inmovilización/mineralización, ya que el aporte de sustratos orgánicos nitrogenados por V.
villosa es un fuerte activador de la mineralización (McKenney et al., 1995) y no se traduce en
un aumento de la concentración de amonio y sí en un aumento en la concentración de
nitrógeno total durante el siguiente período de muestreo. Este efecto es mencionado por
numerosos autores como Broadbent y Nakashima (1967), para los que la inmovilización es un
proceso habitual en suelos agrícolas, responsable de la demora en el rendimiento de
fertilizantes.
Una vez enterrada la planta, la actividad amonificante se mantiene y las
concentraciones de amonio aumentan, lo que podría deberse a una disminución del proceso
de inmovilización, y a que en el caso de los suelos bajo la influencia de las plantas ya no
existe captación de esta forma nitrogenada por parte de la veza. Además, en los meses que
transcurren desde que se entierran las plantas hasta Octubre (T4), la precipitación es muy
reducida, y el lavado, aunque este ion no está especialmente afectado en este sentido, también
será muy reducido.
Cabe destacar que en condiciones de campo tanto en estas experiencias como en las
previas realizadas con la variedad Namoi, no se detecta un balance neto positivo en la
concentración de amonio entre el comienzo y el final del experimento. Sin embargo, en
condiciones de laboratorio, sí se detecta un balance neto final positivo, pero éste se registra
también en los controles, probablemente debido por una parte, a las condiciones de humedad
y temperatura, que son en conjunto más favorables para el proceso y por otra, a que el balance
inmovilización/mineralización es menos acusado.
La disponibilidad de amonio es uno de los principales factores reguladores de la
nitrificación (Holmes et al., 1994); por esta razón Stanford et al. (1975) señalan como factor
limitante de la nitrificación la velocidad de la mineralización. Nuestros resultados indican una
evolución en los potenciales amonificante y nitrificante muy similar, incluida la disminución
del potencial nitrificante también observada en la amonificación en el control de la variedad
Látigo durante el período de floración. Dichas actividades están íntimamente relacionadas
como también lo indican las variaciones en la concentración de amonio, por lo que nuestros
resultados apoyan la hipótesis inicialmente planteada. En los suelos control, además de existir
una mayor concentración de amonio existen también mejores condiciones para la
nitrificación, puesto que las bacterias nitrificantes no tienen que competir por el oxígeno con
las raíces (Bodelier et al., 1996). Sin embargo, hay que señalar que el aumento en las
237
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
concentraciones de amonio detectadas en T4 no repercuten sobre la nitrificación como en
casos anteriores, pero se observa tanto bajo las plantas como en los controles, un significativo
aumento en la concentración de nitratos. Este hecho podemos atribuirlo tanto al aumento de
la nitrificación como al aumento en la concentración de nitrato por una disminución en el
lavado del mismo.
Los resultados de las experiencias de laboratorio demuestran tendencias semejantes en
cuanto a la evolución de la actividad nitrificante potencial. Sin embargo, las variaciones en
los niveles de nitrógeno nitrato durante el ciclo fenológico de las plantas no son comparables
debido a la considerable actividad desnitrificante observada en el laboratorio, a diferencia de
las experiencias de campo en Montepríncipe en las que dicha actividad fue nula tanto en
floración como en fructificación.
La actividad desnitrificante potencial en los suelos estudiados sólo fue detectada en T0
y T4, cuando los niveles de nitrato alcanzan los valores significativamente más altos. Los
valores de carbono orgánico detectados en los suelos son muy bajos durante toda la
experiencia, y las épocas en las que coinciden valores bajos de carbono orgánico y de nitrato
limitan el proceso hasta hacerlo imperceptible. La desnitrificación heterótrofa requiere una
abundante fuente de carbono degradable, por tanto es un factor crítico para dicha actividad
(Bouwman y Focht, 1974; Stanford et al., 1975; Beauchamp et al., 1989). Autores como
Lalisse-Grundmann et al. (1996) señalan que cuando en el suelo existen las concentraciones
adecuadas de nitrato, la disponibilidad de carbono es el factor más importante en el control de
la desnitrificación. Una vez enterrada la planta observamos un aumento de esta actividad. Mc
Kenney et al. (1995) observan un aumento de la actividad desnitrificante bajo residuos de V.
villosa. Este incremento era mayor que el observado en suelos tratados con residuos de otras
plantas. En T4, unas condiciones ambientales de temperatura y humedad más favorables y un
aumento en la concentración de nitratos, proporcionan las condiciones adecuadas para el
incremento de esta actividad. Los restos orgánicos de V. villosa provocan la aparición de
puntos calientes donde se ve favorecida la desnitrificación (Parkin, 1987). No obstante, según
se deduce de los resultados obtenidos tanto en condiciones de laboratorio como en las pruebas
previas de campo realizadas con la variedad Namoi, el factor decisivo que controla el proceso
es la disponibilidad de materia orgánica oxidable, que según los potenciales de
desnitrificación observados en las experiencias mencionadas es aportada por V. villosa, y que
en el caso de las experiencias realizadas en las parcelas de Montepríncipe no llegan a
238
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
compensar las deficiencias en carbono orgánico oxidable de dichos suelos.
Las variaciones entre los distintos momentos de muestreo en la concentración de
nitrógeno total son significativas tanto bajo las plantas como en los controles. Tras la
disminución de nitrógeno total detectada durante el período de floración, se produce un
significativo aumento bajo las plantas durante el período de fructificación de forma que las
variaciones entre el principio y el final del cultivo, no son significativas. Estos datos junto
con los anteriormente comentados indican que el aporte de compuestos orgánicos
nitrogenados por exudación en ambas variedades, compensan las pérdidas de nitrógeno
resultantes de la actividad desnitrificante y de las pérdidas por lixiviado. Este último factor se
presenta como el principal responsable de la disminución de nitrógeno detectada en floración
debido a las abundantes precipitaciones registradas entre Abril y Junio.
