Minicongreso de Fisiología 2004 28-29 Abril de 2004 Presentación de los paneles por los alumnos de Laboratorio Avanzado de Fisiología Edificio de Biológicas 1 SESIÓN ÚNICA DE PRESENTACIÓN DE PANELES: 29 de Abril de 2004 9:30 a 18:30 Panel 1. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA DE DOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID: Olga Bodegón Fernández, Belén Espigares López y Rosana Leiva Panel 2. ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA CAM EN FUNCIÓN DE LAS COMUNIDADES FITOPLANCTÓNICAS: Patricia Prieto Chinchilla, Susana García Fernández y Rubén López Vila Panel 3. EVOLUCIÓN ESPACIO-TEMPORAL DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID: María Calvente, Blanca Esteban y Vanesa Fernández Panel 4. INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE ANABAENA SP. PCC7120: Ana Navarro, Enma Barahona y Margarita Murillo Panel 5. LAS FICOBILIPROTEINAS EN LA FOTOSINTESIS DE LAS CIANOBACTERIAS: Papel DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC 7120: Ana Peropadre López, Laura Saiz Aúz y Cristina Herranz Sánchez Panel 6. EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO: Marta Sancelestino Garchenilla, Mª Mar Rodríguez Pozo y Tamara Hernández del Prado Panel 7. EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE N2: Iñaki Arroyos Solaguren, Carlos Pineda Vadillo y Gonzalo del Monte Nieto Panel 8. EL ESTRES SALINO DISMINUYE LA FIJACIÓN DEL N2 EN LA SIMBIOSIS EN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM-PISUM SATIVUM: José Antonio Romero Carnerero, Álvaro Sebastián Serrano y Patricia Alcalde Alonso Panel 9. MÓDULO DE CULTIVO in vitro (SIN RESUMEN): Rocío García Prieto, Kilian Gutiérrez Viñas y Álvaro Peña Panel 10. CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS DE CLAVEL: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO DE FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS: Jesús García López, Eva Díaz Guerra y Carolina L. Arias Gómez Panel 11. RESPUESTA AL ESTRÉS SALINO EN PLANTAS DE TOMATE: Carmen López Barba y Mercedes Herrera Torres Panel 12. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS DE TOMATE: Ana Ramos Franco, Cristina Barrera y Sara Moreno Rivera Panel 13. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS DE TOMATE: SALINIDAD, ESTRÉS OXIDATIVO Y ENZIMAS 2 ANTIOXIDANTES: Alicia Hernández Vivanco, Ismael Roldán Hernando y Ana Ayuso Arroyo Panel 14. ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO LOCOMOTOR EN DROSOPHILA MELANOGASTER: Alicia Gonzalo Gómez, Iván Chacón Triguero y Marta García García Panel 15. ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO EN Drosophila melanogaster: PARÁLISIS Y OLFACIÓN.: Víctor López, David López y Jacobo Pastor Panel 16. UNIÓN NEUROMUSCULAR LARVARIA (NMJ): VISUALIZACIÓN DE LA ENDOCITOSIS DE VESÍCULAS SINÁPTICAS EN NMJ DE Drosophila UTILIZANDO FM4-64: Aurora Vázquez Vázquez, Mayte San José Martín y Raquel Martín Carretero Panel 17. EL SISTEMA GAL4/UAS COMO HERRAMIENTA DEL ESTUDIO DE LA ANATOMÍA DE LARVAS DE Drosophila melanogaster: Noelia Alonso González, Teresa Poderoso y Juan Luque Buzo Panel 18. UTILIDADES DEL SISTEMA GAL4/UAS PARA LA VISUALIZACION DE DISTINTAS ESTRUCTURAS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE DROSOPHILA EN ESTADO ADULTO: Francisco Javier Moreno Martínez, Ithaisa Sologoren Marrero y María Malalana Leiva Panel 19. ESTUDIO DEL SITEMA NERVIOSO EN INDIVIDUOS ADULTOS DE Drosophila melanogaster MEDIANTE EL USO DEL SISTEMA GAL4/UAS: Eduardo Sanz Martiner, Arántzazu Cabezón Sánchez y Nieves Zamora Panel 20. LA UNIÓN NEUROMUSCULAR LARVARIA EN DROSOPHILA: VISUALIZACIÓN DEL PROCESO DE ENDOCITOSIS: María Victoria Tejada Calvo, Mónica Martínez y Alicia Zamarrón Moreno 3 Panel 1. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA DE DOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID: Olga Bodegón Fernández, Belén Espigares López y Rosana Leiva La producción primaria de un embalse es entrada de carbono orgánico en el ecosistema acuático, siendo la entrada más importante de materia y energía útil. Nuestro estudio consiste en la determinación de producción primaria del fitoplancton, comparando la entrada de carbono por metro cuadrado de superficie en un día, en el embalse de Santillana (eutrófico, de gran cantidad de nutrientes) y Atazar (oligotrófico, con pocos nutrientes), de distintas características geográficas, de profundidad, irradiancia diaria. El carbono asimilado, junto con la irradiancia, dará lugar a curvas PvsI que utilizamos como herramienta para conocer la fotosíntesis realizada en la columna de agua. En ésta, la intensidad de luz que incide disminuye con la profundidad y varía según las horas del día. A partir de los datos de los grupos de alumnos, hemos llevado a cabo unos cálculos más exhaustivos. Esta nueva perspectiva nos mostrará a todos si las interpretaciones iniciales de los parámetros obtenidos de las curvas, son o no fiables. ¡Toda la verdad, en nuestro poster del día 29! Guión de la prácica: producción primaria en ecosistemas acuáticos. 4 Panel 2. ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA FITOPLANCTÓNICAS CAM EN FUNCIÓN DE LAS COMUNIDADES Patricia Prieto Chinchilla, Susana García Fernández y Rubén López Vila Los embalses en los que centramos nuestro estudio: Atazar y Santillana, son ecosistemas acuáticos continentales donde las comunidades fitoplanctónicas poseen un papel protagonista en la producción primaria. Las propiedades fotosintéticas de estos sistemas, dependen de las características tróficas de la columna de agua, de los tipos de comunidades fitoplanctónicas dominantes y del entorno climático y geográfico en el que se encuentran. El objetivo del presente trabajo es comparar las características fotosintéticas de estos dos embalses, que presumiblemente poseen distinto estado trófico. El embalse del Atazar es mesotrófico, de gran tamaño y profundidad, y bajo grado de contaminación. En cambio, el embalse de Santillana posee las características opuestas. La confección de las curvas PvI nos permite obtener los parámetros fotosintéticos ; afinidad de los fotosistemas por la luz; ; pendiente de fotoinhibición; Ps: fotosíntesis máxima. Como complemento a esta información, se analiza la composición de las comunidades fitoplanctónicas, se cuantifica la biomasa y la cantidad de nutrientes disponibles. ¿Realmente existen diferencias en las características fotosintéticas de dichos embalses? Los resultados y discusión se exponen en el panel. 