EMULSIONES MULTIPLES Y METODOS DE PREPARACION

k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k kInt. Cl. : B01J 13/00 11 Número de publicación: 2 116 340 6 51 ESPAÑA B01F 17/42 B01F 17/00 A61K 9/113 A61K 7/00 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 12 kNúmero de solicitud europea: 92915365.8 kFecha de presentación : 25.06.92 kNúmero de publicación de la solicitud: 0 591 452 kFecha de publicación de la solicitud: 13.04.94 T3 86 86 87 87 k 54 Tı́tulo: Emulsiones múltiples y métodos de preparación. k 30 Prioridad: 27.06.91 US 721810 15.04.92 US 869822 18.06.92 US 897390 1380 South Oxford Road Atlanta, GA 30322, US k 72 Inventor/es: Hunter, Robert L. y k 74 Agente: Dávila Baz, Angel 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 16.07.98 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: ES 2 116 340 T3 k 73 Titular/es: Emory University 16.07.98 Aviso: k Bennett, Carol Elizabeth k En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid ES 2 116 340 T3 DESCRIPCION Emulsiones múltiples y métodos de preparación. 5 10 Campo Técnico La presente invención se refiere a composiciones y métodos para preparar emulsiones de agua en aceite y múltiples de agua en aceite en agua. Más particularmente, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para preparar emulsiones múltiples de agua en aceite estables que son útiles para muchas aplicaciones diferentes, incluyendo, pero no limitadas a, adyuvantes; vacunas, incluyendo inmunización oral y parenteral; suministro de fármacos oral, tópico y parenteral; y cosméticos. Antecedentes de la Invención 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Una emulsión es un sistema heterogéneo que consiste en al menos dos lı́quidos inmiscibles, uno de, los cuales está dispersado en el otro en la forma de gotı́culas. Tales sistemas poseen una estabilidad mı́nima.1 El problema de la estabilidad de la emulsión se ha tratado convencionalmente mediante la adición de aditivos tales como emulgentes y sólidos finamente divididos. Las emulsiones consisten en fases continuas y discontinuas. La fase discontinua se denomina variadamente la fase dispersada o interna, mientras que la fase en la que se produce la dispersión se denomina la fase continua o externa. Los componentes estándar de las emulsiones son una fase aceitosa y una acuosa. Cuando el agua es la fase continua, la emulsión se denomina de aceite en agua (o/w), y cuando el aceite es la fase continua, la emulsión se denomina de agua en aceite (w/o). Las emulsiones multifásicas de agua en aceite en agua (w/o/w) han ganado importancia recientemente. Las emulsiones de aceite en agua son las emulsiones usadas más frecuentemente. Sin embargo, las emulsiones de agua en aceite y múltiples son deseables para muchas aplicaciones y se usarı́an más extensivamente si pudieran vencerse los problemas con la inestabilidad. The Encyclopedia of Emulsion Technology indica que las “emulsiones múltiples (o dobles) se usan como sistemas de depósito y pueden considerarse como una variación del tipo de W/O. Sus ventajas potenciales en el suministro de fármacos pueden ser contrarrestadas por una complejidad incrementada de la forma de dosificación y los problemas concomitantes de la formulación óptima y la estabilidad aceptable.”2 W/0 es una abreviatura de agua en aceite. “A pesar de su porvenir inicial, el sistema de emulsión múltiple no se ha utilizado ampliamente... Las emulsiones múltiples producidas a partir de aceites vegetales son particularmente difı́ciles de elaborar si se requieren un alto rendimiento de gotı́culas múltiples y buena estabilidad.” Las emulsiones consisten generalmente en tres componentes. La fase aceitosa, la fase acuosa y un emulgente. Cada uno de estos componentes y el método en el que se preparan y combinan contribuye al tipo y a la estabilidad de la emulsión. Se han hecho muchos intentos para definir reglas que determinen el tipo de emulsión producido.3 En general, el lı́quido (aceite o agua) en el que el tensioactivo es más soluble será la fase continua en la emulsión final. Sin embargo, las correlaciones entre las propiedades del tensioactivo, el aceite y otros materiales, y la emulsificación son muy empı́ricas. Esto es, las reglas se aplican a un espectro limitado de materiales y hay excepciones frecuentes.4 El modo de mezcladura de los componentes es importante para determinar las propiedades de las emulsiones. Hay tres medios generales de emulsificación: 1) mecánica, 2) inversión de fases, y 3) emulsificación espontánea.5 La emulsificación mecánica que usa fuerza de cizallamiento para romper los componentes de la emulsión en partı́culas pequeñas es la más comúnmente usada. La inversión de fases se refiere al proceso de producir una emulsión de un tipo, agua en aceite, con componentes que son más estables con el tipo opuesto, aceite en agua. La emulsión cambia entonces espontáneamente de tipo. Estas emulsiones pueden ser crı́ticamente dependientes de la concentración de los materiales, las sales, la temperatura y otros factores. La emulsificación espontánea se refiere a la situación en la que se forma una emulsión con agitación mı́nima.6 Esto implica un nivel de estabilidad termodinámica que es altamente deseable, pero rara vez alcanzado. Los agentes superficiactivos son compuestos que contienen un resto hidrófilo e hidrófobo en la misma molécula. Se localizan preferencialmente en las interfases entre el aceite y el agua donde reducen la energı́a libre superficial. Dentro del espectro de los agentes superficiactivos, sin embargo, hay una gran diversidad de estructura quı́mica y función. El concepto de equilibrio hidrófilo-lipófilo se desarrolló en un esfuerzo para predecir la función de los agentes superficiactivos para elaborar diversos tipos de emulsiones y para otras actividades. El equilibrio hidrófilo-lipófilo es una medida semiempı́rica de las intensidades 2 ES 2 116 340 T3 relativas de los componentes hidrófilos e hidrófobos.7 Está relacionado con la energı́a libre asociada con el emplazamiento de la molécula anfifı́lica en la interfase de aceite-agua. Los valores del equilibrio hidrófilolipófilo requeridos para diversas aplicaciones se muestran en la siguiente tabla: TABLA I 5 Intervalos y Aplicaciones del Equilibrio Hidrófilo-Lipófilo8 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Intervalo Aplicación 3a6 7a9 8 a 13 13 al 15 15 a 18 emulgente de agua en aceite agente humectante emulgente de aceite en agua detergente solubilizante Estos valores se citan ampliamente en la literatura como guı́as para la selección de emulgentes para propósitos particulares. Se indican para usar con emulgentes no iónicos. Se han desarrollado sistemas análogos para emulgentes aniónicos o catiónicos, pero son menos útiles que aquéllos para emulgentes no iónicos. Los ı́ndices del equilibrio hidrófı́lo-lipófilo se han publicado para muchos tensioactivos no iónicos.9 Además, Davies ideó un método para calcular ı́ndices del equilibrio hidrófilolipófilo para tensioactivos directamente a partir de su fórmula usando ı́ndices derivados empı́ricamente.10 Ası́, un ı́ndice de grupo se asigna a diversos grupos de componentes en emulgentes y el equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) se calcula a continuación a partir de las siguientes relaciones:11 HLB = 7 + Σ (ı́ndices del grupo hidrófilo) - Σ (ı́ndices del grupo lipófilo): los ı́ndices de HLB han resultado guı́as valiosas para seleccionar emulgentes ya que los emulgentes fuera del intervalo especificado rara vez serán eficaces para una aplicación particular. Sin embargo, un ı́ndice de HLB correcto no garantiza el comportamiento, lo que indica que otros factores distintos al HLB también son importantes y deben considerarse. Debe apuntarse que no se listan aplicaciones para tensioactivos con HLBs de menos de tres. Tales agentes se han usado para extender aceite de baño sobre la superficie de agua, como adyuvantes de vacunas y para unas pocas aplicaciones más. Sin embargo, rara vez se usan como agentes emulsionantes. La mayorı́a de las emulsiones de agua en aceite usan tensioactivos con un HLB en el intervalo de 3 a 6 según se describe anteriormente.12 Sólidos finamente divididos también pueden usarse como agentes emulsionantes. Se ha dado cuenta de que el objetivo en una emulsión de agua en aceite es producir una pelı́cula interfacial con rigidez y sin carga.13 La estabilidad de una emulsión puede incrementarse frecuentemente incrementando la concentración de agente emulsionante, pero esto incrementa problemas de toxicidad para aplicaciones biológicas y también puede ser subóptimo para otras aplicaciones. La estabilidad de la emulsión se incrementa frecuentemente cuando dos tensioactivos con diferencia moderadas en el HLB y otras propiedades se mezclan entre sı́. Si las diferencias son demasiado grandes, sin embargo, entonces la combinación rara vez funciona. Se han hecho intentos de predecir la función de combinaciones de tensioactivos promediando sus valores de HLB, pero son muy conocidos casos en los que las combinaciones producen resultados que son muy diferentes de la media de los componentes.14 Los tensioactivos mezclados pueden producir un efecto sinérgico para estabilizar las emulsiones. Se cree que esto está relacionado con la formación de complejos estructurados similares a cristales lı́quidos en la R 80 para estabilizar emulsiones de agua interfase de aceite-agua. Se han mezclado fosfolı́pidos con Span en aceite vegetal.15 Finalmente, la heterogeneidad de la longitud de la cadena de polioxietileno frecuentemente afecta a la estabilidad de la emulsión, especialmente en situaciones en las que el tensioactivo es marginalmente soluble. Las preparaciones con una heterogeneidad incrementada de longitud de cadena tienden a producir emulsiones con mayor estabilidad. Como puede observarse a partir del análisis precedente, es difı́cil predecir las propiedades emulsionantes de cualquier combinación de compuestos basándose en las propiedades fı́sicas de los compuestos. 3 ES 2 116 340 T3 5 Diversos aceites difieren marcadamente en la facilidad con la que pueden emulsionarse y en la estabilidad de las emulsiones resultantes. En general, el aceite mineral es más fácil de emulsificar que los aceites vegetales.16 Cada aceite tiene un ı́ndice de HLB requerido para la producción de un tipo particular de emulsión. Esta es la razón para el intervalo de ı́ndices de HLB para la producción de cada tipo de emulsión que se muestra en la Tabla 1. Cuanto más polar es la fase aceitosa, más polar debe ser el tensioactivo para producir una emulsión óptima. Las emulsiones de agua en aceite siguen reglas similares a las emulsiones de aceite en agua, pero los valores de HLB son inferiores. Se han publicado los valores de HLB requeridos para producir emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua con muchos aceites usados comúnmente.17 10 15 20 Se han ideado numerosos métodos para producir emulsiones de agua en aceite. La mayorı́a de éstos implicaba mezclar los componentes en una máquina que produce agitación o una fuerza de cizallamiento intensa. Se ha recomendado que los materiales solubles en aceite se pongan en la fase de aceite y los materiales solubles en agua en la fase de agua antes de combinar las fases.18 Sin embargo, esto da como resultado una preparación de la emulsión menos que satisfactoria. Una excepción a esto es que pueden producirse emulsiones de aceite en agua muy finas poniendo un tensioactivo soluble en agua en la fase aceitosa. Lo inverso no se ha recomendado para emulsiones de agua en aceite.19 Poner tensioactivos hidrófobos en la fase acuosa de una emulsión conduce generalmente a una emulsificación pobre. Emulsiones de aceite en agua finas pueden prepararse a partir de emulsiones de agua en aceite mediante inversión de fases. Muchos tensioactivos cambian sus propiedades y se alteran desde promover un tipo de emulsión hasta el otro con un cambio en la temperatura.20 Este fenómeno puede usarse para producir emulsiones bajo ciertas circunstancias. Estabifizantes para Emulsiones de Agua en Aceite: 25 30 35 40 Las emulsiones de agua en aceite de la técnica anterior son difı́ciles de estabilizar. Esto ha impedido seriamente su aplicación en muchas situaciones en las que de otra manera serı́an altamente deseables. La estabilización se ha intentado incrementando la viscosidad de una o más de las fases o interfases. Eso puede efectuarse añadiendo estabilizantes polı́meros que forman geles en las fases en masa u otras estructuras