La producción de CO2 aumenta a lo largo del ciclo fenológico de las plantas y es
considerablemente mayor en los suelos bajo las plantas que en los controles; el efecto más
acusado se detecta bajo la variedad Látigo. El aumento en la producción de CO2 refleja un
aumento de la actividad y/o biomasa microbiana en torno a sus raíces (Bowen y Foster, 1978;
Paul y Clark, 1989; Bowen y Rovira, 1991). Como ya observamos en las experiencias de
laboratorio, el sistema radical de Látigo presenta mayor superficie y longitud radical, lo que
podría justificar el aumento diferencial de la producción de CO2 en ambas variedades. A la
vista de los resultados podemos decir que es la exudación radical la que favorece este
aumento en la producción de CO2, ya que una vez enterradas las plantas, pese a seguir
presentando valores mayores que el control, se produce una disminución significativa. Por
tanto, los restos vegetales de ambas variedades estimulan a la población bacteriana, pero la
exudación radical debe proporcionar compuestos fácilmente asimilables por las bacterias, así
como otra serie de metabolitos que estimulen de algún modo la actividad microbiana. Los
resultados obtenidos en las parcelas de Toledo en condiciones de campo coinciden con los
encontrados en las parcelas de Montepríncipe, y ambos experimentos difieren
apreciablemente de las experiencias de laboratorio. Las razones de estas diferencias quedaron
expuestas al discutir la producción de CO2 en condiciones de laboratorio. Además, habría que
añadir que el contenido en carbono orgánico de estos suelos es cuatro veces menor que el de
los suelos empleados en las experiencias de laboratorio, por lo que el posible efecto sobre la
actividad respiratoria total se hace más patente en estos suelos.
El ACP de las actividades potenciales del ciclo del nitrógeno y producción de CO2 no
239
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
permite establecer grupos claramente definidos entre los distintos momentos de muestreo, ni
entre tratamientos. La razón es el potente efecto que sobre la distribución de las muestras
tiene la producción de CO2 en floración, fructificación y T4, que enmascara los efectos
anteriormente comentados como queda puesto de relieve mediante ANOVAs.
La variación de todos los cationes de cambio a lo largo de la experiencia se encuentra
directamente relacionada con la disminución del CIC observada durante el período
vegetativo. En general, se observa una disminución en la concentración de todos los cationes
de cambio y una disminución aún más acusada en las concentraciones de fosfato. Estos datos
apoyan lo anteriormente comentado sobre el considerable lavado de nutrientes que se produce
durante este período. Posteriormente se observan ligeras recuperaciones de los niveles de los
cationes de cambio, pero no así de fósforo y magnesio. No se pueden extraer conclusiones a
partir de estos resultados debido por una parte, al factor anteriormente comentado y por otra a
que no se detectan unas variaciones en el CIC que se puedan relacionar con las
concentraciones de nutrientes analizadas, salvo la significativa disminución del CIC
observada bajo la variedad Namoi durante el período vegetativo. Esta disminución a pesar de
ser significativa no incide sobre las concentraciones de nutrientes, aunque, sugiere una
demanda nutricional de la variedad Namoi superior a la de Látigo, hecho que puede
relacionarse por una parte con la absorción de ácidos orgánicos (Dinkelaken et al., 1989) que
actúan como agentes quelantes (Jones et al., 1994; Baziramakenga et al., 1995) y por otra,
con el mayor crecimiento de la variedad Namoi durante este período.
Nuestros resultados indican que las plantas no tienen una influencia decisiva sobre el
CIC, no obstante las variaciones de CIC y su efecto sobre la disponibilidad de cationes
solubles son, difíciles de justificar, debido a la gran cantidad de variables que inciden en la
estructura del complejo coloidal edáfico.
El ACP de los resultados fisicoquímicos permite una separación definida de las
muestras recogidas a T4 debido a bajas concentraciones de magnesio y potasio y elevadas de
nitrato. El peso de estos factores de carga no permite deducir conclusiones con respecto a los
demás parámetros. La alta concentración de nitratos presente en estas muestras junto con los
controles se corresponde con un aumento del potencial nitrificante durante este período en
todos los casos.
En cuanto a los análisis biométricos efectuados con las plantas y refiriéndonos en
primer lugar al peso de la parte aérea, podemos observar que la producción de biomasa de
240
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
Namoi alcanza su máximo en floración y se mantiene hasta fructificación (Figura 5.37). Sin
embargo, la variedad Látigo crece a lo largo de todo su ciclo fenológico, superando a Namoi,
aunque no lo hace de forma significativa en fructificación, momento en que alcanza su
máxima biomasa. Las diferencias de producción entre ambas variedades por unidad de
superficie no son significativas en ninguno de los muestreos, salvo en el período vegetativo,
donde Namoi produce una biomasa significativamente mayor que Látigo.
La concentración de nitrógeno en las raíces no muestra diferencias significativas entre
variedades. Sin embargo, la evolución durante el ciclo fenológico es distinta en ambas. En la
variedad Látigo la concentración de nitrógeno radical va disminuyendo de forma progresiva a
lo largo de su ciclo fenológico, mientras Namoi mantiene estable esta concentración hasta
floración y luego baja significativamente. Esta pérdida de nitrógeno coincide con la necrosis
nodular y con el cese del crecimiento de la planta. En Látigo, sin embargo, la disminución
de la concentración de nitrógeno entre floración y fructificación no es significativa, y la planta
sigue aumentando su biomasa en dicho período.
La cantidad de nitrógeno en la parte aérea de ambas variedades es muy similar, no
mostrando diferencias significativas. Detectamos una disminución significativa en
fructificación. Sin embargo debemos tener en cuenta que estos datos se refieren a la parte
aérea sin frutos. Podemos por tanto indicar que existe una clara traslocación del nitrógeno
hacia los frutos en este período. Es pues evidente la pérdida de calidad del forraje en
fructificación, aunque en este momento se dispone del grano, que bien puede ser incorporado
al forraje para solucionar dicho problema (dado el elevado contenido en nitrógeno de la
semilla), o asumirlo y destinar el grano a otros usos. En el contenido de nitrógeno total en los
frutos si existen diferencias significativas entre variedades, encontrándose en las semillas de
Látigo una mayor concentración.