5 Panel 3. EVOLUCIÓN ESPACIO-TEMPORAL DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID María Calvente, Blanca Esteban y Vanesa Fernández Compararemos los parámetros fotosintéticos de las comunidades de fitoplancton de dos embalses con distinto estado trófico, que son Santillana y Atazar, estudiando su evolución en el transcurso de tres semanas. Para ello realizamos una salida de campo a cada uno de los embalses, teniendo en cuenta que Santillana es un embalse eutrófico, es decir, con gran cantidad de biomasa debido a la contaminación por fertilizantes de origen ganadero y en la que los representantes mayoritarios del fitoplancton son algas verdes que tienen una eficiencia fotosintética baja, porque necesitan más fotones para alcanzar su fotosíntesis máxima, que toma valores altos; y Atazar, es oligotrófico, lo que conlleva una escasez de nutrientes y apenas presenta contaminación; en su comunidad fitoplanctónica predominan las cianobacterias, que tienen una alta eficiencia fotosintética, por lo que tardan poco en llegar a su fotosíntesis máxima, que tiene valores bajos. El estudio se basa en la evolución de la fotosíntesis máxima, la eficiencia fotosintética () y en la fotoinhibición (), que son los parámetros que comparamos y que nos llevan a los siguientes resultados: En cuanto a la fotosíntesis máxima, Atazar no presenta diferencias significativas a lo largo de las tres semanas, debido al gran volumen de agua y profundidad del embalse, que dificulta la mezcla de nutrientes, por lo que las características físico-químicas permanecen más o menos constantes. Por el contrario, en Santillana se produce una disminución de esta tasa, como consecuencia de que se ha producido mezcla y se pierde biomasa. Con respecto a la fotoinhibición, en Atazar se produce un incremento de ésta, debido a que la irradiancia (fotones recibidos), aumenta provocando un daño en los fotosistemas de las comunidades fitoplanctónicas; en Santillana también aumenta porque la mezcla hace que desciendan los organismos de las capas superficiales por lo que pierden intensidad y el fitoplancton que asciende se satura a gran velocidad al no estar habituado. Por último, la eficiencia fotosintética en Atazar, se mantiene más o menos constante en las dos primeras semanas, descendiendo bruscamente en la última por la bajada de las temperaturas y el aumento de la inestabilidad climática, que contribuye al incremento de las turbulencias en las capas superficiales de agua que perjudica la captación de la luz por parte de las comunidad algales. En Santillana también disminuye por un aumento de la competencia intra- e inter-específica teniendo, como consecuencia, una disminución de la biomasa y por tanto menores valores de , esto puede estar agravado por unas condiciones meteorológicas adversas. 6 Panel 4. INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE Anabaena SP. PCC7120 Ana Navarro, Enma Barahona y Margarita Murillo Con este estudio intentamos reflejar la existencia de una interconexión entre procesos bioenergéticos esenciales en las cianobacterias: fotosíntesis oxigénica y respiración. El organismo con el que hemos trabajado es una cianobacteria filamentosa, Anabaena sp. PCC7120, un procariota, gram negativo, aerobio y fotosintético. Concretamente en este ensayo utilizamos un mutante, PHB11, originado por inserción del transposón Tn5 que se ha introducido en un gen que codifica para una subunidad de un posible complejo relacionado con la NADHdeshidrogenasa,el cual es el complejo I de la cadena de transporte electrónico respiratoria. Gracias al empleo de un electrodo de oxígeno tipo Clark conseguimos medir la actividad fotosintética y respiratoria, además de la de los fotosistemas I y I, tanto de la cepa silvestre como de la mutante. Con estos procedimientos hemos logrado cuantificar una inhibición significativa de la fotosíntesis y la respiración en el PHB11. A la vez, hemos realizado otros ensayos como la medida de los espectros de absorción in vivo y la extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos con el objetivo de observar posibles efectos de la mutación. Con los resultados de estos experimentos podido comprobar una relación clara entre la inhibición de la respiración y la mutación del PHB11, ya que hay un funcionamiento anómalo de la cadena respiratoria de transporte electrónico. Pero, ¿a qué se debe el notable descenso de la actividad fotosintética del mutante PHB11 con respecto a la cepa silvestre? Probablemente, la respuesta esté en la interconexión que se ha descrito en cianobacterias entre la cadena de transporte electrónico fotosintética y respiratoria que comparten componentes en el tilacoide; donde además se ha encontrado actividad NADH-deshidrogenasa. Quizá el complejo al que pertenecen la proteína mutada de PHB11 tenga un papel importante en la citada interconexión de ambos procesos bioenergéticos en la membrana tilacoidal. Friederich, T., Weiss, H. Et al. (1995) The proton-pumping respiratory complex I of bacteria and mitochondria and its homologue in chloroplasts. 