Examen histológico de órganos en ratonas albinas

Avances en la Investigación Agrícola, Pecuaria,
Forestal y Acuícola en el Trópico Mexicano 2009
EXAMEN HISTOLÓGICO DE ÓRGANOS EN RATONAS ALBINAS UTILIZADAS COMO MODELO DE
INFECCIÓN POR Brucella abortus
David Itzcóatl Martínez Herrera1
Olivia Padrón Tello1
Magnolia Gricel Salcedo Garduño1
Margarita Robledo Salinas2
Evelyn Pulido Camarillo1
Álvaro Enrique Peniche Cardeña1
Arturo Moreno Loyo1
Apolo Adolfo Carrasco García1
Ricardo Flores Castro3
Francisco Morales Álvarez3
RESUMEN
Para evaluar el uso de ratonas albinas (Mus musculus) como modelo para identificar cambios histológicos
inducidos por Brucella abortus a partir de leche artificialmente infectada con la cepa RB51 de Brucella
abortus, se emplearon 12 ratonas de 30 a 50 g sexualmente maduras que fueron divididas en dos grupos de
seis. El grupo I se inoculó con 0.5 ml de leche ultrapasteurizada infectada con la cepa RB51 a dosis de 100 a
120 unidades formadoras de colonias (UFC) y el grupo control, sólo con leche ultrapasteurizada. Las ratonas
se mantuvieron en condiciones de bioterio (22 a 24 °C y humedad relativa 50 a 60%) en cajas de plexiglas;
se inocularon intraperitonealmente y se dividieron en subgrupos de 2/6 para cada grupo. Fueron sacrificadas
por dislocación cervical a los 10, 20 y 30 días postinoculación. Se extrajeron hígado, bazo, y riñón y se
fijaron con formalina al 10% para procesarse por la técnica histológica de Hematoxilina y Eosina. Se observó
hepatomegalia, esplenomegalia y nefromegalia en las todas las ratonas del grupo I; pero, las del grupo II, no
mostraron evidencia de cambios macroscópicos. Para el grupo I, los cambios histológicos observados en el
hígado de 3/6, consistieron en degeneración hepática y; en el bazo 1/6, hiperplasia linfoide y en otra (1/6),
hiperemia difusa. Para el grupo II, sólo se observó cambio en 1/6 a partir de riñón consistente en atrofia
glomerular. No se encontraron diferencias significativas (p>0.05) entre los cambios histológicos de ambos
grupos; ni asociación entre la inoculación con leche infectada y los cambios histológicos observados (OR =
6.54; IC95: 0.68 – 63). Se concluye que el modelo de infección de ratonas albinas puede ser empleado para
la identificación de cambios histológicos por Brucella abortus a partir de leche, pero éstos deben tipificarse
por técnicas histológicas como inmunohistoquímica o análisis de imágenes.
Palabras clave: Inoculación, cepa RB51, degeneración, hiperplasia, Brucella abortus
INTRODUCCION
Los microorganismos del género Brucella poseen una membrana externa (ME), que contiene al
lipopolisacárido (LPS) y las proteínas propias de la membrana (OMPs: “outer membrane proteins”); los
cuales representan el punto de contacto inicial entre el patógeno y el hospedador y además, le confieren su
clasificación rugosa o lisa a cada especie (Robinson y Melling, 1993; Estein, 2006; Castro et al., 2005).
Durante el proceso infeccioso, si la especie es de baja virulencia, entonces la respuesta celular del sistema
mieloide resuelve la infección, inclusive sin que ocurra la seroconversión pues la bacteria, es fagocitada por
los leucocitos mononucleares en donde no sobrevive y tampoco se multiplica (Enright, 1990). Si la cepa es
de alta virulencia, aún con las defensas celulares pueden llegar a otros sitios del organismo, lo que le
permite localizarse en diversos órganos, tales como el hígado, el útero, la glándula mamaria y el bazo
1
Universidad Veracruzana. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. [email protected]
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. Centro de Investigación Regional
Golfo Centro. Campo Experimental La Posta
3
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. Centro Nacional de Investigación
Disciplinaria en Microbiología Animal
2
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Pecuario
(Crowford, 1988) pues en este caso, los propios monocitos facilitan la diseminación de las bacterias y sirven
de protección frente a las actividades bactericidas de anticuerpos y complemento y además; la transportan
hacia los tejidos linfoides y los órganos del sistema fagocítico mononuclear, pues los macrófagos y los
neutrófilos poseen la capacidad de destruir, aunque no por completo, a las brucelas fagocitadas (Spector et
al., 1973; Eze et al., 2000).