en las interfases. Tales polı́meros incluyen proteı́nas, almidones, gomas, materiales celulósicos, poli(alcoholes vinı́licos), poli(ácido acrı́lico) y polivinilpirrolidona.21 Estos materiales se unen a la interfase mediante enlaces covalentes o mediante interacciones electrostáticas e hidrófobas. Forman un “complejo interfacial” que se define como una asociación de dos o más moléculas superficiactivas en una interfase en una relación que no existe en cualquiera de las fases en masa. Ciertos complejos localizados en la interfase de emulsiones de aceite en agua pueden ser eficaces para estabilizar las emulsiones. Algunos materiales de bajo peso molecular se han usado de forma similar como estabilizantes. Estos incluyen colesterol, que puede formar complejos con ciertos agentes emulsionantes no iónicos.22 Además, las sales de ácidos grasos de cationes divalentes, tales como estearato de aluminio, son muy eficaces para estabilizar emulsiones de agua en aceite. Las sales de los mismos ácidos grasos con cationes monovalentes, tales como estearato sódico, no son eficaces. Problemas con las Emulsiones de Agua en Aceite de la Técnica Anterior: 45 50 Los principales problemas que impiden el uso incrementado de emulsiones de agua en aceite son la dificultad en la preparación, la alta viscosidad y la escasa estabilidad. Los aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete y aceite de soja, o un aceite animal, tal como escualeno o escualano, serı́an preferibles al aceite mineral para muchas aplicaciones. Sin embargo, son más difı́ciles de emulsificar y forman emulsiones menos estables. Las emulsiones de agua en aceite, de aceite vegetal, requieren concentracioR 80 y un estabilizante. Estearato de nes relativamente altas de un emulgente hidrófobo tal como Span aluminio o magnesio se han usado satisfactoriamente como estabilizantes. Sin embargo, se suman a la complejidad y la toxicidad de las emulsiones. Otro problema es que la solubilidad de los tensioactivos no iónicos, y ası́ su capacidad para producir emulsiones estables, varia con la temperatura. Esto produce problemas en el almacenamiento de emulsiones cuando la temperatura puede variar desde por debajo de la congelación hasta más de 48,9◦C. 55 60 Muchos intentos para vencer estos problemas han implicado la polimerización de algún componente de la emulsión para producir una rigidez incrementada. Se han añadido polı́meros a las fases acuosa o aceitosa que se polimerizan a continuación quı́micamente o mediante radiación. Algunos tensioactivos pueden polimerizarse en la interfase de aceite-agua con radiación x.23 Esto no es útil para emulsiones de agua en aceite que requieren tensioactivos hidrófobos debido a que estos tensioactivos tienden a degradarse por radiación x. Finalmente, calentar hasta temperaturas que desnaturalizan las proteı́nas se requiere para fundir o disolver ciertos componentes de las emulsiones.24 Esto impide el uso de tales emulsiones 4 ES 2 116 340 T3 5 10 15 para muchas actividades biológicas en las que se requieren proteı́nas naturales no dañadas. Finalmente, pueden ser necesarias concentraciones muy altas de agentes emulsionantes. En un ejemplo, hasta 82% R L121 (poloxámero de la fase aceitosa de las emulsiones estaba formado por el tensioactivo Pluronic 25 401). Otros ejemplos en la misma patente requerı́an calentar hasta temperaturas altas para producir emulsiones de agua en aceite con tensioactivos de copolı́meros de bloques. Lo que se necesita es un método mejorado para producir emulsiones de agua en aceite que no requiera altas temperaturas, disolventes orgánicos, radiación x o reacciones quı́micas para provocar la reticulación para formar la emulsión deseada. El método debe producir óptimamente emulsiones de agua en aceite mediante emulsificación espontánea. Además, las emulsiones necesitan estabilidad incrementada. Deben ser estables a un alto intervalo de temperaturas. Preferiblemente, las emulsiones deben tener una toxicidad inferior para ser útiles para aplicaciones biológicas. Para esto, deben contener menos componentes y los componentes que están presentes deben ser menos tóxicos. Los estabilizantes deben reducirse. La concentración de agua en la emulsión de agua en aceite debe incrementarse hasta un nivel superior, preferiblemente por encima de 80%. La mayorı́a de las emulsiones de agua en aceite han usado menos de 50% de agua. Finalmente, la emulsión de agua en aceite debe proporcionar una buena materia prima para la próducción de emulsiones múltiples de agua en aceite en agua. Emulsiones Múltiples: 20 25 30 35 40 La emulsión múltiple de agua en aceite en agua comprende tres fases distintas.26 La fase más interna es acuosa. Está encapsulada en una fase aceitosa que, a su vez, está encerrada dentro de una segunda fase acuosa. Cada glóbulo de aceite dispersado en una emulsión de agua en aceite en agua forma una estructura vesicular con compartimientos simples o múltiples o acuosos separados del fluido de suspensión acuoso por una capa de componentes de la fase aceitosa. Tales emulsiones tienen la mayorı́a de las ventajas de las emulsiones de agua en aceite con una viscosidad muy inferior. También tienen muchas similitudes con los liposomas pero tienen compartimientos acuosos grandes y pueden prepararse sin disolventes inorgánicos. Las emulsiones múltiples pueden considerarse una metafase relativamente inestable entre emulsiones de agua en aceite y aceite en agua. La capa de aceite que separa las dos fases acuosas puede hacerse muy delgada, lo que es independiente de la cantidad del(de los) componente(s) de la fase aceitosa. La estabilidad de estas emulsiones puede entenderse fenomenológicamente como producida por la durabilidad de la capa aceitosa.27 Las capas o pelı́culas aceitosas rı́gidas se asocian por la estabilidad incrementada. Las emulsiones múltiples pueden ser útiles en muchas tecnologı́as. Particularmente en la ciencia farmacéutica y de la separación. Sus aplicaciones biofarmacéuticas potenciales son únicas como consecuencia de la dispersión de una fase acuosa dentro de gotı́culas de otra. Estas incluyen potencial como adyuvantes de vacunas, sistemas de suministro de fármacos, reservas de sorbente en tratamientos de sobredosis de fármacos y para la inmovilización de enzimas. También pueden usarse para la separación de hidrocarburos y en la retirada de materiales tóxicos de agua residual. Las emulsiones múltiples de acuerdo con la presente invención pueden formularse como cosméticos y como productos domésticos tales como pulimento de cera. Se han usado para imnovilizar insulina para la inyección en depósito, y en alimentos. El principal problema asociado con las emulsiones múltiples es su inestabilidád que ha limitado severamente su utilidad en las muchas aplicaciones para las que han mostrado un porvenir obvio.28 45 Producción de Emulsiones Múltiples: 50 55 60 Las emulsiones múltiples se han producido mediante varias técnicas que tienen ventajas en diferentes situaciones. Sin embargo, ninguna de ellas es óptima. Un procedimiento implica la preparación de una emulsión de agua en aceite que se convierte a continuación en una emulsión múltiple incrementando la cantidad de fase de agua hasta que la capacidad emulsionante de la fase aceitosa se supera. Alternativamente, cambiando la temperatura más allá del punto de inversión, algunas emulsiones se transformarán desde agua en aceite hasta aceite en agua produciendo una fase de emulsión múltiple transitoria. Las emulsiones múltiples que tienen dos fases acuosas diferentes debe ir prepararse en dos etapas. Esto se efectúa produciendo una emulsión de agua en aceite mediante cualquier técnica estándar. Esta emulsión de agua en aceite se re-emulsifica a continuación en la segunda fase acuosa que normalmente contiene tensioactivos. Emulgentes no iónicos son habitualmente preferibles a los iónicos para la segunda R 80 ha sido un emulgente satisfactorio para la emulsión de agua en aceite en la primera etapa. Span R 80 en parafina lı́quida, sin embargo, es una de las condiciones etapa. “Una gran cantidad de Span R 80 da necesarias para desarrollar dispersiones de tipo de emulsión múltiple”.29 Menos de 20% de Span como resultado una emulsión de aceite en agua (véase la Tabla II). El óptimo para el aceite de parafina es 5 ES 2 116 340 T3 5 aproximadamente 30%. Para la emulsificación de aceite animal o aceites vegetales, se requieren cantidades incluso mayores de Span 80, del orden de 50%. El emulgente de agua en aceite siempre se añade a la fase aceitosa de la emulsión. La concentración de emulgente hidrófilo en la fase acuosa externa también es crı́tica ya que la concentración debe ser muy pequeña en relación a la concentración de emulgente hidrófobo en la fase aceitosa. Por ejemplo, la concentración de Tween 80 en la fase acuosa no puede superar 1%, mientras que Span 80 en la fase aceitosa debe estar por encima de 30% para producir una emulsión estable.30 TABLA II 10 % de Span 80 Tipo de Emulsión Indice de Emulsión Múltiple 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 o/w o/w w/o/w w/o/w w/o/w w/o/w w/o/w w/o/w w/o/w w/o/w 0 0 0,7 0,15 0,25 0,30 0,27 0,16 0,05 0 15 20 25 30 35 40 45 R Tabla II: Efecto de la concentración de Span 80 en la fase aceitosa sobre la formación de emulsiones de agua-parafı́na lı́quida-agua preparadas mediante la agitación mecánica; la concentración de SDS en la fase acuosa se fijaba a 0,15 M en todos los casos. El ı́ndice de emulsión múltiple es una medida de la formación de w/o/w.31 Se han usado una variedad de agentes estabilizantes y regı́menes en la técnica anterior para incrementar la estabilidad de las emulsiones múltiples. La lecitina de soja en una concentración de 8% permitı́a R 80 hasta 20% mientras que mantenı́a la estabilidad de la emulsión. una reducción en la cantidad de Span Como las emulsiones de agua en aceite, la fracción en volumen de la fase aceitosa no es crı́tica. Se cree que esto se debe al hecho de que los componentes en la emulsión son móviles y la estabilidad depende de mantener la integridad de una pelı́cula de lı́pido a medida que adelgaza.32 Como las emulsiones de agua en aceite, los aceites vegetales y los aceites animales son más difı́ciles de usar en la producción de emulsiones múltiples que el aceite mineral. Por ejemplo, se requiere 60% de R 80 para producir una emulsión múltiple con aceite de oliva.33 Esto puede reducirse hasta 43% si se Span añade 17% de lecitina de soja. Además, pueden usarse pares de tensioactivos para estabilizar emulsiones múltiples casi de la misma manera que se han usado para emulsiones de w/o. Tensioactivos de Copolı́meros de Bloques en las Emulsiones Múltiples de la Técnica Anterior: 50 55 60 R L101 (poloxámero 331) se ha usado como el emulgente hidrófobo en comCopolı́mero Pluronic R binación con Pluronic P123 (poloxárnero 403) como el emulgente hidrófilo para producir emulsiones R L101 al 5% en aceite mineral se emulsionó con múltiples de agua en aceite en agua.34,35 El Pluronic solución salina que contenı́a 2% de albúmina de suero bovino. A lo largo del tiempo, la albúmina de R L101 en la interfase de aceite-agua. Se creı́a que este suero bovino formaba un complejo con el Pluronic complejo era importante para mantener la estabilidad del componente de agua en aceite de la emulsión. Si la emulsión múltiple se produce antes de que este complejo interfacial tenga tiempo para formarse, la emulsión de agua en aceite en agua resultante es menos estable. Esta emulsión se re-emulsificó a contiR P123. Varios tensioactivos de copolı́mero se nuación en solución salina que contenı́a 0,4% de Pluronic R evaluaron en este estudio. Se encontró que Pluronic L101 y P123 eran los más eficaces. Copolı́meros con hidrófobos mayores que 4000 no se han evaluado. 