“LA UNICA HERRAMIENTA QUE ESTANDARIZA LOS BANCOS DE SANGRE : CALIDAD” ALDREDO MARTINEZ LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS CEMIC “ La única fuente de obtención de sangre es el ser humano, por lo cual la misma debe emplearse en condiciones de equidad, raciocinio e igualdad, de este modo la disponibilidad de la misma y sus componentes se transforman en una problemática de orden público e interés nacional dada su calidad de irreemplazable y necesaria”. Marcos Andrés Bujas; “Revista Argentina de Transfusión”, prologo de la editorial “Guias Nacionales para el uso apropiado de sangre y sus hemocomponentes” Volumen XXXIII/ Nº 3,4/ 2007, Pag. 193 UN HIJO LE ESCRIBE A SU MADRE: “MAMÁ AYUDAME A SABER QUE PASA CON ESTE AMIGO QUE NO ALCANZO A ENTENDERLO, PORQUE SE DIVORCIÓ DE SU MUJER SE ENAMORÓ DE LA HERMANA DE SU CUÑADA QUE ES MADRE DE SUS SOBRINOS, NIETOS DE SU EX SUEGRO” LA MADRE LE CONTESTA A SU HIJO: “NO SE SI PUEDO AYUDARTE HIJO MIO, PORQUE TAMBIEN YO TENGO ALGUNAS INCOGNITAS, YO SE QUE ERES MI HIJO, PERO YO ESTUVE ENAMORADA DE TU PADRE, QUE FUE MI CUÑADO, AUNQUE NO ERA EL TIO DE TUS PRIMOS PERO SI EL HIJO DE TU ABUELO Y EL HERMANO DE MI CUÑADA” NO ENTENDER!! RESULTADOS QUE DEBEMOS HACER? EN EL BANCO DE SANGRE EXISTEN MÉTODOS: -CUANTITATIVOS - CUALITATIVOS Métodos Cualitativos : Definición METODOS CUALITATIVOS RESPUESTA BINARIA: SI - NO PRESENCIA - AUSENCIA POR ARRIBA DE UNA DETERMINADO NIVEL (CONCENTRACIÓN)a EXISTEN GUÍAS CLARAMENTE DEFINIDAS PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS CUANTITATIVOS. NO EXISTEN LINEAMIENTOS CLAROS PARA LOS MÉTODOS CUALITATIVOS . LOS PARÁMETROS DE DESEMPEÑO QUE CARACTERIZAN A LOS MÉTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS SON DISTINTOS. VALIDACION VERIFICACION Validación. Definición VALIDACION ES LA CONFIRMACIÓN MEDIANTE EL EXAMEN Y LA PROVISIÓN DE UNA EVIDENCIA OBJETIVA DE QUE SE HAN SATISFECHO UNOS REQUISITOS PARTICULARES PARA UN USO PRETENDIDO Y ESPECIFICO Verificación. Definición “Verificar las especificaciones provistas por el fabricante y asumimos que el ensayo puede ser incorporado al laboratorio” DEFINICION DE VALIDACION SEGUN LA NORMA ISO 8402 LAS PREGUNTAS A CONSIDERAR SON: -CUMPLE ESE ENSAYO CON NUESTROS REQUERIMIENTOS DE CALIDAD? -DE ACUERDO A LOS PARÁMETROS DE DESEMPEÑO VOLCADOS POR EL FABRICANTE EN SUS INSERTOS (QUE SE TRANSFORMARAN EN NUESTRAS ESPECIFICACIONES A VERIFICAR),¿PODEMOS DECIR QUE EN FORMA TEÓRICA EL ENSAYO CUMPLE CON NUESTROS REQUERIMIENTOS DE CALIDAD - ¿CÓMO PODEMOS ASEGURAR ESTO? FABRICANTE VERIFICACION VALIDACION PARAMETROS DE DESEMPEÑO BIAS, CV, RANGO REPORTABLE SE INCORPORA AL BANCO DE SANGRE “Los métodos cualitativos o semi-cualitativos se suelen emplear como métodos de screening” Separan o discriminan muestras de un grupo más grande. -Uno o más analitos por encima o por debajo de un valor preestablecido. - Este valor preestablecido puede haber sido establecido de distintas formas: 1) Organismo oficial 2) Control de Calidad Interno 3) Requerimientos del Cliente VALOR DE CORTE CUT OFF Como pueden Verificarse los parámetros de un ENSAYO ESTÁNDAR INTERNACIONAL PANELES DE SEROCONVERSIÓN MUESTRAS CLINICAS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA LA VALIDACION Y/O VERIFICACION DE UNA PRUEBA Parámetros de Desempeño: -Veracidad: “Se define como el grado de acuerdo entre una cantidad medida o calculada y a su