367:107-111. Peschek, G. A. (1996). Interaction of Photosynthesis and Respiration. 729-732. 7 Panel 5. LAS FICOBILIPROTEINAS EN LA FOTOSÍNTESIS DE CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC 7120 LAS Ana Peropadre López, Laura Saiz Aúz y Cristina Herranz Sánchez En este estudio se trata se trata de determinar el papel de las ficobiliproteínas en la fotosíntesis de cianobacterias. Para ello se utilizó el mutante LC1 de Anabaena sp. PCC 7120 dañado en un gen que codifica para la ficocianina que, junto con otras bilinas y proteínas de unión, forman el ficobilisoma, complejo antena del fotosistema II (PSII). Esta mutación queda patente tras medir la concentración de ficocianina en cultivos de LC1 y compararla con la concentración obtenida a partir de cultivos de la estirpe silvestre, empleada en el estudio como control. Bajo una fuente de luz blanca, excitando así todos los fotopigmentos, se midió la actividad fotosintética máxima en ambas estirpes, siendo muy superior en el mutante. Se compararon estos resultados con los obtenidos bajo fuentes de luz roja y verde. Con filtro rojo los valores presentan una disminución poco significativa respecto a los obtenidos para fotosíntesis máxima en ambas cepas. A esta longitud de onda casi todos los fotopigmentos, incluida la clorofila, pigmento protagonista en la fotosíntesis de las cianobacterias, se encuentran excitados. Donde si se observó una disminución notable en la cepa mutante fue en los valores de fotosíntesis bajo luz verde, que excita mayoritariamente a la ficoeritrina y ficocianina, que dadas las características de la mutación, deben estar prácticamente ausente en los ficobilisomas; por lo que los ficobilisomas de la cepa LC1 deben ser más pequeños, conservando sólo el núcleo de aloficocianina. Se midió la actividad del PSII para comprobar si se encuentra afectada en LC1. Los resultados obtenidos difieren de los esperados, observándose una actividad mayor en LC1 que en silvestre, al igual que ocurría con la fotosíntesis máxima. Esto puede ser debido a que dicho mutante desarrolle un mecanismo de compensación que aumente el número del número de ficobilisomas y/o PSII respecto del PSI. Ducret A., 1995. Isolation,characterization and electron microscopy analysis of a hemidiscoidal phycobilisome type from the cyanobacterium Anabaena sp.PCC 7120. Eur. J. Biochem. 236:1010-24 MacColl R.,1998. Cyanobacterial phycobilisomes. J. Estruc. Biol. 124:311-334 8 Panel 6. EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO Marta Sancelestino Garchenilla, Mª Mar Rodríguez Pozo y Tamara Hernández del Prado El módulo consiste en el estudio del compontente II de la nitrogenasa en el sistema rizobiáceasleguminosas a nivel transcripiconal, de síntesis proteica y actividad enzimática en dos situaciones fisiológicas: cultivo control y estrés salino. Como material biológico se utilizaron nódulos resultantes de la simbiosis entre Pisum sativum y Rhizobium leguminosarum en condiciones de esterilidad. Mediante RT-PCR se cuantificó el grado de expresión del gen Nif H. Para observar la síntesis del componente II del enzima nitrogenasa fueron empleadas técnicas electroforéticas de proteinas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SDS (SDS-page); visualizando las bandas con tinción de Coomasie y electroblotting seguido de inmunodetección. Por último se estimó la actividad de la nitrogenasa por el método de reducción del acetileno, midiendo el etileno resultante en el cromatógrafo de gases. Los experimentos realizados mostraron una mayor expresión, síntesis y actividad del enzima en plantas control. Los resultados son consecuencia del efecto de la salinidad en el sistema fijador de nitrógeno: inhibición de la formación de nódulos fijadores de nitrógeno, reducción del crecimiento del hospedador, desequilibrio nutricional en la planta y afección a determinados procesos fisiológicos como son la disminución o inhibición de la actividad enzimática, reducción de la respiración en el nódulo y de la proteina citosólica Leghemoglobina en el mismo. Abdel-Ghaffar AS, El-Affar HA, El-Halfawi MH, Abdel-Sadam AA (1982) Effect of inoculation, nitrogen fertilizer, salinity and water stress on symbiotic nitrogen-fixation by Vicia faba and Phaseolus vulgaris. En: Biological nitrogen fixation technology for tropical agriculture. PH Graham, SC Harris (eds),pp 153-160. Centro Internacional de Agricultura Tropical de Cali, Colombia. Bolaños L, El-Hamdoui A, Bonilla I (2003) Recovery of development and functionality of nodules and plant growth in salt-stressed Pisum sativum - Rhizobium leguminosarum symbiosis. J Plant Physiol 162: 1491-1495. 9 Panel 7. EFECTO DE LA SALINIDAD EN LA FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE N2 Iñaki Arroyos Solaguren, Carlos Pineda Vadillo y Gonzalo del Monte Nieto La salinidad es uno de los tipos de estrés que tiene unos efectos más dañinos sobre las plantas, el más evidente es la reducción del desarrollo, pero también produce daños a otros niveles. El objeto de nuestro estudio es determinar el efecto de la salinidad sobre la simbiosis rizobioleguminosa, que afecta a los primeros pasos de la iniciación del nódulo. También se ha observado que produce una disminución de la actividad nitrogenasa específica. Para estos experimentos se utilizó como material biológico la leguminosa Pisum sativum L.cv. Argona y como cepa bacteriana, Rhizobium leguminosarum bv. Viciae 3841GFP. Si observamos las plantas tratadas con sal, estas presentan un menor desarrollo de la parte aérea y, o no tienen nódulos, o son muy pequeños. Se estudió la presencia de nitrogenasa en los distintos tratamientos mediante inmunodetección específica del componente II de la nitrogenasa. Los resultados implican una menor presencia de la proteína en plantas tratadas con