el embrión de pollo como modelo de
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EL EMBRIÓN DE POLLO COMO MODELO DE EXPERIMENTACIÓN: VEN Y DESCUBRE LA EMBRIOLOGÍA XIV Semana de la Ciencia en Madrid. Julio Contreras Rodríguez, Pilar Martínez Sainz, Inmaculada Santos Rodríguez y Concepción Rojo Salvador. Dpto. Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas. Facultad de Veterinaria. UCM I. INTRODUCCIÓN La gran contribución de las aves como modelo de investigación biomédica es incuestionable. Distintas especies (gallina, codorniz, pato...) han sido utilizadas como modelos en estudios tanto del desarrollo, como en ciertas patologías o estudios quirúrgicos. Además, el hecho de ser las aves susceptibles a diversos virus las ha convertido en objeto de interés para microbiólogos y se han utilizado para el consiguiente desarrollo de vacunas. El huevo de ave ofrece un mecanismo para el estudio del desarrollo embrionario y la patología de forma muy accesible y detallada, sirviendo como modelo para el estudio de múltiples aspectos ontogénicos y teratogénicos. Existen ventajas importantes para el uso de las aves como modelo de investigación, y concretamente del embrión de pollo en el que nos centraremos: 1. Los huevos fertilizados de pollo son baratos, se desarrollan en 20-21 días y pueden ser fácilmente mantenidos en incubadores comerciales, con gran adaptación al laboratorio, sin necesidad de grandes instalaciones ni atenciones. 2. A diferencia de otras especies tradicionales de animales de laboratorio, su mantenimiento es mucho menor y los costes se reducen mucho. 3. Este embrión es accesible y fácilmente manipulable, siendo numerosos los experimentos en que se intercambian regiones en desarrollo incluso entre especies (quimeras). 4. Además, células y distintos tejidos del pollo son factibles de ser llevados a condiciones de cultivo celular, lo que amplía como veremos ampliamente las posibilidades de trabajar, pues a los posibles tratamientos o modificaciones in vivo se añaden una gran cantidad de posibilidades de trabajo in vitro. II. EL HUEVO DE LAS AVES Debemos conocer y comprender la estructura del huevo para su posterior manipulación en los distintos experimentos que planteemos. El huevo de un ave es en realidad un oocito u ovocito gigantesco, con gran cantidad de yema o vitelo y que se va formando en el tracto reproductivo de la hembra (en el caso que nos ocupa de la gallina). El huevo de gallina es por tanto macrolecítico y telolecítico (mucho vitelo que se dispone en un polo o extremo) a diferencia de los mamíferos que será microlecítico e isolecítico (poco vitelo de distribución homogénea). Esta característica es la que condiciona las fases tempranas del desarrollo muy diferentes en aves a las de los mamíferos. El ovario de la gallina contiene muchos folículos que varían en tamaño dependiendo de la cantidad de yema que acompañe al oocito. El ovocito estará formado por un núcleo o “vesícula germinal”, un citoplasma formativo o “mancha germinal”, en conjunto por el “disco germinal”. Además está el vitelo o “yema”, formado por una masa central blanca o latebra, rodeada por capas concéntricas de vitelo blanco (protéico) y vitelo amarillo (lipídico).Tras la ovulación el ovocito recubierto por su membrana vitelina, o membrana secundaria segregada por el ovario (su porción o capa interna), progresa por el oviducto izquierdo (no hay útero en aves y el oviducto y ovario derecho degeneran tras nacer) donde se irá recubriendo de las membranas terciarias, cuya misión será proteger al embrión y contribuir a su nutrición. Estas membranas serán: -La porción externa de la membrana vitelina. Dicha membrana en su conjunto parece que juega un importante papel en el intercambio de agua o algunas sustancias. -El albumen o albúmina que rodea al ovocito. Tiene dos componentes, uno denso y otro claro. Además existen unos ligamentos que se condensan alrededor de la membrana vitelina, las chalazas, que mantienen al ovocito en el centro del albumen. -Las membranas testáceas, interna y externa. Formadas por fibras de queratina entrecruzadas. A nivel del polo obtuso del huevo se separan y dejan entre ellas un espacio o cámara de aire, que equilibra la presión en el interior del huevo conforme