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ELISA (Enzime Linked Immunoassay): Bases Teóricas y Fundamentos Prácticos Versión a utilizar en sesiones: 6 y 9 Ensayo inmunoenzimático Definición: – Es una técnica que combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de un ensayo enzimático. Esta técnica es utilizada para medir tanto antígenos como anticuerpos, de manera cualitativa, semicuantitativa y cuantitativa http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp Las inmunoglobulinas: estructura y función Antígenos e Interacciones Antígeno-anticuerpo Moléculas complejas extrañas al organismo, de naturaleza proteica que son capaces de inducir una RI y combinarse con los elementos efectores de la misma ••Enlaces Enlaces iónicos ••Enlaces Enlaces de hidrógeno ••Interacciones Interacciones hidrofóbicas ••Fuerzas Fuerzas de van der Waals ••Interacciones Interacciones dipolo -dipolo dipolo-dipolo Fases de las respuesta inmune humoral Abbas Abbas A, A, Inmunología Inmunología celular celular yy molecular molecular 2000 2000 FUNDAMENTO DEL ELISA Muestra Muestra Ag Ab Ag Ab Ag-Ab Ag-Ab-Enzima Fase Sólida Enzima unida al anticuerpo Substrato Compuesto Compuesto coloreado coloreado ELEMENTOS DEL ELISA • Tipo de muestra Antígenos Anticuerpos • Fase sólida • Enzimas • Lavados • Substratos Lequin RM, Clin Chem, 2005; 51:2415 • Revelador de la actividad enzimática TIPO DE MUESTRA • Orina •Suero • Saliva • Heces • LCR • Otros ANTÍGENO •Completo (Organismo, estructura íntegra) •Extracto total (Ultrasonido,solventes) Fase sólida •Fracción Purificada (Núcleo, de membranas, organelas) •Péptido sintético ANTICUERPOS: Policlonales (infecciones naturales) Monoclonales Producción de Anticuerpos Monoclonales Inmunización de un ratón para estimular la producción de anticuerpos Células formadoras de anticuerpo aisladas del bazo Células tumorales crecen en cultivos tisulares Conjugado Conjugado con con la la enzima enzima Células formadoras de anticuerpo se fusionan con células tumorales cultivadas para formar un hibridoma Se mide la producción de anticuerpos por los hibridomas Se clonan las células de hibridoma productoras de anticuerpo Se separan los anticuerpo monoclonales del cultivo Capturar Capturar antígenos antígenos MATERIALES DE LA FASE SÓLIDA: Soporte Nitrocelulosa Polivinilo Poliestireno Látex, nylon, celulosa Forma disponible Membranas, Láminas Placas, Láminas Placas, Láminas, Perlas Láminas, Perlas Unión No covalente Covalente Covalente Covalente SOLUCIÓN DE BLOQUEO : Buffer de bloqueo Caseína Composición Desventajas 5% p/v leche sin grasa Deteriora rápidamente. Enmascara algunos antígenos Caseína/Tween2 5% p/v leche sin grasa, O,2 0 %de Tween20 Tween 20 Gelatina BSA O,2 %de Tween Deteriora rápidamente. Enmascara algunos antígenos Podría generar algunos residuos Gelatina 0.2% (2mg/ml) 3% de BSA, Relativamente costoso Sistema de revelado de la reacción Ag-Ac: ENZIMA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Alta pureza Actividad específica Bajo costo Ausencia en fluidos biológicos Fácil detección Facilidad de conjugación Estabilidad a ciertas condiciones de almacenamiento http://www.che.utexas.edu/~angela/sbelisa.jpg TIPOS LA ENZIMA ENZIMA ORIGEN Substrato Peroxidasa Rabano picante OPD (Amarillo 492 nm) TMB (Amarillo 450 nm) Fosfata Alcalina PNP(Amarillo) β-Galactosidasa Eschericia coli Escherichia coli Glucosa oxidasa Aspergilus ninger Lisozimas Clara del huevo Malato Deshidrogenasa Corazón de Cerdo ONPG (Amarillo 410) Glucosa OPD (Anaranjado 490nm) (Campbell, 1991) SUBSTRATOS 1. 2. 3. 4. Compuestos solubles Fácil de manipular No resulten tóxicos Bajo costo Detección de la actividad Enzimática Ácidos Fuertes Bases Fuertes Ensayo inmunoenzimático Sensibilización de la placa Bloqueo de los espacios vacíos Incubación con la Muestra problema Incubación con El sistema de detección: Ej. Si se busca IgG contra Ag del VIH, se trata con anti -IgG anti-IgG humana conjugada con una enzima Adición del sustrato http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm E E E E E S S S S S E E Antígeno Antígeno Buffer Buffer de de bloqueo bloqueo Anticuerpo Anticuerpo E S 9 DIRECTO 9 INDIRECTO 9INDIRECTO 9 TIPO “SÁNDWICH” 9TIPO O CAPTURA DE ANTÍGENOS 9 COMPETITIVO 9COMPETITIVO S Tipos de ELISA E E E E E Anti-IG Anti-IG acoplada acoplada aa una una enzima enzima Substrato Substrato Tipos de ELISA S S S S S S 9 INDIRECTO 9 TIPO “SÁNDWICH” O 9TIPO CAPTURA DE ANTÍGENOS 9 COMPETITIVO 9COMPETITIVO E E E E E E E E E E E E E Anticuerpo Anticuerpo acoplado acoplado aa la la enzima enzima S Antígeno Antígeno Buffer Buffer de de bloqueo bloqueo Anticuerpo Anticuerpo Substrato Substrato Tipos de ELISA 9 INDIRECTO 9 TIPO “SÁNDWICH” O 9TIPO CAPTURA DE ANTÍGENOS 9 COMPETITIVO 9COMPETITIVO APLICACIONES Detección de antígenos o anticuerpos Virus Hongos Parásitos bacterias Detección de autoanticuerpos IgG (Factor reumatoideo reumatoideo)) DNA PProteína roteína del nnúcleo úcleo Tiroglobulina -Microsomales Tiroglobulina-Microsomales Complejos inmune APLICACIONES Medición de Hormonas Progesterona, estr ógenos, cortisol insulina estrógenos, cortisol,, insulina,, testosterona ónica humana ,TSH. testosterona,, gonadotropina cori coriónica Detección de antígenos tumorales: Antígeno prostático Alfa -fetoproteína Alfa-fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario
