Diagnóstico de laboratorio del parvovirus b19

Artículo de revisión
Diagnóstico de laboratorio
del parvovirus B19
Foto: Archivo
Rafael García Gonzáleza, David Basilio Hernándezb, Aurora Hernández Ramírezb
Resumen
Parvovirus B19, es el único patógeno humano conocido de los
parvovirus. El espectro de enfermedad al cual se encuentra
asociado el B19 incluye un amplio rango de enfermedades:
eritema infeccioso, síntomas de trombopenia o granulocitopenia, crisis aplástica, o anemia hemolítica en pacientes
inmuno comprometidos. El diagnóstico de laboratorio de
infección por parvovirus B19 es confirmado principalmente
por la detección de anticuerpos antivirales del tipo de IgM
por medio de la técnica de ELISA, la cual se encuentra dirigida tanto a epítopes conformacionales como lineales de
proteínas de cápside VP1 y VP2. Cuando la respuesta a IgM
declina, la presencia de IgG se hace cada vez más evidente en contra de VP1 y VP2, pudiendo ser detectada por inmunofluorescencia, ELISA y Western blot. El empleo de la
reacción en cadena de la polimerasa se usa en la actualidad
de manera rutinaria como complemento o alternativa de la
serología.
Palabras clave: Parvovirus humano B19, diagnóstico, IgM,
IgG, ELISA, PCR.
Coordinación de Enseñanza del Departamento de Microbiología
y Parasitología. Facultad de Medicina. UNAM. México, DF.
b
Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de
Medicina. UNAM. México, DF.
Correo electrónico: [email protected]
Recibido: 04-03-11. Aceptado: 13-09-11.
a
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Revista de la Facultad de Medicina de la UNAM
Parvovirus B19: Laboratory diagnosis
Abstract
Parvovirus B19 (B19) is the only known human pathogenic
parvovirus. The spectrum of illness to which B19 is associated includes a wide range of diseases: erythema infectiosum, thrombocytopenia or granulocytopenia, aplastic crisis
or hemolytic anemia in immunocompromised patients. The
laboratory diagnosis of Parvovirus B19 infection is primarily
confirmed by the detection of IgM antiviral antibodies using
the ELISA technique, which is directed against both conformational and linear epitopes of VP1 and VP2 capsid. When
IgM response declines, an IgG immune-response against structural proteins VP1 and VP2 becomes prominent and can
detected by immunofluorescence, ELISA and Western blot.
Polymerase chain reaction is now used as a routine analysis
as well as complement or alternative to serology.
Key words: Human parvovirus B19, diagnosis, IgM, IgG, ELISA,
PCR.
INTRODUCCIÓN
El parvovirus B19, fue descubierto accidentalmente por Yvonne Cossat y cols. en 1974, durante el
examen practicado a sueros de donadores de sangre, en la búsqueda del antígeno de superficie del
virus de hepatitis B (HbsAg). Debe su nombre al
R. García González, D.B. Hernández, A. Hernández Ramírez
suero número 19 del panel B, que resultó positivo
a través de contrainmunoelectroforesis (CIE) y negativo por otros procedimientos.1 Al ser observada
la línea de precipitación de la CIE por microscopía
electrónica se visualizaron partículas de 23 nm de
diámetro con características de parvovirus. El parvovirus humano B19, es el primer parvovirus y el
único que ha demostrado ser patógeno en humanos, y aunque existen otros asociados a adenovirus
y se han visualizado partículas parecidas a parvovirus,
no existen evidencias de que se encuentren asociados
a estos últimos en cuadros clínicos en humanos.1-3
A partir de 1981 Pattison JR lo asoció con crisis
de anemia aplásica en pacientes con enfermedad
de células falciformes y Anderson MJ demostró en
1983, que es el agente causal de eritema infeccioso
(quinta enfermedad exantemática).
En la actualidad se le conoce como la causa primaria de crisis transitorias de aplasia en pacientes
con anemia hemolítica crónica, anemia crónica en
pacientes con inmunodeficiencia, así como hidropesía fetal y muerte fetal. También es causa de artritis y artralgias especialmente en mujeres jóvenes
y de otros cuadros clínicos.4-7
AGENTE ETIOLÓGICO.
