PARTICIPACIÓN DE LAS SUPERFICIES CELULARES EN LOS
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Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. PARTICIPACIÓN DE LAS SUPERFICIES CELULARES EN LOS MECANISMOS DE TROMBOSIS COORDINADORES: F. VELASCO. Unidad de Investigación, Hospital Universitario Reina Sofía, Córdoba G. ESCOLAR. Servicio de Hemoterapia y Hemostasia, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, Barcelona Resumen del simposio En 1860 Virchow propuso una tríada de factores para explicar la etiopatogenia de los fenómenos trombóticos. La lesión vascular, la reducción del flujo y alteraciones en la propia sangre circulante eran observaciones constantes en las zonas en las que se producían los trombos. Sin embargo, los conocimientos actuales nos permiten apreciar que aquellas observaciones de Virchow no se producen de forma aislada, y que en realidad están interrelacionadas entre sí. En los mecanismos de la hemostasia fisiológica intervienen la pared vascular, las plaquetas, los glóbulos rojos, los leucocitos, una serie de factores de la coagulación, proteínas con acción proteolítica e inhibidores de las proteasas, que deben actuar en un perfecto equilibrio. Los fenómenos trombóticos se desencadenan cuando existe un fallo en la regulación de los procesos fisiológicos de la hemostasia. Esto puede ocurrir por un exceso en los mecanismos de activación, o bien por un defecto en los mecanismos de inhibición. Todos estos fenómenos ocurren en la sangre circulante, pudiendo las propias condiciones de flujo condicionar los mecanismos que pueden ponerse en marcha en un determinado territorio vascular. Aceptando la extrema complejidad de los mecanismos de la trombosis y la imposibilidad de cubrirlos correctamente en un tiempo limitado, los organizadores de este symposium nos propusimos presentar una visión simplificada y comprensible de la trombosis. Basándonos en el concepto de que “La trombosis se inicia sobre superficies celulares” creímos interesante revisar los componentes celulares que podrían tener un papel más destacado en su desarrollo. – En 1865 Trousseau reconoció que “en el cáncer existe algún factor sanguíneo que predispone a la coagulación espontánea en ausencia de reacciones inflamatorias”. Unos años más tarde Billroth localizaba células malignas en los trombos formados en algunos pacientes. Los pacientes con tumoraciones malignas presentan un riesgo elevado de sufrir accidentes trombóticos y no es infrecuente que las manifestaciones trombóticas precedan al diagnóstico de la propia tumoración. La Dra. Rosario López-Pedrera revisará los mecanismos patogénicos de la trombosis asociados a enfermedades neoplásicas y autoinmunes. – El endotelio vascular constituye la interfase entre la pared vascular y la sangre circulante. Este hecho le confiere un papel crítico, no sólo en el desarrollo de la trombosis sino también en su localización. Durante muchos años las células endoteliales fueron simplemente consideradas como el pavimento que recubría la superficie de los vasos. Actualmente, sabemos que las células endoteliales son un elemento clave en la tromborresistencia. El Dr. Ramón Montes hará una actualización del papel del endotelio vascular en la fibrinólisis y de las implicaciones de la respuesta tóxica e inflamatoria en el mantenimiento de un correcto balance de la actividad fibrinolítica. – Los pacientes con insuficiencia renal crónica cursan con alteraciones de la hemostasia, hasta cierto punto contradictorias. A pesar de que estos pacientes pueden presentar sintomatología hemorrágica, las estadísticas demuestran que están sometidos a un riesgo muy elevado de desarrollar complicaciones cardiovasculares. Estudios recientes han demostrado la existencia de una disfunción endotelial en la uremia. El Dr. Aleix Cases revisará los conocimientos actuales sobre la alteración funcional del endotelio y cómo ésta puede alterar el balance hemostático en la insuficiencia renal. – Los pacientes con anemia grave pueden presentar complicaciones hemorrágicas y los que sufren poliglobulia pueden desarrollar fenómenos isquémicos. Sería sencillo explicar que los hematíes desempeñan un importante papel reológico y que su número es el factor crítico. Sin embargo, considerar que el único papel de los hematíes sería reológico conduciría a un error tan grave creer que el único papel del endotelio es recubrir los vasos. Los hematíes poseen un gran contenido en fosfolípidos, una gran capacidad metabólica y tienen un papel determinante en la etiopatogenia de la trombosis. La Dra. Juana Vallés nos lo demostrará poniéndonos al día sobre las distintas interacciones que se dan entre los elementos celulares de la sangre. Igualmente, nos explicará la relevancia de esas interacciones en la generación de trombina y en la fisiopatología de la trombosis. Estamos seguros que los asistentes reconocerán la experiencia y esfuerzo de los ponentes, y esperamos que disfruten del contenido de este Symposium tanto como los que hemos participado en su organización. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 314 MECANISMOS PATOGÉNICOS DE TROMBOSIS ASOCIADOS A ENFERMEDADES NEOPLÁSICAS capacidad de producir y activar moléculas procoagulantes y fibrinolíticas, así como citocinas proinflamatorias (IL-1, TNF-␣ y VEGF), y b) la capacidad de interacción con otros tipos celulares del árbol vascular (células endoteliales, plaquetas y monocitos) (fig. 1)1. C. LÓPEZ-PEDRERA, N. BARBARROJA, P. BUENDÍA, A. TORRES Y F. VELASCO Unidad de Investigación. Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba. Propiedades protrombóticas de las células tumorales Actividades procoagulantes Uno de los procesos neoplásicos más directamente relacionado con el desarrollo de complicaciones trombohemorrágicas es la leucemia. Las complicaciones trombohemorrágicas son las alteraciones más frecuentes en pacientes con todos los tipos de leucemia aguda y alcanzan una relevancia especial en las leucemias agudas promielocíticas (LAP), llegando a ser la causa principal de muerte de estos pacientes. La primera y más generalmente reconocida anormalidad en el sistema coagulativo de los pacientes leucémicos con diátesis hemorrágica es la liberación de sustancias procoagulantes por parte de las Introducción Los pacientes afectados de ciertos tipos de neoplasias muestran una incidencia de alteraciones tromboembólicas anormalmente elevada. Diversos factores de índole general, tales como reacciones de fase aguda, alteraciones en el metabolismo proteico, necrosis y modificaciones en los procesos hemodinámicos, contribuyen al incremento en el estado de hipercoagulabilidad de los pacientes con cáncer. Sin embargo, son las células tumorales las principales responsables del desarrollo y mantenimiento del estado procoagulante en los procesos neoplásicos. Las células tumorales presentan diversas propiedades protrombóticas, entre las que se incluyen: a) la Plaquetas Monocito P P P Antígenos tumorales ± complejos inmunes P P P P PAI tPA la l élu uPAR c era Int P TF sc ne cio P élu a-c uPA FVII TF Célula tumoral FIX FVII Citocinas IL-1, TNF, VEGF TF-FVIIa In cé tera lul cc a- ion cé e lul s a CP FIXa FX FV-R FXa FV Protrombina Endotelio vascular TF PAI TM TPA Trombina Fibrinógeno Fibrina Figura 1. Principales rutas de interacción de las células tumorales con las células del sistema hemostático. Las células tumorales expresan: a) moléculas procoagulantes (p. ej., TF, CP, receptor del FV) que activan la cascada de la coagulación; b) moléculas pro y anti-fibrinolíticas (p. ej., uPA, tPA, PAI, uPAR), y c) citocinas proinflamatorias (p. ej., IL-1, TNF-a y VEGF) que convierten la superficie endotelial, de propiedades anticoagulantes en estado basal, en una superficie protrombótica. Asimismo, las células neoplásicas también interaccionan, directamente o a través de mediadores solubles, con otros tipos celulares sanguíneos (plaquetas, células endoteliales y monocitos). Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios células leucémicas, dando lugar al desarrollo de una coagulación intravascular diseminada (CID). La CID ha sido atribuida principalmente a la expresión de factor tisular (TF) por parte de los blastos leucémicos2. El TF es un pequeño receptor transmembrana de la superficie celular, de 47 kDa, que media la iniciación celular de la cascada de las serinproteasas del proceso coagulativo. Dicho factor actúa como receptor celular para los factores VII y VIIa de la coagulación. El complejo bimolecular formado por el TF y el FVII(a) activa a los factores IX y X por proteólisis limitada, conduciendo a la formación de trombina y finalmente de fibrina. El TF se expresa de forma selectiva en algunos tejidos humanos en condiciones fisiológicas normales y se halla anormalmente elevado en numerosos procesos neoplásicos. Otro tipo de actividad procoagulante observada en las células leucémicas está generada por una proteasa de cisteína, el cáncer procoagulante (CP). Esta enzima es capaz de iniciar la coagulación mediante activación directa del factor X en ausencia del factor VII (ligando natural del TF). Se trata de una proteína de 68 kDa, que parece ser expresada únicamente en tumores y tejidos trofoblásticos. El CP se ha detectado también en células de pacientes con leucemia aguda no linfoblástica (LANL) y se encuentra incrementado de forma particular en la LAP en relación a otros tipos celulares3. Asimismo, se han identificado otros tipos de moléculas con actividades procoagulantes en tumores humanos, tales como el receptor del factor V, asociado con vesículas procedentes de membranas liberadas de las células plasmáticas tumorales. Dicho receptor facilita el ensamblaje del complejo protrombinasa y promueve la actividad dependiente del factor XIII, responsable de la consolidación de la molécula de fibrina mediante enlaces covalentes4. Actividades fibrinolíticas La fibrinólisis puede también contribuir al defecto hemostático observado en las leucemias agudas. Recientemente se ha demostrado que las células tumorales, entre ellas las de leucemia mieloide y linfoide (especialmente de fenotipo T) contienen activadores del plasminógeno tipo tisular y tipo urocinasa (tPA y uPA) en cantidades variables. Asimismo, los promielocitos leucémicos contienen uPA y tPA en cantidades suficientes para generar plasmina. Hemos de reseñar que entre los activadores fibrinolíticos, el uPA es la molécula más ampliamente expresada en las lesiones tumorales. Por otro lado, el inhibidor del activador del plasminógeno tipo I (PAI-1, principal inhibidor natural del tPA) se encuentra reducido en los pacientes con LAP. Además, la presencia sobre la membrana celular de la célula tumoral de receptores celulares específicos de moléculas pro- y antifibrinolíticas es de gran relevancia en la modulación de diversas funciones tumorales. Los procesos mediados por receptores 315 facilitan la activación del sistema fibrinolítico y juegan un papel muy importante en la patogénesis de los procesos hemorrágicos en los pacientes leucémicos. De modo adicional a su participación en la hemostasis, estudios recientes han demostrado que existe un fino equilibrio en los niveles de expresión entre los activadores del plasminógeno y sus inhibidores asociado directamente a los procesos de invasividad tumoral, proliferación celular tumoral y metástasis. Es más, los niveles de expresión de una o más de estas proteínas se han reconocido como factores predictores del período libre de enfermedad y supervivencia a largo plazo en algunos pacientes con enfermedades neoplásicas5. Producción de citocinas Un tercer mecanismo por el que las células leucémicas pueden activar el sistema coagulativo es la liberación de citocinas proinflamatorias. Dichas citocinas alteran las propiedades anticoagulantes normales del endotelio vascular. Así, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral tipo alfa (TNF-␣) y la interleucina-1 (IL-1), así como el lipopolisacárido bacteriano (LPS o endotoxina) inducen la expresión de TF y PAI-1 y reducen la expresión de trombomodulina (TM) en las células endoteliales. A su vez, la reducción de los niveles de los complejos TM-trombina conduce a la inhibición del sistema de la proteína C, uno de los principales sistemas endógenos de defensa contra la coagulación en el árbol vascular. Aunque el TNF-␣ y el LPS pueden también incrementar los niveles de tPA in vivo, van Hinsberg y colaboradores han demostrado que cuando dichos compuestos son administrados a