En función de los resultados de porcentaje de alcaloides, hexosas, pentosas, FAD y
FND, las dos variedades presentan usos diferenciales. Namoi podría emplearse como forraje,
cortando la planta en floración. En esta época, la planta alcanza su máxima producción de
biomasa, contiene la mayor concentración de nitrógeno y la menor de alcaloides y hexosas,
además de que el porcentaje de fibra es menor. Las experiencias de campo de Toledo, así
como las de laboratorio indican que cuando el suelo reune las condiciones adecuadas,
fundamentalmente disponibilidad de carbono orgánico degradable, la desnitrificación se ve
claramente estimulada durante floración en la variedad Namoi. Por esta razón, el cosechado
241
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- DISCUSIÓN
de Namoi en floración avanzada o una vez transcurrida, implica significativas pérdidas de
nitrógeno por esta vía en el suelo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que durante floración
en esta variedad no se ha producido traslocación de nitrógeno a las partes aéreas. Por lo tanto
el aporte de nitrógeno al suelo durante la descomposición de las raíces podría compensar las
pérdidas de nitrógeno por desnitrificación, que podría evitarse con una adecuada aireación del
suelo.
La variedad Látigo, sin embargo, sería más útil para la producción de semillas. Las
semillas son más ricas en nitrógeno y pentosas, y poseen un menor porcentaje de hexosas
que las de Namoi. La planta durante la fructificación presenta valores más bajos de alcaloides.
Sin embargo, si se quiere utilizar como forraje, como ya hemos comentado, debemos indicar
que gran parte del nitrógeno se trasloca al fruto, que resulta muy rico en nitrógeno. Esta
variedad, además, presenta una mayor producción de biomasa en fructificación y el contenido
en fibra no varía significativamente con respecto a la floración.
242
8. CONCLUSIONES
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- CONCLUSIONES
1. En las poblaciones de V. villosa estudiadas, las bacterias que colonizan su sistema
rizosférico muestran variaciones cualitativas y cuantitativas durante el ciclo biológico de las
plantas. Este sistema
está colonizado mayoritariamente por cepas pertenecientes a los
géneros Bacillus y Pseudomonas, presentando estas últimas densidades poblacionales más
estables durante todo el ciclo biológico de las plantas.
2. En la rizosfera de V. villosa la actividad desnitrificante es realizada mayoritariamente por
bacterias pertenecientes al género Bacillus, que alcanzan sus máximos poblacionales durante
el período de crecimiento vegetativo y de floración de las plantas. Dada la disminución de
cepas con metabolismo anaerobio y microaerófilo durante el período de fructificación, se
deduce que en este período las condiciones son mas favorables para el desarrollo de cepas con
metabolismo aerobio. Sin embargo, en todas las etapas de muestreo las actividades
funcionales del ciclo del nitrógeno detectadas indican la coexistencia en el sistema rizosférico
de microhábitats con características muy distintas .
3. El análisis de la divergencia genética de las cepas pertenecientes al género Bacillus y
Pseudomonas con la técnica de RAPDs, revela la presencia de cepas con una similitud del
100 % en unos casos y menos del 90 % en otros, entre cepas recogidas en parcelas diferentes
en el mismo estado fenológico de las plantas. Estos resultados, junto con la menor
divergencia genética de las cepas de Bacillus, con respecto a Pseudomonas, sugieren una
interacción selectiva entre V. villosa y sus cepas rizobacterianas.
4. Ninguna de las cepas bacterianas ensayadas presenta un claro efecto activador o inhibidor
sobre el rendimiento de la germinación. Sin embargo, determinadas cepas pertenecientes al
género Pseudomonas adelantan el intervalo de máxima germinación, mientras que ciertas
cepas del género Bacillus lo retrasan.
5. Las pruebas biológicas realizadas con las cepas rizosféricas aisladas de poblaciones
naturales de V. villosa, demuestran la existencia de cepas con efectos sobre la fisiología de las
plantas. Dichos efectos son diferenciales según la variedad considerada.
6. Entre las cepas rizobacterianas de poblaciones naturales de V. villosa, con efectos sobre la
fisiología de las plantas, se encuentran representantes tanto del género Bacillus como del
244
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- CONCLUSIONES
género Pseudomonas. Los metabolitos producidos por dichas cepas alteran los patrones de
crecimiento del sistema radical y aéreo, sugiriendo la presencia de reguladores del
crecimiento vegetal entre otros metabolitos.
7. Las experiencias, tanto de laboratorio como de campo, demuestran que los niveles de
nutrientes a nivel edáfico están controlados, no sólo por las actividades de los
microorganismos implicados en el reciclado de nutriente, sino también por factores como
solubilidad, lixiviado, transporte y asimilación por parte de microorganismos y de plantas.
8. Ambas variedades de V. villosa inducen en las experiencias de campo un aumento en la
fijación libre de nitrógeno medida como ARA, y el efecto es especialmente acusado bajo la
variedad Namoi. El aumento de ARA ocurre en diferentes estados del ciclo fenológico de las
plantas según la variedad que se considere. El proceso se muestra especialmente sensible a las
distintas formas de nitrógeno mineral presentes en el suelo.
9. La mineralización del nitrógeno, considerando tanto la producción de amonio como su
transformación en nitrato, no es estimulada a nivel edáfico por las plantas. Los niveles de
ambos nutrientes presentan alteraciones significativas durante el ciclo fenológico de las
plantas. El balance neto en la concentración de amonio no presenta variaciones debido a
procesos de inmovilización, mientras que el de nitrato disminuye debido a procesos de
lixiviado y desnitrificación.
10. La desnitrificación está claramente activada bajo el efecto de las plantas durante el
período vegetativo en la variedad Látigo, y en floración e la variedad Namoi. El aporte de
materia orgánica por exudación, así como la disminución de la concentración de oxígeno a
nivel edáfico por respiración radical, no son capaces de compensar las limitaciones que el
suelo de las parcelas de Motepríncipe imponen al proceso.