6 ES 2 116 340 T3 Estabilizantes Fı́sicos: 5 10 15 20 25 Debido a la inestabilidad inherente de las emulsiones múltiples, se han intentado varios procedimientos para aumentar la estabilidad produciendo rigidez fı́sica.36,37 Un procedimiento utiliza la interacción entre polı́meros hidrófilos en la fase acuosa interna con el tensioactivo. La interacción de BSA-L101 descrita anteriormente es un ejemplo. Otros ejemplos usaban poli(ácido acrı́lico) o polielectrólitos con pesos moleculares altos que se aproximaban a tres millones. Además, el tensioactivo en la interfase se ha reticulado mediante radiación x o polimerización de monómeros quı́micamente reactivos.38 Esto se ha realizado para polimerizar material en la fase acuosa interna, en la interfase de aceite-agua, en la fase aceitosa, y en la fase acuosa externa. Las gotı́culas de aceite se han encapsulado con gelatina y otros materiales para proporcionar barreras fı́sicas. Aunque cada uno de estos métodos ha proporcionado una medida de estabilidad incrementada bajo ciertas condiciones, las emulsiones rara vez han sido suficientemente estables, atóxicas y funcionales para facilitar un uso extendido. Problemas con Emulsiones Múltiples de Agua en Aceite en Agua: Según se menciona anteriormente, el principal problema en las emulsiones de agua en aceite en agua es la estabilidad. La inestabilidad inherente de las emulsiones múltiples ha impedido la mayorı́a de los usos comerciales. Sin embargo, ha habido unos pocos informes de intentos de mejorar la estabilidad. Los procedimientos para incrementar la estabilidad de emulsiones múltiples han sido bastante empı́ricos ya que cada manipulación tiende a ser altamente especı́fica para la emulsión particular bajo evaluación.39 Con todo, pueden formularse algunos principios. El problema más importante parece ser la inestabilidad provocada por el emulgente acuoso en la capa externa que solubiliza progresivamente el emulgente hidrófobo en la capa de aceite y destruye la emulsión interna.40 La interacción casi inevitable del tensioactivo usado en la segunda etapa de emulsificación con la pelı́cula interfacial inicial demuestra la impracticabilidad inherente de emplear estabilizantes de tensioactivo, libres en emulsiones múltiples. Es preferible una membrana interfacial más permanente que no permita la difusión de componentes estabilizantes. Determinación de las Emulsiones Múltiples: 30 35 Las emulsiones múltiples se han clasificado como tipos A, B y C, dependiendo del tamaño y el número de gotı́culas de agua dentro de las gotas de aceite. El tipo A tiene una sola gotı́cula de agua, B un pequeño número, y C un número mayor de gotas de agua dentro de las gotas de aceite.41 De acuerdo con esta clasificación, la emulsión produce un adyuvante completo de Freund o las emulsiones múltiples de la presente invención son mucho más finas incluso que las emulsiones C. Se ha dado cuenta de que las emulsiones múltiples pueden ser más estables que las emulsiones de agua en aceite originales bajo ciertas circunstancias. En un ejemplo, aceite de soja emulsificado con monooleato de glicerilo era estable a 80◦ C.42 Se da cuenta de que las emulsiones múltiples elaboradas con adyuvante de Freund son más estables que la emulsión de agua en aceite original en el almacenamiento a 4◦ C.43 40 45 US-A-4 446 044 describe una emulsión de agua en aceite que consiste esencialmente en una fase dispersadade agua, una fase continua de aceite, en la que el aceite es una combinación de disolventes orgánicos, al menos un tensioactivo no iónico hidrófobo que tiene un valor de HLB menor que 3 y un tensioactivo no iónico hidrófilo que tiene un valor de HLB mayor que 10. El tensioactivo hidrófobo se disuelve en la fase aceitosa, y el tensioactivo hidrófilo se introduce en la fase acuosa. US-A-4 384 974 se refiere a una emulsión estable de agua en aceite que comprende agua, aceite, un tensioactivo de copolimero de bloques y un tensioactivo cosméticamente aceptable. Ambos tipos de tensioactivos se introducen en la fase aceitosa. 50 55 60 El problema primordial que limita la utilidad de las emulsiones múltiples es la estabilidad, La mayorı́a de las publicaciones que tratan de la estabilidad demuestran niveles inaceptables incluso para las preparaciones más estables. Para poductos biológicos, las emulsiones deben tener una vida de almacenaje comparable a la del fármaco contenido en el refrigerador o el congelador. Además, muchos de los componentes usados para incrementar la estabilidad también incrementarán la toxicidad. Las emulsiones múltiples han usado habitualmente concentraciones altas de tensioactivos hidrófobos y estabilizantes que son inherentemente tóxicos. Además, una baja concentración de agua, menor que 50% en la fase acuosa interna, fuerza un incremento en la cantidad de aceite para la cantidad de fase acuosa interna que ha de suministrarse. Esto es importante debido a que la fase acuosa interna es el sitio de elección para la mayorı́a de los ingredientes activos. Finalmente, serı́a altamente deseable usar un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, o un aceite animal (escualeno o escualano) en lugar del aceite mineral no metabolizable. Sin embargo, las emulsiones múltiples con aceite vegetal han sido aún más difı́ciles de producir y 7 ES 2 116 340 T3 mantener estables que aquéllas con aceite mineral. Sumario de la Invención 5 La presente invención comprende emulsiones de agua en aceite y múltiples de agua en aceite en agua y el método de preparación que vence muchas de las limitaciones de las emulsiones previas y son preparaciones superiores para usar en numerosas aplicaciones, incluyendo, pero no limitadas a, adyuvantes de vacunas, suministro de fármacos oral, tópico y parenteral, productos farmacéuticos, cosméticos, alimentos y diversos usos domésticos e industriales. 10 La presente invención es una emulsión de agua en aceite estable que contiene una fase acuosa dispersada dentro de una fase aceitosa continua, teniendo la fase acuosa una cantidad eficaz de un primer tensioactivo con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2 y teniendo la fase aceitosa continua un segundo tensioactivo. 15 20 La presente invención también incluye una emulsión múltiple estable de agua en aceite en agua que contiene una fase acuosa interna dispersada dentro de una fase aceitosa que está en una fase acuosa externa continua, teniendo la fase acuosa interna una cantidad eficaz de un primer tensioactivo con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2 y teniendo la fase aceitosa un segundo tensioactivo. Opcionalmente, puede añadirse un tensioactivo a la fase acuosa externa continua. El compuesto preferido que ha de añadirse a la fase acuosa interna es una cantidad eficaz de un copolı́mero superficiactivo con la siguiente fórmula general: 25 30 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que a es un número entero tal que el hidrófobo representado por (C3 H6 O) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3000 a 15000, con el intervalo preferible entre 3000 y 9000, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 5000 y 6000, y b es un número entero tal que la porción de hidrófilo representada por (C2 H4 O) constituye de aproximadamente 2% a 19% en peso del compuesto. R R 180.5 es el tensioactivo preferido. La fórmula para Pluronic 180.5 es como El copolı́mero Pluronic sigue: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 35 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 5200 y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 5% en peso. R L141 que tiene la siguiente fórmula: Otro tensioactivo preferido es Pluronic 40 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 4600 y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 10% en peso. 45 50 55 Las emulsiones se elaboran tı́picamente mezclando los componentes de las fases acuosa interna, aceitosa y acuosa externa. Si un tensioactivo de copolı́mero de bloques ha de incluirse en la fase acuosa interna, debe solubilizarse mediante refrigeración y dejarse precipitar calentando antes de la emulsificación. Una emulsión de agua en aceite (w/o) se prepara mediante cualquier método conveniente. Esta se pre-emulsifica a continuación en la fase acuosa externa para preparar una emulsión múltiple (w/o/w). La emulsión de w/o puede ensayarse poniendo una muestra en agua. La emulsión de w/o/w se evalúa mediante varios procedimientos. El más simple es la microscopı́a. De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos para preparar emulsiones de agua en aceite y agua en aceite en agua que son estables y útiles en una amplia variedad de aplicaciones. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos para preparar adyuvantes de vacunas superiores. 60 Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos para preparar emulsiones que puedan usarse como vehı́culos de suministro de fármacos parenteral, tópico, mucoso u oral. 8 ES 2 116 340 T3 Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos que puedan usarse para preparar emulsiones útiles para formular preparaciones cosméticas. 5 Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos que puedan usarse para preparar emulsiones que sean útiles en la preparación de alimentos. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos que puedan usarse para preparar emulsiones que sean útiles en la ciencia de la separación. 10 Estos y otros objetivos, caracterı́sticas y ventajas de la presente invención se harán evidentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las modalidades descritas y las reivindicaciones adjuntas. Breve Descripción de las Figuras 15 La Fig. 1 es una cuadrı́cula que muestra la relación entre los diversos compuestos de poloxámero. La Fig. 2 muestra las valoraciones de IgA secretora en fluido intestinal después de la imnunización oral con TNP-HEA en una emulsión de agua en aceite en agua. 20 La Fig. 3 muestra las valoraciones en suero de IgG e IgA después de la inmunización oral con TNPHEA en una emulsión de agua en aceite en agua. Descripción Detallada 25 30 Las nuevas emulsiones de la presente invención implican poner un agente superficiactivo insoluble con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2 en la fase acuosa interna. Esto es contrario a la técnica anterior que enseña que los emulgentes hidrófobos deben ponerse en la fase aceitosa. Emulgentes muy hidrófobos puestos en la fase acuosa en una forma finalmente dispersada proporcionan una estabilidad excepcional de la emulsión probablemente formando una barrera interfacial estable en la interfase de aceite/agua. El compuesto preferido que ha de añadirse a la fase acuosa interna es una cantidad eficaz de un copolı́mero superficiactivo con la siguiente fórmula general: 35 40 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que a es un número entero tal que el hidrófobo representado por (C3 H6 O) tiene un peso molecular medio de aproximadamente 3000 a 15000, preferiblemente de 5000 a 1000, y b es un número entero tal que la porción de hidrófilo representada por (C2 H4 O) constituye de aproximadamente 2% a 19% en peso del compuesto. R L180.5. El copolı́mero L310 se preparó mediante fraccionación por permeación en gel de Pluronic La fórmula para L310 se calcula como sigue: 45 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 10.000 y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 4% en peso. 50 R R L180.5 es el tensioactivo preferido. La fórmula lara Pluronic L180.5 es El copolı́mero Pluronic como sigue: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 55 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 5200 y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 5% en peso. R L141 que tiene la siguiente fórmula: Otro tensioactivo preferido es Pluronic HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 60 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 4600 y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 10% en peso. 9 ES 2 116 340 T3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 R Los bloques de copolı́mero Pluronic o de poloxámero se forman mediante condensación de unidades de óxido de etileno y óxido de propileno a temperatura y presión elevadas en presencia de un catalizador básico. Hay alguna variación estadı́stica en el número de unidades de monómero que se combinan para formar una cadena de polı́mero en cada copolı́mero. Los pesos moleculares medios dados son aproximaciones del peso medio de las moléculas de copolı́mero en cada preparación. Debe entenderse que los bloques de óxido de propileno y óxido de etileno no tienen que ser puros. Pueden mezclarse pequeñas cantidades de otros materiales con tal de que las propiedades fisicoquı́micas globales no se cambien sustancialmente. Un análisis más detallado de la preparación de estos productos se encuentra en US-A-2.674.619. La nomenclatura de los compuestos de poloxámero se basa en una cuadrı́cula de poloxámeros (Fig. 1). La cuadrı́cula de poloxámeros es la relación entre la nomenclatura y la composición de los diversos miembros de polı́mero. Los pesos moleculares medios del hidrófobo (polioxipropileno) se dan como puntos medios aproximados de intervalos. Los dos primeros dı́gitos de un número de poloxámero en la cuadrı́cula, multiplicados por 100, dan