sal. Mediante RT-PCR se estudió la expresión del gen nifH (gen del componente II de la nitrogenasa). Los resultados revelaron que existe expresión génica en plantas tratadas con sal, pero en menor medida que en las plantas control. Para estudiar la actividad enzimática de la nitrogenasa se realizó un experimento basado en la reducción de acetileno a etileno (que realiza el enzima de forma inespecífica) por cromatografía de gases. Los resultados indicaron que no existe esta actividad en las plantas tratadas con NaCl. B and Ca mediated recovery of nodulation and nodule development under salt stress.Abdelaziz ElHamdaoui, Miguel Redondo-Nieto, Rafael Rivilla,Ildefonso Bonilla, Luis Bolaños. Influence of boron and calcium on the tolerance to salinity of nitrogen-fixing pea plants. A. El-Hamdaoui, M. Redondo Nieto, B. Torralba, R. Rivilla, I. Bonilla, L. Bolaños. B- Ca relationship in salt stresses legume nodules. Luis Bolaños 10 Panel 8. EL ESTRÉS SALINO DISMINUYE LA FIJACIÓN DEL N2 EN LA SIMBIOSIS EN Rhizobium leguminosarum-Pisum sativum José Antonio Romero Carnerero, Álvaro Sebastián Serrano y Patricia Alcalde Alonso La fijación biológica del N2 consiste en la reducción de N2 a NH4+ por la enzima nitrogenasa de microorganismos procariotas diazótrofos de vida libre o en simbiosis. El caso a estudiar es la simbiosis entre rhizobiaceas (Rhizobium leguminosarum) y leguminosas (Pisum sativum) entre las cuales se produce un complejo intercambio de señales moleculares que inducen la infección de la planta (generalmente a nivel de la raíz) por parte de la bacteria, produciéndose un nódulo donde esta se diferencia hacia la forma fijadora de N2 (bacteroide). El ensayo se centra en la enzima nitrogenasa (principal responsable de dicha fijación) a tres niveles: transcripción, síntesis de proteínas y actividad enzimática, en dos situaciones fisiológicas: cultivo control y estrés salino. Vemos así los efectos del NaCl en la fijación simbiótica del N2. Respecto al análisis de expresión génica nos centramos en la transcripción del gen nifH que codifica la proteína nitrogenasa reductasa. Mediante RT-PCR observamos que hay expresión en las dos situaciones fisiológicas, siendo mayor en ausencia de sal. Realizamos una inmunodetección usando un antisuero (anticuerpo policlonal) de la nitrogenasa reductasa. Con esta técnica apreciamos que la síntesis de proteína se ve disminuida en presencia de sal. Por último, para medir la actividad de la enzima nos basamos en su inespecificidad de sustrato, concretamente en la reducción de acetileno a etileno y medimos la aparición de producto mediante un cromatografo de gases. Se observó mayor actividad enzimática en las plantas control. Con todo esto concluimos que la salinidad además de afectar a la reducción de la nodulación (observable a simple vista), produce una disminución de la actividad nitrogenasa que conlleva una apreciable reducción de la actividad fijadora de N2. Abdelaziz El-Hamdaoui (2002)Papel de la relación Boro-Calcio como modulador del estrés salino en la fijación biológica del nitrógeno en la simbiosis rhizobium leguminosarum-pisum sativum.Tesis doctoral 11 Panel 9. MÓDULO DE CULTIVO in vitro (SIN RESUMEN) Rocío García Prieto, Kilian Gutiérrez Viñas y Álvaro Peña 12 Panel 10. CULTIVO in vitro DE EXPLANTOS DE CLAVEL: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO DE FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Jesús García López, Eva Díaz Guerra y Carolina L. Arias Gómez Con el avance de las ciencias biológicas en las dos últimas décadas, se han desarrollado técnicas que posibilitan el estudio de las plantas a nivel celular y molecular. Estas nuevas técnicas conocidas como biotecnológicas se están convirtiendo en herramientas poderosas para la mejora en plantas y para el progreso socioeconómico. Dentro de estas técnicas, el cultivo de tejidos es importante por su aplicación práctica en agricultura e industria, como por ser una herramienta versátil para el estudio de la fisiología de los vegetales. El término cultivo de tejidos vegetales se refiere al cultivo in vitro de cualquier estructura viva de una planta, sea esta célula, un tejido o un órgano bajo condiciones controladas y asépticas. Asimismo, es de crucial importancia el estrecho control en la adición de las fitohormonas, especialmente de la relación entre auxinas y citoquininas para lograr el perfecto desarrollo de las estructuras vegetales utilizadas. Una de las aplicaciones de la manipulación genética de plantas se ha dirigido a buscar beneficios en cuanto a la nutrición de las poblaciones humanas. El uso del "arroz dorado" tiene como objetivo erradicar la deficiencia de vitamina A de los países pobres. También se busca la producción de un arroz transgénico con altas concentraciones de hierro para solucionar otras carencias de la dieta de los más desfavorecidos. Ye X, Salim Al-Babili, Klöti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, Potrykus I.(2000) Engineering the Provitamin A (beta-carotene) Biosynthetic Pathway into (carotenoid free) rice endosperm. Science 287:303-305. 