11. Los resultados obtenidos en el análisis microbiano de la rizosfera de poblaciones naturales
de V. villosa junto con los datos de actividad desnitrificante potencial de las experiencias
245
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- CONCLUSIONES
tanto de laboratorio como de campo, sugieren un efecto alelopático metabólico directo sobre
las poblaciones rizobacterianas desnitrificantes de V. villosa.
12. El cultivo de ambas variedades de V. villosa permite el mantenimiento de los niveles de
nitrógeno total a nivel edáfico, a pesar de las variaciones en la concentración de este nutriente
que se producen durante el ciclo biológico de las plantas y de la aceleración generalizada del
ciclo del nitrógeno, que conducen a un aumento de las pérdidas de nitrógeno por
desnitrificación y lixiviado
13. Los análisis biométricos y de la dinámica del ciclo del nitrógeno, sugieren un uso
diferencial de ambas variedades. Namoi es más apropiada como planta forrajera y Látigo
como planta para grano, ya que Namoi alcanza su máxima producción y unas mejores
características nutritivas en la floración. Además, hay que tener en cuenta que bajo esta
variedad las pérdidas de nitrógeno por desnitrificación en floración son acusadas, la
concentración de nitrógeno en las raíces se mantiene estable hasta este momento, y sus frutos
son menos ricos en nitrógeno que los de la variedad Látigo. En Látigo la producción de
biomasa antes de la fructificación la hace menos rentable como planta forrajera y en este
período los niveles de nitrógeno en la parte aérea descienden significativamente.
246
9. BIBLIOGRAFÍA
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10. APÉNDICES
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
APÉNDICE A
1. Reactivos utilizados en el análisis de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
1.1 Reactivo de Nessler
Solución A
HgI2............................ 50
g
KI............................... 36.5 g
Agua destilada............
1000 mL
Solución B
KOH..........................
Agua destilada............
150 g
1000 mL
En el momento de usarlo se mezclaron volúmenes iguales de las soluciones A y B.
1.2. Reactivo de la difenilamina sulfúrica
NH(C6H5)2......................
10 g
H2SO4............................. 1000 mL
Agua destilada ...............
200 mL
2. Medios de cultivo para el análisis de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno
2.1. Solución de oligoelementos
Na2(MoO4).2H2O................... 0.05 g
K2B4O7.10H2O....................... 0.05 g
FeCl3.6H2O............................ 0.05 g
Cd(NO3)2.4H2O...................... 0.05 g
CoSO4.7H2O.......................... 0.05 g
CuSO4.5H2O.......................... 0.05 g
ZnSO4.7H2O.......................... 0.05 g
Agua destilada....................... 1000 mL
295
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
2.2. Preparación del extracto de tierra
Se preparó con tierra de la zona de muestreo recogida entre 10 y 15 cm de profundidad.
La tierra se mezcló con agua destilada en proporción 1:1 (p/v) y cada litro se enriqueció
con 1 mL de la solución de oligoelementos. La solución resultante se introdujo en el autoclave
donde permaneció una hora a 130
C. Se dejó reposar y se filtró por papel. El filtrado se
esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 115 C.
2.3. Solución salina de Winogradsky
K2HPO4............................
5.0 g
MgSO4.7H2......................
2.5 g
NaCl.................................
2.5 g
MnSO4.H2O......................
0.05 g
Fe(SO4)3...........................
0.05 g
Agua destilada..................
1000 mL
Se añadió 1 mL de la solución salina de oligoelementos a 110
ajustó el pH entre 7.0 y 7.5 con una solución de OHNa al 10 % (p/v).
2.4. Medio para microorganismos diazotróficos aerobios
Solución salina .............................
50 mL
Manitol ........................................
10 mL
Extracto de tierra .........................
10 mL
Sol. Oligoelementos .....................
1 mL
CaCO3 .........................................
0.5 gr
Agua destilada .............................
1000 mL
2.5. Medio para microorganismos diazotróficos anaerobios
Solución salina...........................
50 mL
KH2PO4.....................................
0.75 g
NaOH(0.1N)..............................
33 mL
Glucosa......................................
10 g
Extracto de tierra .......................
10 mL
296
C, y posteriormente se
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Solución de oligoelementos.........
Agua destilada ............................
1
mL
1000 mL
2.6. Medio para amonificantes
Solucion salina............................
50
mL
Asparragina.................................
0.2 g
Solucion de oligoelementos.........
1
mL
Agua destilada ............................
950
mL
2.7. Medio para desnitrificantes
Solución salina............................
50 mL
KNO3..........................................
2
g
Glucosa.......................................
10
g
CaCO3........................................
5
g
Solución de oligoelementos.........
1
mL
Agua destilada ............................
1000 mL
3. Tampones para electroforesis de DNA
3.1. Tampón TAE
Tris............................................
24.2 g
Ácido acético glacial..................
5.71 g
EDTA (pH 8.0) 0.5M................
10
Agua destilada...........................
Hasta 100 mL
mL
3.2. Tampón de carga
Azul de Bromofenol...................
0.25 %
Sacarosa en agua destilada.........
40 % (p/v)
297
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
4. Crone sin Nitrógeno
ClK.................................
0.75 g
CaSO4.............................
0.5 g
MgSO4............................
0.5 g
Ca(PO4)2.........................
0.25 g
Fe(PO4)2.........................
0.25 g
Disolver 2.5 g en 1 L de agua destilada.
5. Medio de cultivo para Rhizobium YMA
5.1. Agar YMA
PO4HK2..........................
0.4 g
PO4HK...........................
0.1 g
SO4Mg...........................
0.2 g
ClNa...............................
0.1 g
Cl2Ca..............................
0.04 g
Extracto de levadura.......
0.8-1 g
Manitol...........................
10
g
Agar...............................
15
g
Agua destilada................
Hasta 1 L
Llevar a pH 7.2
5.2. Caldo de cultivo YMA
PO4HK2..........................
0.4 g
PO4HK...........................
0.1 g
SO4Mg...........................
0.2 g
ClNa...............................
0.1 g
Extracto de levadura.......