Los mecanismos activados para inhibir la multiplicación o destrucción de la Brucella incluyen la estimulación
del estallido respiratorio y la producción de radicales oxígeno libres en los Monocitos Polimorfonucleares
(Canning et al., 1988), en dependencia de la opsonización específica con Ac y/o inespecífica con C3b
(Young et al., 1985).
La cepa RB51 está desprovista de las cadenas laterales O del LPS; por tal carencia, no induce anticuerpos
anti-O, en independencia de la edad, dosis o frecuencia de las inoculaciones; anticuerpos que podrían ser
identificados por las pruebas estándares de diagnóstico para brucelosis (Casas, 2007); al ser una cepa
atenuada, se elimina en un espacio de tiempo relativamente corto con capacidad abortiva pequeña o nula;
aunque se ha sugerido que la cadena O es un factor esencial de este patógeno para la sobrevivencia en
ratones (Godfroid et al., 1998).
El aislamiento de Brucella spp es sin duda la demostración de su presencia; sin embargo, es limitado su
desarrollo en medios de cultivo artificiales (Hernández et al., 1996; Ruíz, 1986). En un frotis teñido por Gram,
Ziehl Neelsen modificado o Koster de muestras directas, la concentración de bacterias por ml o g de
muestra, debe ser de por lo menos 1’000,000 unidades formadoras de colonias (UFC); de igual forma, para
que se puedan aislar en medios de cultivo, su concentración deberá ser de 1,000 UFC por ml o g como
mínimo (López et al., 1991; Yeager et al., 1967).
El diagnóstico bacteriológico, limita el conocimiento a detalle del agente (Alton et al., 1976; Díaz et al., 2001;
Hernández et al., 1996; OIE, 2000) así como, los cambios morfológicos; aunque, no son características de
un órgano o enfermedad (Trigo, 1993) y; al ser incoloros, las células y los tejidos del organismo, impide
identificarlos y diferenciarlos durante la observación microscópica (Ayala et al., 2001), pero gracias a las
sustancias que los constituyen (azúcares, aminoácidos, lípidos), pueden colorearse con sustancias químicas
(Junqueira y Carneiro, 2003).
Bruce aisló por primera vez a Brucella melitensis a partir del bazo de un cadáver humano en 1886 (Ruiz,
1986); sin embargo, el aislamiento de Brucella spp a partir de sangre y exudados de enfermos y de
productos lácteos ha tenido siempre muchas dificultades, pues depende de la fase septicémica (Alton et al.,
1976; Díaz et al., 2001).
La crianza de diversas especies con diferentes funciones zootécnicas; la forma de producción ganadera que
incluye la tecnología y los tipos, formas y tamaños de la propiedad, puede determinar el perfil de la salud
animal; por otro lado, las condiciones de comercialización de productos lácteos así como los hábitos de
consumo por parte de la población, determinan la facilidad para la transmisión de la enfermedad de acuerdo
al Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE) y de la Secretaría de Salud (SS),
que reportan aislamientos de B. melitensis y B. abortus como los más frecuentes, y en menor proporción B.
suis y B. canis; situación que coincide con los informes del CENID-Microbiología Veterinaria del INIFAP
quienes, además, registran aislamientos de B. ovis (Gurría, 1998).
Los ratones Mus musculus se han empleado para la evaluación de daños por la infección por cepas
conocidas de Brucella spp, para la evaluación de la potencia de las vacunas que se emplean en los animales
(Baldwin y Parent, 2002; Nájera et al., 1980); sin embargo, se adolece de información con respecto a si la
inoculación de al menos 100 UFC (Yeager et al., 1967) podría ser suficiente para infectarlos y que la bacteria
pueda reproducirse en los tejidos en cantidad suficiente para que se puedan observar cambios morfológicos
en los órganos blanco, en esta caso bazo, hígado y riñón.