pacientes o a voluntarios sanos, el rápido aumento de tPA inducido se ve compensado por un incremento aún mayor de PAI-1, conduciendo a un estado hipofibrinolítico y procoagulante. Asimismo, varios autores han asignado un importante papel a la IL-1 en el desarrollo de la CID en pacientes leucémicos. Así, Cozzolino y colaboradores basaron dicha conclusión en la observación de que los promielocitos leucémicos de pacientes con CID secretaban más IL-1 que los blastos de pacientes con LAP que no sufrían CID. Las células neoplásicas secretan el denominado vascular endothelial growth factor (VEGF), una citocina multifuncional, responsable final de los procesos de angiogénesis tumoral. El VEGF induce la generación de nuevos capilares vasculares, actúa como mitógeno selectivo y factor quimiotáctico para las células endoteliales e induce la expresión de diversos genes en dichas células, entre los que se encuentra el potente procoagulante TF. La regulación de la síntesis de VEGF en diversos modelos tumorales murinos y humanos se asocia igualmente a nivel molecular con la regulación de la síntesis de TF en estos tipos celulares así como con la mediación de la angiogénesis in vivo6. Así, la hiperexpresión del gen TF en células Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 316 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 tumorales induce a su vez una hiperexpresión del gen del VEGF. La regulación de la síntesis de VEGF por TF en células tumorales y células vasculares proporciona un importante nexo de unión en pacientes con cáncer entre la activación de la coagulación, la inflamación, la trombosis y la progresión del tumor y las metástasis. Interacciones de las células tumorales con las células del sistema vascular: células endoteliales, plaquetas y monocito-macrófagos Células endoteliales Las células tumorales interaccionan con el endotelio vascular a través de múltiples mecanismos, tanto directos como indirectos. Los mecanismos indirectos, como se ha mencionado anteriormente, derivan del efecto de citocinas proinflamatorias sintetizadas por las células neoplásicas y que ejercen su efecto sobre las células endoteliales reduciendo sus propiedades antitrombóticas y potenciando sus características protrombóticas. Los mecanismos directos de interacción célula tumoral-célula endotelial implican la adhesión de las células tumorales sobre el endotelio vascular y/o a la matriz extracelular a través de moléculas de adhesión de la superficie celular endotelial (VCAM-1, el ligando para las integrinas 1 y 2, ICAM-1 e ICAM-2, E-selectina, etc). Asimismo, la activación por IL-1 y TNF-␣ incrementa la expresión de estas moléculas de adhesión en las células endoteliales. Las células tumorales adheridas a la pared vascular promueven así la activación de la coagulación y la formación del trombo y favorecen la adhesión de otros tipos celulares sanguíneos, tales como los leucocitos y las plaquetas. Además, las interacciones homotípicas (célula tumoral-célula tumoral) y heterotípicas (célula tumoral-célula endotelial vascular) facilitan la migración y extravasación de las células tumorales. Es más, la expresión incrementada de TF en las células endoteliales activa los procesos de neovascularización y angiogénesis tumoral. Plaquetas No existen evidencias que demuestren la participación directa de las plaquetas en los procesos coagulativos que conducen a la deposición de fibrina en el espacio extravascular de los tumores sólidos. Sin embargo, existen numerosos estudios que demuestran una implicación de las interacciones célula tumoral-plaqueta en la deposición de fibrina y el mantenimiento del estado de hipercoagulabilidad en pacientes con neoplasias hematológicas así como en la producción de metástasis. Las plaquetas pueden ser activadas por células tumorales, lo que induce su agregación y la liberación de su contenido intracelular. En pacientes con neoplasias activas se han observado niveles plasmáticos elevados de gránulos alfa de proteínas específicos de plaquetas, alfatromboglobulina y factor plaquetario 4. Además, diversos estudios han demostrado en pacientes neoplásicos la presencia de plaquetas con una elevada expresión de CD62 y CD63, antígenos de membrana expuestos en la superficie celular durante la activación plaquetaria. Las interacciones directas de las plaquetas con las células tumorales se han atribuido principalmente a las propiedades adhesivas de las células neoplásicas. Varios mecanismos parecen estar implicados en este proceso. Uno de dichos mecanismos implica la interacción directa entre las plaquetas y células tumorales o vesículas liberadas de dichas células, proceso que facilita la agregación plaquetaria. Asimismo, las células tumorales pueden iniciar la formación del trombo, generar trombina, y potenciar así la adhesión mediada por plaquetas de células tumorales al endotelio vascular. Otro posible mecanismo implica la inducción de la agregación plaquetaria por las células tumorales mediante la liberación de mediadores proagregantes, como el ADP o una cistein-proteinasa como la catepsina-B. Por tanto, las plaquetas participan en la progresión tumoral contribuyendo a la cascada metastásica, protegiendo a las células tumorales de la vigilancia inmunológica, y regulando la invasión celular tumoral y la angiogénesis. Además, las plaquetas contienen uno de los mayores almacenes de factores angiogénicos y mitogénicos, y puesto que la vasculatura tumoral es fina, ello permite a las plaquetas contactar con el tumor y depositar múltiples factores angiogénicos, como el VEGF y la trombina sobre las células tumorales, los cuales a su vez contribuyen a la progresión del tumor. Monocitos-macrófagos Las células tumorales per se y/o moléculas liberadas por la mismas pueden interaccionar con el sistema monocito-macrofágico e inducir la expresión de TF en dichas células. Los monocitos circulan en el torrente sanguíneo, pero pueden también ser localizados sobre la pared vascular en respuesta a estímulos inflamatorios. Asimismo, los monocitos forman parte del infiltrado linforreticular de la masa tumoral. Los monocitos, al igual que las células endoteliales, no expresan TF, pero pueden generarlo en respuesta a diversos estímulos, como el LPS, proteínas del complemento, complejos inmunes, linfocinas y otros mediadores inflamatorios. Diversos estudios han demostrado una activación monocítica in vivo en pacientes con numerosos tipos de tumores, mecanismo asociado al desarrollo y mantenimiento de un estado de hipercoagulabilidad en pacientes neoplásicos, y responsable de la deposición de fibrina en el tejido tumoral. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios Regulación de los procesos trombóticos y de desarrollo tumoral. Terapias antitrombóticas y antiangiogénicas en pacientes con neoplasias hematológicas El estudio de las bases moleculares de regulación de los procesos trombóticos y del desarrollo tumoral ha puesto de manifiesto que el TF, considerado hasta ahora únicamente el iniciador fisiológico de la coagulación, es también un factor determinante clave en la regulación del avance de los procesos tumorales. Así, varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de TF en diversos tipos de células tumorales y su unión con el FVIIa conduce a: 1. Incremento en el potencial metastásico tumoral. 2. Incremento en la invasividad de las células tumorales in vitro. 3. Incremento del crecimiento del tumor in vivo. 4. Incremento en la expresión de uPAR en células SW979. 5. Inducción de la expresión de VEGF y sus receptores en células de melanoma y leucemias agudas. 6. Reorganización del citoesqueleto en células J82. 7. Aumento en la expresión de una gran variedad de genes que codifican para diversos factores de transcripción (Egr-1, c-Fos y c-Myc), factores de crecimiento, citocinas proinflamatorias y proteínas que afectan la migración y reorganización celular (uPAR y colagenasas)7. Estos hallazgos, junto al conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación de la expresión del TF, han promovido la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas dirigidas a inactivar directamente al TF o a inhibir las rutas intracelulares que regula. Los procesos de angiogénesis y los factores angiogénicos juegan igualmente un importante papel en el desarrollo de diversas patologías hematológicas. La leucemia mieloide aguda y los síndromes mielodisplásicos (MDS) están asociados a un incremento sustancial en la neoformación de vasos sanguíneos en la médula ósea, así como a incrementos en los niveles de diversos factores angiogénicos, tales como el VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento epidérmico, la angiogenina, la angiopoyetina-1, etc. La mayoría de estos factores angiogénicos parecen ser secretados por células hematopoyéticas neoplásicas y facilitan el crecimiento y la proliferación de las células leucémicas de forma autocrina. Entre los citados factores, el VEGF es el principal factor proangiogénico, regulador de múltiples funciones tanto en las células endoteliales como en las células neoplásicas. De hecho, estudios recientes de inactivación génica han demostrado que el VEGF es esencial para la respuesta agiogénica celular. 317 Los estudios sobre angiogénesis en patologías hematológicas aún se hallan en fase experimental inicial, pero los resultados obtenidos hasta el momento indican que el perfil angiogénico en neoplasias hematológicas es diferente del observado en tumores sólidos. Dichos estudios han revelado que las células neoplásicas en este tipo de tumores pueden elaborar y responder a factores angiogénicos de forma autocrina o paracrina, contribuyendo a la supervivencia y expansión del tumor, adhesión, reabsorción ósea y supresión inmune. Vías de actuación terapéutica Además de los mecanismos patogénicos asociados al incremento de episodios trombóticos relacionados con el desarrollo del tumor, terapias antitumorales tales como la quimioterapia contribuyen al mantenimiento de un estado hipercoagulable. La quimioterapia facilita la exacerbación de los procesos trombóticos a través de diversos mecanismos, que en síntesis implican: 1. Liberación de moléculas procoagulantes y citocinas por las células neoplásicas en respuesta al tratamiento antitumoral. 2. Toxicidad inducida en el endotelio vascular. 3. Activación de la expresión del factor tisular en monocitos y células tumorales. 4. Reducción en los niveles fisiológicos de moléculas anticoagulantes. Durante la última década, se han desarrollado y analizado en detalle diversos compuestos alternativos al uso de los fármacos antitumorales convencionales. En la tabla 1 se encuentran sintetizadas las principales terapias antitrombóticas y antiangiogénicas aplicadas en pacientes con neoplasias hematológicas, especialmente aquellos afectos de leucemia aguda promielocítica, así como los efectos a nivel celular y molecular de dichos compuestos sobre las células neoplásicas y/o diversos componentes del árbol vascular8-10. Adicionalmente, numerosos estudios a nivel celular y molecular han permitido el desarrollo de terapias complementarias y/o alternativas a los retinoides y compuestos arsénicos. Dichas moléculas son reguladoras específicas de diversas rutas intracelulares relacionadas con los procesos trombóticos y angiogénicos y se hallan en muchos casos en fase de ensayos clínicos para su administración en pacientes neoplásicos. Entre ellas, hemos de destacar: Terapias antiangiogénicas. Centradas en la inhibición de las rutas intracelulares activadas por el VEGF: 1. Desarrollo de anticuerpos monoclonales para bloquear la unión del VEGF a sus receptores celulares. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 318 Tabla 1. Principales terapias antitrombóticas y antiangiogénicas aplicadas en pacientes con leucemias agudas ATRA As2O3 AM80 CD437 Respuesta fisiológica y celular Induce diferenciación Derivado retinoide del ATRA, Derivado retinobenzoico Induce apoptosis (1-2 M) granulocítica agonista específico de estable del ATRA, agonista mediante el colapso de los RAR␥ específico de RAR␣ potenciales de la membrana mitocondrial asociada a los grupos tiol Inhibe proliferación celular Induce diferenciación granulocítica parcial e inhibición de TF a dosis bajas (0,1-0,5 M) Inhibe actividades procoagulantes en células leucémicas, monocíticas y endoteliales Inhibe la proliferación celular 10 veces más potente que ATRA como inductor de diferenciación in vitro Regula la expresión de moléculas de adhesión Potencia la acetilación de histonas, proceso esencial en la activación transcripcional de un elevado n.