0.8-1 g
Manitol...........................
10
Agua destilada................
Hasta 1 L
g
Llevar a pH 7.2
298
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
APÉNDICE 1
Resultados de los análisis fisicoquímicos en los suelos donde crecieron las dos
variedades de V. villosa y el control
Tabla I. Resultados de amonio (µg/g de suelo) en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
el control en los cuatro tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
4.05 ±0.22
4.05 ±0.22
4.05 ±0.22
TIEMPO 1
7.08 ±0.02
8.29 ±0.03
7.94 ±0.35
TIEMPO 2
7.86 ±1.16
24.38 ±0.85
14.75 ±2.20
TIEMPO 3
70.01 ±2.80
35.00 ±3.35
46.41 ±1.70
Tabla II. Resultados de nitrato (µg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica
µg/g de suelo
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
18.566 ±2.553
18.566 ±2.553
18.566 ±2.553
TIEMPO 1
112.100 ±1.710
81.400 ±7.780
95.200 ±0.535
TIEMPO 2
111.850 ±1.580
39.850 ±2.528
37.150 ±1.622
TIEMPO 3
100.616 ±11.931
43.133 ±2.026
85.516 ±4.416
299
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla III. Resultados de nitrógeno total (mg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica
mg/g de suelo
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
1 ±0.023
1 ±0.023
1 ±0.023
TIEMPO 1
1.33 ±0.27
2.66 ±0.27
2.66 ±0.27
TIEMPO 2
1 ±0.094
2.33 ±0.27
2 ±0.124
TIEMPO 3
0.73 ±0.12
1 ±0.10
1.33 ±0.27
Tabla IV. Resultados de carbono orgánico (%)en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
0.84 ±0.02
0.84 ±0.02
0.84 ±0.02
TIEMPO 1
0.77 ±0.03
0.82 ±9.4x10-3
0.99 ±0.01
TIEMPO 2
0.63 ±0.01
0.78 ±9.4x10-3
0.89 ±0.03
TIEMPO 3
0.73 ±5.44x10-3
0.83 ±0.02
0.97 ±0.02
Tabla V. Resultados de pH en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el control en los tres
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de tres réplicas y
tres repeticiones por réplica.
Unidades de pH
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
6.36 ±0.06
6.36 ±0.06
6.36 ±0.06
TIEMPO 1
6.31 ±0.01
5.91 ±7.2x10-3
5.93 ±0.02
TIEMPO 2
5.49 ±0.04
5.95 ±0.02
5.81 ±0.03
TIEMPO 3
5.43 ±0.05
5.47 ±0.01
5.72 ±0.03
300
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla VI. Resultados de C.I.C. (meq/100 g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V.
villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
meq/100 g de suelo
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
7.433 ±0.259
7.433 ±0.259
7.433 ±0.259
TIEMPO 1
4.933 ±0.054
4.866 ±0.196
4.866 ±0.054
TIEMPO 2
6.400 ±0.200
5.000 ±0.090
5.133 ±0.054
TIEMPO 3
5.930 ±0.190
6.333 ±0.144
7.266 ±0.331
Tabla VII. Resultados de fósforo (µg/g de suelo) en el suelo donde crecieron las dos variedades de V. villosa y
el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
22.50 ±1.08
22.50 ±1.08
22.50 ±1.08
TIEMPO 1
19.50 ±0.62
24.83 ±0.60
25.16 ±0.95
TIEMPO 2
22.83 ±0.95
18.66 ±0.83
28.33 ±1.30
TIEMPO 3
21.33 ±0.36
24.16 ±0.36
29.16 ±0.60
301
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Resultados de los análisis de las actividades biológicas potenciales del ciclo del nitrógeno
y producción de CO2 en los suelos donde crecieron las dos variedades de V. villosa y el
control
Tabla VIII. Resultados de ARA potencial (nmol de etileno/g de suelo y hora) en el suelo donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica
nmol de etileno/g y hora
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
34.085 ±2.618
34.085 ±2.618
34.085 ±2.618
TIEMPO 1
10.956 ±0.813
6.516 ±0.113
8.250 ±0.444
TIEMPO 2
4.203 ±0.138
4.562 ±0.029
6.310 ±0.120
TIEMPO 3
0.457 ±0.110
1.231 ±0.307
3.729 ±0.230
Tabla IX. Resultados de amonificación potencial (µg/g de suelo y día de incubación) en el suelo donde
crecieron las dos variedades de V. villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece
en cursiva. Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo y día
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
23.036 ±0.421
23.036 ±0.421
23.036 ±0.421
TIEMPO 1
25.304 ±0.107
31.847 ±0.637
31.966 ±0.525
TIEMPO 2
98.304 ±4.542
64.768 ±2.642
103.086 ±4.508
TIEMPO 3
161.528 ±9.925
165.331 ±8.387
187.751 ±11.682
302
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla X. Resultados de nitrificación potencial (µg/g de suelo y día de incubación) en el suelo donde crecieron
las dos variedades de V. villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo y día
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
4.7725 ±0.0582
4.7725 ±0.0582
4.7725 ±0.0582
TIEMPO 1
3.4358 ±0.5545
3.7808 ±0.5931
3.2933 ±0.0482
TIEMPO 2
2.8683 ±1.1931
6.1550 ±0.3368
5.2925 ±0.0482
TIEMPO 3
17.990 ±0.857
4.5891 ±0.0639
2.6533 ±0.2328
Tabla XI. Resultados de desnitrificación potencial (nmol de N2O/g de suelo y hora) en el suelo donde crecieron
las dos variedades de V. villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol de N2O/g y h
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
0.00 ±0.00
0.00 ±0.00
0.00 ±0.00
TIEMPO 1
1.329 ±0.286
0.883 ±0.072
0.682 ±0.100
TIEMPO 2
2.164 ±0.226
2.774 ±0.425
0.00 ±0.00
TIEMPO 3
3.646 ±0.188
0.00 ±0.00
0.00 ±0.00
Tabla XII. Resultados de producción de CO2 (nmol de CO2/g de suelo y hora) en el suelo donde crecieron las
dos variedades de V. villosa y el control en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol de CO2/g y hora
CONTROL
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 0
279.886 ±5.395
279.886 ±5.395
279.886 ±5.395
TIEMPO 1
238.319 ±13.677
178.650 ±3.460
219.709 ±9.264
TIEMPO 2
82.286 ±1.316
84.071 ±5.244
108.943 ±5.009
TIEMPO 3
57.896 ±3.147
54.219 ±1.848
61.957 ±3.114
303
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Resultados del análisis biométrico, nitrógeno total y ARA de los nódulos en las dos
variedades de V. villosa
Tabla XIII. Resultados de biomasa (g de planta seca) de las dos variedades de V. villosa en los tres tiempos de
muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres
repeticiones por réplica.