Al evaluar el modelo ratón (Mus musculus) se logró el aislamiento de B. abortus a partir de los riñones de
hembras infectadas artificialmente con la cepa RB51; observándose también hepatomegalia,
esplecnomegalia y nefromegalia (Lara, 2007); pero se carece de información acerca de observación
microscópica de cortes histológicos referentes a Brucella spp, por lo que la observación de lesiones
histológicas en órganos obtenidos de ratonas que fueron inoculadas con una vacuna comercial elaborada
con la cepa RB51 de Brucella abortus en caso de que se observen, ofrecerán una ventaja para que el
modelo ratón sea una alternativa de recuperación de cepas de campo a partir de leche de bovino procedente
de hatos que, de acuerdo con pruebas serológicas oficiales, son considerados como afectados y demostrar
infección activa.
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Avances en la Investigación Agrícola, Pecuaria,
Forestal y Acuícola en el Trópico Mexicano 2009
Por lo que evaluar histológicamente hígado, riñón y bazo de ratones albinos hembras (Mus musculus)
utilizados como modelo de infección por Brucella abortus; para identificar lesiones e interpretarlas, es
necesaria para aportar información acerca de los hallazgos presentes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon los órganos parenquimatosos (hígado, bazo y riñon) obtenidos de 12 ratonas albinas
sexualmente maduras y con un peso corporal de entre 30 y 50 g; las cuales se dividieron en dos grupos de
seis hembras cada uno para ser inoculadas por vía intraperitoneal. El grupo I, con un inoculo elaborado con
la vacuna comercial de cepa RB51 de Brucella abortus con título certificado por el laboratorio Nova Litton de
México, S.A. de C.V diluida con leche entera de bovino ultra pasteurizada como diluente, para obtener una
concentración de 100 a 120 UFC contenidas en 0.5 ml y; el grupo II, se inoculó sólo con el diluente y se
colocaron en dependencia del grupo al que pertenecían, en cajas de plexiglás en condiciones de bioterio (22
a 24 °C y humedad relativa 50 a 60%).
A los días 10, 20 y 30 post-inoculación, dos ratonas de cada grupo fueron sacrificadas por dislocación
cervical de acuerdo con el National Research Council, (2001); y bajo condiciones de esterilidad, se
extrajeron e inspeccionaron hígado, bazo y riñón, los cuales se colocaron en formalina al 10% para su
adecuada fijación (Celani et al., 1984).
Los órganos obtenidos se procesaron en un histoquinete Hendrey que intercaló su inmersión en las
sustancias propias para su fijación como fueron el formol al 15%; deshidratación, alcohol etílico de 96° y
alcohol etílico absoluto; preparación, alcohol absoluto y xilol; inmersión en xilol para por último impregnar
con parafina e impedir con ello, el paso del agua.
Los órganos fueron incluidos en la unidad bloqueadora y en forma manual con ayuda del micrótomo
Spencer, se cortaron los bloques a un grosor de cinco m, los cuales se depositaron en un baño de flotación
con grenetina y, se colocaron en un portaobjetos identificado. Después, se desparafinaron por medio de
calor a una temperatura de 55 a 60°C y posterior a ello, con xilol.
Para la tinción de rutina se utilizaron, los reactivos Hematoxilina de Harris y Eosina Amarillenta; kit comercial
de Hycel; la cual inició con xilol por cinco minutos, alcohol absoluto, alcohol etílico de 96°, alcohol etílico de
80°, agua destilada, hematoxilina por tres minutos, agua corriente, agua amoniacal, agua corriente, alcohol
96°, eosina por cinco minutos, en alcohol 96°, alcohol etílico absoluto, xilol y por último, las laminillas se
mantuvieron en otro recipiente con xilol hasta su montaje con el cubreobjetos (Alzola, 2001). Una vez listas,
se observaron al microscopio con los objetivos 10X y 40X para identificar en primera instancia el tejido al que
pertenecen y posterior a ello, las lesiones o cambios histológicos.
Los resultados obtenidos se analizaron para significancia por chi cuadrada y para asociación, por Odds Ratio
(OR) con el programa Win Episcope 2.0 (Thrusfield et al., 2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los cambios histológicos observados en los cortes realizados en los hígados de las ratonas del grupo I,
presentaron moderada degeneración; en bazo moderada hiperplasia linfoide un una ratona e hiperemia
difusa en otra; y no se encontraron cambios en los cortes histológicos de los riñones. En los órganos de las
ratonas del grupo II, solo se observó atrofia glomerular en un corte.