El parvovirus B19 pertenece a la familia Parvoviridae, que se encuentra dividida en dos subfamilias:
Parvovirinae y Densovirinae, por su capacidad para
infectar vertebrados e invertebrados respectivamente. La subfamilia Parvovirinae se subdivide en 3 géneros, de acuerdo con su capacidad para replicarse
autónomamente como sucede con el parvovirus,
con ayuda de un virus en el caso de dependovirus,
y por su capacidad eficiente y de manera preferente
en células eritroides como es el caso de eritrovirus,
al cual pertenece al parvovirus B19.8
El parvovirus B19 es un virus relativamente uniforme, sin envoltura, presenta simetría icosaédrica,
de 20 a 25 nm de diámetro, con ADN de cadena única de 5,596 nucleótidos de longitud, que es
empaquetado como cadena positiva o negativa en
igual proporción. Esto es consecuencia de su peculiar forma de replicación, que origina un intermediario replicativo (ADN de doble cadena) gracias a
la existencia de terminales 3´ palindrómicas de 383
El parvovirus B19, fue descubierto
accidentalmente en 1974, durante
el examen practicado a sueros de
donadores de sangre, en la búsqueda
del antígeno de superficie del virus
de hepatitis B (HbsAg). Debe su
nombre al suero número 19 del panel
B, que resultó positivo a través de
contrainmunoelectroforesis (CIE) y
negativo por otros procedimientos.
El parvovirus humano B19, es el
primer parvovirus y el único que
ha demostrado ser patógeno en
humanos, y aunque existen otros
asociados a adenovirus y se han
visualizado partículas parecidas a
parvovirus, no existen evidencias de que
se encuentren asociados a estos últimos
en cuadros clínicos en humanos.
nucleótidos, que son empleadas como iniciadores
para la síntesis de una cadena de ADN positiva,
a partir de la que se origina la cadena negativa en
la que emplea ADN polimerasa celular. Formando
en un principio un concatámero, que será replicado para producir un tetrámero, que por acción de
una endonucleasa, se producirán 2 cadenas positivas y 2 negativas.9
El parvovirus se replica únicamente en células
en división, y tanto la replicación como la trascripción, se efectúan en el núcleo de la célula infectada,
en donde se acumulan proteínas no estructurales y
se realiza el ensamblaje del virión.3,8
El parvovirus B19 codifica para 2 proteínas estructurales; VP1 (5%) y VP2 (95%), así como una
proteína principal no estructural (NS1). VP1 tiene
un peso molecular de 84 kDa, codificada por la secuencia que va del nucleótido 2444 al 4786. VP2
con un peso molecular de 58 kDa codificada por la
secuencia de nucleótidos que va de 3125 al 4786.
Vol. 55, N.o 2. Marzo-Abril 2012
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Foto: Archivo
Diagnóstico de laboratorio del parvovirus B19
La infección por parvovirus B19 es
común (40 a 60% de la población
mundial) y su máxima incidencia
se encuentra en la edad escolar. En
adultos jóvenes, existen evidencias
en el 50-60%, y en mayores de 50
años más del 80% tienen evidencias
serológicas de infección pasada. Su
incidencia se incrementa en invierno
y primavera, en zonas con clima
templado.
La proteína no estructural NS1 tiene un peso molecular de 77 kDa cuya función no está completamente caracterizada. 9, 10
Tomando en cuenta las variaciones en las proteínas NS1 y VP1, Servant y cols. propusieron en
el 2006, agrupar al parvovirus B19, en 3 genotipos; genotipo 1 (cepa de referencia B19, prototipo
Pvaua), genotipo 2 (prototipo Lali y A6) y genotipo 3 (cepa prototipo V6), reportándose una variación en las proteínas estructurales que va de 8 al
14% dependiendo del genotipo.11 Se desconoce la
prevalencia y el significado clínico de estas varian-
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Revista de la Facultad de Medicina de la UNAM
tes, y Cohen BJ les refiere un significado temporal
y geográfico.12 la infección por parvovirus B19 es
común en el humano. La única célula que se conoce que es permisiva para parvovirus B19, es el pronormoblasto (célula progenitora eritroide), sobre
la que tiene un efecto lítico.4,13 La infección de la
célula se realiza a través del antígeno P (globósido
Gb4), receptor expresado en las células eritroides
y en otras, entre las que se incluyen células del endotelio, plaquetas sinoviocitos, células del músculo
liso y miocitos fetales.