g (pie de planta seca)
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 1
0.0826 ±0.0113
0.0723 ±0.0107
TIEMPO 2
0.2303 ±0.0369
0.2800 ±0.0400
TIEMPO 3
0.3948 ±0.0288
0.4772 ±0.0771
Tabla XIV. Resultados de superficie radical (cm2) de las dos variedades de V. villosa en los tres tiempos de
muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres
repeticiones por réplica.
cm2
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 1
4.689 ±0.295
4.9853 ±1.325
TIEMPO 2
6.1953 ±1.108
9.765 ±4.120
TIEMPO 3
8.8838 ±0.902
14.052 ±0.575
Tabla XV. Resultados de nitrógeno total (mg/g de planta seca) de la parte aérea de las dos variedades de V.
villosa en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
mg/g de planta seca
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 1
43.3333 ±2.7217
33.3333 ±2.7217
TIEMPO 2
30 ±0.943
40 ±1.414
TIEMPO 3
33.3333 ±2.7217
26.6666 ±2.7217
304
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla XVI. Resultados de nitrógeno total (mg/g de raíz) de la parte radical de las dos variedades de V. villosa
en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de
tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
mg/g de planta seca
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 1
13.3333 ±2.7217
10 ±1.414
TIEMPO 2
10 ±0.943
10 ±0.471
TIEMPO 3
10 ±0.816
16.6666 ±5.4434
Tabla XVII. Resultados de ARA (nmol de etileno /g y hora) de los nódulos de las dos variedades de V. villosa
en los tres tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de
tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol de etileno /g y hora
NAMOI
LÁTIGO
TIEMPO 1
2871.247±369.359
4181.059 ±583.268
TIEMPO 2
0.0 ±0.000
23439.846 ±5155.154
TIEMPO 3
0.0 ±0.000
0.00 ±0.00
305
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
APÉNDICE 2
Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos de Toledo
Tabla I. Caracterización fisicoquímica de los suelos. A la derecha de cada dato, en cursiva,
aparece el error estándar y una letra que indica las diferencias entre momentos de muestreo.
Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
Amonio
Nitrato
(µg/g suelo)
(µg/g suelo)
pH
Carbono
Nitrógeno Total
(mg/g suelo)
Orgánico (%)
T0
14.83
154.33 ±30.59 5.18 ±0.05 2.83 ±0.19 a
4.22 ±0.20 a
Floración
16.33
768.27 ±82.42 5.08 ±0.05 3.36 ±0.20 a
4.37 ±0.44 a
Fructificación
24.00
594.63 ±83.11 4.88 ±0.19 2.90 ±0.30 a
3.04 ±0.54 a
Resultados de los análisis de las actividades biológicas del ciclo del nitrógeno y
producción de CO2 en condiciones potenciales y de campo en los suelos de Toledo
Tabla II. Resultados de las actividades potenciales del ciclo del nitrógeno. A la derecha de
cada dato, en cursiva, aparece el error estándar y una letra que indica las diferencias entre
momentos de muestreo. Letras iguales indican la ausencia de diferencias significativas.
Amonificación Nitrificación Desnitrificación
(µg NH4+/g día)
(µg NO3-/g día)
(nmol N2O/g h)
CO2
(nmol CO2/g h)
T0
358.39 ±10.77
5.94 ±0.10 a
5.43 ±1.08 a
175.92
0.95 ±0.05
Floración
349.89 ±11.65
-26.35 ±6.97
8.76 ±1.28 a
99.66 ±11.41
0 ±0 b
Fructificación
271.38 ±30.38
-27.31 ±4.07
12.89 ±2.90 a
279.41
7.25 ±1.25
306
ARA
(nmol etileno/g
h)
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla III. Resultados de las actividades del ciclo del nitrógeno en condiciones de campo en
los suelos. A la derecha de cada dato, en cursiva, aparece el error estándar y una letra que
indica las diferencias entre momentos de muestreo. Letras iguales indican la ausencia de
diferencias significativas.