A pesar de que no se encontraron diferencias significativas entre las ratonas del grupo I y II (p>0.05); sin
embargo, sí se observa asociación entre la inoculación con leche infectada y los cambios histológicos (OR =
6.54; IC95: 0.68 – 63). Lo que significa que los cambios observados pudieran estar relacionados por la
inoculación de la leche infectada por las bacterias, pero el tamaño de la muestra, no es suficiente para
establecer diferencias estadísticas significativas, como puede observarse en Cuadro 1.
Cuadro 1. Diferencia de cambios histológicos observados entre ratonas de los grupos I y II
Ratonas
Con cambios
Sin cambios
Total
Grupo I
5ª
13a
18
Grupo II
1a
17ª
18
Total
6
30
36
*Letras iguales entre filas no difieren para P>0.05; sin embargo, OR = 6.54 (IC95: 0.68 – 63)
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Pecuario
La primera especie del género Brucella fue aislada a partir del hígado y bazo de pacientes que murieron
como consecuencia de las complicaciones de la brucelosis (Bruce, 1924) entre ellas, su presentación
nerviosa, lo cual se explica debido a la presencia de las células del sistema fagocítico mononuclear
presentes en el hígado (células de Kuppfer) y bazo; incluso en el riñón que también cuenta con este tipo
células, como son las del Mesangio (Tizard, 2004) explican el aumento del tamaño de los órganos y los
cambios celulares que se presentan en ellos. Así también, la utilización de animales de laboratorio como
ratones, cuyes o conejos para demostrar la presencia de Brucella spp (Alton et al., 1976) en muestras de
tejidos animales o sus subproductos, se ha empleado con resultados variables; sin embargo, de estas
especies son el hígado, el bazo y el riñón los órganos de elección para los estudios bacteriológicos e
histopatológicos.
La utilización de la cepa mutante rugosa de Brucella abortus, tiene una deficiencia en las cadenas laterales
del antígeno “O”, factor esencial que permite la sobrevivencia en ratones (Godfroid et al.,1998); razón por la
que es rápidamente controlada por la respuesta celular del sistema mieloide (Enright, 1990) alrededor de las
cuatro semanas postinoculación (Baldwin y Parent, 2002).
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Hígado
Figura 1. Diferencias de cambios histologicos en Higado de ratonas de Grupo I y Grupo II
La mayoría de los cambios histológicos observados en las ratonas que pertenecen al grupo I, se encontraron
en el hígado (Figura 1), en donde además de identificarse la hepatomegalia señalada por Bruce (1924) y
Ruíz, (1986), el aumento del tamaño del órgano es debido a la infiltración de macrófagos tisulares y
degeneración hidrópica ocurrida en esas células, ya que el daño causado por un agente patógeno como
Brucella abortus, es restituido gracias a la regeneración de células, y los macrófagos que desempeñan un
papel determinante, pero si además, se trata de parásitos intracelulares facultativos (Montaraz, 1997), los
linfocitos T cooperadores de la clase Th1, son los encargados de liberar substancias quimiotácticas para
macrófagos como lo son los interferones y el factor de necrosis tumoral  para eliminar el agente causal y
por tanto, promueven la migración de una mayor cantidad de estos tipos celulares, para reabsorber en su
caso el exudado y por último, regenerar los tejidos destruidos. Este último proceso, no siempre se lleva a
cabo de manera adecuada, pues es necesario contar con un microambiente favorable y los estímulos físicoquímicos óptimos, pues si esto no se logra, el proceso de reparación termina con una cicatriz que en algunos
casos es un granuloma o bien una lesión granulomatoide (Trigo, 1993). Las cepas de campo de Brucella
abortus, inducen la formación de lesiones granulomatoides, en cambio, la cepas vacunales conocidas, son
procesadas por los macrófagos del sistema mieloide en poco tiempo como lo señalan Baldwin y Parent
(2002).
Las diferencias en la celularidad que se observaron en el bazo de las ratonas inoculadas con la cepa RB51
(Figura 2) están ligadas a las características anatomofuncionales del órgano, debido a que puede
experimentar cambios patológicos, porque es el blanco primario de muchos procesos morbosos (Junqueira
et al., 2003), cumple múltiples funciones como la hematopoyesis, como lo es la filtración sanguínea y, es el
sitio principal donde se desarrollan las respuestas inmunes contra los patógenos que alcanzan la circulación
sanguínea (Trigo, 1993).