13 Panel 11. RESPUESTA AL ESTRÉS SALINO EN PLANTAS DE TOMATE Camen López Barba y Mercedes Herrera Torres La salinización de suelos es el principal factor de estrés abiótico que afecta a la agricultura en todo el mundo: el 20% de los suelos cultivados y aproximadamente el 50% de las tierras irrigadas están catalogados como potencialmente salinos. El principal efecto sobre las plantas es la reducción de su desarrollo y productividad, debido a la pérdida de la homeostasis del potencial osmótico y del equilibrio iónico, lo cual favorece la aparición de especies reactivas de oxígeno, las denominadas EROs: estrés oxidativo. Para combatir este daño celular, las plantas sintetizan compuestos osmoprotectores, como la osmotina, y activan un mecanismo de detoxificación constituido por diversas enzimas, entre las que se encuentran la ascorbato peroxidasa (APX). El objetivo de nuestro estudio es analizar la respuesta de las plantas de tomate (Lycopersicon esculentum), cuando se ven sometidas a un exceso de NaCl en el medio de cultivo. Para cuantificar este efecto, hemos valorado la variación en la expresión génica de la osmotina y de la ascorbato peroxidasa en plantas de tomate sometidas a dos tratamientos distintos: uno control y otro suplementado con 200 mM de NaCl. Además, se ha determinado la actividad de APX en ambos casos. Por último, hemos hecho un análisis del índice de peroxidación de lípidos y los posibles cambios en la concentración de clorofila. Para discutir nuestros resultados contrastaremos nuestras conclusiones con las obtenidas en estudios realizados en la regulación del sistema de antioxidación en distintas especies de tomate. Jian-kang Zhu, Arizona, F(2001). Plant salt tolerance. Trends in Plant Science 6:1-9 Mittova V.;Guy M.; Tal M.; Volokita M; Israel, M (2004). Salinity up-regulates the antioxidative system in root mitochondria and peroxisomes of the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii. Journal of Experimental Botany :1-9 14 Panel 12. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS DE TOMATE Ana Ramos Franco, Cristina Barrera y Sara Moreno Rivera Entre las distintas situaciones de estrés abiótico a las que pueden verse sometidas las plantas, la salinidad cobra una especial relevancia en el área mediterránea. El principal efecto que causa en las plantas es la reducción del crecimiento y del desarrollo vegetal debido a la disminución del potencial osmótico del medio y en consecuencia, del potencial hídrico del suelo así como una toxicidad específica asociada con la absorción excesiva de Na+ y Cl- que produce un desequilibrio nutricional por la interferencia de los iones con los nutrientes esenciales. Como consecuencia de estos efectos, se inducen otro tipo de estreses secundarios, entre ellos el oxidativo debido al aumento de especies reactivas de oxígeno. Para neutralizar la toxicidad de este proceso las plantas activan varias enzimas: superóxido dismutasa (SOD) y ascorbato peroxidasa (APX). Para estudiar la respuesta de la plantas de tomate sometidas a un exceso de sal en el medio de cultivo, se realizaron diversos ensayos: inducción de la expresión de genes de osmotina y APX mediante RT-PCR; actividad de APX mediante análisis en gel nativo; peroxidación de lípidos mediante colorimetría MDA y cambios en la concentración de clorofilas mediante el análisis de dichos pigmentos. Los resultados indicaron, para cada tipo de ensayo, diferencias importantes entre las plantas sometidas a estrés salino y las plantas testigo que comentaremos durante la exposición de nuestro panel. Dionisio-Sese ML et al. 1998 Antioxidant responses of rice seedling to salinity stress. Vieira-Santos CL et al. 2001 In situ and in vitro senescense induced by KCl stress: nutritional imbalance, lipid peroxidation and antioxidant metabolism. Zhu JK, 2001 Plant salt tolerance. 15 Panel 13. ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS DE TOMATE: SALINIDAD, ESTRÉS OXIDATIVO Y ENZIMAS ANTIOXIDANTES: Alicia Hernández Vivanco, Ismael Roldán Hernando y Ana Ayuso Arroyo En plantas, la alta concentración de sales en el medio puede provocar un estrés consistente en un desequilibrio del potencial hídrico y de la distribución de iones. Esto se traduce en una reducción del desarrollo y crecimiento vegetal. Uno de los factores que causan daño durante las condiciones ambientales adversas, como es el aumento de salinidad, es la producción en exceso de especies reactivas de oxígeno (EROs), tales como el ion superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radicales hidroxilo (OH-). El O2- y el H2O2 pueden inactivar varias moléculas directamente, pero es la conversión a OH- la que conlleva la mayor toxicidad, ya que los radicales hidroxilo reaccionan con proteínas, lípidos y DNA, causando daño celular. Incluso bajo condiciones óptimas, muchos procesos metabólicos, incluyendo el transporte de electrones en membrana plasmática, mitocondria y cloroplasto, producen estas mismas EROs, por lo que las plantas han desarrollado diversos mecanismos enzimáticos antioxidantes. En este ensayo hemos analizado algunos daños causados por estrés salino, así como los mecanismos de defensa ante esos daños en plantas de tomate (Lycopersicon esculentum). Para ello sometimos a las plantas a dos condiciones de cultivo distintas: una control y otra suplementada con NaCl 200 mM. Se determinó la concentración de clorofilas mediante un espectrometría de absorción, tras su extracción con acetona, para ver si había cambios en su contenido como consecuencia del estrés. El malondialdehído (MDA), producto de la peroxidación de lípidos e índice de estrés oxidativo, nos sirvió para determinar el daño oxidativo causado en la célula. Asimismo, en nuestro ensayo hemos estudiado la actividad y expresión de la ascorbato perosidasa (APX), mediante análisis en gel nativo y mediante RT-PCR respectivamente. APX y la superóxido dismutasa (SOD) están probablemente implicadas en la eliminación de EROs. Se discutirán nuestros datos con los obtenidos de la bibliografía. Dirk Inzé and Marc Van Montagu. (1995). Oxidative Stress in Plants. Current Opinion in Biotechnology 6:153-158. Jian-Kang Zhu. (2001). Plant salt tolerance. TRENDS in Plant Science 6: Shigeru Shigeoka, Takahiro Ishikawa, Masahiro Tamoi, Yoshiko Miyagawa, Toru Takeda, Yukinori Yabuta and Kazuya Yoshimura. (2002). Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. Journal of Experimental Botany 53:1305-1319. 16 Panel 14. ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO LOCOMOTOR EN Drosophila melanogaster Alicia Gonzalo Gómez, Iván Chacón Triguero y Marta García García En nuestro póster planteamos la identificación de proteínas implicadas en comunicación neuronal. Para ello hacemos uso de mutagénesis clásica (introducción de mutaciones al azar), seleccionando aquellos mutantes que manifiesten anomalías en el comportamiento locomotor; en nuestro caso parálisis. El hecho de centrarnos en el estudio de la locomoción se debe al conocimiento que se tiene de dicho comportamiento, lo que facilita la detección de fenotipos anómalos. De esta manera, conseguimos aislar dos tipos de mutantes condicionales a temperatura: (i) Paralitic (Para), resultó ser un mutante en el canal de Na+ dependiente de voltaje, indispensable en la generación del potencial de acción. (ii) Shibire (Shi), un mutante para el gen que codifica para la proteína Dinamina cuya actividad GTPasa resulta esencial para la endocitosis de las vesículas sinápticas. Ambos mutantes se basan en la condición ectoterma de Drosophila, según la cual, un aumento en la temperatura ambiente supone un incremento en la actividad del animal. Las mutaciones portadas por Para y Shi les hacen incapaces de responder al alto requerimiento energético, lo que se traduce en parálisis. En nuestro estudio comentaremos los resultados obtenidos tras someter a ambos mutantes a temperatura restrictiva, centrándonos en su parálisis y posterior recuperación. Así mismo, ampliaremos el estudio, aportando experimentos realizados con técnicas de mutagénesis dirigida , como por ejemplo, el sistema Gal4/UAS con el cual se generan líneas mutantes en comportamiento locomotor, orientado también al estudio de la comunicación neuronal así como a la observación de redes neuronales implicadas. http://flybase.bio.indiana.edu http://www.ncbi.nlm.nih.gov Guión de prácticas elaborado por Laura Torroja 17 Panel 15. ENSAYOS DE COMPORTAMIENTO EN Drosophila melanogaster: PARÁLISIS Y OLFACIÓN Víctor López, David López y Jacobo Pastor Drosophila melanogaster presenta comportamientos estereotipados que se pueden estudiar en el laboratorio. Mediante el estudio de estos comportamientos podemos conocer la fisiología y anatomía de su sistema nervioso. El estudio del comportamiento requiere el uso de poblaciones grandes que sean homogéneas genéticamente, controles adecuados y el control de todas las variables: ambientales, edad, etc. Para ello se utilizan diversas técnicas genéticas: mutagénesis clásica, que nos permite analizar genes implicados en comunicación neuronal y el sistema de transcripción de levaduras Gal4/UAS, mediante el cual podemos suprimir la actividad neuronal de manera controlada y estudiar así las redes neuronales que determinan un comportamiento. Los ensayos que hemos realizado son el estudio de la actividad locomotora y la vía olfativa de Drosophila melanogaster. En el ensayo de la actividad locomotora hemos utilizado los mutantes paralityc y shibire. Ambos mutantes son sensibles a temperatura y sólo expresan su fenotipo en condiciones restrictivas. Al someterlos a 37°C observamos una parálisis de la actividad locomotora. En el caso de paralityc se debe a que la mutación en los canales de Na + dependientes de voltaje impide la generación de potenciales de acción. Por su parte, el mutante shibire codifica una dinamina defectiva en su actividad GTPasa que impide la endocitosis de las vesículas sinápticas. El ensayo de olfación consiste en dar a elegir a las moscas entre una solución olorosa repelente y otra control. Para ello empleamos dos grupos de moscas: control, y un mutante que hemos obtenido mediante la construcción Gal4GH146/UAS-TeTxTLC en la que la toxina tetánica se expresa en 2/3 de las neuronas de proyección de los glomérulos antenales. Tras realizar el experimento a distintas concentraciones del repelente, observamos que nuestro mutante no presenta una respuesta de repulsión tan acusada, debido a la supresión de la comunicación neuronal de los glomérulos antenales con los “mushroom bodies” y el lateral “horn”, responsables respectivamente de la memoria olfativa y de la respuesta motora ante los estímulos olfativos. Heimbeck, Gertrud; Bugnon, Veronique et al. (2001) A central circuit for experience-independent olfactory and courtship behaviour in Droshopila melanogaster. PNAS 26 Keller, Andreas; Vosshall, Leslie B. (2003) Decoding olfaction in Drosophila. Current opinion in Neurobiology 13: 103-110. Keller, Andreas; Sweeney, Sean T. et al. (2002) Targeted expression of tetanus neurotoxin interferes with behavioural Responses to sensory input in Drosophila. Neurobiology 50: 221-233. McGuire, Sean E.; Phuong, T. Le et al. (2001) The role of Drosophila body signaling in olfactory memory. Science 293: 1330-1333. Rothenfluh, Adrian; Heberlein, Ulrike (2002) Drugs, flies, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current opinion in Neurobiology 12: 639-645 Sokolowski, Marla B. (2001) Drosophila: genetics meets behaviour. Macmillan Magazines 2: 879-892. Torroja, Laura (2003) Técnicas avanzadas en fisiología animal. U.A.M. Waddell, Scout; Quinn, William G. (2001) Learning how a fruit fly forgets. Science 293: 1271-1272. White, Benjamin; Osterwalder, Thomas et al. (2001) Molecular genetic approaches to the targeted suppression of neuronal activity. Current Biology 11: 1041-1053. 