Desnitrificación
CO2
ARA
(nmol N2O/g h)
(nmol CO2/gn)
(nmol etileno/g h)
T0
0±0a
42.69 ±9.30 a
0±0
Floración
27.03 ±4.28 b
214.97 ±28.60 b
0±0
Fructificación
10.68 ±1.54 c
269.76 ±20.96 b
0±0
APÉNDICE 3
307
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Resultados de los análisis fisicoquímicos de los suelos de las parcelas de
experimentación donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles
Tabla I. Resultados de amonio en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
Control Namoi
5.19 ±0.58
0.95 ±0.02
4.83 ±0.28
0.60 ±0.08
7.05 ±0.49
Namoi
5.19 ±0.58
0.58 ±0.07
2.47 ±0.18
1.15 ±0.02
7.60 ±0.43
Control Látigo
5.19 ±0.58
0.95 ±0.25
2.29 ±0.25
0.60 ±0.08
7.05 ±0.49
Látigo
5.19 ±0.58
0.52 ±0.04
1.53 ±0.23
1.07 ±0.17
3.17 ±0.18
Tabla II. Resultados de nitrato en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
Control Namoi 25.78 ±1.49
7.50 ±0.62
6.00 ±0.62
22.00±0.47
36.33 ±1.60
25.78 ±1.49
8.30 ±0.95
7.00 ±0.41
13.83 ±1.19
42.85 ±3.56
Control Látigo 25.78 ±1.49
7.50 ±0.62
22.00 ±0.47
36.33 ±1.60
25.78 ±1.49
5.17 ±0.36
13.67
±0 68
17.67
±0 98
12.50 ±1.73
76.00 ±0.85
Namoi
Látigo
T0
308
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla III. Resultados de nitrógeno total en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
mg/g de suelo
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
Control Namoi
1.07 ±0.08
0.93 ±0.08
0.33 ±0.05
0.67 ±0.04
0.53 ±0.03
Namoi
1.07 ±0.08
1.00 ±0.02
0.35 ±0.04
0.90 ±0.00
0.58 ±0.04
Control Látigo
1.07 ±0.08
0.93 ±0.08
0.35 ±0.02
0.67 ±0.04
0.53 ±0.03
Látigo
1.07 ±0.08
0.92 ±0.08
0.55 ±0.04
0.92 ±0.01
0.48 ±0.04
Tabla IV. Resultados de carbono orgánico en los suelos de las parcelas de experimentación
de Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
T0
Control Namoi
0.22 ±0.02
Namoi
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
0.18 ±0.004 0.17 ±0.03
0.20 ±0.04
0.23 ±0.02
0.22 ±0.02
0.24 ±0.04
0.16 ±0.02
0.21 ±0.03
0.17 ±0.00
Control Látigo
0.22 ±0.02
0.18 ±0.004 0.17 ±0.02
0.20 ±0.04
0.23 ±0.02
Látigo
0.22 ±0.02
0.25 ±0.01
0.26 ±0.06
0.24 ±0.00
0.15 ±0.02
Tabla V. Resultados de pH en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
309
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Unidades de
pH
Control Namoi
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
8.01 ±0.02
8.12 ±0.03
7.88 ±0.02
7.94 ±0.057
Namoi
8.01 ±0.02
8.20 ±0.03
8.05 ±0.02
7.94 ±0.021
Control Látigo
8.01 ±0.02
8.12 ±0.03
7.88 ±0.02
7.94 ±0.057
Látigo
8.01 ±0.02
8.30 ±0.02
8.21
±0 007
8.16
±0 009
7.99
±0 006
7.88 ±0.01
8.05 ±0.04
7.99 ±0.04
Tabla VI. Resultados de CIC en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
meq/g de suelo
T0
Vegetativo
Control Namoi 31.30 ±2.03 18.07 ±0.55
Namoi
31.30 ±2.03 14.37 ±0.03
Control Látigo 31.30 ±2.03 18.07 ±0.55
Látigo
31.30 ±2.03 18.27 ±0.03
Floración
Fructificación
T4
18.80
±0 59
16.00
±0 77
19.67
±1 60
19.93
±1 41
19.40 ±1.73
17.87 ±1.19
17.27 ±0.86
20.33 ±0.67
19.40 ±1.73
17.87 ±1.19
19.85 ±0.56
20.44 ±1.30
Tabla VII. Resultados de potasio en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
T0
Vegetativo
Control Namoi 125.0 ±0.00 83.33 ±3.40
Namoi
125.0 ±0.00
75.0 ±0.00
Control Látigo 125.0 ±0.00 83.33 ±3.40
Látigo
125.0 ±0.00 66.67 ±6.80
Floración
Fructificación
T4
87.50
±0 00
87.50
±0 00
100.0
±0 00
116.7
±13 61
91.67 ±3.40
75.0 ±0.00
83.33 ±3.40
70.0 ±4.08
91.67 ±3.40
75.0 ±0.00
87.50 ±5.89
115.0 ±14.72
Tabla VIII. Resultados de calcio en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
310
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
T0
Control Namoi
5649.7
±101 6
5649.7
±101 6
5649.7
±101 6
5649.7
±101 6
Namoi
Control Látigo
Látigo
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
4916.7
4958.3
5263.9
5000 ±117.9
±136 1
±148 3
±435 83
4466.7
5250 ±155.9 5125 ±212.5 5333.3 ±122.7
±13 6
4916.7
5166.7
5263.9
5000 ±117.9
±136 1
±278 5
±435 83
5066.7
5083.3
5250 ±328.1 5416.7 ±90.0
±90 0
±36 0
Tabla IX. Resultados de magnesio en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
T0
Vegetativo
Control Namoi 260.9 ±5.22 166.7 ±9.00
260.9 ±5.22
150.0
±10 21
Control Látigo 260.9 ±5.22 166.7 ±9.00
Namoi
Látigo
260.9 ±5.22 145.8 ±6.80
Floración
Fructificación
T4
130.8
±19 77
129.2
±11 92
177.5
±2 04
170.8
±7 85
122.5 ±15.88
91.67±3.40
136.7 ±6.76
89.17 ±0.68
122.5 ±15.88
91.67 ±3.40
146.7 ±15.38
95.83 ±5.81
Tabla X. Resultados de fósforo en los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg/g de suelo
T0
Control Namoi 18.33 ±2.27
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
3.17 ±0.14
0.67 ±0.14
0.83 ±0.27
1.19±0.09
311
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
18.33 ±2.27
1.00 ±0.14
2.00 ±0.36
0.00 ±0.00
1.2 ±0.12
Control Látigo 18.33 ±2.27
3.17 ±0.14
1.50 ±0.47
0.83 ±0.27
1.19 ±0.09
18.33 ±2.27
1.67 ±0.28
0.67 ±0.16
0.50 ±0.00
1.37 ±0.07
Namoi
Látigo
Resultados de los análisis de las actividades biológicas potenciales del ciclo del nitrógeno
y producción de CO2 en los suelos de las parcelas de experimentación donde crecieron
las dos variedades de V. villosa y los controles
Tabla XI. Resultados del ARA potencial de los suelos de las parcelas de experimentación de
Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los controles en los 5
tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la
media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol etileno/g suelo
h
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