º de genes Aumenta la producción de citocinas en células leucémicas, y neutraliza sus efectos protrombóticos sobre las células endoteliales, favoreciendo la respuesta fibrinolítica endotelial Induce remisiones completas Regula la expresión de moléculas de adhesión en pacientes que han sufrido recaída o resistencia a tratamiento con ATRA Inhibe la producción de VEGF y suprime la angiogénesis Inhibe la producción de VEGF y suprime la angiogénesis Regulación intracelular Degrada la proteína de fusión PML/RAR␣ en las células LAP Degrada la proteína de fusión PML/RAR␣ en células LAP Incrementa la expresión del inhibidor de NFB (IB␣) Degrada la proteína de fusión PML/RAR␣ en células LAP en un proceso mediado por caspasas Incrementa la expresión del inhibidor de NFB (IB␣) Incrementa la expresión del inhibidor de NFB (IB␣) Reduce la expresión de moléculas diana del gen NFB Activa fosforilación de JNK e inhibe pERK1/2 Reduce la expresión de moléculas diana del gen NFB Reduce la expresión de moléculas diana del gen NFB Activa PI3K␥, regulando así la expresión de TF, TM y CD11b No altera la expresión de bcl-2 ni p21 Activa PKC, PI3K␥ y pERK1/2, rutas de regulación de la expresión de CD11b, TF y TM en células LAP Activa fosforilación de c-jun y JNK e inhibe pERK1/2 Promueve una lenta degradación de bcl-2 Activa AP-1, p21 y p53 Inhibe la expresión de bcl-2 y degrada PARP Con potencial de evitar resistencia a la droga creada por RAR␣ Rápido inductor de apoptosis Inhibe la proliferación celular in vivo Inhibe la actividad procoagulante en células leucémicas Degrada PARP Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios 2. Uso de pequeñas moléculas que actúan como inhibidores químicos de las funciones tirosincinasas de los receptores del VEGF (SU5416, SU11248, PTK/787/ZK222584, etc.). 3. Ácidos nucleicos “anti-sentido” para interferir en la producción celular del VEGF6. Curcumina (diferulolylmethane). Compuesto fenólico natural presente en las plantas con propiedades antitrombóticas, anticarcinogénicas, antioxidantes y antiinflamatorias. Inhibe la transcripción y actividad del gen TF en células endoteliales y fibroblastos a través de: a) inhibición de la activación del factor de transcripción NFB; b) inhibición de la síntesis de m de c-jun; c) inhibición de la actividad de unión de AP-1, y d) inhibición de la síntesis inducida de la proteína Egr-111. NAPC2 (nematode anticoagulant peptide). Inhibidor de la coagulación sanguínea a concentraciones picomolares. Este pequeño péptido actúa a través de su unión al factor Xa, previniendo así su interacción con el complejo TF-VIIa y la activación del proceso coagulativo12. Heparinas de bajo peso molecular. Interfieren en diversos procesos relacionados con el crecimiento del tumor y la metástasis, tales como la formación de fibrina, unión de la heparina al VEGF y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), modulación de la expresión de TF, liberación del TFPI tisular, etc13. Derivados del AMPc. Estudios recientes han demostrado que el 8-CPT- (4-chlorophenylthio)-cAMP, un análogo sintético del AMPc, muestra efectos sinérgicos con el As2O3 promoviendo una diferenciación granulocítica terminal en células LAP14. Antagonistas específicos de oncogenes celulares. Potentes oncogenes pueden derregular la expresión de estimuladores e inhibidores de angiogénesis en células tumorales. Así, el incremento de la expresión de VEGF y la angiogénesis pueden ser inducidos por la activación constitutiva de proteínas oncogénicas tales como EGFR, Raf, MEK o PI3K, que actúan a diferentes niveles en la ruta de señalización del gen ras. Los oncogenes activados (p. ej., ras, src, HER-2) inducen coexpresión de propiedades angiogénicas de forma concomitante con incrementos en la mitogénesis o la resistencia a la apoptosis, circunstancias que pueden acelerar la selección del fenotipo angiogénico a nivel de población celular. Diversos estudios experimentales han demostrado que muchas de estas propiedades pueden ser suprimidas simultáneamente por el uso de antagonistas específicos de estos oncogenes e inhibidores de rutas de transducción intracelular15. Conclusiones La generación de trombina y la formación de fibrina se encuentran activadas de modo constante en 319 pacientes con neoplasias, lo que origina un riesgo incrementado de complicaciones tromboembólicas. La activación de la coagulación sanguínea en la neoplasia es un fenómeno complejo que implica muy diferentes rutas del sistema hemostático, así como numerosas interacciones de células tumorales con otros tipos celulares sanguíneos. Más aún, además de la inducción de un estado de hipercoagulabilidad en estos pacientes, idénticos mecanismos están implicados en los procesos de crecimiento primario del tumor, neoangiogénesis y formación de metástasis, un ciclo vicioso en el que el crecimiento del tumor conduce a un incremento en la coagulación y a su vez una coagulación incrementada acelera el crecimiento tumoral. Queda claro pues que las principales vías de actuación terapéutica deben ser dirigidas por un lado a la inhibición de la activación del proceso coagulativo, a través de la regulación de la expresión de los receptores, proteasas y productos génicos que controlan dicho proceso, y por otro, a la inhibición del crecimiento tumoral, mediante la regulación de los mecanismos implicados en la angiogénesis. La experiencia clínica con pacientes afectados de neoplasias hematológicas ha demostrado que no existe un único agente quimioterapéutico o biológico que prolongue de modo significativo la supervivencia de estos pacientes. El desarrollo de recaídas y resistencias al mismo tratamiento parecen sugerir que es importante disponer de terapias alternativas que puedan complementar del uso de una primera terapia de choque. Asimismo, el conocimiento detallado de la fisiología de la célula tumoral y su interacción con otros tipos celulares ha puesto de manifiesto la importancia de utilizar terapias combinadas dirigidas a controlar de modo simultáneo diversas respuestas celulares adversas. Agradecimientos Trabajo subvencionado por: Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF 01/0918), Fondo de Investigación Sanitaria (FIS PI020215) y Junta de Andalucía (exp 70 y 61/02). Bibliografía 1. Falanga A, Rickles. Pathophysiology of the Thrombophilic State in the Cancer Patient. Semin Thromb Haemost 1999;25:173-82. 2. López-Pedrera Ch, Jardí M, Malagón MM, Inglés-Esteve J, Dorado G, Torres A, Félez J, Velasco F. Involvement of Tissue Factor (TF) and urokinase receptor (uPAR) in bleeding complications of leukemic patients. Thromb Haemost 1997;77:62-70. 3. Falanga A, Alessio MG, Donati MB, Barbui T. A new procoagulant in acute leukemia. Blood 1988;71:870-5. 4. Van de Water L, Tracy PB, Aronson D, Mann KG, Dvorak HF. 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Introducción El endotelio vascular constituye una superficie tromborresistente porque secreta a la circulación o expone como receptores de membrana una serie de moléculas que promueven la vasodilatación y antiagregación, evitan la activación a destiempo de la coagulación, facilitan la puesta en marcha de mecanismos anticoagulantes y mantienen un potencial fibrinolítico suficiente para lisar los coágulos de fibrina emergentes. Hasta hace poco se creía que la aportación del endotelio al mantenimiento del potencial fibrinolítico basal se limitaba a su capacidad para sintetizar los principales activadores de la fibrinólisis, la urocinasa (u-PA) y especialmente el activador tisular del plasminógeno (t-PA), así como el principal inhibidor de ambos: el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1). Sin embargo, recientemente se ha descrito una carboxipeptidasa en cuya activación participa necesariamente la célula endotelial: el inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina o TAFI, que posee una capacidad antifibrinolítica notable y cuya actividad debe tenerse en cuenta al examinar el balance coagulación/fibrinólisis en un lecho vascular concreto ante una situación determinada. La primera parte de esta revisión se va a dedicar al análisis de la participación del endotelio en la activación del TAFI. Para tener una visión más completa del potencial antifibrinolítico del endotelio, en la segunda parte se estudiará la síntesis endotelial de PAI-1 y se hará énfasis en su regulación durante la sepsis severa, una situación en la que la disfunción endotelial juega un papel básico en la aparición de microtrombos en diversos órganos que conducirá a la coagulación intravascular diseminada (CID). Papel del endotelio en la activación del TAFI La trombomodulina, cofactor necesario en la activación del TAFI La trombomodulina (TM), glucoproteína expresada en la membrana de la célula endotelial, forma un complejo estequiométrico 1:1 con la trombina circulante. Esta interacción modifica la afinidad del centro activo de ésta por sus sustratos, perdiendo su capacidad de transformar el fibrinógeno en fibrina e incrementando su potencial activador de la proteína C (PC) a proteína C activada (PCA). Por este motivo se considera que la expresión endotelial de TM es un requisito para que el vaso mantenga un potencial anticoagulante apropiado. Sin embargo, recientemente se ha comprobado que la TM está también involucrada en el mecanismo fibrinolítico (fig. 1A): el complejo trombina-TM es capaz de activar al TAFI, procarboxipeptidasa que en su forma activa (TAFIa) es capaz de retrasar la lisis del coágulo de fibrina1. El TAFIa retrasa la lisis del coágulo El TAFI, procarboxipeptidasa B o carboxipeptidasa U, se sintetiza en el hígado. Una vez escindido un péptido señal de 22 aminoácidos se genera una molécula de 55 kDa; el 20 % del peso molecular corresponde a carbohidratos incorporados en puntos de N-glucosilación situados en el péptido de activación y que incrementan su vida media; su concentración plasmática oscila entre 4 y 15 g/ml. La mayor parte del TAFI circula ligada al Lys-plasminógeno, por el que presenta alta afinidad (Kd = 35 nmol/l). El TAFI es una metalocarboxipeptidasa: su centro activo contiene una molécula de Zn2+, como queda de manifiesto por el hecho de que la 1,10-phenantrolina, quelante del Zn2+, inhibe la actividad del TAFIa. Por otro lado, la presencia de un residuo Asp en la región de unión al sustrato motiva que la enzima presente afinidad por los aminoácidos básicos. El TAFIa lisa residuos Arg y Lys en posición carboxi-terminal. Su importancia en la fibrinólisis reside en su capacidad de lisar los residuos Lys carboxi-terminales existentes en la superficie de la fibrina parcialmente degradada: el plasminógeno y el t-PA, uniéndose a dichos residuos Lys a través de sus “lugares de unión a la lisina” (LBS, lysine binding sites) logran acelerar la tasa de generación de plasmina gracias al papel catalizador de la fibrina1; además, la plasmina unida a la fibrina escapa a la inhibición por la ␣2-antiplasmina. La acción proteolítica del TAFIa reduce el número de residuos Lys sobre la superficie de la fibrina, ralentizando así la generación Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios de plasmina e incrementando la eficacia inhibitoria de la ␣2-antiplasmina. Como era de esperar, se ha comprobado experimentalmente que el tiempo de lisis del coágulo de fibrina se alarga en presencia de TAFIa2. Aunque el TAFIa puede actuar además sobre otros sustratos (p. ej., la anafilatoxina, C5a), en esta revisión nos ceñiremos a su papel en la fibrinólisis. El TAFIa es termolábil El TAFIa es termolábil, lo cual motiva que su vida media a 37 °C sea sólo de alrededor de 10 min3. Este hecho exige que, para mantener una acción antifibrinolítica prolongada, deba existir asimismo una presencia mantenida de complejos trombina-TM activando nuevas moléculas de TAFI. La TM incrementa la eficacia activadora de la trombina sobre el TAFI La importancia de la TM en la activación del TAFI queda de manifiesto por el hecho de que, sin su cofactor, la trombina es alrededor de 1.250 veces menos eficaz en la activación de la procarboxipeptidasa. El efecto de la TM se manifiesta como una drástica reducción de la Kcat: el complejo trombina-TM adopta una conformación espacial que acelera la proteólisis del péptido de activación del TAFI y la consiguiente transformación de éste en TAFIa1. La TM es anticoagulante y es antifibrinolítica Hemos descrito cómo la TM puede