18 Panel 16. UNIÓN NEUROMUSCULAR LARVARIA (NMJ): VISUALIZACIÓN DE LA ENDOCITOSIS DE VESÍCULAS SINÁPTICAS EN NMJ DE Drosophila UTILIZANDO FM4-64 Aurora Vázquez Vázquez, Mayte San José Martín y Raquel Martín Carretero Los objetivos de este experimento son visualizar la morfología típica de la unión neuromuscular (NMJ) larvaria utilizando una línea Gal-4 que se expresa en motoneuronas y UAS-GFP. Estudiar también la modulación de la actividad neuronal y la endocitosis de vesículas sinápticas en la NMJ de individuos normales (c155 w/Y; UAS mCD8.GFP/+) y mutantes (c155 w/shiTS1/Y; UASmCD8.GFP/+) utilizando el compuesto fluorescente FM4-64. El experimento de la actividad neuronal consiste en visualizar, gracias a los marcadores, si se producía endocitosis con dos soluciones diferentes: solución [ K+] alta y solución [K+] + Ca2+. La solución sin Ca2+ no produce endocitosis ya que el Ca2+ es el responsable de la liberación de vesículas de exocitosis. La solución con K+ y Ca2+ si dio lugar a endocitosis ya que el aumento extracelular de K+ provoca su entrada a la célula y, por tanto, un cambio en el potencial de membrana y el Ca 2+ la liberación de las vesículas con el neurotransmisor. Con respecto a los individuos mutantes y control, el mutante condicional shiTS1 a temperatura restrictiva (temperatura > 30 ºC), produce dinamina mutada, que es una proteína defectiva en su actividad GTPasa, la cual participa en la endocitosis de vesículas; luego no se reciclan las vesículas ni el neurotransmisor. Además el compuesto utilizado para el marcaje (FM1-43 y derivados) presenta otras aplicaciones que mostramos en el póster Neuron. 1994 13(2):363-75 19 Panel 17. EL SISTEMA GAL4/UAS COMO HERRAMIENTA DEL ESTUDIO DE LA ANATOMÍA DE LARVAS DE Drosophila melanogaster. Noelia Alonso González, Teresa Poderoso y Juan Luque Buzo En los últimos años ha habido un gran desarrollo de las herramientas genéticas para el estudio in vivo del sistema nervioso en organismos modelo como Drosophila melanogaster. Sin suda, la herramienta más importante, de la que va a ser objeto nuestro estudio, es el sistema de transcripción de levaduras Gal4/UAS, gracias al cual se pueden visualizar estructuras concretas del sistema nervioso. Este sistema está formado por dos transgenes:1.-RE-gal4, que codifica para la proteína Gal4 que es un factor de transcripción que reconoce la secuencia reguladora UAS. 2.UAS-genX, que expresará en gen X (gen delator, represor neuronal...) si se le une la proteína Gal4. Este genX, en nuestro caso e un gen marcador que codifica para las proteínas GFP o la proteína -galactosidasa, cuyos productos permiten visualizar las estructuras deseadas. De manera, que las proteínas GFP y -galactosidasa sólo se expresarán en aquellas células qu hayan integrado los dos transgenes y que expresen factores de transcripción que reconozcan específicamente las secuencia reguladora (RE) upstream de gal4. Los resultados obtenidos tras la utilización de este sistema con distintas líneas Gal4 serán expuestos en nuestro panel mediante las fotografías que muestran el marcaje con (GFP o -galactosidasa) de distintas estructuras del SNC larvario obtenidas tras nuestros experimentos, como: Los “Mushromm bodies” (centros de procesamiento e integración de señales)utilizando la línea Gal4-c503; motoneuronas (neuronas encargadas del avance y rotación larvaria) con la línea Gal4-c164 o los lóbulos antenales (que procesan la información informativa) con la línea Gal4-GH146. Dubnau J. and Tully T. Funcional anatomy: From molecule to memory. Current Biology 11:R240-R243 (2001) Duffy J. B. GAL4 System in Drosophila: A Fly Geneticist´s Swiss Army Knife. Genesis 34: 1-15 (2002). 20 Panel 18. UTILIDADES DEL SISTEMA GAL4/UAS PARA LA VISUALIZACION DE DISTINTAS ESTRUCTURAS DEL SISTEMA DROSOPHILA EN ESTADO ADULTO NERVIOSO CENTRAL DE Francisco Javier Moreno Martínez, Ithaisa Sologoren Marrero y María Malalana Leiva El sistema Gal4/UAS, se basa en la expresión de dos transgenes, el Gal4, que es un activador transcripcional de levaduras y la secuencia reguladora UAS, que llevará asociado un genX concreto. Sólo si está presente la proteína Gal4, se expresará el genX. El transgén Gal4 se introduce aleatoriamente, empleando elementos P de Drosophila melanogaster, mediante la técnica “Enhancer trap”, la cual nos permite generar patrones espaciales y celulares que reflejan el patrón de inserción de Gal4. Así, obtenemos patrones de expresión diferentes, según el punto de inserción del genoma en el que se inserte el transgén. Si conocemos la secuencia del promotor para un gen determinado, podemos introducir la construcción del transgén Gal4, con dicho promotor directamente, y realizar estudios de expresión controlada. Una de las principales aplicaciones del sistema Gal4/UAS, consiste en la visualización de la anatomía y estructura del Sistema Nervioso en la mosca de la fruta. Para visualizar el patrón de expresión de las distintas líneas Gal4, se utilizan genes marcadores que se clonan downstream de las secuencias UAS. Los dos más utilizados son GFP y -galactosidasa. Se han construído híbridos de ambos para distintas localizaciones celulares. Gracias a la gran especificidad del sistema, podemos, en función de que línea Gal4 utilicemos, marcar distintos tipos celulares y/o estructuras del Sistema Nervioso de Drosophila. El sistema Gal4/UAS, permite expresar cualquier proteína “in vivo” de interés para el investigador, bajo un control espacio-temporal concreto del desarrollo. Teniendo en cuenta que esta proteína puede proceder de otros organismos, con el sistema Gal4/UAS podemos expresar genes humanos en la mosca, pudiendo reproducir enfermedades de gran interés biomédico. Este sistema tan dinámico, permite determinar si la mutación provocada en la mosca es letal. Concluímos comentando, que se realizan estudios comportamentales, y técnicas de generación de moscas transgénicas que expresarán un RNAi de doble cadena. Duuffy.J.B.GAL4 System in Drosophila: A Fly Geneticist's Swiss Army Knife. Genesis 34:1-15 (2002). Sulzbacher A, Reiter&Karl-Friedrich F: Caracterización de las líneas Gal4 con la expresión en el lóbulo óptico del drosophila usando GFP como marcador. Osterwalder