6.65 ±0.54
0.30 ±0.03
0.95 ±0.11
10.24 ±0.28
0.36 ±0.03
Control Látigo 14.83 ±0.98 0.10 ±0.001 6.47 ±1.32
6.65 ±0.54
0.30 ±0.03
8.08 ±0.15
0.68 ±0.04
Control Namoi 14.83 ±0.98 0.10 ±0.001 0.35 ±0.06
Namoi
Látigo
14.83 ±0.98
14.83 ±0.98
0.22 ±0.03
0.16 ±0.03
312
8.18 ±0.37
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla XII. Resultados del potencial amonificante de los suelos de las parcelas de
experimentación de Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los
controles en los 5 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg NH4+/g suelo día
T0
Vegetativo
Control Namoi 57.66 ±5.00 68.00 ±1.63
Namoi
57.66 ±5.00 53.33 ±1.36
Control Látigo 57.66 ±5.00 68.00 ±1.63
Látigo
57.66 ±5.00 51.00 ±2.87
Floración
Fructificación
T4
84.67
±4 25
66.67
±2 18
58.00
±0 94
70.00
±0 94
62.00 ±1.63
57.76 ±5.09
44.00 ±4.90
42.24 ±5.51
62.00 ±1.63
57.76 ±5.09
44.67 ±0.54
43.36 ±4.13
Tabla XIII. Resultados del potencial nitrificante de los suelos de las parcelas de
experimentación de Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los
controles en los 5 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
µg NO3-/g suelo día
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
Control Namoi
3.54 ±0.20
3.33 ±0.85
3.93 ±0.17
2.57 ±0.13
3.35 ±0.30
Namoi
3.54 ±0.20
1.03 ±0.03
1.98 ±0.32
0.71 ±0.17
5.88 ±0.09
Control Látigo
3.54 ±0.20
3.33 ±0.85
2.53 ±0.54
2.57 ±0.13
3.35 ±0.30
Látigo
3.54 ±0.20
0.83 ±0.06
1.60 ±0.13
0.81 ±0.10
4.32 ±0.17
313
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Tabla XIV. Resultados del potencial desnitrificante de los suelos de las parcelas de
experimentación de Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los
controles en los 5 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol N2O/g suelo h
T0
Vegetativo
Floración
Fructificación
T4
Control Namoi
2.12 ±0.05
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
1.97 ±0.08
Namoi
2.12 ±0.05
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
3.41 ±0.38
Control Látigo
2.12 ±0.05
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
1.97 ±0.08
Látigo
2.12 ±0.05
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
0.0 ±0.00
7.12 ±0.58
Tabla XV. Resultados de producción de CO2 potencial de los suelos de las parcelas de
experimentación de Montepríncipe donde crecieron las dos variedades de V. villosa y los
controles en los 5 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
nmol CO2/g suelo h
T0
Vegetativo
Control Namoi 33.83 ±1.58 12.23 ±0.60
Namoi
33.83 ±1.58 19.86 ±1.98
Control Látigo 33.83 ±1.58 12.23 ±0.60
Látigo
33.83 ±1.58 15.66 ±0.55
Floración
Fructificación
T4
24.22
±0 99
24.88
±1 60
33.55
±6 75
98.05
±11 0
50.32 ±1.01
34.54 ±0.98
100.52 ±8.04
55.84 ±1.53
50.32 ±1.01
34.54 ±0.98
188.54 ±7.36
120.00 ±1.86
Resultados del análisis biométricos y bioquímicos en las dos variedades de V. villosa
Tabla XVI. Peso de la parte aérea de las dos variedades de V. villosa en los 3 tiempos de
muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores corresponden a la media de tres
réplicas y tres repeticiones por réplica.
g
Vegetativo
Floración
314
Fructificación
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
Namoi
7.886 ±0.45
Látigo
5.276 ±0.31
55.15 ±1.73
61.71
±13 07
43.17
±8 94
65.93 ±19.16
Tabla XVII. Resultados de concentración de nitrógeno en las raíces de las dos variedades de
V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
mg/g de planta
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
21.8 ±2.55
20.4 ±0.25
7.32 ±1.13
Látigo
28.77 ±4.79
21.80
±0 48
11.07 ±0.79
Tabla XVIII. Resultados de concentración de nitrógeno en la parte aérea de las dos
variedades de V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
Namoi
Látigo
Vegetativo
Floración
32.00 ±5.83 33.67±3.4
7
30.47
31.77 ±1.11
±0 96
Fructificación
7.56 ±1.01
10.00 ±0.00
Tabla XIX. Resultados del porcentaje de alcaloides en la parte aérea de las dos variedades de
V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
0.02 ±0.001
0.006 ±0.001
Látigo
0.036
±0 002
0.002
±0 03
0.02
±0 002
0.009 ±0.001
Tabla XX. Resultados del porcentaje de azúcares en la parte aérea de las dos variedades de V.
villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
315
Estudio de las rizobacterias de V. villosa: optimización de la productividad.- APÉNDICES
%
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
3.25 ±0.14
9.60 ±0.21
5.39 ±0.57
Látigo
6.45 ±0.41
8.43 ±0.44
7.60 ±0.84
Tabla XXI. Resultados del porcentaje de pentosas en la parte aérea de las dos variedades de
V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva. Los valores
corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
0.26 ±0.008 0.77 ±0.06
0.47 ±0.04
Látigo
0.65 ±0.05
0.30 ±0.04
0.77 ±0.01
Tabla XXII. Resultados del porcentaje de fibra ácido detergente en la parte aérea de las dos
variedades de V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
22.07 ±1.36
41.31 ±0.52
Látigo
22.85 ±1.64
24.23
±0 47
39.33
±1 46
42.89 ±1.58
Tabla XXIII. Resultados del porcentaje de fibra neutro detergente en la parte aérea de las dos
variedades de V. villosa en los 3 tiempos de muestreo. El error estándar aparece en cursiva.
Los valores corresponden a la media de tres réplicas y tres repeticiones por réplica.
%
Vegetativo
Floración
Fructificación
Namoi
31.53 ±0.40
54.52 ±2.25
Látigo
36.77 ±2.86
32.23
±2 24
45.31
±1 66
51.91 ±1.41
316