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Bazo
Figura 2. Diferencias de cambios histologicos en Bazo de ratonas de Grupo I y Grupo II
Los folículos esplénicos contienen linfocitos B, que proliferan en una intensa respuesta inmunitaria, pero
deben ser activados por los linfocitos T CD4+ de la clase Th2 (Montaraz, 1997; Tizard, 2004) frente a la
presentación de antígenos por parte de monocitos y células dendríticas que son macrófagos; por lo que la
hiperplasia se debe a que el número de células aumenta, en consecuencia a los procesos infecciosos
subagudos o crónicos como la brucelosis. Así, los antígenos son captados por los macrófagos que se ubican
en la zona marginal y tapizan los sinusoides de la pulpa roja, transportan los antígenos a los folículos
primarios de la pulpa blanca y es a partir de estos, donde después de unos días, emigran las células
productoras de anticuerpos y, al igual que en la respuesta inmune primaria, las células productoras de
anticuerpos emigran desde esos folículos hacia la pulpa roja y hacia la zona marginal, donde se efectúa la
mayor parte de la producción de anticuerpos, aunque, algunos pueden producirse en el interior de los
folículos ya hiperplásicos (Tizard, 2004).
La hiperemia se relacionada a un curso agudo de alteraciones en el flujo sanguíneo y estímulo de sustancias
vasodilatadoras liberadas en el tejido; como suele ocurrir en la fiebre (González, 2005); signo común de la
brucelosis, por tratarse de un patógeno intracelular facultativo y por ello, se activan los linfocitos Th1 para la
secreción de interferones y el factor de necrosis tumoral α que sirven como activadores de macrófagos para
destruir a los microorganismos intracelulares por un mecanismo distinto al del sistema inmuno – peroxidasa,
el de óxido nitroso (Montaraz, 1997).
El único cambio histológico en riñón fue atrofia glomerular y fue observado en una ratona perteneciente al
grupo control (Figura 3); condición que no se atribuye a Brucella abortus, pues ésta es capaz de causar
pielonefritis que se relaciona con la cronicidad (Borts, 1960).
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Pecuario
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Riñón
Figura 3. Diferencias de cambios histologicos en Riñon de ratonas de los Grupos I y II
Los modelos de infecciones experimentales son útiles para el entendimiento de la multiplicación de las
bacterias dentro de los tejidos animales; así también, otros trabajos han mencionado que si Brucella spp se
encuentran por debajo de la dosis mínima necesaria para manifestarse en medios de cultivo artificiales
(Dietelleux et al., 1988; Ruíz, 1986), las pruebas biológicas son una opción; sin embargo, las ratonas
inoculadas con la cepa RB51 de Brucella abortus pertenecientes al grupo I, presentaron cambios
histológicos en bazo e hígado, aunque no en significancia (p>0.05) estadística suficiente, para sugerir que a
la dosis empleada, se obtengan cambios importantes que caractericen lesiones específicas, pero, también
se observó que los cambios histológicos encontrados, sí están asociados con la inoculación de la cepa RB51
(OR = 6.54 ;IC95: 0.68 – 63).
CONCLUSIONES
Se encontró asociación entre los cambios histológicos de los órganos de las ratonas inoculadas con leche de
bovino infectada con cepa RB51 de Brucella abortus (OR = 6.54;IC95: 0.68 – 63); sin embargo, no son
significativos (p>0.05).
Los cambios encontrados en las ratonas inoculadas con cepa RB51 en el hígado, corresponden a
degeneración hepática y en el bazo a hiperplasia linfoide e hiperemia difusa, por lo que tampoco es posible
establecer una característica específica de daño por infección causada por Brucella abortus.
No se observó pielonefritis en los riñones de las ratonas inoculadas con la cepa RB51.
AGRADECIMIENTOS
La investigación fue financiada por el proyecto “Estudio comparativo de la eficacia de la cepa RB51 y cepa
S19 para prevenir la brucelosis en hatos con diferentes condiciones sanitarias”, del Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) para la Convocatoria SAGARPA-CONACYT
2004 Fondo Sectorial 23.
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