IA-MBA-PT-016 Determinación de Listeria monocytogenes

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1. Objetivo
Disponer de un método para detectar la presencia de Listeria monocytogenes.
2. Alcance
Para aplicar en muestras lácteas, pescado y mariscos.
3. Responsabilidad y Autoridad
Jefe de Sección: debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
Analistas de laboratorio: deben realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento.
4. Definiciones
No aplica
5. Abreviaturas y siglas
BLEB: Buffered Listeria Enrichment Broth (Listeria leche)
6. Referencias y/o Bibliografía
IA-MBA-PE-009-RE-011
Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes
IA-MBA-PE-012-RE-006 Control Interno para análisis de Listeria monocytogenes (FDA)
IA-MBA-PE-015 Control de calidad de reactivos
IA-MBA-PO-004 Control de Equipo
SEG-PE- 005
Control de medios de cultivo
FDA Manual de Bacteriología Analítica 8ava Online Capítulo 10 Edición Enero 2003
Instrucciones para la identificación bioquímica de Listeria con el sistema api® Listeria
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7. Descripción del procedimiento
7.1 Fundamento teórico
El método consiste en el pre-enriquecimiento de la muestra en caldo listeria leche, este medio contiene
acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida agentes selectivos que inhiben los microorganismos
competidores. Posteriormente se hace un aislamiento selectivo en agar Oxford para luego hacer la
confirmación de las colonias sospechosas con pruebas bioquímicas y pruebas diferenciales (hemólisis,
motilidad)
7.2. Equipo, materiales, medios de cultivo y reactivos
7.2.1
Equipo
Balanza sensibilidad  0,1g
Homogenizador o Stomacher
Incubadora de 30 ºC ± 1ºC
Incubadora de 35 ºC  1ºC
Vortex
7.2.2
Materiales
Bolsas plásticas para stomacher 7 ½ x 11 ¾ pulg (ancho x largo) con cierre de alambre
Pipetas de vidrio de 1 ml, 2 ml
Micropipeta de 50 l -200 l
Puntas micropipeta 20 l -200 ul
Asas bacteriológicas
Aplicadores con algodón estéril
7.2.3
Medios de Cultivo y reactivos
Caldo Listeria leche (Buffered Listeria Enrichment Broth)
Agar Oxford leche
Agar motilidad
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Agar sangre de oveja al 5%
Agar tripticasa soya con extracto de levadura
Caldo Infusión Cerebro Corazón (ICC)
api® Listeria
7.2.4
Cepas de referencia
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
7.3 Procedimiento
Día 1
7.3.1
Pesar 25 gramos de la muestra en una bolsa plástica estéril de stomacher.
7.3.2
Agregar 225 ml de caldo listeria leche y mezclar en stomacher durante 2 minutos.
7.3.3
Incubar el caldo a 30 °C ± 1°C por 24 horas.
Día 2
7.3.4
Colocar 0,1 ml del caldo en la placa de agar Oxford leche y con un aplicador con algodón estéril
rayar el 25 al 50 % de la superficie del agar . Con el asa bacteriológica rayar la superficie del plato
restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 ± 1°C por 24
horas.
7.3.5
El caldo reincubar a 30 °C ± 1°C por 24 horas más.
Día 3
7.3.6
Examinar los platos que tengan colonias con morfología típica de Listeria, pequeñas rodeadas de
un halo oscuro debido a la hidrólisis de esculina.
7.3.7
Si la placa no presenta crecimiento, reincubar por 24 horas más
7.3.8
Tomar 5 colonias sospechosas y rayar en agar tripticasa soya con extracto de levadura, incubar
35 °C ± 1°C por 24 horas
7.3.9
Colocar 0,1 ml del caldo de 48 horas en la placa de agar Oxford leche y con un aplicador con
algodón estéril rayar el 25 al 50 % de la superficie del agar. Con el asa bacteriológica rayar la
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superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a
35 ± 1°C por 24 horas.
Día 4
7.3.10 Examinar los platos (de 24 horas y de 48 horas), buscar colonias con morfología típica de Listeria,
pequeñas rodeadas de un halo oscuro debido a la hidrólisis de esculina.
7.3.11 Inocular un tubo de medio motilidad a partir de las colonias aisladas en agar tripticasa soya con
extracto de levadura e incubar a por 7 días a temperatura ambiente. Observar diariamente.
7.3.12 A partir del agar tripticasa soya con extracto de levadura, inocular por punción una placa de agar
sangre de de oveja al 5%, tomar de 20 a 25 colonias. Incubar la placa a 35 °C ± 1°C por 24 horas
Día 5
7.3.13 Hacer la lectura de los tubos de medio motilidad, la movilidad característica de Listeria es de
“sombrilla”
7.3.14 Buscar colonias con beta hemólisis en la placa de agar sangre.
7.3.15 Inocular api® Listeria usando colonias beta hemolíticas. Incubar 24 horas a 35 °C ± 1°C
7.3.16 Si no hubiera crecimiento en el agar oxford leche depués de 48 horas , ni colonias sospechosas
en el agar sangre, reportar el resultado como ausencia de Listeria monocytogenes.
Día 6
7.3.17 Lectura del api® Listeria
7.4 Control de Calidad
7.4.1
Cada lote de reactivos de galerías api® Listeria se les hará control de calidad por medio de cepas
de referencia siguiendo procedimiento IA-MBA- PE-015 Control de calidad de reactivos.
7.4.2 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al
procedimiento SEG-PE-005.
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7.5 Reporte de resultados
7.5.1 Reportar presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g
7.5.2 El resultado y los datos obtenidos en cada paso del análisis se registran en el formulario
IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes
7.6 Puntos Críticos de Control
Control de las temperaturas de los incubadores: se debe mantener el registro de la temperatura óptima de
cada incubador, así como las medidas correctivas a seguir en caso de alguna variable, , según se
establece en el procedimiento IA-MBA-PO-004 Control de Equipos
8. Anexos
No aplica
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