incrementar tanto el potencial anticoagulante como el potencial antifibrinolítico del endotelio. En ausencia de otras moléculas que pudieran modular las afinidades, el complejo trombina-TM activa bien a la PC, bien al TAFI, con una eficacia aparentemente similar, estando la Km en ambos casos en el orden de 1 a 2 mol/l4. Debido a que el centro activo de la trombina, cuando ésta se une a la TM, sólo puede estar ocupado por una molécula, se podría pensar que la PC, al ser activada por la trombina ligada a la TM, no sólo desencadenaría un mecanismo anticoagulante sino que evitaría la puesta en marcha de un mecanismo antifibrinolítico al impedir el acceso de las moléculas de TAFI al complejo activador. Esta hipótesis se ve apoyada por los hallazgos de Kokame et al4, que demostraron en un sistema purificado que la PC se comporta como un inhibidor competitivo de la activación del TAFI por trombina-TM y viceversa: concentraciones crecientes de TAFI también ejercen una inhibición competitiva creciente sobre la activación de la PC. De este modo, al efecto antifibrinolítico del TAFIa habría que añadir un efecto limitante del potencial anticoagulante, ambas acciones supeditadas en cualquier caso a la presencia de TM en la superficie endotelial. ¿Juega el TAFI un papel fisiológico? La “paradoja del complejo trombina-trombomodulina” A raíz de las observaciones del apartado anterior se podría pensar que el balance entre la concentración 321 A TAFI TAFIa T PC PCA TM B TAFI PC PCA T TM EPCR Figura 1. A) La trombina ligada a la TM sobre la superficie de la célula endotelial puede activar tanto a la PC como al TAFI, pero en ningún caso puede activar de forma simultánea a ambas moléculas. B) Es esperable que la unión del EPCR a la PC facilite el acceso de ésta al centro activo de la trombina ligada a la TM, lo que dificultaría el acceso y posterior activación del TAFI. PC, proteína C; TM, trombomodulina; T, trombina; PCA, PC activada; TAFIa, TAFI activo; EPCR, receptor endotelial de la PC/PCA. de TAFI y de PC en un determinado momento en un lecho vascular concreto determinará que predomine la activación de una u otra especie. Sin embargo, se ha sugerido que la concentración de los complejos trombina-TM es asimismo determinante en la tendencia hacia qué molécula, TAFI o PC, se activará preferentemente: Mosnier et al añadieron trombina, TAFI y PC a células endoteliales en cultivo5 y observaron que el incremento de éstas en número –que implicaba un incremento en la concentración de TM– manteniendo invariable la concentración de las demás moléculas modificaba la tendencia inicial, que era de activación mayoritariamente del TAFI, hacia una activación preferencial de la PC; argumentan que a partir de un determinado umbral en la concentración de trombina-TM, la cantidad generada de PCA sería lo suficientemente elevada como para reducir notablemente la activación de la protrombina, lo cual conduciría a un descenso en la formación de nuevos complejos trombina-TM que impediría la generación de nuevas moléculas de TAFIa. Asimismo, los autores proponen un modelo in vivo en el cual el TAFIa impediría la lisis anormalmente prematura del Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 322 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 coágulo actuando durante las primeras fases de la formación de fibrina, una situación en la que la concentración de trombina, y por tanto de trombinaTM, es baja y en la que la fibrina aún no ha adoptado una estructura resistente que le permita evitar la pérdida de componentes sanguíneos a través de las lesiones producidas en la pared vascular. Conforme se incrementara la concentración de trombina se activaría el factor XIII, cuya actividad transformaría las moléculas aún semisolubles y fácilmente lisables de fibrina en ␥-polímeros insolubles y altamente resistentes. Una vez lograda la estabilidad del coágulo, el propio incremento de los complejos trombina-TM, favoreciendo la activación de la PC sobre la del TAFI, se encargaría de evitar que éste persistiera más tiempo que el necesario. ¿Puede jugar el TAFI un papel patológico? Si la hipótesis propuesta en el apartado anterior fuera cierta estaríamos ante un sistema finamente condicionado por la disponibilidad de TAFI, PC, trombina y TM. Cabría esperar por tanto que cualquier alteración en la concentración de alguna de estas moléculas podría conducir a una regulación anómala. Esta idea se ve apoyada por el hecho de que los niveles antigénicos de TAFI por encima del percentil 90 incrementan aproximadamente al doble el riesgo de experimentar una trombosis venosa, según ha comprobado el grupo de Bertina en su población del Leiden Thrombophilia Study6. En esa misma línea se ha descrito que los niveles antigénicos elevados de TAFI incrementan el riesgo de angina7. Cabe por tanto deducir que una incorrecta modulación del sistema integrado por el TAFI, la PC, la trombina y la TM, como en este caso por una concentración anormalmente alta del primero, podría acarrear consecuencias patológicas. El endotelio, ¿participa en el balance activación de TAFI frente a activación de PC únicamente exponiendo TM? Posible papel del EPCR La literatura disponible hasta la fecha en la que se estudia el sistema del complejo trombina-TM y su capacidad de activar al TAFI y a la PC expone un cuadro con sólo cuatro protagonistas, los que acabamos de nombrar. Sin embargo, nosotros creemos que debe tenerse en cuenta la posible participación de otra molécula en este sistema: el receptor endotelial para la PC/PCA o EPCR, glucoproteína expuesta en la membrana de la célula endotelial que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y capaz de ligar PC/PCA con muy alta afinidad (Kd ≈ 30 nmol/l). La unión del EPCR a la PC va a permitir que el complejo trombina-TM active a ésta con mucha más eficacia, disminuyendo la Km del orden de cinco veces8. Al parecer, el hecho de que la TM “fije” a la trombina y de que el EPCR haga lo propio con la PC facilita la aproximación física enzima-sustrato, siendo este acercamiento el responsable del incremento en la eficacia de la activación de la PC. Ante este hecho, demostrado experimentalmente in vitro e in vivo (la inhibición de la unión EPCR-PC en babuinos mediante la administración de un anticuerpo monoclonal disminuye la tasa de generación de PCA cerca de un 90 %9), resulta difícil creer que el EPCR no vaya a participar en el balance activación de TAFI frente a activación de PC: aun estando pendiente de demostración experimental, creemos que dado que el EPCR disminuye notablemente la Km de activación de la PC, y sabiendo que en ausencia de EPCR las Km de PC y TAFI son similares4, en presencia de EPCR se dificultará notablemente la activación del TAFI (fig. 1B). Si esto es así, la capacidad de un vaso de lisar un coágulo emergente se verá influida no sólo por el nivel de expresión de TM sino también por la expresión de EPCR: ésta no es uniforme en todos los lechos vasculares sino que, como regla general, predomina más en el árbol arterial que en el venoso y disminuye conforme disminuye el calibre del vaso, estando casi ausente en la microcirculación, donde por el contrario la TM es muy abundante. Así pues, el sistema podría ofrecer un balance TAFIa/PCA diferente dependiendo del territorio vascular. Asimismo, el hallazgo de Mosnier et al5, al que antes se ha aludido –una disminución de la activación del TAFI conforme se incrementaba el número de células endoteliales, que se atribuía a un incremento en los niveles de TM– bien podría deberse a un aumento en la concentración de EPCR que, facilitando el acceso de moléculas de PC al centro activo de la trombina, dificultaría el acceso de las moléculas de TAFI, ralentizando así la activación de éste. Síntesis endotelial de PAI-1 El balance endotelial t-PA/PAI-1 permite el mantenimiento de una actividad fibrinolítica basal Como ya se ha mencionado al principio, en condiciones normales el endotelio sintetiza t-PA –el principal activador circulante de la fibrinólisis– y PAI-1 –el principal inhibidor de éste– en una proporción que va a permitir la generación de pequeñas cantidades de plasmina, suficientes para evitar la persistencia de los pequeños coágulos de fibrina que continuamente se forman para evitar la pérdida de componentes sanguíneos a través de las pequeñas roturas que se producen con frecuencia en la pared vascular. El PAI-1 es una serpina de 50 kD sintetizada por los hepatocitos y las células endoteliales: éstas lo secretan tanto hacia la matriz extracelular como hacia el torrente circulatorio, en el que está a una concentración de alrededor de 0,4 nmol/l; liga con alta afinidad vitronectina (VN), molécula que preserva su conformación activa. Las moléculas de PAI-1 que no circulan ligadas a la VN experimentan rápidamente una inactivación conformacional, pasando a la forma conocida como latente, atacable por la estromelisina o MMP-3, que la proteoliza y transforma en la Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios forma sustrato, no reactivable. Es necesaria la expresión de un nivel basal de PAI-1 para evitar una predisposición anormal al sangrado, como ha quedado patente en algunos casos descritos de déficits congénitos de PAI-110. La endotoxina altera la expresión endotelial de PAI-1 En una patología infecciosa, la sepsis, encontramos el ejemplo que ilustra la importancia del papel del endotelio como regulador de la actividad fibrinolítica a través del sistema t-PA/PAI-1: una de las características del cuadro de sepsis inducida por bacterias gramnegativas, que exponen en su membrana externa la endotoxina o lipopolisacárido (LPS) responsable de la mayor parte de sus efectos patológicos, es la hipofibrinólisis que cursa con este síndrome11. El LPS acelera la expresión endotelial de PAI-1 e induce un incremento en su nivel plasmático, que es anormalmente alto en los pacientes con sepsis12, por lo que parece claro que la sobreexpresión endotelial del inhibidor juega un papel básico en la importante disminución del potencial fibrinolítico observado durante la endotoxemia. Dicha disminución va a ser en buena medida responsable de la aparición de trombos en la microcirculación capilar en órganos como el pulmón o el riñón: en un estudio llevado a cabo en nuestro laboratorio se logró evitar la aparición de coágulos renales de fibrina en conejos a los que se había administrado LPS junto con un anticuerpo monoclonal (Ac Mo) capaz de prevenir la unión del PAI-1 al t-PA y, en consecuencia, la inhibición de éste13; los conejos que sólo recibían LPS presentaban patentes depósitos de fibrina renales, especialmente en la microcirculación glomerular (fig. 2A). Las citocinas proinflamatorias, ¿mediadores necesarios de la sobreexpresión endotelial de PAI-1 durante la sepsis? El LPS induce un incremento muy notorio en la expresión del factor de necrosis tumoral-␣ (TNF-␣) y de la interleucina-1 (IL-1) en los monocitos a consecuencia del cual estas citocinas van a desencadenar la puesta en marcha de una batería de mecanismos: incremento en la expresión de moléculas de adhesión endoteliales y de integrinas leucocitarias, producción de radicales libres que van a originar lesiones tisulares, expresión de factor tisular que va a desencadenar la formación de trombina, producción en exceso de prostaglandinas, leucotrienos, óxido nítrico, etc., acciones que en conjunto van a dar lugar al fallo multiorgánico. Aunque se considera que ambas citocinas son también responsables de la sobreexpresión endotelial de PAI-1 inducida por el LPS11, nosotros hemos podido ver recientemente (fig. 2B) que ésta no se corregía a pesar de inhibir la producción de TNF-␣ e IL-1 en conejos en los que se había inducido una sepsis severa con LPS14. Nuestros resultados concuerdan con los ob- 323 tenidos por Emeis et al15 en ratas que recibían también una dosis muy alta de LPS y en las que la inhibición de la actividad del TNF-␣ y de la IL-1 no lograba tampoco evitar el incremento del PAI-1: en ambos trabajos se emplearon cantidades altas de LPS administradas durante varias horas mientras que en los experimentos en los que la inhibición de las citocinas proinflamatorias sí lograba disminuir los niveles de PAI-1 se emplearon cantidades mucho más bajas de LPS infundidas en bolus. Queda pendiente de comprobación si la discrepancia entre unos resultados y otros se podría deber a los diferentes patrones de administración. En cualquier caso, durante una sepsis severa la cantidad de LPS a la que el