el peso molecular medio aproximado del hidrófobo. El último dı́gito, por 10, da el porcentaje en peso aproximado de contenido de hidrófilo (polioxietileno) del tensioactivo.44 Por ejemplo, el poloxámero 407, mostrado en el cuadrante derecho superior de la cuadrı́cula (Fig. 1), se deriva de un hidrófobo de un peso molecular medio de 4000, comprendiendo el hidrófilo 70% del peso molecular medio total del copolı́mero. Otro ejemplo es el poloxámero de 760.5 que tiene un hidrófobo con un peso molecular medio de 7600 daltons y tiene un hidrófilo que comprende 5% del peso molecular medio total del copolı́mero. Las emulsiones de la presente invención tienen un alto grado de estabilidad y pueden prepararse con hasta aproximadamente 90% a 95% de agua en la fase acuosa interna. La emulsión se crema con coalescencia parcial de las gotı́culas de aceite sin ruptura de la emulsión interna de agua en aceite. La solubilización del emulgente hidrófobo mediante el emulgente hidrófilo se elimina en gran parte. Un problema común con las emulsiones múltiples es que el tensioactivo hidrófilo en la fase acuosa externa hace exudar al tensioactivo hidrófobo fuera de la fase aceitosa y lo solubiliza en la fase acuosa externa. Esto destruye la capacidad de emulsificación de la fase aceitosa. Poniendo un tensioactivo hidrófobo en la fase acuosa interna, se mantiene separada de la fase acuosa externa. La capacidad de emulsificación de la fase aceitosa no está comprometida por el contacto con el tensioactivo acuoso externo. Aun cuando las gotı́culas de las fases aceitosas de las emulsiones de la presente invención puedan sufrir coalescencia y fusionarse, hay poca o ninguna mezcladura de las fases acuosas interna y externa. Por consiguiente, las emulsiones múltiples pueden volver a formarse meramente removiendo la preparación. Las emulsiones de agua en aceite pueden formarse espontáneamente con hasta 90% de agua. Las nuevas emulsiones pueden volver a formarse después de la ruptura completa mediante agitación moderada. Esto está en contraste con las emulsiones de agua en aceite más comunes con grandes proporciones de agua que no pueden volver a formarse después de romperse, excepto separando los componentes y empezando de nuevo. Las emulsiones de la presente invención se preparan fácilmente y son estables con diversos aceites vegetales o animales, particularmente aceite de cacahuete y escualeno además de aceite mineral. Pueden prepararse con entre 10% y 95% de agua en la fase acuosa interna, sin embargo, para la mayorı́a de los propósitos, la concentración. óptima de agua está entre 60% y 80% volumen/volumen. La fase acuosa interna tiene caracterı́sticamente un tamaño de las gotı́culas muy fino. Las preparaciones son estables congeladas, refrigeradas, a temperatura ambiente y a temperaturas elevadas hasta una extensión mucho mayor que las preparaciones de la técnica anterior. Tienen un nivel excepcionalmente bajo de toxicidad. Las emulsiones de la presente invención pueden formarse con una variedad de diferentes tipos de aceites, agentes superficiactivos hidrófobos en la fase aceitosa, y agentes superficiactivos hidrófilos en la fase acuosa externa. Aceites que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aceites animales tales como escualeno o escualano, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceites minerales tales como drakeol, y aceites sintéticos tales como miristato de isopropilo. Los aceites y las combinaciones de tensioactivos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las emulsiones también pueden utilizar otros agentes estabilizantes tales como sı́lice, estearato de aluminio, albúmina de suero bovino, otras proteı́nas, y otros agentes polimerizantes y estabilizantes que conocidos por los expertos en la técnica. Es importante evitar el uso de agentes desemulsificantes. La preparación general de las emulsiones múltiples de la presente invención implica mezclar u homogeneizar en primer lugar lo que será la fase acuosa interna de la emulsión con un tensioactivo con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2. Otros materiales pueden mezclarse o disolverse en la fase acuosa interna. Por ejemplo, si la emulsión ha de usarse como un adyuvante, el antı́geno puede ponerse en la fase acuosa. Los tensioactivos preferidos son los copolı́meros de bloques analizados aquı́, pero debe entenderse que pueden usarse otros tensioactivos con tal de que tales otros tensioactivos 10 ES 2 116 340 T3 tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de 2. La mezcla se homogeiniza a continuación con un aceite para formar una mezcla de agua en aceite. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 La homogeneización puede realizarse transfiriendo rápidamente el fluido entre dos jeringas. La homogeneización también puede realizarse en un minimezclador, mediante sonicación, o mediante uno cualquiera de un número de métodos que son bien conocidos para alguien de experiencia normal en la técnica. Para producir una emulsión múltiple de agua en aceite en agua, la emulsión de agua en aceite se homogeiniza a continuación con una segunda fase acuosa. Una aplicación de la presente invención es la preparación de vacunas eficaces contra infecciones que pueden usarse en cualquier especie de animal. Se sabe muy bien que las emulsiones de agua en aceite, tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante 65, son muy eficaces para producir respuestas inmunitarias fuertes frente a una amplia variedad de antı́genos. El adyuvante 65 es una emulsión de agua en aceite de cacahuete que usa monooleato de mánido como un emulgente y estearato de aluminio como un estabilizante. El adyuvante 65 se ha evaluado en numerosos estudios de animales y seres humanos.45,46 Las emulsiones elaboradas de acuerdo con la presente invención son superiores debido a que tienen una toxicidad inferior, pueden usarse con dosis inferiores de aceite y agentes superficiactivos, y producen respuestas inmunitarias equivalentes o superiores. Son particularmente eficaces para producir-vacunas de una sola dosis contra el tétano y la hepatitis B. La conversión de vacunas de múltiples dosis en vacunas de una sola dosis es un fin prioritario de la Organización Mundial de la Salud. Las formulaciones también son útiles como adyuvantes de vacunas para otros estados diversos incluyendo la malaria, el SIDA, la influenza y la neumonı́a por neumococos. Como vacunas, las formulaciones tienen las ventajas de permitir que se use una dosis reducida de antı́geno de una manera más eficaz. Son menos desnaturalizantes para el antı́geno que las emulsiones de aceite mineral. Esto produce una proporción superior de anticuerpo eficaz contra determinantes naturales del organismo infeccioso. Las emulsiones elaboradas de acuerdo con la presente invención utilizan el efecto adyuvante de los copolı́meros de bloques además de sus propiedades emulsionantes. (Véase la Solicitud de Patente de EE.UU. N◦ de Serie 07/544.831, que se incorpora aquı́ mediante referencia). Cuando se usan con antı́genos, las emulsiones potencian la producción de anticuerpo para un número mayor de determinantes antigénicos o epı́topos sobre antı́genos de parásito. Estas emulsiones son relativainente atóxicas debido a la reducción en la dosis de aceite, tensioactivo y material estabilizador. Pueden mezclarse con derivados de lipopolisacáridos, muramildipéptidos u otros agentes inmunomoduladores para modular el isotipo o equilibrio entre el anticuerpo y la inmunidad mediada por células. Las vacunas pueden ası́ modularse para producir tipos particulares de respuesta inmunitaria que son particularmente eficaces contra enfermedades especı́ficas. Debido a que los agentes inmunomoduladores están contenidos dentro de la fase interna de las emulsiones, pueden usarse en dosis inferiores con menos toxicidad sistémica. Cuando las emulsiones producidas de acuerdo con la presente invención se usan como adyuvantes, pueden inyectarse mediante cualquier ruta conveniente intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente, tomarse oralmente o aplicarse mediante la ruta mucosa o nasal. Las emulsiones son estables indefinidamente en el congelador, lo que es una ventaja principal sobre las vacunas con adyuvantes de alumbre que deben refrigerarse. El requerimiento para la refrigeración, el “tren frı́o” es un impedimento principal para usar las vacunas en muchas partes del mundo. Las emulsiones de agua en aceite o múltiples de acuerdo con la presente invención pueden usarse como -vehı́culos de suministro de fármacos para uso oral, tópico o mucoso. Tienen la propiedad inusual de contener materiales fácilmente desnaturalizados tales como proteı́nas en solución salina u otro fluido no desnaturalizante durante el tránsito a través del estómago y el tracto gastrointestinal superior. El material se suministra intacto y con alta eficacia al tracto gastrointestinal inferior. Hallar medios para proteger los materiales de la digestión durante el paso a través del tracto gastrointestinal superior ha sido durante mucho tiempo un fin esquivo de la investigación del suministro de fármacos. Las emulsiones múltiples de acuerdo con la presente invención pueden usarse para inyección parenteral para producir la liberación sostenida de fármacos o para dirigir fármacos a áreas especı́ficas del cuerpo, especialmente a áreas con altas concentraciones de macrófagos. Debido a que las emulsiones múltiples tienen muchas de las propiedades de los liposomas, pueden usarse para cualquier aplicación en la que los liposomas se han usado o considerado. Tienen la ventaja añadida de un gran compartimiento interno acuoso y pueden producirse sin el uso de disolventes orgánicos.47 Tales emulsiones pueden usarse para la ingestión oral de fármacos para promover la liberación sostenida y/o proteger a los fármacos de la digestión en el estómago debida a enzimas ácidas y proteolı́ticas. Las emulsiones de acuerdo con la presente invención también pueden facilitar la absorción. Además el uso de copolı́meros inhibe las lipasas y mantiene la integridad de la emulsión y el suministro de fármacos a las partes inferiores del 11 ES 2 116 340 T3 tracto gastrointestinal. Las emulsiones múltiples también pueden usarse para el suministro de fármacos transmucosamente a través de la nariz, el recto, la vagina y otras membranas mucosas. La tendencia de las emulsiones múltiples a extenderse sobre superficies compatibles facilita el suministro y la absorción de fármacos a través de cualquier superficie corporal externa o interna. 5 10 Una emulsión de agua en aceite de la técnica anterior, el adyuvante completo de Freund, ha sido el adyuvante inmunitario más ampliamente usado para inmunizar animales. Sin embargo, es demasiado tóxico para usar en seres humanos. Una versión sin micobacterias, adyuvante incompleto de Freund, se usó en vacunas clı́nicas pero se abandonó por razones de toxicidad.48,49,50,51 Una emulsión de agua en R A (monooleato de mánido) y estearato de aluminio aceite, de aceite de cacahuete, que contenı́a Arlacel se evaluó en los 1960’s como un adyuvante para vacunas humanas.52,53,54 Mostraba porvenir pero se abandonó. Uno de los problemas con estas vacunas de emulsión de agua en aceite es que la dosis de 1/4 a 1/2 ml da como resultado una inyección excesivamente grande de aceite que se ha asociado con reacciones tóxicas locales severas y ocasionalmente sistémicas. 15 Las emulsiones múltiples con un alto contenido de agua y estabilidad adecuada tienen usos potenciales en alimentos, cosméticos, la ciencia de la separación, la catálisis de reacciones quı́micas y muchas otras áreas. La preparación de emulsiones con un contenido muy alto de agua, y de emulsiones múltiples que carecen de agentes estabilizantes irritantes, es una ventaja una ventaja particular en cosméticos. 20 25 Las emulsiones múltiples se han propuesto como un uso en múltiples tipos de alimentos y salsas. La baja toxicidad de los copolı́meros y la formación con aceites comestibles proporcionan excelentes oportunidades para los productos alimenticios. Las emulsiones múltiples preparadas mediante la presente invención pueden usarse en casi cualquier aplicación de la ciencia de la separación en la que se han preparado otras emulsiones de agua en aceite o agua en aceite en agua. Las emulsiones múltiples proporcionan un vehı́culo conveniente para la difusión de materiales a través de membranas semi-permeables (la capa aceitosa). En situaciones apropiadas, esto puede usarse para facilitar la separación de materiales. Se ha propuesto que tales emulsiones pueden usarse para la extracción con disolventes y como un método para tratar la sobredosis de drogas. 