valor estimado (mejor estimación del valor verdadero), mediante análisis de materiales de referencia o comparación de resultados con los obtenidos por un método de Referencia.” Precisión LA PRECISIÓN ES CUAN CERCA LOS VALORES MEDIDOS ESTÁN UNOS DE OTROS. Precisión en condiciones de repetibilidad (Sr, SDr) - El mismo procedimiento de medida - El mismo laboratorio - El mismo operador - El mismo equipo - Repeticiones en un intervalo corto de tiempo “Es lo que comúnmente denominamos precisión intra corrida o intra serie” VALOR DE CORTE : “CUT Off” “ES EL UMBRAL ESTABLECIDO POR EL FABRICANTE POR ENCIMA DEL CUAL EL TEST ES POSITIVO Y POR DEBAJO DEL CUAL EL TEST ES NEGATIVO “ CUT OFF : 50%(+)- 50% (-) C50 VALOR DE CORTE “CUT OFF” RESPUESTA NEGATIVA IDEAL RESPUESTA POSITIVA C= 0,02 CONCENTRACION REAL ZONA DE VERDADEROS NEGATIVOS ZONA DE FALSOS POSITIVOS ZONA DE FALSOS NEGATIVOS C= 0,02 ZONA DE VERDADEROS POSITIVOS CONCENTRACION CURVA DE IMPRESICION CONCENTRACIONES DEL ANALITO CERCANO AL CUT OFF INTERVALO 95 % INTERVALO C5-C95 INTERVALO 95% (C5-C95) C5 5%(+) 95%(-) CUT OFF- (C5-C95) 50%(+) 50%(-) C95 95%(+) 5%(-) VERIFICACION DE PARAMETROS DE ENSAYOS CON MUESTRAS CLINICAS 1- Preparar tres tipos de muestras una con la Concentración del cut off C50 y las otras dos con un rango de concentraciones 20% por arriba del cut off y 20% por debajo de manera de poder hacer 40 replicados sobre la misma muestra 2-Las muestras deben testearse 40 veces o más por duplicado y determinar el porcentaje de resultados positivos y negativos ES EL C50 PREPARADO EL CORRECTO ? REPLICADOS C50 REPLICADOS (+) N=40 13 32.5 27 67.5 C50 REPLICADOS C50 n=40 % (+) 18 A 22 (+) C50 INCONSISTENTE 45 % A 55% CONSISTENTE EL RANGO DE CONCENTRACION +20% -20% CONTIENE EL INTERVALO C5-C95 ? 1- SI 35/40 (87.5%) RESULTADOS (+) ESTAN DENTRO DEL RANGO +20% Y 35/40 (87.5%) DE RESULTADOS NEGATIVOS ESTAN DENTRO DEL RANGO -20%. EL RANGO +20% -20% ESTA DENTRO DEL INTERVALO C5-C95 2- SI 36/40 (90%) RESULTADOS (+) ESTAN DENTRO DEL RANGO +20% Y 36/40 (90%) DE RESULTADOS NEGATIVOS ESTAN DENTRO DEL RANGO -20% . EL RANGO +20% -20% CONTIENE EL INTERVALO C5-C95 3- SI 36/40 (90%) RESULTADOS (+) ESTAN DENTRO DEL RANGO +20% Y 35/40 (87.5%) DE RESULTADOS NEGATIVOS ESTAN DENTRO DEL RANGO -20% . EL RANGO +20% -20% ESTA PARCIALMENTE DENTRO DEL INTERVALO C5-C95 4- SI 35/40 (87.5%) RESULTADOS (+) ESTAN DENTRO DEL RANGO +20% Y 36/40 (90%) DE RESULTADOS NEGATIVOS ESTAN DENTRO DEL RANGO -20% . EL RANGO +20% -20% ESTA PARCIALMENTE DENTRO DEL INTERVALO C5-C95 Falso Positivo (FP) “Muestras (+) por el “test de screening” y (-) por el método de referencia” Falso Negativo (FN) “Muestras (-) por el “test de screening” y (+) por el método de referencia” Tasa de Falsos Positivos “Probabilidad de que una muestra con valor verdadero negativo de un valor positivo por el test de screening” FP TASA DE FP = FP + TN FP: Falso Positivo FN: Falso Negativo TP: Positivo Verdadero TN: Negativo Verdadero Tasa de Falsos Negativos “Probabilidad de que una muestra con valor verdadero positivo de un valor negativo por el test de screening” FN TASA DE FALSON NEGATIVOS = FN + TP TABLA DE CONTINGENCIA Método X Diagnóstico Clínico Positivo Negativo Total Positivo A B A+B Negativo C D C+D Total A+C B+D N S= 100% (A/A+C) PVP= 100%{A/(A+B)} E=100% (D/B+D) PVN= 100%{D/(C+D)} EE= 100%{(A+D)/N} CONTROL CALIDAD EN HERRAMIENTAS MOLECULARES