Aún cuando se ha demostrado la necesidad del
Ag P para que el virus se una a la célula, se sugiere
de la necesidad de un coreceptor (α5β1) para que
la infección sea exitosa, y que actúe como integrina. Esto puede explicar la alta especificad por las
células eritroides, ya que expresan en gran cantidad
ambas moléculas en su superficie.13
Histológicamente en médula ósea, Portillo-Carrillo y cols. han observado pronormoblastos con
cambios megaloblásticos, con inclusiones eosinófilas y marginación de la cromatina nuclear.4 Por
otra parte, a través de la microscopía electrónica, se observan arreglos cristalinos en el núcleo y
por hibridación in situ usando ADN clonado se
demuestra la presencia del genoma de parvovirus
B19, tanto en infecciones crónicas como agudas.7,8
La mayoría de las infecciones por B19, son asintomáticas o cursan con cuadros ligeros.3-5,14 Sin embargo, cuando la infección se encuentra asociada a
desordenes clínicos y es influenciada por la edad,
por el estado inmunológico y hematológico, en algunos casos, ponen en peligro la vida del paciente
al presentar una amplia variedad de manifestaciones clínicas.
EPIDEMIOLOGIA
Desde el punto de vista epidemiológico, debido
a su ubicuidad, la infección por parvovirus B19
es común (40 a 60% de la población mundial),
y su máxima incidencia se encuentra en la edad
escolar.8 En adultos jóvenes, existen evidencias en
el 50-60%, y en personas mayores de 50 años más
del 80% tienen evidencias serológicas de infección
pasada. Su incidencia se incrementa en invierno y
primavera, en zonas con clima templado, aunque
R. García González, D.B. Hernández, A. Hernández Ramírez
la infección puede ocurrir en cualquier época del
año.
Su transmisión se realiza principalmente, a través de secreciones respiratorias, y se disemina de
persona a persona (contacto directo), posiblemente por fomites y transfusión sanguínea. Parvovirus
B19 ha sido detectado en secreciones respiratorias,
orina, sangre y derivados de ésta, así como en una
variedad de tejidos.14,15
PATOGÉNESIS
La infección por parvovirus B19 tiene un período de
incubación de 6 a 18 días y la enfermedad tarda en
manifestarse entre 1 y 2 semanas. En el caso de la quinta enfermedad, el lapso se prolonga de 2 a 4 semanas.
A partir del cuarto día postinfección se inicia
la viremia por parvovirus B19, y alcanza su punto
máximo entre el día 6 y 10, también puede ser localizado en el aparato respiratorio.
Entre las principales enfermedades producidas
por parvovirus B19, se encuentra la quinta enfermedad, también llamada eritema infeccioso, en niños de 4 y 11 años de edad, artropatía sobre todo
en mujeres adultas de edad media, crisis aplásica
transitoria en pacientes con eritropoyesis activa
(esferocitosis hereditaria y enfermedad de células falciformes), hidropesía fetal, aborto y muerte
fetal, también ha sido asociado con glomerulonefritis, vasculitis, neuropatía periférica, miocarditis,
falla hepática fulminante y síndrome de Nezelof.
Puede afectar a pacientes infectados con el virus
de inmunodeficiencia adquirida, pacientes bajo tratamiento con quimioterapia citotóxica y en receptores de transplante de órganos. El parvovirus B19
puede persistir y conducir a anemia crónica, aplasia de células rojas y en menor grado trombocitopenia, neutropenia y pancitopenia en pacientes
inmunocomprometidos.4,5,16,17
La respuesta inmune humoral, se manifiesta entre el día 10 y 14 con la presencia de IgM e IgG
respectivamente.8,18 Los valores normales de reticulocitos, leucocitos y hemoglobina descienden a
partir del sexto, séptimo y décimo día posinfección
respectivamente. Volviendo a su normalidad entre
el día 20, 16 y 26 respectivamente. En personas
con anormalidades hematológicas, se produce un
La infección por parvovirus B19 tiene un
período de incubación de 6 a 18 días y la
enfermedad tarda en manifestarse entre
1 y 2 semanas.
Entre las principales enfermedades
que produce, se encuentra el eritema
infeccioso en niños de 4 y 11 años de
edad, artropatía sobre todo en mujeres
adultas de edad media, crisis aplásica
transitoria en pacientes con eritropoyesis
activa (esferocitosis hereditaria y
enfermedad de células falciformes),
hidropesía fetal, aborto y muerte
fetal, también ha sido asociado con
glomerulonefritis, vasculitis, neuropatía
periférica, miocarditis, falla hepática
fulminante y síndrome de Nezelof. Puede
afectar a pacientes infectados con el
VIH, bajo tratamiento con quimioterapia
citotóxica y en receptores de transplante
de órganos.