30 Abreviatura y Códigos de Resultados de Emulsiones Múltiples: 35 40 45 50 55 60 31R1 AlSt AlSt-1 AISt-4 R 186 Arlacel BSA-3 BSA-10 DDA Drakeol 6VR lec huevo F68 miris so CEF L101 L121 L141 L180,5 nr Octadecil o/w P123 Acido palmi plurocol 2010 plurocol 4010 RT S80 R 31R1) Meroxapol, (Pluronic estearato de aluminio 10 mg/ml de estearato de aluminio 40 mg/ml de estearato de aluminio mezcla de tensioactivos no iónicos de mono- y diglicéridos 3 mg/ml de albúmina de suero bovino en solución salina 10 mg/ml de albúmina de suero bovino en solución salina bromuro de dimetildioctadecilamonio aceite mineral ligero lecitina de huevo R F68) poloxámero 188 (Pluronic miristato de isopropilo células y fluido de cultivo de fibroblastos de embrión de polluelo R L101) poloxámero 331 (Pluronic poloxámero 401 (Pluronic R L121) R L141) poloxámero 461 (Pluronic R L180.5) poloxámero 520.5 (Pluronic no realizado octadecilamina emulsión de aceite en agua R P123) poloxámero 403 (Pluronic ácido palmı́tico, polioxipropileno (PM ∼ 2000) polioxipropileno (PM ∼ 3900) temperatura ambiente R 80, monooleato de sorbitán Span 12 ES 2 116 340 T3 10 Sil-10 Sil-50 lec soja R Span 65 T150R1 T1501 R 80 Tween w/o w/o/w 15 El código de graduación encontrado en las últimas dos columnas de cada tabla se define en la siguiente tabla. La indicación “0” es la menos estable y se rompe en segundos. La indicación “4” es la más estable y permanecerá una emulsión durante semanas o meses bajo condiciones duras. La indicación “c” implica que las gotı́culas de agua en el aceite sufren coalescencia pero debido a esto no se fusionan o rompen. 5 10 mg/ml 5µm MIN-U-SIL (partı́culas de cuarzo) 50 mg/ml 5µm MIN-U-SIL (partı́culas de cuarzo) lecitina de haba de soja triestearato de sorbitán R R T150R1 Tetronic R T1501 (Poloxamina) Tetronic monooleato de polioxietilensorbitán emulsión de agua en aceite emulsión de agua en aceite en agua Tiempo de Estabilidad de Emulsión Código 20 Intermedio Rápido Lento Muy Lento Estable 25 30 35 Segundos Horas Dı́as Semanas Semanas en condiciones duras 0 1 2 3 4 Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse de ningún modo como limitaciones impuestas sobre el alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a diversas otras modalidades, modificaciones y equivalentes de los mismas que, después de leer la descripción de aquı́, pueden sugerirse por sı́ mismos a los expertos en la técnica, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Ejemplo 1 40 45 50 55 60 Se prepararon emulsiones de agua en aceite y múltiples (agua en aceite en agua) usando los materiales y las proporciones mostrados en las Tablas 1 a 8. Las tres fases (acuosa interna, aceitosa y acuosa externa) se prepararon en primer lugar mezclando los componentes en las proporciones mostradas. Por ejemplo, en la lı́nea 35 de la Tabla 1, la fase acuosa interna se preparó mezclando copolı́mero L180.5 al 20% v/v con una solución de 3 mg/ml de DSA en solución salina fisiológica. La mezcla se puso en un refrigerador a 4◦ C para permitir que el copolı́mero entrara en la solución. A continuación se calentó para precipitar el copolı́mero antes de usar. La fase aceitosa se preparó a partir de una mezcla de escualeno con 20% R 80. No se usó estabilizante. Si se hubiera usado sı́lice como un estabilizante, se en volumen de Span habrı́a mezclado con el tensioactivo de la fase aceitosa antes de combinar con el aceite. Si el estearato de aluminio hubiera sido el estabilizante, la fase aceitosa se habrı́a calentado hasta de 50 a 80◦ C para R 80 y disolverlo. La fase acuosa externa es una mezcla de solución salina fisiológica con 0,5% de Tween 0,5% de F68. La emulsión de agua en aceite se prepara en primer lugar mediante homogeneización usando cualquier dispositivo homogeneizador adecuado familiar para los expertos en la técnica. En este ejemplo, una parte (1 ml) de la fase aceitosa se homogeiniza con 1 ml de la fase acuosa interna para producir una emulsión de agua en aceite. Esta emulsión puede ensayarse poniendo una gota sobre la superficie de agua. Debe mantener su conformación y no dispersarse. La emulsión de agua en aceite se emulsifica a continuación secundariamente en 6 partes (6 ml) de la fase acuosa externa para producir una emulsión de agua en aceite en agua. Se encontró que esta emulsión (lı́nea 35 de la Tabla 1) era altamente estable después de 24 horas a temperatura ambiente. Cada una de las otras emulsiones mostradas en las Tablas 1 a 8 se prepararon mediante procedimientos similares. Un esquema para clasificar las emulsiones múltiples como tipos A, B y C fue propuesto por Florence. El tipo C es el mejor. La fase acuosa interna tiene muchas gotı́culas de agua pequeñas. El tipo B es 13 ES 2 116 340 T3 5 una emulsión menos satisfactoria en la que la fase acuosa interna tiene varias gotı́culas de agua discretas. El tipo A, el más pobre, tiene una fase acuosa interna con una sola gotı́cula grande. La emulsión de este ejemplo era mejor que cualquiera descrita por Florence.55 Las gotı́culas acuosas internas eran tan finas que las gotı́culas individuales no podı́an observarse con microscopio óptico. En cambio, la emulsión parecı́a tener una apariencia de vidrio triturado debido a la miriada de gotı́culas de agua muy finas de la fase acuosa interna. Ejemplo 2 10 R 80 en escualeno puede producir emulsiones de agua en aceite estables, pero De 10% a 20% de Span es incapaz de producir emulsiones múltiples estables de agua en aceite en agua (lı́nea 25-26; Tabla 1). Ejemplo 3 15 20 R 80 en escualeno reduce la capacidad La adición de copolı́meros L121, L141 o L180.5 a 10% de Span para formar una emulsión estable de agua en aceite (lı́neas 1-12; Tabla 1). Los copolı́meros L121 y L180.5 desestabilizan las emulsiones en concentraciones de 8% en escualeno mientras que se requiere 20% de L141. Ejemplo 4 R 80 hasta 20% de la fase aceitosa vence la capacidad desestaIncrementar la concentración de Span bilizante de L141 y facilita la preparación de una emulsión estable de agua en aceite. Por otra parte, el L141 en esta situación promueve la forinación de una emulsión múltiple estable (lı́neas 26 y 27; Tabla 1). 25 Ejemplo 5 30 Estearato de aluminio al 1 ó 4% como un estabilizante en la fase aceitosa vence la capacidad desestabilizante del copolı́mero L141 y también promueve la formación de emulsiones múltiples estables (lı́neas 28-31; Tabla 1). Ejemplo 6 35 Los copolı́meros L141 o 1,180.5 añadidos a la fase acuosa interna de una emulsión facilitan la formación de emulsiones múltiples estables. Este es un resultado sorprendente ya que la literatura enseña que los tensioactivos hidrófobos deben ponerse en la fase aceitosa. Por otra parte, el HLB de estos copolı́meros es inferior que los presentados para emulgentes eficaces de agua en aceite (lı́neas 32-35 y 25-26; Tabla 1). Ejemplo 7 40 R 80 para producir emulsiones F68 es un tensioactivo en fase acuosa externa más eficaz que Tween múltiples (lı́neas 1-9; Tabla 2). Ejemplo 8 45 R 80 y copolı́mero L180.5 se combinan en la fase aceitosa, incrementar la concentración de Si Span R 80 desde 10% hasta 40% disminuye la estabilidad de la emulsión múltiple resultante. Esto debe Span contrastarse con la literatura que indica que las emulsiones múltiples requieren concentraciones altas de R 80 (lı́neas 20-27; Tabla 2). Span 50 Ejemplo 9 55 El copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna es superior a L141 o copolı́meros más pequeños para estabilizar las emulsiones múltiples. Esto se demuestra claramente cuando la concentración de agua en la fase acuosa interna se eleva hasta 80% de la de la emulsión de agua en aceite (lı́neas 1-6; Tabla 3). Ejemplo 10 60 El copolı́mero L180.5 estabiliza eficazmente emulsiones múltiples con 80% de agua en la fase acuosa interna. Estas emulsiones permanecen estables según se observa con microscopio óptico después del almacenamiento a 37◦C, 4◦ C, congelación a -20◦C y descongelación durante un perı́odo de varias semanas (lı́neas 1-6; Tabla 3). 14 ES 2 116 340 T3 Ejemplo 11 5 Emulsiones múltiples con 80% de agua en la fase acuosa interna podrı́an prepararse con un gran volumen de fase acuosa externa sin comprometer la estabilidad. Esto está en contraste con la literatura que enseña la importancia de limitar el volumen de la fase acuosa externa (lı́neas 1-3 y 19-21; Tabla 3). Ejemplo 12 10 El copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna de emulsiones de agua en aceite con escualeno incrementa la estabilidad de la emulsión de agua en aceite e incrementa muy marcadamente la estabilidad de las emulsiones múltiples. La estabilidad de las emulsiones múltiples depende del tipo de tensioactivo en la fase acuosa externa. En preparaciones con copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna, podı́a usarse una variedad mucho más amplia de tensioactivos en la fase acuosa externa (lı́nea 7-12 y 19-24; Tabla 4). 15 Ejemplo 13 20 Una emulsión múltiple con 10% de copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna y 0,25% de P123 como el tensioactivo de la fase acuosa externa consiste en 80% de agua en la emulsión interna de agua en aceite y 80% del volumen total que es la fase acuosa externa de modo que la fase aceitosa constituı́a sólo 4% de la emulsión total. Esto producı́a una emulsión múltiple altamente estable que soportaba la congelación y la descongelación cuatro veces durante un intervalo de 17 dı́as, el almacenamiento en el refrigerador a temperatura ambiente o 37◦ C durante perı́odos prolongados sin una evidencia ni siquiera de un pequeño deterioro (lı́nea 24; Tabla 4). 25 Ejemplo 14 30 35 La capacidad del copolı́mero L180.5 para promover la estabilidad de emulsiones de agua en aceite y múltiples de agua en aceite en agua se ensayó con varios aceites, tensioactivos de fase aceitosa hidrófobos, y estabilizantes. El copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna incrementaba la estabilidad tanto de emulR R 80, Arlacel 186 o siones de agua en aceite como múltiples de aceite de cacahuete preparadas con Span R 80 más estearato de aluminio (lı́neas 11-20, Tabla 5). Tenı́a un efecto similar con un aceite mineral Span (Drakeol 6VR) (lı́neas 21-30; Tabla 5). El copolı́mero L180.5 en la fase acuosa interna no incrementaba la estabilidad de emulsiones con miristato de isopropilo o plurocoles bajo estas condiciones de un volumen acuoso externo muy alto. Ejemplo 15 40 45 50 Se ha dado cuenta frecuentemente de que es difı́cil elaborar emulsiones estables de agua en aceite o múltiples de agua en aceite en agua con aceites vegetales. Se demuestra la capacidad del copolı́mero R 80 con aceite L180.5 en la fase acuosa interna para promover la estabilidad de tales emulsiones. Span de cacahuete produce una emulsión de aceite en agua incluso con sólo 50% de agua (lı́nea 16; Tabla 6A). Si el copolı́mero L180.5 se añade a la fase acuosa interna, se producen emulsiones de agua en aceite altamente estables con 50%, 70% ó 90% de agua. Las emulsiones de agua en aceite forman a continuación una emulsión múltiple estable (lı́neas 10-12; Tabla 6). Esta emulsión se ensayó adicionalmente mediante almacenamiento con congelación a 4◦ C y se encontró que también era estable bajo estas condiciones. Otros agentes estabilizantes tales como estearato de aluminio eran menos eficaces por sı́ mismos pero producı́an emulsiones muy estables cuando se usaban en combinación con el copolı́mero L180.5 (lı́neas 22-24, 28-30 y 31-36; Tabla 6A). Se observaron resultados similares cuando la fase acuosa interna contenı́a fibroblastos de embrión de polluelo y sus medios de cultivo en una formulación se usaban para vacunas (lı́neas 37-72; Tabla 6B). Ejemplo 16 55 60 Varios agentes superficiactivos hidrófobos se añadieron a las fases acuosas internas de emulsiones de agua en aceite y múltiples de escualeno, aceite de cacahuete, aceite mineral y miristato de isopropilo. El copolı́mero L180.5 incrementaba marcadamente la estabilidad de las emulsiones tanto de agua en aceite como múltiples con cada uno de estos aceites (lı́neas 1-2, 13-14, 25-26 y 37-38; Tabla 7). El copolı́mero T1501 tenı́a un efecto similar pero menor (lı́neas 4, 16, 28 y 40; Tabla 7). El DDA, la lecitina de soja, el estearato de aluminio y la octadecilamina incrementaban todos la estabilidad de una o más de las emulsiones de agua en aceite cuando se añadı́an a la fase acuosa interna (Tabla 7). 