FLUJO DE TRABAJO EN EL USO DE HERRAMIENTAS MOLECULARES Pre analítico Toma de muestra Extracción ADN/ ARN Almacenamiento Analítico Preparación reacción PCR Amplificación Detección Post analítico Informe del resultado Interpretación DESAFÍOS DEL CONTROL CALIDAD EN MÉTODOS MOLECULARES • Nuevas tecnologías y de rápida evolución • Altas expectativas de precisión en pruebas génicas • Falta de materiales de control de calidad y de calibradores estandarizados • Posible contaminación de muestras, equipos y aerosoles • Presencia de inhibidores de amplificación • etc. Basic QC Practice ,3er edicion. Westgard INCORPORACIÓN DE NUEVO ENSAYO MOLECULAR ¿POR DONDE EMPIEZO? • Revisar bibliografía disponible • Establecer la población a la que se le realizara la prueba • Seleccionar metodología apropiada para la enfermedad o condición a evaluar • Establecer las especificaciones analíticas y determinar el procedimiento de control de calidad • Implicancias del ensayo y limitaciones Good Laboratory Practices for Molecular Genetic Testing for Heritable Diseases and Conditions CDC. MMWR June 12, 2009 INCORPORACIÓN NUEVO ENSAYO MOLECULAR • Validación/ Verificación analítica • Validación clínica CONTROL DE CALIDAD :DISEÑADO PARA CONTROLAR … Integridad de la muestra (DNA, RNA) Preparación de la muestra, amplificación, detección. Calibradores y controles Documentación, Documentación, interpretación e informe interpretación e informe ETAPA PRE ANALÍTICA SOLICITUD DEL TEST- TIPO Y TOMA DE MUESTRA-TRANSPORTE • PLANILLAS: INFORMACIÓN PACIENTE O CONSENTIMIENTO PARA TEST GENÉTICOS • TOMA DE MUESTRA: TUBOS, MEDIOS DE TRANSPORTE, HISOPO . ALMACENAMIENTO HASTA EL PROCESADO (SEPARACIÓN DE PLASMA) • TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA: TEMPERATURA Y CONDICIONES • PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: TEMPERATURA Y VELOCIDAD DE CENTRIFUGADO Good Laboratory Practices for Molecular Genetic Testing for Heritable Diseases and Conditions CDC. MMWR June 12, 2009 ETAPA ANALÍTICA PROCESAMIENTO DE MUESTRAS- EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS, PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN;- REACCIÓN ENZIMÁTICA O AMPLIFICACIÓN - DETECCIÓN DE ANALITOS - REGISTRO DE RESULTADOS • CONTROL AMPLIFICACIÓN: CONTROL POSITIVO, NEGATIVO Y CUANTIFICADOS (DOS CONCENTRACIONES) PARA TEST CUANTITATIVOS • CONTROL DE EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS • CONTROL DE INHIBICIÓN: CONTROL INTERNO • CONTROL DE CONTAMINACIÓN O DE REACTIVOS • CONTROL DE INSTRUMENTAL Eileen Burd. Clin Microbiol Rev.23 (3)550-576 .2010 FALSOS NEGATIVOS/ POSITIVOS FALSOS NEGATIVO • TOMA DE MUESTRA Y/O CONSERVACIÓN INADECUADA • FALLA EN LA EXTRACCIÓN / AMPLIFICACIÓN : CONTROL INTERNO • PROBLEMAS TÉCNICOS: REACTIVOS O INSTRUMENTOS FALSOS POSITIVO CONTAMINACIÓN: CONTROL BLANCO DE REACTIVOS Good Laboratory Practices for Molecular Genetic Testing for Heritable Diseases and Conditions CDC. MMWR June 12, 2009 ETAPA ANALÍTICA FLUJO UNIDIRECCIONAL DE MUESTRAS, REACTIVOS Y PERSONAL Objetivo: minimizar la contaminación de reactivos y de las muestras ETAPA ANALÍTICA • FLUJO UNIDIRECCIONAL DE MUESTRAS, REACTIVOS Y PERSONAL Etapa analítica A M P L I C O N E S ETAPA POST ANALÍTICA • INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO • INFORME DE RESULTADOS • TIEMPO DE ENTREGA DEL RESULTADO • REGISTRO DE RESULTADOS CRÍTICOS • NUEVAS