endotelio se expone, así como el tiempo de exposición, concordarían más con nuestras condiciones experimentales que con las que generan una endotoxemia leve. Además nuestro grupo ha demostrado que el LPS es capaz de inducir el incremento en la expresión de PAI-1 en células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) en ausencia de TNF-␣ o IL-116. En la búsqueda de otras moléculas capaces de participar en la regulación de la síntesis endotelial de PAI-1 se ha propuesto que el óxido nítrico (NO) podría jugar un papel antitrombótico en la sepsis atenuando la expresión del inhibidor17: sin embargo, en unos experimentos llevados a cabo recientemente en nuestro laboratorio con células HUVEC incubadas con LPS en presencia o ausencia de dadores de NO y de inhibidores de las sintasas de NO no se consiguió demostrar con claridad la participación del NO en la modulación del gen del PAI-118. El endotelio y la fibrinólisis/proteólisis extravascular En esta revisión nos hemos centrado en el papel del endotelio en la fibrinólisis dentro del torrente circulatorio. Aunque sea brevemente, conviene recordar que el endotelio participa activa y decisivamente en procesos de fibrinólisis/proteólisis extravascular aportando una batería de proteasas o activadores de éstas (metaloproteasas, u-PA) y de inhibidores de las anteriores (TIMP, el propio PAI-1), cuyo balance va a promover o ralentizar procesos sobre todo angiogénicos, pero también en otros contextos como la metástasis tumoral o la progresión/regresión de la placa aterosclerótica19. La reciente demostración de la participación de la PCA en la activación de la progelatinasa A o proMMP-2, también de origen endotelial20, plantea interesantes interrogantes acerca del papel de receptores endoteliales como la TM o el EPCR, involucrados en la activación de la PC y en la modulación de la especificidad de la PCA, en la proteólisis extravascular. Conclusiones Las células endoteliales contribuyen decisivamente al mantenimiento del nivel plasmático basal de dos Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 324 A Actividad PAI Fibrina renal 4,0 1.200 3,5 1.000 3,0 800 Score Porcentaje 2,5 600 2,0 1,5 400 1,0 200 0,5 0 2 4 0 6 Tiempo (h) LPS LPS LPS + Ac Mo anti-PAI-1 B LPS + Ac Mo anti-PAI-1 Actividad PAI 1.500 1.300 Porcentaje 1.000 900 700 500 300 100 0 2 4 6 Tiempo (h) LPS LPS + FR (0,5 mg/kg/h/6 h) LPS + FR (0,25 mg/kg/h/6 h) LPS + FR (1 mg/kg/h/6 h) Figura 2. A) Actividad PAI plasmática y depósitos renales de fibrina en conejos tratados con 100 g/kg/h de LPS (IV) durante 6 h en presencia o ausencia de un Ac Mo anti-PAI-1. La actividad PAI, expresada como porcentaje con respecto a la actividad basal, se determinó durante las 6 h de tratamiento; los depósitos de fibrina, evaluados de acuerdo a un score de severidad (ver referencia 13) se analizaron 24 h después del inicio del experimento (*p < 0,05; **p < 0,01 con respecto al grupo LPS). (Adaptada de Montes et al13.) B) Actividad PAI plasmática, expresada como porcentaje con respecto a la actividad basal, en conejos tratados con 100 g/kg/h de LPS (IV) durante 6 h en presencia o ausencia de FR167653 (FR), inhibidor de la producción de TNF-␣ e IL-1 (todas las dosis de FR empleadas inhibieron en más de un 85 % la producción de TNF-␣; no se detectaron niveles apreciables de IL-1 en ninguno de los grupos). (Adaptada de Montes et al14.) Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios inhibidores de la fibrinólisis: exponiendo TM en su membrana plasmática, participan en la activación del TAFI, que presumiblemente va a contribuir a evitar la lisis prematura de los coágulos emergentes de fibrina en situaciones en las que la continuidad de la pared vascular se vea comprometida; sintetizando y secretando PAI-1 al torrente circulatorio permite mantener un balance hemostático adecuado. Sin embargo, determinados agentes eventualmente expuestos al endotelio, como el LPS durante la sepsis, inducen una sobreexpresión de PAI-1 que va a participar decisivamente en la aparición de microtrombos en la circulación capilar de diversos órganos que puede originar el cuadro de CID, no conociéndose con certeza si dicha sobreexpresión es originada directamente por el agente externo actuando sobre la célula endotelial o a través de algún mediador del propio huésped. 18. Pérez-Ruiz A, Montes R, Velasco F, López-Pedrera C, Paramo JA, et al. Regulation by nitric oxide of endotoxin-induced tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 in endothelial cells. Thromb Haemost 2002;88:1060-5. 19. Shapiro SD. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Curr Opin Cell Biol 1998;10:602-8. 20. Nguyen M, Arkell J, Jackson CJ. Activated protein C directly activates human endothelial gelatinase A. J Biol Chem 2000;275:9095-8. DISFUNCIÓN ENDOTELIAL Y BALANCE HEMOSTÁTICO EN LA UREMIA A. CASES AMENÓS, M. DÍAZ-RICART G. ESCOLAR ALBALADEJO Y Servicios de Nefrología y Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic. Universidad de Barcelona. Barcelona. Introducción Bibliografía 1. Bajzar L. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and an antifibrinolytic pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:2511-8. 2. Mosnier LO, von dem Borne PA, Meijers JC, Bouma BN. 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La insuficiencia renal crónica se asocia con una elevada prevalencia de factores de riesgo cardiovascular “clásicos” (Framingham): edad, hipertensión arterial, diabetes mellitus, tabaquismo, hiperlipemia, hipertrofia ventricular izquierda, etc. Sin embargo, basado en el análisis convencional de factores de riesgo cardiovascular para la población general, estos factores no explican totalmente el exceso de morbimortalidad cardiovascular en estos pacientes. Por ello, se ha postulado que factores alternativos también estarían implicados en este riesgo elevado. La prevalencia de factores de riesgo cardiovascular emergentes (lipoproteína (a), hiperhomocisteinemia, inflamación, hiperfibrinogenemia, estrés oxidativo, etc.) es elevada en los pacientes urémicos. Situaciones propias de la insuficiencia renal crónica, como la hipervolemia, la anemia, las alteraciones del metabolismo calcio-fósforo y/o el hiperparatiroidismo; o la acumulación de productos metabólicos, como los productos finales de glucosilación avanzada (AGE), o los inhibidores endógenos de la síntesis de óxido nítrico (NO) (dimetil-arginina asimétrica [ADMA], NG-monometil-L-arginina [L-NMMA]), podrían contribuir al exceso de riesgo cardiovascular. El endotelio vascular es la diana de los factores aterogénicos, y la disfunción endotelial es considerada el evento inicial en el desarrollo de aterosclerosis2. El endotelio vascular participa en la regulación del tono vascular, del crecimiento y migración de la Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 326 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 fibra muscular lisa vascular subyacente, así como en la regulación de la composición de la matriz subendotelial, de la permeabilidad a sustancias, de fenómenos inflamatorios, del reclutamiento y transmigración de leucocitos, de la adhesión y activación de las plaquetas, y del balance entre coagulación y fibrinólisis. Su situación estratégica le permite sensar cambios en las fuerzas hemodinámicas o las señales provenientes del torrente circulatorio y responde liberando sustancias vasoactivas y distintos mediadores3. El endotelio vascular ejerce también un papel importante en la regulación de la hemostasia. La integridad tanto funcional como estructural del endotelio es fundamental para el mantenimiento del equilibrio entre los mecanismos de coagulación y fibrinólisis. Las células endoteliales proporcionan una superficie no trombogénica; ello es debido en parte a la expresión de glucosaminoglucanos, que inactivan el factor X y la trombina; la trombomodulina, CONTROL que se liga a la trombina; la proteína C; o la producción del factor inhibidor de la vía del factor tisular, o de factor activador del plasminógeno (t-PA), que activa la fibrinólisis. Sin embargo, en determinadas circunstancias el endotelio puede favorecer la trombosis mediante la expresión de factor tisular, que acelera la activación de factor X dependiente de FVIIa4. El NO y la prostaciclina producidos por el endotelio inhiben la agregación plaquetaria, mientras que el tromboxano A2 tiene un efecto proagregante plaquetario3. Balance hemostático en la uremia La insuficiencia renal crónica se asocia con un aumento de los niveles de factores de la coagulación, como fibrinógeno o FVII5,6, así como con índices de generación de trombina a nivel intravascular aumentada (aumento de niveles del complejo trombinaantitrombina, dímero D, F1 + 2), sugiriendo la existencia de una activación hemostática7,8. Respecto a la fibrinólisis se ha descrito que las concentraciones de t-PA están disminuidos, así como la liberación de t-PA por la pared vascular tras un estímulo, mientras que no hay acuerdo sobre si los niveles de PAI-1 están aumentados, normales o incluso reducidos8,9. Sin embargo, parece que la generación de plasmina, demostrada por un aumento del complejo plasmina-antiplasmina, o productos de degradación del fibrinógeno o de la fibrina, está aumentada en la uremia7,8. Disfunción endotelial en la uremia URÉMICA Figura 1. Imágenes correspondientes a células endoteliales en cultivo en presencia de suero control y de suero urémico. Las células endoteliales expuestas a medio urémico presentan un crecimiento más rápido, una mayor proporción de células se encuentra en división, y presentan alteraciones morfológicas evidentes (×160). En los pacientes con insuficiencia renal crónica terminal se ha demostrado la existencia de una disfunción endotelial, evidenciada por un patrón típico de elevación de los niveles de diversas glucoproteínas derivadas del endotelio en el suero de estos pacientes, tales como el factor von Willebrand, PAI-1 o trombomodulina10; de factores vasoactivos liberados por este, como endotelina 1; así como por la liberación disminuida de estos factores tras la estimulación del endotelio (FvW, t-PA). Se ha demostrado también que la vasodilatación dependiente de endotelio está disminuida en estos pacientes. Esta última técnica es actualmente considerada, como el gold standard, para evaluar la función endotelial in vivo11. En estudios en los que las células endoteliales son cultivadas en presencia de un medio urémico, éstas presentan un crecimiento más acelerado, así como alteraciones morfológicas con aparición de formas irregulares y la presencia de abundantes vacuolas en el citoplasma celular12,13 (fig. 1). Además, se ha demostrado un incremento de células en fase S + G2M y un aumento de los niveles de fosforilación de las MAP cinasas en células endoteliales incubadas con suero urémico14. Por otro lado, su adherencia al subendotelio en condiciones de flujo es inferior a las células endoteliales cultivadas en presencia de suero Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios control12,13. Asimismo, las matrices subendoteliales generadas por estas células endoteliales son más pobres y desorganizadas12, aunque son más trombogénicas y muestran una expresión aumentada de factor tisular y factor von Willebrand13; sin embargo, y en contra de lo esperado, no se ha observado un aumento de la apoptosis en estas células14. Las células endoteliales incubadas en presencia de suero urémico presentan también un aumento de la expresión de ARNm para factor tisular, factor von Willebrand y trombomodulina15. Los estudios inmunocitoquímicos han mostrado que estas células presentan un aumento en la expresión de moléculas de adhesión (ELAM-1, VCAM-1 y ICAM-1) en los contactos intercelulares, con un aumento en sus correspondientes ARNm. Estos resultados indican la existencia de un estado inflamatorio, que podría jugar un papel contribuyente en el desarrollo de complicaciones aterotrombóticas en estos pacientes. En contraste con los resultados en HUVEC, otro estudio con una línea de células endoteliales híbridas (que no son fenotípicamente iguales a las células endoteliales obtenidas de cultivos primarios) no pudo observar cambios en la actividad de factor tisular en lisados de células endoteliales incubadas durante sólo 4 h con suero urémico, a diferencia de nuestros resultados16. Asimismo, las células endoteliales incubadas en presencia de un medio urémico muestran una secreción de PAI-1 estimulada por citocinas aumentada, mientras que la secreción de activador del plasminógeno tisular es similar a las células endoteliales control17. Finalmente, existe controversia sobre si la producción de NO por células endoteliales expuestas a plasma urémico está aumentada18 o disminuida19. Las evidencias de los estudios in vitro indican que las células endoteliales en presencia de un medio urémico presentan una expresión aumentada de moléculas de adhesión asociada a una mayor trombogenicidad y una alteración de la respuesta fibrinolítica. Si los cambios descritos in vitro también ocurren in vivo ello favorecería el desarrollo de un estado protrombótico y proaterogénico en la uremia, que podría estar implicado en el aumento del riesgo cardiovascular y de fenómenos trombóticos que presentan los pacientes con insuficiencia renal crónica. Posibles mecanismos implicados La disfunción endotelial descrita en la uremia podría deberse a la frecuente presencia de factores que alteran la función endotelial en la población general, como la hipertensión arterial, la hiperlipemia, la diabetes o el tabaquismo. En este sentido se ha observado una correlación directa entre niveles de FVII, fibrinógeno o F1 + 2 y niveles de lípidos en estos pacientes5,6. Sin embargo, otros factores parecen estar también implicados en la disfunción endotelial. 