15 ES 2 116 340 T3 Ejemplo 17 5 10 El efecto de proteı́na en la fase acuosa interna y la concentración de copolı́mero L180.5 se evaluaron en los estudios mostrados en la Tabla 8. El efecto máximo del copolı́mero L180.5 para estabilizar las emulsiones múltiples requerı́a una concentración de 5% o más (lı́neas 1-2, 11-12; Tabla 8). Sin embargo, se observó un efecto en la concentración más baja usada, 0,01% (lı́neas 9, 19; Tabla 8). La presencia de proteı́na en la fase acuosa interna no tenı́a influencia sobre los resultados. Estas preparaciones se ensayaron todas a temperatura ambiente y 4◦C con resultados similares. Se realizaron estudios adicionales para evaluar el papel de la concentración salina sobre la estabilidad de las emulsiones. Las emulsiones formadas con agua destilada en la fase acuosa externa eran menos estables que las formadas con solución salina en estado normal. De forma similar, una concentración de sal dos veces la de la solución salina fisiológica producı́a emulsiones con estabilidad inferior. Esto está de acuerdo con resultados previos de otros que demuestran que el tipo y la cantidad de concentración de sal es importante para determinar la estabilidad de emulsiones de agua en aceite y múltiples. 15 Ejemplo 18 20 25 30 35 40 45 50 55 60 L101 añadido en 5% v/v a la fase aceitosa de miristato de isopropilo no formaba una emulsión de agua en aceite al 80% con solución salina que contenı́a BSA (lı́nea 6; Tabla 5). Tampoco formaba una emulsión múltiple con solución salina que contenı́a P123 como la fase acuosa externa (lı́nea 6; Tabla 5). Esto se contrasta con el informe de Law y otros que prepararon emulsiones tanto de agua en aceite como w/o/w con estos materiales.56 Sin embargo, hay varias diferencias esenciales entre su trabajo y la presente invención. En primer lugar, Law y otros describieron solamente una emulsión de agua en aceite de 50% de aceite. La presente invención puede prepararse por encima de 70% con una variedad de aceites incluyendo miristato de isopropilo (lı́nea 3; Tabla 7). En segundo lugar, su emulsificación se llevó a cabo a 1200 más/menos 200 RPM en un agitador mecánico durante 30 minutos para formar una emulsión de agua en aceite. Las emulsificaciones de la presente invención se realizan tı́picamente en 5 minutos o menos usando jeringas unidas en la forma comúnmente usada para preparar emulsiones de adyuvantes inmunológicos.57,58,59 Esto demuestra la superioridad de la presente invención ya que las emulsiones de agua en aceite son mucho más fáciles de preparar. En tercer lugar, Law y otros enseñan que la adición de R R 80 al aceite de sus emulsiones provoca coalescencia intensiva. Span 80 tensioactivos tales como Span es un emulgente de fase aceitosa eficaz en muchos ejemplos de la presente invención con una variedad de aceites incluyendo miristato de isopropilo (lı́nea 37-38; Tabla 7). En cuarto lugar, Law y otros enseñan que la formación de emulsiones múltiples usando estos materiales requiere que la emulsión de agua en aceite se envejezca durante la noche antes de la preparación de la emulsión de w/o/w. Esto permite la interacción de la proteı́na y el copolı́mero L101. Su documento “Stabilization of w/o/w múltiple emulsions by interfacial complexation of macromolecules and noniorfle surfactants” identifica este fenómeno como necesario para la estabilidad de sus emulsiones. Law y otros identifican claramente el mantenimiento de la separación de los tensioactivos a través de la capa aceitosa como un factor importante en la estabilidad de emulsiones de w/o/w, pero la solución que ellos enseñan es bastante diferente de la presente invención. Las emulsiones de la presente invención se preparan bajo condiciones mucho más suaves, contienen proporciones superiores de agua, son más estables y no requieren perı́odo de espera después de la preparación de la emulsión de agua en aceite. Ejemplo 19 Las vacunas actuales para la infección por hepatitis B son seguras y eficaces pero requieren un mı́nimo de tres inyecciones durante un perı́odo de varios meses para alcanzar una concentración de anticuerpos protectores de 10 mIU/ml en la mayorı́a de las personas.61 Una emulsión múltiple se preparó y se ensayó como una vacuna para el antı́geno superficial del virus de la hepatitis B. La fase acuosa interna consistı́a en copolı́mero L180.5 (10 mg) mezclado con 130 µg de antı́geno superficial de hepatitis B derivado de plasma (HBsAg) en 0,1 ml de solución salina y se refrigeró para disolver el copolı́mero. La fase aceitosa R 80. Se preparó una emulsión consistı́a en 0,08 ml de una mezcla de 90% de escualeno y 10% de Span de agua en aceite poniendo la fase acuosa interna y las fases aceitosas en un tubo cónico de plástico de 1 ml y extrayendo la mezcla repetidamente a través de una aguja roma de calibre 18 hacia una jeringa de plástico de 1 ml. Se formaba una emulsión espesa de agua en aceite en menos de 30 segundos. Esta se convertı́a en una emulsión múltiple de agua en aceite mediante la adición de 0,22 ml de solución salina R P103 (poloxámero 404) como la fase acuosa externa. La mezcla se que contenı́a 0,25% de Pluronic extrajo a través de la aguja de calibre 18 para dispersar la- emulsión de agua en aceite en una emulsión múltiple. La emulsión múltiple resultante consistı́a en gotı́culas de emulsión de agua en aceite con un tamaño 16 ES 2 116 340 T3 medio de alrededor de 10 micras y gotas de agua internas demasiado pequeñas para ser discernidas con un microscopio óptico. Era estable a temperatura ambiente durante más de 4 meses. Preparaciones similares eran estables a través de cinco ciclos de congelación-descongelación. 5 10 15 20 25 30 La emulsión se inyectó subcutáneamente en los costados de ratones exogámicos OCR en un volumen R 80, 16 µg de antı́geno y 9,25 de 0,05 ml que contenı́a 1,23 mg de copolı́mero L180.5, 1,03 mg de Span mg de escualeno. Todos los ratones producı́an concentraciones mayores que 10 mIU/ml en 14 dı́as. A los 28 dı́as, la concentración media era 20,815 mIU/ml. U respuesta inflamatoria local era mı́nima. Ejemplo 20 Los Ejemplos 20 a 22 demuestran cómo una emulsión de agua en aceite de acuerdo con la presente invención puede usarse para suministrar un ingrediente activo como una sustancia terapéutica tópica. Una mujer blanca de 40 años de edad se trata con una emulsión de agua en aceite (75% de agua) usando R R L180.5 en la fase acuosa y escualeno + 10% de Span 80 como la fase aceitosa, con una Pluronic concentración final de 5% de sulfato de dermatán (Scientific Protein Labs, Waunakee, WS), para una quemadura por radiación severa en la cabeza. La paciente recibió 15 dosis de radiación cerebral total para un adenocarcinoma metastático o en el lóbulo temporal izquierdo del cerebro. La paciente perdió todo su cabello. Recibió una terapia convencional que consistı́a en tratamiento tópico de gel de aloe y lanolina para las quemaduras de la cabeza. Las quemaduras eran especialmente severas en la frente. La paciente sufrió dolor y picor severos. El cuero cabelludo de la paciente se cubrió con habones inflamados rojos. Detrás de la oreja del paciente, donde se dirigı́a al tumor una radiación de alta dosis, la piel estaba agrietada, roja, hinchada y muy seca. La emulsión de agua en aceite se aplicó a todo el cuero cabelludo y la frente. La paciente tenı́a inmediatamente un alivio del picor. Doce horas después del primer tratamiento, todas los habones inflamados rojos de su cabeza habı́an desaparecido completamente. La piel de la frente era suave y flexible. Usando la emulsión de agua en aceite la paciente estaba esencialmente libre de picor durante 12 horas. La paciente podı́a dormir sin medicación por primera vez en semanas. Ejemplo 21 35 40 50 ml de una emulsión de agua en aceite al 70 % que contenı́a 5 %de sulfato de dermatán se administra a un hombre blanco de 61 años de edad que ha sufrido dermatitis de “contacto” severa durante más de 5 años. El problema más severo del paciente es con las manos y especialmente durante el tiempo frı́o. Entre los dedos del paciente, la piel se agrieta y sangra y toda su mano tiene una apariencia escaldada escamosa. Las manos del paciente le pican hasta el punto de que durante el sueño se rasca hasta que sangran. El paciente se aplicó la emulsión de w/o dos veces al dı́a, por la mañana y por la noche. En unas pocas horas después del primer tratamiento el dolor y el picor se aliviaron. Después de que el paciente usara la emulsión durante una semana, la piel era flexible y tenı́a una apariencia de piel normal. Ejemplo 22 45 50 Una mujer blanca de 30 afios de edad fue tratada de una quemadura solar severa que cubrı́a toda su espalda. La paciente habı́a expuesto su espalda al sol durante aproximadamente 7 horas con una protección solar mı́nima. Al dı́a siguiente, el dolor era tan severo que la paciente sentı́a náuseas. La paciente fue tratada 48 horas después de recibir la quemadura solar con la misma emulsión de agua en aceite usada en él Ejemplo 23. En aproximadamente 30 minutos, el dolor y el picor se aliviaban. La preparación se aplicó dos veces al dı́a. 24 horas después de la primera aplicación toda la rojez y la inflamación se habı́an ido. Usó la preparación durante 3 dı́as más y la piel se curó completamente. Ejemplo 23 55 60 Se preparó una emulsión múltiple de agua en aceite en agua que consistı́a en 50% v/v de una fase acuosa externa de solución salina con 0,25% de copolı́mero P123. El otro 50% v/v era una fase de agua R 80 y 32 mg en aceite dispersada que consistı́a en 72% de solución salina, 18% de escualeno, 2% de Span de copolı́mero L310 y 0,5 mg de TNP-HEA por 0,5 ml de emulsión. La emulsión se administró a ratones exogámicos OCR oralmente en una dosis de 0,5 ml/ratón. La emulsión múltiple fue examinada bajo un microscopio de 200 aumentos. La apariencia microscópica de la emulsión era partı́culas de 1,0 a 20 µ de diámetro de emulsión de agua en aceite. El ileón distal abierto transiluminado de un ratón, 6 horas 17 ES 2 116 340 T3 5 10 15 20 después de la administración gástrica de la emulsión, mostraba partı́culas de emulsión asociadas con la cúpula de una Placa de Peyers (P). Debido a que el antı́geno proteı́nico está suspendido en solución salina en la emulsión, este experimento sugiere que las emulsiones de agua en aceite son capaces de suministrar antı́geno, natural a tejido linfoideo asociado con el intestino. Esta emulsión era muy visible y consistı́a en partı́culas de agua en aceite intactas microscópicamente. Una muestra de contenido fecal se retiró a las 6 horas después de la administración oral, se examinó mediante análisis de Ouchterlony y se encontró que contenı́a TNP-HEA antigénicamente intacto. Los niveles de IgA secretora se midieron después de la inmunización oral de un antı́geno en una emulsión de agua en aceite. La emulsión de agua en aceite (0,5 ml) con TNP-HEA en la fase acuosa interna se infundió intragástricamente en grupos de 6 ratones OCR exogámicos los dı́as 0, 14 y 34. Otros grupos recibieron emulsiones idénticas que contenı́an 100 µg de RaLPS destoxificado, Saponina o Sı́lice como adyuvantes. Las concentraciones de anticuerpos IgG e IgA en circulación se midieron después de la inmunización oral. Las muestras de suero se recogieron simultáneamente con el fluido intestinal de los ratones. Los resultados se muestran en las Figs. 2 y 3. En la mayorı́a de los casos, la administración del antı́geno TNP-HEA con emulsión sola daba las concentraciones más altas tanto en el fluido intestinal como en el suero. Cuando el TNP-HEA se administra oralmente en solución salina, no hay respuesta inmunitaria en el intestino o en el suero. Debe entenderse, por supuesto, que lo precedente se refiere solamente a modalidades preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosas modificaciones o alteraciones allı́ sin apartarse del alcance de la invención según se indica en las reivindicaciones adjuntas. 1 Becher P. Macroemulsions. Nonionic Surfactants Physical Chemistry, Edited by Martin J. Shick. Marcel Decker, 1987, pp 435-492 2 Becher, P. Medical and Pharmaceutical Applations of Emulsions. Chapter 3 of Encyclopedia of Emulsion Technology, volumen 2. Marcel Dekker, NY. 1985, ISBN 0-8247-1877-1 (v.2) en la página 160 3 Myers D. Surfaces, Interfaces and Colloids. VCH Publishers, Inc. 1990, en la página 232 4 Myers, D. Anteriormente en la página 232 5 Myers, D. Anteriormente en la página 222 6 Schulman JH y Cockbain EG. Molecular interactions a oil/water interfaces. Part I. Molecular complex formation and the stability of oil in water emulsions.Trans. Faraday Soc., 36:651-661, 661-668, 1940. 