MUTACIONES DETECTADAS CONTROL DE CALIDAD EXTERNO CONTROL DE CALIDAD EXTERNO DEFINICIÓN ISO SISTEMA QUE CONTROLA OBJETIVAMENTE LOS RESULTADOS DE LABORATORIO POR MEDIO DE UNA AGENCIA EXTERNA, INCLUYENDO LA COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL LABORATORIO A INTERVALOS CON LOS DE OTROS LABORATORIOS, SIENDO SU MAYOR OBJETIVO EL ESTABLECIMIENTO DE LA VERACIDAD UN CONTROL DE CALIDAD EXTERNO… •EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL PARTICIPANTE •EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE LA METODOLOGÍA •HERRAMIENTA DE EDUCACIÓN CONTINUA •EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO ANALÍTICO Y SU RELACIÓN CON LA CLÍNICA •SOPORTE PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO • VALIDACIÓN DE RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN CONTROL DE CALIDAD EXTERNO TIPOS TIPO 1 – DISEÑADO PARA INFORMAR A TERCEROS EL DESEMPEÑO DE LABORATORIOS : AUTORIDADES, ORGANISMOS DE ACREDITACIÓN, SEGURIDAD SOCIAL, ETC. TIPO 2 – DISEÑADO PARA REPORTAR DESEMPEÑO ANALÍTICO A LOS PARTICIPANTES TIPO 3 – DISEÑADO PARA RESPALDAR SOLUCIONES DE PROBLEMAS EN LOS LABORATORIOS. TIPO 4 – DISEÑADOS PARA EVALUAR MÉTODOS DE MEDICIÓN Y APARATOS IVDS DIAPOSITIVA Dra. Silvia Quiroga CONTROL DE CALIDAD EXTERNO OBJETIVOS • ESTIMULAR LA FILOSOFÍA Y PRÁCTICA DEL CONTROL DE CALIDAD • RESPALDAR LA CONFIABILIDAD DE LOS RESULTADOS DE LOS LABORATORIOS CON UNA EVALUACIÓN INDEPENDIENTE • MEJORAR EL CONSENSO ENTRE LABORATORIOS CONTROLAR METODOLOGÍAS Y EQUIPOS DISPONIBLES COLABORAR EN LOS PROCESOS DE ACREDITACIÓN / CERTIFICACIÓN DE LOS LABORATORIOS • VALIDAR LOS RESULTADOS DE INVESTIGACIÓN OBJETIVOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA ENSAYOS DE BANCO DE SANGRE DESEMPEÑO DEL PARTICIPANTE CONTROL DEL DESEMPEÑO DESEMPEÑO DEL MÉTODO HERRAMIENTAS MUESTRAS ADECUADAS ? DISEÑO DEL ESQUEMA EVALUACIÓN APROPIADA SEGUIMIENTO COMUNICACIÓN CON LOS PARTICIPANTES EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE UN MÉTODO • INCLUYE REACTIVOS, CALIBRADOR Y EQUIPO • ASPECTOS: TRAZABILIDAD, ESPECIFICIDAD, RANGO DINAMICO, LÍMITE DE DETECCIÓN, LIMITE DE CUANTIFICACIÓN INTERFERENCIAS, PRECISIÓN CONTROL DE CALIDAD DEBE CREAR GRUPOS HOMOGÉNEOS DE USUARIOS DESEMPEÑO DEL PARTICIPANTE • DESEMPEÑO DE LOS LABORATORIOS PARTICIPANTES • VARIACIÓN INTRA LABORATORIO • VARIACIÓN INTER LABORATORIO • RELACIONES ENTRE PROCEDIMIENTOS DE RESULTADOS ANALÍTICOS Y: – procedimientos analíticos adecuados – reactivos comerciales – instrumentos analíticos – constituyentes del material de control de calidad CONTROL DE CALIDAD EXTERNO EDUCATIVO EL ORGANIZADOR EL OBJETIVO DEL CC DEBE SER DELINEADO ANTES DE COMENZAR LA RONDA Y PREPARAR LAS MUESTRAS LAS MUESTRAS DEBEN DAR INFORMACIÓN CORRECTA Y SER APROPIADAS PARA EL OBJETIVO LOS ORGANIZADORES DEL CC DEBEN BUSCAR EL ORIGEN DE RESULTADOS ABERRANTES Y ENCONTRAR EL REMEDIO APROPIADO OBJETIVOS DEL PROGRAMA DE CC MONITOREO DE LOS PARTICIPANTES, SIN ESPECIFICAR LA CALIDAD ESPERADA COMPARACIÓN ENTRE LOS DISTINTOS GRUPOS COMPARACIÓN ENTRE DISTINTOS MÉTODOS EVALUACIÓN DE FACTORES DE CALIDAD CUALES SON LAS DESVENTAJAS PARA REALIZAR UN CCE 1- LAS MUESTRAS A EVALUAR DEBEN PREPARASE CON UN ESTANDAR INTERNACIONAL 2- DISTINTOS TIPOS DE HERRAMIENTAS MOLECULARES 3- DNA ES MAS ACCESIBLE QUE RNA 4- NO EXISTEN MÉTODOS DE REFERENCIA “ DONAR SANGRE NO ES DOLOROSO, NECESITARLA Y NO TENERLA SÍ ” GRACIAS…