327 La hiperhomocisteinemia está presente en fases iniciales de la insuficiencia renal y aumenta con el deterioro de la función renal. En pacientes con insuficiencia renal terminal la prevalencia de hiperhomocisteinemia es superior al 90 %20. Tras la exposición a homocisteína, aparece disfunción endotelial a varios niveles. El endotelio normal pasa a un fenotipo más protrombótico con aumento de la actividad factor V y factor XII, disminución de la activación de la proteína C e inhibición de la expresión de trombomodulina, inducción de la expresión de factor tisular y supresión de la expresión de heparán sulfato. La homocisteína también reduce la unión del activador del plasminógeno tisular a su receptor endotelial, anexina II21 e inhibe la inactivación de factor Va por la proteína C activada en estudios in vitro22. Todos estos cambios tienen como acción final común la facilitación de la generación de trombina. La generación de trombina también puede ser facilitada a través de la inducción de factor tisular por los monocitos estimulada por la homocisteína. Sin embargo, la hiperhomocisteinemia en la uremia no se correlaciona con los marcadores de activación hemostática8. Los pacientes urémicos presentan con frecuencia una resistencia a la insulina. Estudios recientes en la población general indican que la vasodilatación dependiente de endotelio se correlaciona con la sensibilidad a la misma en sujetos normales y pacientes hipertensos y diabéticos tipo 2. Ello sugiere que la resistencia a la insulina y/o la hiperinsulinemia favorecen la disfunción endotelial. La resistencia a la insulina reduce la biodisponibilidad de NO, y se asocia con un aumento de los niveles de ADMA. La insulina por su parte estimula la producción de endotelina-1 y es un factor facilitador de la activación del factor de transcripción NF-B. Además, en la hiperinsulinemia existe una resistencia vascular a la activación de la síntesis de NO o de la Na-K-ATPasa, probablemente secundario a la activación de la proteincinasa C. Finalmente, la mejora de la resistencia a la insulina se asocia con una mejoría de la disfunción endotelial en pacientes diabéticos tipo 2. La síntesis de NO por la NO sintasa (NOS) puede ser inhibida de forma competitiva por análogos endógenos de la L-arginina, como L-NMMA, ADMA, metilguanidina u otros metabolitos que se acumulan en presencia de insuficiencia renal. En células endoteliales en cultivo la ADMA aumenta el estrés oxidativo y favorece la adhesión de monocitos, dos procesos clave en el desarrollo de aterosclerosis. Los pacientes urémicos con aterosclerosis presentan unos niveles de ADMA superiores a los pacientes sin aterosclerosis. Además, los niveles de ADMA en estos pacientes están relacionados con el grosor de la íntima-media y son un factor de riesgo de mortalidad cardiovascular. Sin embargo, el papel patogénico de estos inhibidores endógenos de la NOS en la Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 328 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 disfunción endotelial en la uremia precisa ser confirmado. Los pacientes urémicos presentan un estrés oxidativo aumentado. El estrés oxidativo modula la función endotelial regulando la formación de caveolas, la expresión de la eNOS y la interacción entre la eNOS y las caveolas. El anión superóxido inactiva el NO, formando peroxinitrito (el cual favorece la apoptosis), activa el factor de transcripción NF-B, estimula la peroxidación lipídica y oxida la tetrahidrobiopterina (BH4) formando dihidrobiopterina. El BH4 es un cofactor esencial para la eNOS, y su depleción resulta en un desacoplamiento de esta enzima, lo que favorece que eNOS genere aniones superóxido en lugar de NO a partir de la L-arginina, ello se traduce en una disminución de la biodisponibilidad de NO y un aumento del estrés oxidativo. Los radicales libres de oxígeno favorecen además la formación de AGE y la peroxidación lipídica, aumentan la permeabilidad vascular (vía estimulación de la producción de PAF), favorecen la coagulación al inhibir la producción de prostaciclina; así como la expresión de moléculas de adhesión en células endoteliales y la activación de las metaloproteasas de matriz, e inducen lisis celular. La oxidación de la LDL, favorecida por el estrés oxidativo aumentado, también juega un papel importante en el proceso aterogénico. La LDL oxidada estimula la expresión de moléculas de adhesión, citocinas y factores de crecimiento por las células endoteliales y favorece su apoptosis, estimula la proliferación de la fibra muscular lisa vascular, altera la degradación de colágeno y favorece la trombosis. La LDL oxidada también inhibe la actividad NOS plaquetaria, modifica la respuesta funcional de la fibra muscular lisa a la estimulación de angiotensina II, y aumenta los niveles de este péptido y de endotelina-1. Además, la LDL-oxidada y su derivado peróxido lisofosfatidilcolina estimulan la proteincinasa C, el turnover de fosfoinositoles y el aumento de calcio intracelular. Productos derivados de la oxidación de proteínas también están implicados en el desarrollo de fenómenos inflamatorios. Sin embargo, existen discrepancias en la literatura sobre la posible relación entre estrés oxidativo y disfunción endotelial en la insuficiencia renal crónica con resultados tanto positivos como negativos. Los AGE quelan el NO y aumentan la susceptibilidad de la LDL a ser oxidada. Además, la activación de su receptor (RAGE) favorece la generación de radicales libres de oxígeno, aumenta la translocación del factor nuclear NF-B, la expresión de genes proinflamatorios y de moléculas de adhesión, de la permeabilidad endotelial y de la generación de factor tisular. Por ello, los AGE, que se acumulan en la insuficiencia renal crónica, podrían estar implicados en la disfunción endotelial en la uremia. El estado microinflamatorio crónico presente en los pacientes urémicos podría contribuir a la disfunción endotelial. La respuesta inflamatoria está or- questada por citocinas tales como IL-1, IL-6 o TNF-␣, que inducen la producción de radicales libres de oxígeno en células endoteliales y estimulan el factor de transcripción NF-B, que aumenta la transcripción de moléculas de adhesión y de citocinas. Además, las citocinas aumentan la expresión de factor tisular en células endoteliales y en los monocitos. El fibrinógeno es una proteína de fase aguda cuya síntesis hepática aumenta cuando existe inflamación. Recientemente se ha demostrado una relación entre vasodilatación endotelio-dependiente y marcadores de inflamación en pacientes urémicos, así como entre marcadores de inflamación y de disfunción endotelial con marcadores de actividad hemostática6,8, sugiriendo un papel patogénico de la inflamación en la disfunción endotelial y hemostática asociada a la uremia. El estado urémico per se y la retención de productos nitrogenados podría jugar también un papel en la disfunción endotelial en la uremia. La urea, a dosis fisiológicamente relevantes, inhibe el transporte de L-arginina en células endoteliales, y favorece la proliferación de macrófagos en cultivo por inhibición de la apoptosis, secundaria a una disminución de la producción de NO inducida por la iNOS. Finalmente, la acidosis (frecuente en la uremia) aumenta la producción de factores que estimulan el crecimiento y la permeabilidad, como el VEGF, por las células endoteliales. Respecto a la técnica de tratamiento sustitutivo parece que la hemodiálisis con membranas celulósicas agrava la disfunción endotelial de forma aguda, efecto atribuido al estrés oxidativo generado durante la técnica; aunque otros autores han descrito resultados neutros o incluso una mejoría después de una hemodiálisis, asociado a la disminución de los niveles de inhibidores endógenos de la NOS tras la sesión. Por otra parte, no parecen existir diferencias en el grado de disfunción endotelial entre pacientes en hemodiálisis y pacientes en diálisis peritoneal, a pesar de que en los últimos no existe la activación celular inducida por el circuito extracorpóreo. La presencia de endotoxinas en el líquido de hemodiálisis activa las células sanguíneas, con la consiguiente liberación de citocinas que afectan la función endotelial. El tratamiento con factores eritropoyéticos (eritropoyetina recombinante humana, darbepoetina alfa) para la corrección de la anemia en los pacientes urémicos se ha asociado con un aumento del riesgo de desarrollo o agravamiento de una hipertensión arterial y posiblemente del riesgo de trombosis del acceso vascular, aunque esto último es controvertido. Nuestro grupo ha demostrado que la eritropoyetina recombinante humana (rhuEPO) induce activación de las vías de transducción de señales JAK/STAT y RAS/MAPK en células endoteliales en cultivo. Este efecto activador de rhuEPO sobre las células endoteliales se asociaba con la gene- Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios ración de una matriz subendotelial más trombogénica y con una presencia aumentada de factor tisular23. Sin embargo, en un estudio posterior demostramos que la adición de rhuEPO a células endoteliales incubadas en presencia de suero urémico no parecía ejercer un efecto adicional sobre la activación de tirosincinasas, la trombogenicidad de la matriz subendotelial o la expresión de factor tisular inducidos por el medio urémico per se24. La disfunción endotelial como objetivo terapéutico Aunque disponemos de pocos estudios que hayan analizado el efecto de diversas intervenciones sobre la función endotelial en la uremia, existen evidencias en otras situaciones clínicas que pueden ser extrapolables a la población urémica, a falta de estudios que validen estas intervenciones en estos pacientes. En primer lugar, deberán tratarse aquellos factores reconocidos que inducen disfunción endotelial (hipertensión, dislipemia, tabaquismo, diabetes, etc.) y son factores de riesgo cardiovascular. Cambios en el estilo de vida El abandono del tabaquismo y el ejercicio se asocian con una mejora de la vasodilatación endotelio-dependiente en pacientes no urémicos, por lo que es razonable que también mejoren la misma en los pacientes urémicos y deberían fomentarse. Tratamiento sustitutivo hormonal El tratamiento sustitutivo hormonal mejora la función endotelial en mujeres posmenopáusicas, pero la experiencia con el tratamiento sustitutivo hormonal en estos pacientes es escasa. L-arginina u otros cofactores de la eNOS La L-arginina es el sustrato que precisa la NOS para producir NO. Existen discrepancias en la literatura sobre si la uremia es un estado deficitario en L-arginina. Por otro lado, diversos antagonistas endógenos de la misma, que se acumulan en la insuficiencia renal, como el ADMA, podrían competir por la eNOS. En este sentido, los efectos de la administración de L-arginina sobre la función endotelial en estos pacientes son contradictorios. La administración de BH4 mejora la disfunción endotelial en animales de experimentación y en diversas patologías humanas, como la diabetes mellitus o la enfermedad coronaria. El aumento del estrés oxidativo en la uremia favorecería la oxidación de BH4 y reduciría sus niveles, por lo que su administración podría ser beneficiosa en estos