Thomas, S.Yoon Kenneth, H.White Benjamin, and Keshishian Haig: A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. M.Klueg Kristin, Alvarado Diego, Muskavitch Marc, Duffy Joseph B: Creation of a Gal4/UASCoupled inducible gene expression system for use in Drosophila cultured cell lines. http://flybase.bio.indiana.edu/ http://sdb.bio.purdue.edu/fly/aimain/1aahome.htm http://www.flybrain.org http://flyview.uni-muenster.de/html/Gal4.html 21 Panel 19. ESTUDIO DEL SITEMA NERVIOSO EN INDIVIDUOS ADULTOS DE Drosophila melanogaster MEDIANTE EL USO DEL SISTEMA GAL4/UAS Eduardo Sanz Martiner, Arántzazu Cabezón Sánchez y Nieves Zamora El sistema de transcripción de levaduras gal4/UAS es una herramienta genética que nos va a permitir la manipulación in vivo del sistema nervioso de Drosophila melanogaster. Podremos introducir genes exógenos que activen o silencien genes propios de Drosophila en lugares específicos y momentos del desarrollo concretos. El factor de transcripción gal4 codifica para una proteína que se une a las secuencias reguladoras UAS activando así la transcripción de un genX de nuestro interés situado en posición 3´ a continuación de dicha secuencia. Por tanto, para ver la expresión del genX en una célula, tendrán que estar presentes tanto el gal4 como la secuencia UAS. Esto se consigue mediante elementos P de Drosophila que al ser trasposones que pueden movilizarse e insertarse en el genoma de forma aleatoria nos permiten insertar cualquier secuencia de ADN. Se establecen dos líneas de moscas mediante la microinyección de los elementos P en células polares de embriones: una expresará gal4 con una secuencia genómica reguladora a elegir y la otra con UAS y el gen X en 3´ a dicha secuencia. En ambas líneas el elemento P debe contener un marcador para poder visualizar los individuos que han integrado dicho elemento. Habrá que cruzar moscas de la línea gal4 con moscas de la línea UAS-genX y algunos individuos de la progenie presentarán el sistema binario gal4/UAS expresando, por tanto, el producto del genX. En este estudio que pretende visualizar las estructuras del SNC en adulto, el genX corresponde al de una proteína marcadora que emite fluorescencia (GFP).Además, se han utilizado proteínas híbridas de nueva creación que mejoran el estudio de compartimentos subcelulares: (i) núcleo (proteína GFP.nls); (ii) microtúbulos (proteína Tau.GFP); (iii) membrana celular (mCD8.GFP). Asimismo, como el elemento P tiene capacidad de inserción en cualquier punto del genoma, existe gran variedad de líneas gal4 con diferentes patrones de expresión. Finalmente discutiremos las utilidades y ventajas de este sistema así como otras alternativas al mismo. Duffy J.B. GAL4 System in Drosophila: A Fly Geneticist´Swiss ARmy Knife. Genesis 34: 1-15 (2002). Kei Ito et al. GAL4-responsive UAS-tau as a tool for studying the anatomy and development of the Drosophila central nervous system. Cell and Research 290: 1-10. (1997) Phelps CB, Brand AH. 1998. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system. Methods 14: 367-379. Sean E. McGuire and Ronald L. Davis .The TARGET (Temporal and Regional Gene Expression Targeting) System: a novel temperature-sensitive mutation in GAL80 that facilitates tight regulation of GAL4 dependent transcription in Drosophila and other model organisms.BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE. Department: Molecular and Cellular Biology (www.bcm.tmc.edu/research/OTA/techs/tech-02-107.html) (1996-2000). www.ucl.ac.uk/~ucbhhks/Dros3.htm. Maya R Chandru. Over-, Misexpression Screen for Retinal Axon Guidance Genes in Drosophila melanogaster using the Gal4 system in conjunction with EP target lines. Department of Biology,Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139. Work conducted in Garrity Lab. Banghua Sun, Peizhang Xu, and Paul M. Salvatierra. Dynamic visualization of nervous system in live Drosophila. Division of Neuroscience and Graduate School of biological Sciences, Beckman Research Institute of the City of Hope (1999). Guión de prácticas 22 Panel 20. LA UNIÓN NEUROMUSCULAR LARVARIA EN Drosophila: VISUALIZACIÓN DEL PROCESO DE ENDOCITOSIS María Victoria Tejada Calvo, Mónica Martínez y Alicia Zamarrón Moreno Para tratar la unión neuromuscular en larvas de Drosophila melanogaster, estudiaremos los procesos de exocitosis y endocitosis en la sinapsis, mediante visualización mediada por el fluorocromo FM4-64. El proceso de exocitosis consiste en la liberación de vesículas con neurotransmisor (el glutamato), impulsada por la despolarización de la neurona a consecuencia de un aumento en la concentración de K+ y de la presencia de Ca2+. Tras la exocitosis, y gracias a la dinamina, tiene lugar la endocitosis, consistente en la invaginación de la membrana presináptica y el consecuente reciclaje de las vesículas sinápticas, que retirarán el glutamato de la hendidura sináptica. Los iones K+ y Ca2+ son indispensables para ambos procesos. Realizamos distintos experimentos con diferentes soluciones iónicas para demostrarlo. En un primer experimento, que implica una solución con exceso de K+ y presencia de Ca2+, observamos liberación de glutamato (exocitosis) y endocitosis. En un segundo experimento en el que prescindimos del Ca2+, comprobamos la ausencia de exocitosis, debida a que la dinamina, dependiente de Ca 2+, no actúa promoviendo la endocitosis, sin la cual la exocitosis no tiene lugar. Finalmente, experimentamos con el mutante condicional termosensible ShiTS1, que tiene alterado el gen de la dinamina. Tanto en presencia como en ausencia de Ca2+, no se aprecian en la unión neuromuscular de este mutante ni exocitosis ni endocitosis o reciclado de vesículas sinápticas. Torroja L. and White K. Drosophila neural development. Encyclopedia Life Sci. 1-7 (2001) 23