7 Marszall L. HLB of nonionic surfactans: PIT and EIP methods. Nonionic Surfactants Physical Chemistry. Editado por Martin J. Schick. Marcel Decker, 1987, pp 493-548. 8 Becher P. Macroemulsions. Nonionic Surfactants Physical Chemistry. Editado por Martin J. Schick. Marcel Decker, 1987, pp 435-492, en la página 440 9 Becher P. Anteriormente en la página 443 10 Becher P. Anteriormente en la página 441 11 Becher P. Anteriormente en la página 441 12 Becher P. Anteriormente en la página 440 13 Schulman JH y otros. Molecular interactions at oil/water interfaces. Part I. Molecular complex formation and the stability of oil in water emulsions.Trans. Faraday Soc., 36:651-661, 661-668, 1940. 14 Matsumoto S. W/O/W-type múltiple emulsions. Nonionic Surfactants Physical Chemistry. Editado por Martin J. Schick. Marcel Decker, 1987, pp 549-600, en la página 535. 15 Matsumoto S., Anteriormente en la página 569 16 Becher P. Anteriormente en la página 462 17 Myers D. Surfaces, Interfaces and Colloids. VCH Publishers, Inc. 1990 25 30 35 40 45 50 55 60 18 ES 2 116 340 T3 5 10 15 20 25 30 18 Guthauser B. Stable water-in-oil emulsions. Patente de Estados Unidos N◦ 4.384.974. 24 de Mayo de 1983. 19 Guthouser, Patente de EE.UU. N◦ 4.384.974 20 Becher P., Anteriormente en la página 476 21 Myers D., Anteriormente en 22 Schulman JH y otros Anteriormente 23 Florence AT and Whitehill D. Múltiple w/o/w emulsions stabilized with poloxamer and acrylamide gels.J. Pharm. Pharmacol 32:64P, 1980 24 Guthouser, Patente de EE.UU. N◦ 4.384.974 25 Guthouser, Patente de EE.UU. N◦ 4.384.974 26 Matsumoto S. Anteriormente 27 Matsumoto, S., Anteriormente 28 Florence AT y otros. The formulation and stability of múltiple emulsions. International Journal of Pharmaceutics, 11:277-308, 1982 29 Matsumoto S., Anteriormente, en la página 555 30 Matsumoto S., Anteriormente 31 Matsumoto S., Anteriormente, en la página 555 32 Matsumoto S., Anteriormente, en la página 563 33 Matsumoto S., Anteriormente, en la página 593 34 Law TK y otros. Release from múltiple w/o/w emulsions stabilized by interfacial complexation. J. Pharm. Pharmacol. 36: 50P, 1984 35 Law TK y otros. Stabilization of w/o/w múltiple emulsions by interfacial complexation of macromolecules and nonionic surfactants. J. of Controlled Release 3:279-290, 1986 36 Florence AT y otros, Anteriormente 37 Law TK y otros, J. of Controlled Release, Anteriormente 38 Law TK y otros, J. of Controlled Release, Anteriormente 39 Myers D., Anteriormente en la página 40 Matsumoto S., Anteriormente 41 Florence AT and Whitehill D. Some features of breakdown in water-in-oil-in-water múltiple emulsions. J. of Colloid and Interrface Science, 79:243-256, 1981 42 42 Matsumoto S., Anteriormente, en la página 573 43 Herbert WJ Multiple emulsion adjuvants. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:89-92, 1967. 44 Henry, R. L. y otros, “Burn Wound Coverings and the Use of Poloxamer Preparations”, CRITICAL REVIEWS IN BIOCOMPATIBILITY, Vol. 5, N◦ 3, pp. 206-220 (1989). 45 Hilleman MR, Woodhour A, Friedman A, Weibel RE and Stokes J. The clinical application of adjuvant 65. Annals of Allergy, 30:1.52-158, 1972 46 Hilleman MR. Considerations for safety and application of emulsified oil adjuvants to viral vaccines. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:12-26, 1967 47 Lin T y Lin S. Encapsulation and prolonged release behavior of w/o/w type múltiple emulsions. J. of the Chinese Chemical Society, 35:463-470. 1988 35 40 45 50 55 60 19 ES 2 116 340 T3 48 Stone HD, Brugh M y Beard CW. Influence of formulation on the efficacy of experimental oilemulsion newcastle disease vaccines. Avian Diseases, 27: 688-697, 1983 49 Herbert WJ. Some investigations into the mode of action of the water-in mineral-oil emulsion antigen adjuvants. International Symposium. on Adjuvants- of Immunity., 6:213-230, 1967 50 Hoft LB. Oily adjuvants. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:131-136, 1967 51 Herbert WJ. Some observations of practical interest in the use of water-in mineral-oil emulsion antigen adjuvant. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:251-256, 1967 52 Hilleman MR, Woodhour A, Friedman A, Weibel RE y Stokes J. The clinical application of adjuvant 65. Annals of Allergy, 30-152-158, 1972 53 Woodhour AF, Metzgar DP, Stim. TB, Tytell AA y Hilleman MR. New metabolizable immunologie adjuvant for human use. I. Development and animal immune response. New Adjuvant Development, PSAM 116:516-523, 1964 54 Hilleman MR. Considerations for safety and application of emulsified oil adjuvants to viral vaccines. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:13-26, 1967 55 Florence AT y Whitehill D. Some features of breakdown in water-in-oil-in-water múltiple emulsions. J. of Colloid and Interface Science, 79:243-256, 1981 56 Law TK, Whateley TL y Florence AT. Stabilization of w/o/w múltiple emulsions by interfacial complexation of macromolecules and nonionic surfactants. J. of Controlled Release 3:279-290, 1986 57 Herbert WJ. Some investigations into the mode of action of the water-in-mineral-oil emulsion antigen adjuvants. International Symposium. on Adjuvants of Immunity. 6:213-230, 1967 58 Holt LB. Oily adjuvants. International Symposium on Adjuvants of Immunity 6:131-136, 1967 59 Herbert WJ. Some observations of practical interest in the use of water-in mineral-oil emulsion antigen adjuvants. International Symposium on Adjuvants of Immunity. 6:251-256, 1967 60 Law TK, Whateley TL y Florence AT. Stabilization of w/o/w múltiple emulsions by interfacial complexation of macromolecules and nonionic surfactants. J. of Controlled Release 3:279-290, 1986 61 Francis DP, Hadler SC, Thompson SE y otros. Ann Intem Med 1982; 97:362-66 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20 ES 2 116 340 T3 TABLA 1 5 10 15 20 25 30 35 40 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio% de Estabili- Tensioactivo % de Vol. w/o w/o/w N◦ zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 4 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualono escualeno 1 1 1 1 L121/S80 L121/S80 L121/S80 L121/S80 4/10 8/10 12/10 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 3 0 0 0 nr nr nr nr 5 6 7 8 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 4/10 8/10 12/10 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 3 3 3 0 nr nr nr nr 9 10 11 12 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L180.5/S80 4/10 L180.5/S80 8/10 L180.5/S80 12/10 L180.5/S80 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 3 0 0 0 nr nr nr nr 13 14 15 16 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 9 9 9 9 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L121/S80 L121/S80 L121/S80 L121/S80 4/10 8/10 12/10 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 0 0 0 0 nr nr nr nr 17 18 19 20 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 9 9 9 9 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 4/10 8/10 12/10 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 3 3 3 0 nr nr nr nr 21 22 23 24 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 9 9 9 9 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L180.5/S80 4/10 L180.5/S80 8/10 L180.5/S80 12/10 L180.5/S80 20/10 ninguno ninguno ninguno ninguno nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr nr 3 3 3 0 nr nr nr nr 25 26 ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 1 1 escualeno escualeno 1 1 S80 S80 10 20 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 6 6 3 3 0 0 27 ninguno - BSA-3 1 escualeno 1 L141/S80 20/20 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 6 3 3 28 29 ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 1 1 escualeno escualeno 1 1 L141/S80 L141/S80 12/10 20/10 Al St-1 Al St-1 Tween80/F68 0,5/0,5 Tween80/F68 0,5/0,5 6 6 3 3 3 3 30 31 ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 1 1 escualeno escualono 1 1 L141/S80 L141/S80 12/10 20/10 Al St-4 Al St-4 Tween80/F68 0,5/0,5 Tween80/F68 0,5/0,5 6 6 3 3 3 3 32 33 L141 L180.5 20% BSA-3 20% BSA-3 1 1 escualeno escualeno 1 1 S80 S80 10 10 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 6 6 3 3 3 3 34 35 L141 L180.5 20% BSA-3 20% BSA-3 1 1 escualeno escualeno 1 1 S80 S80 20 20 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 ninguno Tween80/F68 0,5/0,5 6 6 3 3 3 3 45 50 55 60 21 ES 2 116 340 T3 TABLA 2 5 10 15 20 25 30 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio% de Estabili- Tensioactivo % de Vol. w/o w/o/w N◦ zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 4 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 4/10 4/10 4/10 4/10 sil-10 sil-10 sil-10 gil-10 Tween80 Tween80 Tween80 Tween80 1 0,5 0,25 0,1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 2 3 3 5 6 7 8 9 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 4/10 4/10 4/10 4/10 4/10 sil-10 sil-10 sil-10 sil-10 gil-10 F68 F68 F68 F68 F68 2 1 0,5 0,25 0,1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 10 11 ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 1 1 escualeno escualeno 1 1 L141/S80 L141/S80 4/10 4/10 sil-10 sil-10 Tween80/F68 0,5/0,5 Tween80/F68 0,25/0,25 2 2 3 3 2 3 12 13 14 15 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 5/10 5/20 5/30 5/40 - Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 6 6 6 6 3 3 3 3 2 2 3 2 16 17 18 19 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L141/S80 L141/S80 L141/S80 L141/S80 10/10 10/20 10/30 10/40 - Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 Tveen80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 6 6 6 6 3 3 3 3 0 0 0 0 20 21 22 23 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L180.5/S80 L180.5/S80 L180.5/S80 L180.5/S80 5/10 5/20 5/30 5/40 - Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 6 6 6 6 3 3 3 3 3 3 1 1 24 25 26 27 ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 1 1 1 1 escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 L180.5/S80 L180.5/S80 L180.5/S80 L180.5/S80 10/10 10/20 10/30 10/40 - Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 6 6 6 6 3 3 3 3 3 3 2 0 35 40 45 50 55 60 22 ES 2 116 340 T3 TABLA 3 5 10 15 20 25 30 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w N◦ zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 5 5 5 3 3 3 4 4 4 4 5 6 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 5 5 5 3 3 3 0 0 0 7 8 9 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 5 5 5 3 3 3 4 4 4 10 11 12 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 5 5 5 3 3 3 0 0 0 13 14 15 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 20 20 20 3 3 3 3 3 3 16 17 18 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 Tween80/F68 Tween80/F68 0,5/0,5 0,5/0,5 0,5/0,5 20 20 20 3 3 3 0 0 0 19 20 21 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 20 20 20 3 3 3 3 3 3 22 23 24 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 4 4 4 escualeno escualeno escualeno 1 1 1 S80 S80 S80 10 20 30 ninguno ninguno ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 Tween80/F68 0,25/0,25 20 20 20 3 3 3 0 0 0 35 40 45 50 55 60 23 ES 2 116 340 T3 TABLA 4 5 10 15 20 25 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ← −−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite − −−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←− Fase Acuosa Interna −→ ←−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−→ ←−−−−− Fase Acuosa Externa −−−−−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w ◦ N zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensio- zante TensioAcuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 4 5 6 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 DSA-3 BSA-3 BSA-3 4 4 4 4 4 4 escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno - ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,5 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,25 ninguno Tween80/P123 0,25/0,25 ninguno F68 0,25 ninguno P123 0,25 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 nr nr nr nr nr nr 7 8 9 10 11 12 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno - BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 4 4 4 4 4 4 encualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,5 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,25 ninguno Tween80/P123 0,25/0,25 ninguno F68 0,25 ninguno P123 0,25 20 20 20 20 20 20 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 0 13 14 15 16 17 18 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 4 4 4 4 4 4 escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno - ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,5 ninguno Tween80/F68/PI23 0,25/0,25/0,25 ninguno Tween80/P123 0,25/0,25 ninguno F68 0,25 ninguno P123 0,25 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 nr nr nr nr nr nr 19 20 21 22 23 24 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 4 4 4 4 4 4 escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 ninguno Tween80/F68 0,25/0,25 ninguno Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,5 ninguna Tween80/F68/P123 0,25/0,25/0,25 ninguno Tween80/P123 0,25/0,25 ninguno F68 0,25 ninguno P123 0,25 20 20 20 20 20 20 4 4 4 4 4 4 3 3 3 3 2 4 30 35 40 45 50 55 60 24 ES 2 116 340 T3 TABLA 5 5 10 15 20 25 30 35 40 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w ◦ N zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 4 5 6 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2c 2 3 1 0 2 7 8 9 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 10 11 12 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 3 3 3 3 3 13 14 15 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w 0 0 nr nr nr 16 17 18 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w 0 0 nr nr nr 19 20 21 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2c o/w 0 1 nr nr 22 23 24 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 4 4 3 3 3 25 26 27 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 28 29 30 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 4c 4 3 4 4 31 32 33 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 2 2 1 1 0 34 35 36 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 1 2 1 1 1 45 50 55 60 25 ES 2 116 340 T3 TABLA 6A 5 10 15 20 25 30 35 40 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w ◦ N zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 4 5 6 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2c 2 3 1 0 2 7 8 9 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 10 11 12 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 3 3 3 3 3 13 14 15 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w 0 0 nr nr nr 16 17 18 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w 0 0 nr nr nr 19 20 21 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2c o/w 0 1 nr nr 22 23 24 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 4 4 3 3 3 25 26 27 L141 L141 L141 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 28 29 30 L180.5 L180.5 L180.5 10% BSA-10 10% BSA-10 10% BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 4c 4 3 4 4 31 32 33 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 2 2 1 1 0 34 35 36 - - BSA-10 BSA-10 BSA-10 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 1 2 1 1 1 45 50 55 60 26 ES 2 116 340 T3 TABLA 6B 5 10 15 20 25 30 35 40 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru- ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w ◦ N zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 37 38 39 L141 L141 L141 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 o/w nr nr nr nr 40 41 42 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 2 1 2 2 1 43 44 45 L141 L141 L141 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 0 0 0 nr nr nr 46 47 48 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 3 3 3 3 2 49 50 51 - - CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50 Sil-50 Sil-50 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w nr nr nr nr nr 52 53 54 - - CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w nr nr nr nr nr 55 56 57 L141 L141 L141 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 lo 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 1 o/w nr 0 nr nr 58 59 60 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 3 4 3 3 3 61 62 63 L141 L141 L141 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 2 o/w nr 1 nr nr 64 65 66 L180.5 L180.5 L180.5 10% 10% 10% CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 3c 4c 4 3 3 4 67 68 69 - - CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 Sil-50/AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w nr nr nr nr nr 70 71 72 - - CEF CEF CEF 1 2,33 9 a. de cacahuete a. de cacahuete a. de cacahuete 1 1 1 S80 S80 S80 10 10 10 AlSt-4 AlSt-4 AlSt-4 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 2 3,33 10 o/w nr nr nr nr nr 45 50 55 60 27 ES 2 116 340 T3 TABLA 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Grupo N◦ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados EstabiliConc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de Estabili- Tensioactivo % de Vol. w/o w/o/w zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensio- zante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ninguno L180.5 31R1 T1501 T150R1 Span 65 lec huevo lec soja DDA Al St Octadecil Acido Palmi 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 ninguno L180.5 31R1 T1501 T150R1 Span 65 lec huevo lec soja DDA Al St Octadecil Acido Palmi 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 ninguno L180.5 31R1 T1501 T150R1 Span 65 lec huevo lec soja DDA Al St Octadecil Acido Palmi 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 ninguno L180.5 31R1 T1501 T150R1 Span 65 lec huevo lec soja DDA Al St Octadacil Acido Palmi 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 BSA-10 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 2,33 a. a. a. a. a. a. a. a. a. a. a. a. escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguna ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3 3c 0 3 0 4 0 3 4 4 4 nr 0 3 nr 2 nr 0 nr 0 w/o 0 0 nr de de de de de de de de de de de de 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 eso S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P223 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 0 3 0 3 nr 0 3 3 4 0 o/w nr 0 3 nr 0 nr nr 0 0 w/o nr nr nr 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 0 3 0 3 0 0 0 2 4 0 1 nr 0 3 nr 1 nr nr nr 0 w/o nr 0 nr 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 3,33 2 3 0 2 0 0 0 2 3 0 1 nr 0 3 nr 1 nr nr nr 0 w/o nr 0 nr cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete cacahuete drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR drakeol6VR miris miris miris miris miris miris miris miris miris miris miris miris iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso iso 50 55 60 28 ES 2 116 340 T3 TABLA 8 5 10 15 20 ←−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones Múltiples (w-o-w) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−→ ←−−−−−−−−−−−−−−−−−− Emulsiones de Agua en Aceite −−−−−−−−−−−−−−−−−−→ Gru←−− Fase Acuosa Interna −−→ ←−−−−−−−−−−− Fase aceitosa −−−−−−−−−−−→ ←−− Fase Acuosa Externa −−→ Resultados po Estabili- Conc. Sust. Vol. Tipo de Vol. Tensio- % de EstabiliTensioactivo % de Vol. w/o w/o/w ◦ N zante Activa Acuoso Aceite de activo Tensiozante Tensio- Acuoso Aceite activo activo Ext. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L180.5 10,00% L180.5 5,00% L180.5 2,50% L180.5 1,25% L180.5 0,50% L180.5 0,25% L180.5 0,10% L180.5 0,05% L180.5 0,01% L180.5 0,00% BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 BSA-3 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 L180.5 10,00% sol. salina L180.5 5,00% sol. salina L180.5 2,50% sol. salina L180.5 1,25% sol. salina L180.5 0,50% sol. salina L180.5 0,25% sol. salina L180.5 0,10% col. salina L180.5 0,05% sol. salina L180.5 0,01% sol. salina L180.5 0,00% sol. salina 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 escualeno escualeno escualeno escualeno encualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 2 2 1 1 1 0,5 0 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno escualeno 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 S80 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 P123 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 2 2 1 1 1 0,5 0 25 30 35 40 45 50 55 60 29 ES 2 116 340 T3 REIVINDICACIONES 5 1. Una emulsión estable de agua en aceite, que contiene una fase acuosa dispersada dentro de una fase aceitosa continua, teniendo la fase acuosa una cantidad eficaz de un primer tensioactivo con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2 y teniendo la fase aceitosa continua un segundo tensioactivo. 2. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente fórmula: 10 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) está entre aproximadamente 3000 y 15000, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) está entre aproximadamente 2% y 15% en peso. 15 3. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente fórmula: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 20 25 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 10000, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 4% en peso. 4. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente formula: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 30 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 5200, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 0) es aproximadamente 5% en peso. 5. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el aceite se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal, aceite animal y aceite mineral. 35 6. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el aceite vegetal es aceite de cacahuete. 7. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el aceite mineral se selecciona del grupo que consiste en aceite mineral ligero, miristato de isopropilo y polioxipropileno. 40 45 50 8. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el aceite animal se selecciona del grupo que consiste en escualeno y escualano. 9. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el segundo tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en poloxámero 331, poloxámero 461, poloxámero 520.5, monooleato de sorbitán, triestearato de sorbitán, y una mezcla de tensioactivos no iónicos de mono- y diglicéridos. 10. Una emulsión múltiple estable de agua en aceite en agua, que contiene una fase acuosa interna dispersada dentro de una fase aceitosa que está en una fase acuosa externa continua, teniendo la fase acuosa interna una cantidad eficaz de un primer tensioactivo con un equilibrio hidrófilo-lipófilo de menos de aproximadamente 2 y teniendo la fase aceitosa un segundo tensioactivo. 11. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la fase acuosa externa contiene un tercer tensioactivo. 55 60 12. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el tercer tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en poloxámero 403, monooleato de polioxietilensorbitán, poloxámero 188 o mezclas de los mismos. 13. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el tercer tensioactivo es poloxámero 403. 14. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente fórmula: 30 ES 2 116 340 T3 HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) está entre aproximadamente 3000 y 15000, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) está entre aproximadamente 2% y 15% en peso. 5 15. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente fórmula: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 10 15 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 10000, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 4% en peso. 16. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el primer tensioactivo tiene la siguiente fórmula: HO(C2 H4 O)b (C3 H6 O)a (C2 H4 O)b H 20 en la que el peso molecular medio del hidrófobo (C3 H6 O) es aproximadamente 5200, y el porcentaje de hidrófilo (C2 H4 O) es aproximadamente 5% en peso. 17. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el aceite se selecciona del grupo que consiste en aceite vegetal, aceite animal y aceite mineral. 25 18. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el aceite vegetal es aceite de cacahuete. 19. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el aceite mineral se selecciona del grupo que consiste en aceite mineral ligero, miristato de isopropilo y polioxipropileno. 30 35 20. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el aceite animal se selecciona del grupo que consiste en escualeno y escualano. 21. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el segundo tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en poloxámero 331, poloxámero 461, poloxámero 520.5, monooleato de sorbitán, triestearato de sorbitán, y una mezcla de tensioactivos no iónicos de mono- y diglicéridos. 40 45 50 55 60 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada reserva. 31 ES 2 116 340 T3 32 ES 2 116 340 T3 33

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