pacientes, aunque no hay estudios disponibles que lo demuestren. Ácido fólico La suplementación de la dieta con ácido fólico y vitamina B disminuye, pero no normaliza, los niveles de homocisteína en los pacientes urémicos. La ad- 329 ministración intraarterial de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF), la forma activa de folato circulante, mejora de forma aguda (y sin modificar los niveles de homocisteína) la vasodilatación endotelio-dependiente en pacientes no urémicos. Este efecto beneficioso del ácido fólico parece ser debido, al menos en parte, a la reducción de la formación de anión superóxido intracelular. Asimismo, el 5-MTHF es esencial en el ciclo redox que facilita el paso de dihidrobiopterina a la forma activa BH4, por lo que la capacidad del 5-MTHF de regenerar BH4 podría explicar, en parte, la mejora de la biodisponibilidad de NO observada en estudios en humanos. Sin embargo, la administración de ácido fólico, a pesar de reducir los niveles de homocisteína y los marcadores de estrés oxidativo, no mejora la función endotelial en la uremia. Aceites de pescado Los aceites de pescado han demostrado mejorar la función endotelial en pacientes con patología coronaria. El ácido graso n-3 docosahexaenoico reduce la expresión de VCAM-1 inducida por citocinas y otros mediadores inflamatorios. Los ácidos grasos n-3 de cadena larga son los ligandos naturales que activan los peroxisome proliferator activated receptors (PPAR-␣), y es conocido que la activación de PPAR-␣ reduce la actividad inflamatoria en la pared vascular. Antioxidantes Estudios en pacientes diabéticos o con hiperhomocisteinemia han demostrado una mejoría de la vasodilatación endotelio-dependiente con vitamina C. Resultados similares se han descrito con suplementos de vitamina E o la combinación de ambos en pacientes diabéticos. Aunque no hay estudios sobre el efecto de la suplementación con antioxidantes sobre la función endotelial en la uremia, existen resultados sugestivos de su efecto beneficioso sobre la misma en estos pacientes. Estatinas El tratamiento con estatinas mejora la disfunción endotelial en pacientes hipercolesterolémicos y en pacientes diabéticos. Evidencias recientes sugieren que las estatinas mejoran directamente la función endotelial, independientemente de su efecto hipolipemiante, aumentando la producción de NO o reduciendo la inflamación. En estos momentos están en marcha estudios para analizar si las estatinas son capaces de reducir los eventos cardiovasculares en pacientes urémicos. Inhibidores de la enzima de conversión de angiotensina/antagonistas del receptor de angiotensina II Los IECA han demostrado que mejoran la disfunción endotelial en pacientes diabéticos y pacientes Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 330 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 coronarios. Los IECA pueden mejorar la función endotelial por diversos mecanismos: tienen propieda des antioxidantes, tienen un efecto favorable sobre la fibrinólisis, reducen la formación de angiotensina II y aumentan las bradicininas. Estudios recientes también han demostrado que los ARAII mejoran la disfunción endotelial en diversas patologías no urémicas. Es decir, la inhibición de la formación o de la acción de angiotensina II es un enfoque esperanzador para mejorar la disfunción endotelial en los pacientes urémicos. Calcioantagonistas Los calcioantagonistas mejoran la disfunción endotelial en pacientes no urémicos, efecto que parece ser debido a un aumento de la biodisponibilidad de NO a través de su efecto antioxidante. Antagonistas del receptor de endotelina Dado que la endotelina-1 tiene muchos efectos opuestos al NO, la inhibición de sus efectos sobre la función endotelial mediante antagonistas específicos es un campo prometedor. Estudios en modelos experimentales indican un efecto positivo de los antagonistas de endotelina sobre la función endotelial. Aspirina-inhibidores de la COX-2 La aspirina mejora la disfunción endotelial en pacientes hipertensos, pero no en pacientes diabéticos. Ya que la disfunción endotelial en la uremia se asocia con el estado inflamatorio crónico que presentan estos pacientes, el uso de antiinflamatorios podría ser beneficioso, aunque ello está por demostrar. Hemodiálisis Parece que la hemodiálisis con membranas celulósicas agrava la disfunción endotelial de forma aguda, efecto que se previene con membranas no celulósicas, o la utilización de membranas celulósicas recubiertas con vitamina E. Esto último sugiere que el estrés oxidativo que ocurre durante la sesión de hemodiálisis afecta de forma crónica a la función endotelial. La contaminación con endotoxinas del dializado induce activación celular e inflamación, y la utilización de agua ultrapura durante la hemodiálisis reduce el estado inflamatorio, por lo que es razonable pensar que mejore la disfunción endotelial. Factores eritropoyéticos Dado que la eritropoyetina recombinante humana a dosis farmacológicas tiene efectos potencialmente negativos sobre la célula endotelial es razonable plantearse su administración subcutánea a fin de disminuir los niveles plasmáticos alcanzados respecto a la vía intravenosa. Conclusiones El endotelio vascular regula funciones muy importantes, como el control del tono vascular, el balan- ce hemostático y el desarrollo de aterosclerosis. Los pacientes urémicos presentan una disfunción endotelial y una activación hemostática, ya presente en la etapa de prediálisis y que se agrava en pacientes en tratamiento sustitutivo renal, y que parecen estar implicados en el elevado riesgo cardiovascular que presentan estos pacientes. Los posibles mecanismos implicados en esta disfunción son variados y la importancia relativa de cada uno de los factores está por definir. Aunque estudios en pacientes no urémicos han demostrado que se puede modular la función endotelial mediante estrategias farmacológicas y no farmacológicas, disponemos de pocos estudios de este tipo en pacientes con insuficiencia renal crónica. El estudio de los mecanismos implicados en la disfunción endotelial de la uremia y las estrategias para mejorar la misma en estos pacientes es un área de investigación muy prometedora para intentar reducir su elevado riesgo aterotrombótico. Agradecimientos Este trabajo ha sido subvencionado en parte gracias a las becas del Fondo de Investigación Sanitaria de la Seguridad Social (FISS 00/0551) (FISS 01/1512) y SEN (PI 1/98). Bibliografía 1. Foley RN, Parfrey PS, Sarnak MJ. Cardiovascular disease in chronic renal disease: Clinical epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. 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En ambos casos, la trombogénesis tiene lugar con la participación de complejas interacciones entre factores de la coagulación y células sanguíneas, aún no completamente esclarecidas. Entre las células sanguíneas las plaquetas juegan un papel crucial, participando en el inicio, localización, amplificación y consolidación del trombo. Participación de las plaquetas en la trombogénesis 331 La formación del trombo se inicia por el daño vascular que expone a la sangre circulante las estructuras subendoteliales del vaso. Sobre este vaso dañado las plaquetas se adhieren al factor von Willebrand subendotelial o adsorbido del plasma y al colágeno, un fuerte inductor plaquetario, que inicia la activación de las plaquetas. A su vez, las plaquetas activadas liberan sustancias contenidas en sus gránulos (nucleótidos de adenina, serotonina, proteínas adhesivas, factores de la coagulación, etc.) y productos metabólicos como ácido araquidónico libre (AA), tromboxano A2 (TXA2) y otros eicosanoides. Algunas de estas sustancias son agonistas plaquetarios secundarios que amplifican la activación de las plaquetas que los liberan e interaccionan con otras plaquetas y células del entorno induciendo el reclutamiento plaquetario1. Concomitantemente, el daño al endotelio induce la exposición en el mismo de factor tisular (FT), una glucoproteína integral de membrana que se localiza en algunas células de la pared vascular, como en los fibroblastos y en las células del músculo liso. También la rotura de la placa de ateroma expone FT a la sangre circulante2. La unión de FT al FVIIa, que se encuentra en pequeña cantidad en el plasma, inicia la generación de trombina, otro potente inductor de la activación plaquetaria, que potencia y refuerza la activación y el reclutamiento de las plaquetas inducido por el colágeno y promueve la formación de fibrina que estabiliza el trombo. Las plaquetas participan también en la etapa final de consolidación del trombo por su papel en la retracción del coágulo, que está mediada por la unión del fibrinógeno al receptor GPIIbIIIa y las proteínas contráctiles del citoesqueleto3. Las distintas manifestaciones funcionales de la respuesta plaquetaria al estímulo requieren la coordinación y el control de múltiples mecanismos de señalización que conducen a la respuesta funcional apropiada de la célula. Éstos incluyen los receptores de membrana, las proteínas G, el metabolismo del fosfatidil inositol, la síntesis de eicosanoides, los movimientos de calcio y las distintas vías de fosforilación de proteínas en las plaquetas4, aunque las conexiones entre los distintos mecanismos de señalización no están todavía totalmente esclarecidos. Las plaquetas tienen un papel importante en la generación de trombina. La adhesión, activación, agregación y reclutamiento de las plaquetas en el lugar del daño al endotelio además de ser parte esencial en el inicio de la formación del trombo, son también aspectos importantes en la localización y control de la subsiguiente generación de trombina en ese lugar, evitando la activación sistémica de la coagulación. Esta función localizadora y reguladora de la generación de trombina por las plaquetas activadas depende de sus receptores adhesivos a com- Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 332 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 ponentes del endotelio, posibilidad de exponer fosfolípidos procoagulantes, disponer de puntos de unión de alta afinidad en su membrana para algunos factores de la coagulación y contener y liberar de sus gránulos sustancias activadoras e inhibidoras de la formación de trombina, participando así en la regulación del proceso5. Originalmente la contribución de las plaquetas a la coagulación se denominó factor 3 plaquetario que se asoció a los fosfolípidos de membrana6. Hoy sabemos que esta actividad procoagulante es debida a la exposición de fosfolípidos aniónicos en las membranas de las plaquetas activadas y también en otras células sanguíneas. Esto es debido a la alteración de la asimetría de los fosfolípidos de membrana mediada por un incremento del calcio citosólico, lo que provoca la externalización de fosfatidil etanolamina y especialmente de fosfatidil serina (PS). Estos fosfolípidos proporcionan una superficie catalítica para el ensamblaje de factores de la coagulación plasmáticos o liberados por las propias plaquetas activadas7. La presencia de PS es necesaria y quizás suficiente para desarrollar la actividad procoagulante de las plaquetas. Algunos autores apoyan la idea de que esta unión se realiza mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas8; otros autores5 proponen además la existencia de puntos de unión de alta afinidad para algunas proteínas de la coagulación, implicando la posible existencia de receptores específicos. Esto último se apoya en las diferencias cualitativas en la generación de trombina que se observan entre microvesículas y plaquetas intactas que exponen en ambos casos PS5 y, también, en el hecho de que se unan factores de coagulación a receptores plaquetarios. En este sentido es conocido que el receptor GPIIbIIIa, además de unir FvW y fibrinógeno puede unir protrombina9, mientras que el receptor GPIb puede unir FXI10. Por otra parte, el bloqueo de GPIIbIIIa11 o del receptor GPIb12 reduce la generación de trombina dependiente de las plaquetas. Aunque los mecanismos y la contribución relativa de la unión específica y/o inespecífica de factores de la coagulación a la membrana plaquetaria no es un tema resuelto en la actualidad, es un hecho aceptado el que la formación de complejos de la coagulación (protrombinasa y tenasa) en la membrana de las plaquetas activadas localiza y aumenta la eficacia catalítica en la fase de iniciación, de propagación y en el mantenimiento de la generación de trombina. Esto último es debido a la