Puede persistir y conducir a anemia
crónica, aplasia de células rojas y
en menor grado trombocitopenia,
neutropenia y pancitopenia en pacientes
inmunocomprometidos.
cuadro de anemia seria y crisis de aplasia que puede ser transitoria. Aquellos pacientes que no pueden controlar la infección, desarrollan una deplesión crónica en la producción de células rojas.3,14
Peterlana y cols. sugieren que la persistencia del
virus puede ser responsable de inducir autoinmunidad a través de mecanismos de mimetización molecular, y que su posible participación se encuentra
en el tejido del paciente con esclerodermia, lo que
les sugirió que el tejido esclerodérmico dañado es
consecuencia directa de la citotoxicidad viral, que
eventualmente conduce a una agresión por autoinmunidad sobre todo en individuos predispuestos.19
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Diagnóstico de laboratorio del parvovirus B19
Tabla 1. Cuadros clínicos sugestivos de infección por parvovirus B19
Cuadros
Dermatológicos
Hematológicos
Articulares
Hepáticos
Infecciosos
Como cuadros clínicos sugestivos de infección
por parvovirus B19, se consideran a nivel articular,
dermatológicos, hematológicos, hepáticos e infecciosos (tabla 1).
DIAGNÓSTICO
La manera de diagnosticar desde el punto de vista
etiológico infección por parvovirus B19, relacionando las manifestaciones clínicas, es a través del laboratorio.1,2 El tipo de muestras empleadas pueden ser:
suero, saliva y tejidos. Sin embargo, el suero y el
plasma son las principales muestras utilizadas en su
diagnóstico, ya que son estables para la detección
del anticuerpo en contra del virus en los casos de
crisis de aplasia, infección persistente en pacientes
inmunodeprimidos y en infección fetal.
En la búsqueda del agente causal se utilizan
diferentes estrategias diagnósticas. En la actualidad no se cuenta con el empleo de un sistema
de cultivo práctico, y hasta la fecha se tien un uso
limitado.
La detección de antígeno de parvovirus B19,
puede ser realizada a través de radio inmunoensayo o por inmunoensayo enzimático. Para esta
detección del antígeno en suero en casos de crisis
de aplasia transitoria, se sugiere que el muestreo
se realice cuando el cuadro clínico coincida con
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Revista de la Facultad de Medicina de la UNAM
Síndromes
Eritema infeccioso
Eritema acral
Anemia aplásica
Aplasia pura de la serie roja
Anemia hemolítica
Síndrome hematofagocítico
Citopenia ideopática
Artritis no piógena
Artritis reumatoide juvenil
Poliartritis nodosa
Hepatitis infecciosa
Hepatitis fulminante no metabólica/no
Tóxica
Miocarditis
Hidropesía fetal no inmune
Sospecha de infección oportunista después de descartar los
más frecuentemente asociados a inmunosupresión primaria
o adquirida, incluyendo transplante renal y médula ósea
el pico máximo de la viremia ocasionada por este
agente.
La detección directa del antígeno viral puede
ser de las células infectadas por medio de inmunofluorescencia o tinción inmunoenzimática con
el empleo de anticuerpos monoclonales o policlonales.5,19,20
Los ácidos nucléicos del parvovirus B19 pueden
ser localizados a través de pruebas de hibridación
con el empleo de sondas marcadas con material no
radiactivo, lo que ha demostrado ser un método
de detección directo, sensible y adecuado, con una
detección de 103 a 105 copias del genoma viral con
sondas de ADN o ARN.2 Se ha observado que la
metodología mencionada tiene mayor sensibilidad
durante la fase virémica temprana en infecciones
agudas, y eleva la sensibilidad con el empleo de
quimioluminiscencia.
A finales de la década de los años ochenta, la
aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico microbiológico permitió la detección de microorganismos de difícil desarrollo, como es el caso de Mycoplasma, Chlamydia y
virus. Esto dio al laboratorio de investigación inicialmente y al clínico más tarde, una herramienta
de trabajo en la resolución de problemas que de
otra manera no eran fácilmente resueltos.6,12
El PCR es el método más sensible del que se
dispone para la búsqueda de ADN. Por este procedimiento, pueden ser detectadas entre 1.6 × 103
unidades internacionales por mililitro (UI/ml) de
ADN de parvovirus B19, en la que 1 UI de ADN
de parvovirus B19 equivale a 0.65 genomas, usando electroforesis y tinción con bromuro de etidio,
para visualizar el producto amplificado. El resultado puede ser incrementado de 10 a 100 veces
cuando se acompaña de técnicas de hibridación y
del uso de sondas con alta especificidad.