protección de los factores de la coagulación unidos a la membrana de la inactivación por inhibidores plasmáticos13. Otro aspecto significativo de la amplificación y regulación de la generación de trombina dependiente de las plaquetas es la liberación de factores de la coagulación y de microvesículas procoagulantes por las plaquetas activadas. Recientemente se ha descrito la presencia de FT en los gránulos alfa y en el sistema canalicular de las plaquetas que se expone funcionalmente activo en la membrana y en microvesículas de plaquetas activadas14. Este hecho, de confirmarse por otros grupos, proporcionaría una nueva visión de la contribución de las plaquetas a la coagulación, ya que por este mecanismo podrían actuar también como células iniciadoras del proceso de generación de trombina, capacidad que antes de este hallazgo se atribuía sólo al endotelio dañado y a los monocitos activados. Otra contribución importante de las plaquetas a la formación del trombo es su capacidad para modificar algunos aspectos funcionales y bioquímicos de otras células sanguíneas (leucocitos y eritrocitos) vía interacciones celulares heterotípicas, aspectos a los que nos referiremos brevemente a continuación. Interacción leucocito-plaqueta Los neutrófilos (PMN) tienen un papel regulador de la trombosis por su capacidad para adherirse al endotelio y agregarse durante los procesos inflamatorios agudos, que a veces son concomitantes con la trombosis, donde pueden liberar compuestos citotóxicos y radicales libres, regular la función de las plaquetas y contribuir al proceso coagulativo1. Con relación a la interacción leucocito-plaqueta se ha descrito que las plaquetas activadas pueden unirse físicamente a los leucocitos por tres mecanismos: a) mediante unión vía P-selectina en las plaquetas y el receptor P-selectina glucoproteína-1 (PSGL-1) en los leucocitos; b) por unión de los receptores GPIIbIIIa y GPIb en las plaquetas y CD11b/ CD18 (Mac-1) en los leucocitos, y c) vía JAM-3 (junctional adhesion molecule), recientemente descrita en las plaquetas que se une a Mac-1 en los leucocitos15. Mediante estas uniones físicas entre plaquetas y leucocitos, se va a propiciar intercambios metabólicos que condicionarán la bioquímica y la reactividad de ambas células. Los leucocitos no activados inhiben la reactividad plaquetaria16-18, mientras que existe controversia en la literatura sobre el efecto de la activación leucocitaria sobre la función de las plaquetas19. A su vez, las plaquetas activadas liberan sustancias quemotácticas que atraen a los leucocitos al lugar del trombo, donde pueden asociarse a ellos e iniciar algunas etapas en la transducción de estímulo en los leucocitos20 e inducir, en algunas circunstancias, la expresión y secreción de proteínas leucocitarias21. Aunque algunos autores proponen que los neutrófilos (PMN) pueden contribuir a la actividad procoagulante, se considera en general a los monocitos/macrófagos como los leucocitos que juegan el papel esencial en la generación de trombina22,23. Los PMN no tienen FT ni se induce su síntesis/expresión por activación, no obstante se ha sugerido recientemente, que los PMN unidos a plaquetas o microvesículas plaquetarias que expongan FT podrían contribuir también a la generación de trombina14. Los Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. XLV Reunión Nacional de la AEHH y XIX Congreso Nacional de la SETH. Simposios monocitos en cambio, aunque en condiciones normales no contienen FT, tienen la capacidad de sintetizarlo rápidamente y expresarlo en las membranas en respuesta a un estímulo (LPS, C5a, complejos inmunes, proteína C reactiva, PDGF, etc.). También pueden ensamblar en su membrana los complejos de la coagulación necesarios para la generación eficiente de trombina iniciada por el factor tisular22. La expresión de FT en monocitos y la subsiguiente activación de la coagulación puede tener una significación en diversas situaciones patológicas, como en el síndrome antifosfolipídico primario24. Las plaquetas y los monocitos interaccionan en las zonas de daño vascular, inflamación o trombosis. Esta unión física, como se ha dicho, facilita una mutua influencia bioquímica. Un caso claro es el metabolismo transcelular del leucotrieno A4 de los monocitos que es transformado en LTC4 por las plaquetas25. La primera indicación en la literatura de que las plaquetas podían inducir actividad FT de los monocitos es antigua, la realizaron Niemetz y Marcus en 197426, lo que ha sido confirmado posteriormente por otros autores27,28. Otro hallazgo importante, en los primeros estudios dedicados a establecer las bases bioquímicas de la inducción de FT en monocitos por las plaquetas, es que ésta se incrementa notablemente en monocitos activados en presencia del 12-HETE, el producto de lipooxigenación de las plaquetas y del ácido araquidónico29. También el factor 4 plaquetario30 y la P-selectina aumentan la expresión de FT en los monocitos, mientras que el bloqueo de esta vía de interacción célula-célula la disminuye27. Por otra parte, también las plaquetas activadas unidas a monocitos por P-selectina inducen la expresión y liberación de IL-8 y chemotactic protein-1 de los monocitos21. Las uniones heterotípicas plaquetas-leucocitos podrían contribuir al riesgo trombótico, particularmente en el infarto de miocardio31, aunque se necesitan más estudios en distintas circunstancias clínicas para consolidar esta asociación. La capacidad de los monocitos/macrófagos activados para expresar FT que se amplifica con la activación plaquetaria o la influencia del FT de origen plaquetario son las bases de una nueva visión del inicio de la trombosis por las células sanguíneas32,33. A pesar de lo anterior y de que las uniones plaqueta-leucocito aumentarían la masa de trombo in vivo, la participación específica de los distintos leucocitos y de los mecanismos reguladores en la generación de trombina no está todavía totalmente esclarecida34, aunque es un tema de investigación de gran interés. Interacción eritrocito-plaqueta Los eritrocitos (RBC) juegan también un papel potencialmente importante en la formación del trombo que se ha evidenciado en estudios experimentales y clínicos1,19,35. La participación de los eritrocitos en la trombogénesis se ha asociado a su contribución a 333 las propiedades hemorreológicas de la sangre, a su papel inhibidor de la prostaciclina y del óxido nítrico del endotelio y a su influencia sobre la reactividad de las plaquetas1,19. En este sentido se ha comprobado que los RBC incrementan la adhesión, la agregación plaquetaria1,19 y acortan el tiempo de formación del trombo en el sistema PFA-10036. Los eritrocitos tienen también un efecto protrombótico aumentando la activación y el reclutamiento plaquetario, procesos funcionales regulados bioquímicamente37-39. Esta interacción célula-célula reduce el efecto de la aspirina como fármaco antitrombótico39-41 y puede condicionar la hiperfunción plaquetaria en pacientes con trombofilia, como los pacientes con diabetes tipo I42. Los datos referidos y otros trabajos en la literatura apoyan la idea de una participación activa y compleja de los eritrocitos en la formación del trombo. En este sentido hay que tener también en cuenta que los eritrocitos disponen de una abundante maquinaria bioquímica, como receptores, sistemas de fosforilación de proteínas, metabolismo del fosfatidil inositol, proteínas G, etc.43, que puede ser usada para la transducción de señales extracelulares43,44. A pesar de ello se sigue pensando, en general, que los RBC normales son células que no responden a señales externas y que tienen un papel pasivo en la trombosis. Al contrario que en los eritrocitos normales, los eritrocitos de los pacientes con anemia falciforme o betatalasemia se consideran responsables, al menos en parte, de la trombofilia detectada en estos pacientes, aunque los mecanismos envueltos siguen sin estar totalmente clarificados45. Sin embargo, dos aspectos están establecidos: a) en estos pacientes se detecta un porcentaje elevado de eritrocitos (1,5-3 % frente a < 0,5 % en normales) que expresan fosfatidil serina y que por tanto pueden contribuir a la generación de trombina46,47, y b) los eritrocitos de estos pacientes se adhieren al endotelio48,49, un proceso también mediado por la fosfatidil serina50 lo que puede causar fenómenos oclusivos, particularmente en la microcirculación. En estudios experimentales con RBC normales tratados ionóforos de calcio se ha visto que la exposición de PS que está asociada a un aumento del calcio citosólico en la célula51. Este aumento de calcio reduce la deformabilidad eritrocitaria52, otro fenómeno que propicia la oclusión vascular35. Nuestros estudios recientes39 indican que componentes del liberado de plaquetas activadas, como son el tromboxano A2 y el ácido araquidónico libre, producen la exposición de PS en un porcentaje de los eritrocitos normales (1,5-3 %), que de este modo adquieren el fenotipo protrombótico anteriormente descrito en las hemoglobinopatías. Este efecto está mediado por un incremento en el calcio citosólico específico de estos eicosanoides plaquetarios, que no se detecta, en cambio, por el tratamiento de los RBC con otros eicosanoides como la prostaciclina Documento descargado de http://www.elsevier.es el 20/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 334 Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl. 6, octubre 2003 o 12-HETE. Estos resultados demuestran, por primera vez, que los eritrocitos normales pueden ser células señalizadoras que podrían, por este mecanismo, contribuir a un aumento en la generación de trombina. En nuestros estudios subsiguientes se confirma este aspecto, como se comunicará durante el congreso. Estos estudios indican un papel más importante que el que se anticipaba de la interacción entre eritrocitos normales y plaquetas en la generación de trombina. Existen otros estudios en la literatura que también apoyan el papel activo y regulado bioquímicamente de los eritrocitos normales en la formación del trombo. Así, se ha descrito que los eritrocitos normales pueden formar asociaciones heterotípicas con las plaquetas y los neutrófilos activados reguladas por receptores específicos53-55. Otro aspecto de interés en el efecto eritrocitario en la formación del trombo es su regulación bioquímica del reclutamiento plaquetario. La etapa del reclutamiento es fisiológicamente importante ya que de su amplitud dependerá la formación o no de un trombo oclusivo. Por ello, estamos tratando de profundizar desde un punto de vista bioquímico esta etapa de la trombogénesis. En este sentido, encontramos que los eritrocitos incrementan la activación del receptor GPIIbIIIa y la exposición de P-selectina de las plaquetas durante el reclutamiento39. Estos hallazgos proporcionan un nuevo mecanismo de participación de los eritrocitos en la formación del trombo, ya que mediante su influencia en estos ligandos pueden reclutar no sólo más plaquetas, sino también más leucocitos al trombo, como se ha indicado más arriba. Dada la potencial importancia del tema estamos valorando la participación de distintos elementos de la transducción de señales en las plaquetas durante el reclutamiento. Los resultados obtenidos indican una participación coordinada de diversos receptores de la membrana plaquetaria que se ve modificada por los RBC. También la presencia de eritrocitos tiene un efecto específico sobre distintas vías de fosforilación de proteínas en las plaquetas. Estos resultados proporcionan nuevas bases bioquímicas de esta interacción celular y serán presentados durante el congreso. Conclusiones En nuestra opinión, la participación de las distintas células sanguíneas en la generación de trombina y en el control de la reactividad de las plaquetas amplía el conocimiento de la fisiopatología de la trombosis. No obstante, queda un largo camino por recorrer ya que la información disponible es todavía muy incompleta, pero la consideración de la formación del trombo como un fenómeno multicelular y el tratamiento farmacológico adecuado, teniendo en cuenta este hecho, podría proporcionar un mejor beneficio clínico en el futuro en el tratamiento de la trombosis y de la patología vascular. Agradecimientos Los autores agradecen la colaboración técnica de M. Carmen Insa. Este trabajo se ha financiado en parte con la ayuda FIS 01/1208. Bibliografía 1. Santos MT, Vallés J, Aznar J, Moscardó A, Piñón M. 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