Cuando la determinación de IgM es dudosa
como en el caso del paciente inmunocomprometido, o cuando las muestras de sangre o derivados
son sometidos a un monitoreo para determinar la
presencia de parvovirus B19, y en aquellos casos
en que se realiza la vigilancia del pacientes bajo tratamiento, la PCR proporciona resultados satisfactorios en el 49% de los pacientes y el 70% de positividad en estudios realizados en bancos de sangre,
en contra del 17% para IgM en pacientes y el 32%
de bancos de sangre,8,12 sobre todo en los casos en
que ha sido rebasado el pico máximo de detección
de IgM (30 días de aparición de detección). La detección de IgM/PCR positivo se da en una relación
de 1:10.
De acuerdo a estos estudios, la PCR ha servido para demostrar la infección por parvovirus B19
en donadores de sangre asintomáticos, en pacientes inmunocompetentes y en inmunodeprimidos
virémicos que requieren tratamiento inmediato a
partir de inmunoglobulinas, en el diagnóstico diferencial en pacientes con enfermedades exantemáticas, durante crisis de anemia aplásica, en infección
persistente, etc.15
El estudio histopatológico de tejidos por microscopio óptico y la microscopía electrónica, constituyen otras herramientas de gran utilidad en el diagnóstico de infecciones por parvovirus B19, como
lo demuestra la observación de eritroblastos gigantes en muestras que contienen células progenitoras
eritroides, sugestivos de infección por parvovirus
B19.4
El serodiagnóstico a través de la detección de
IgM ha sido la piedra angular en el diagnóstico de
infectividad por parvovirus B19.2 En procesos agu-
Foto: Archivo
R. García González, D.B. Hernández, A. Hernández Ramírez
La manera de diagnosticar infección
por parvovirus B19 relacionando las
manifestaciones clínicas, es a través
del laboratorio. El suero y el plasma
son las principales muestras utilizadas
en su diagnóstico, ya que son estables
para la detección del anticuerpo en
contra del virus en los casos de crisis
de aplasia, infección persistente en
pacientes inmunodeprimidos y en
infección fetal.
dos de pacientes inmunocompetentes, la presencia
de IgM se detecta en el 90% de los casos. La cual
puede estar presente a partir del tercer día de aparición de los síntomas, aunque puede no aparecer
hasta 7 a 10 días después, alcanzando su máximo
en el día 30, y deja de ser detectable entre los 60 y
90 días. La interpretación de su hallazgo después
de los 3 meses de la infección es difícil debido a
su baja concentración. De igual manera, hay que
tomar en cuenta la existencia de títulos bajos o ausencia de IgM en pacientes inmunocomprometidos, así como las reacciones cruzadas con rubeola,
citomegalovirus, herpes simple, Epstein-Barr, sarampión y toxoplasma. Sin embargo, la presencia
de IgM es considerada como uno de los principales
mecanismos de protección en contra de parvovirus
B19.15 Posteriormente aparece la IgG, que persiste
por años y puede incluso durar toda la vida en pacientes inmunologicamente normales.8
Las técnicas empleadas en la detección de in-
Vol. 55, N.o 2. Marzo-Abril 2012
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Diagnóstico de laboratorio del parvovirus B19
munoglobulinas para parvovirus B19 son: contrainmunoelectroforesis (CIE), inmunoensayo enzimático (ELISA).5 En aquellos casos en que el estudio
serológico no ayuda al diagnóstico, existe la posibilidad de hacer el diagnóstico directo mediante la
demostración del virus a través de la microscopia
electrónica, o por medio de la detección del ADN
viral.
La detección de proteínas de la cápside de parvovirus B19 puede ser a través de inmunohistoquímica 19
En resumen, ante la no existencia de líneas celulares comerciales o sistemas de cultivo de células convencionales para la detección de parvovirus
B19, y a pesar de que la implementación de una
prueba de amplificación de ácidos nucléicos resulta
costosa y especializada, este virus puede ser evidenciado por la detección de IgM e IgG, a través de
procedimientos serológicos como son los ensayos
inmunoenzimáticos. Sin embargo, los anticuerpos
contra parvovirus humano B19, pueden no ser detectables en pacientes inmunodeficientes y en algunos casos con infección crónica y persistente. Se
encuentra también su uso limitado en el feto y en
pacientes inmunocomprometidos.5,18
Ante esta situación, la demostración del ADN
de parvovirus B19 por PCR en suero, sangre o tejidos de pacientes, se presenta como una excelente
prueba diagnóstica. La literatura reporta alta sensibilidad (1 a 10 fentogramos de ADN), elevada especificidad, y detección temprana en relación con
la determinación de IgM.
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