se evapora el agua que contiene. -La cáscara o cubierta externa del huevo de carbonato cálcico, que se aplica directamente contra la membrana testácea externa. Contiene muchos poros de pequeño diámetro y cerrados por una cutícula proteica. III. EMBRIOLOGÍA BÁSICA EN AVES A. Formación de las membranas extraembrionarias Distintas capas distales al embrión temprano (somatopleura y esplacnopleura) se extienden sobre el vitelo, más allá del cuerpo del embrión, constituyendo las membranas extraembrionarias. Lo primero en aparecer será el saco vitelino, y tendrá gran importancia por la red vascular que lleva asociada (vasos vitelinos). Conforme se limita el cuerpo del embrión los pliegues laterales que se forman se hacen mayores y tienden a cerrarse por encima del embrión, conformando el amnios y el corion. Por último tendremos el alantoides, que aparece como un divertículo del intestino posterior y crece hasta fusionarse con el corion. Los vasos del alantoides son fundamentales para el intercambio gaseoso del embrión. B. Estadios iniciales del desarrollo El conocimiento del desarrollo del embrión de pollo nos ayudará a tener una perspectiva dinámica de la anatomía al mostrar una visión histórica de la génesis de los distintos tejidos y órganos del animal, lo que a su vez nos permite comprender con más facilidad la morfología del ave adulta. De esta manera podremos elegir el momento concreto del desarrollo en que queremos actuar en nuestra experimentación. Por otro lado, conociendo la embriología del ave podemos analizar las diferencias con los mamíferos, lo que será de utilidad a la hora de plantear nuestra investigación, decantándonos por el modelo animal más apropiado para el experimento concreto a realizar. La fertilización tiene lugar en el infundíbulo del oviducto de la gallina, que es la primera porción del mismo. Conforme el huevo progresa por el oviducto, como ya hemos visto, el embrión sufre en primer lugar los procesos de SEGMENTACIÓN o división ovular. Esta división será condicionada por el vitelo, y será incompleta o meroblástica, con cuatro o cinco divisiones con carioquinesis o división del núcleo completas, pero con citoquinesis o división del citoplasma incompletas. Estas “células abiertas” estarán abiertas a la masa vitelina. En este momento el disco germinal pasa a denominarse blastodermo o blastodisco. Alrededor de la segmentación en estadio de 64-células tendremos células como tal, llamadas blastómeras. Pronto se limitan los elementos celulares y se separan del vitelo subyacente, apareciendo entre ambos un espacio o cavidad subgerminal. Las blastómeras que cubren directamente la cavidad son las blastómeras centrales, que al igual que el nudo embrionario de mamíferos formará las estructuras embrionarias. Las células más periféricas, las blastómeras marginales, formarán algunas de las membranas extraembrionarias. En este momento tendremos un blastodermo que presenta externamente dos regiones: el área pelúcida, o central que se sitúa encima de la cavidad subgerminal, y el área opaca, o periférica. En el transcurso de la segmentación se establecen los ejes de polaridad del embrión: primero el eje dorso-ventral y después el craneo-caudal. Aproximadamente en el momento de la puesta se desprenden células del blastodermo por un proceso de delaminación, que comienza en el polo caudal, obteniéndose una BLÁSTULA con células en la superficie, o epiblasto, y células en profundidad, o hipoblasto. Entre ambas poblaciones tendremos una cavidad o blastocele. El proceso de GASTRULACIÓN se inicia con un engrosamiento en el polo posterior del blastodisco, en la zona marginal posterior, por una expansión en esta zona del epiblasto. Se inicia así un desplazamiento hacia la línea media de las células del epiblasto en una secuencia caudorrostral, acumulándose células en la línea media caudal. Esta convergencia progresiva de células en la línea media es la línea primitiva, que marca la situación del futuro eje longitudinal del embrión. El extremo craneal de ésta línea primitiva se ensancha y conforma el denominado nudo primitivo o nudo de Hensen. A partir de la línea primitiva, y concretamente del surco primitivo, células de origen epiblástico abandonan su localización y por un lado alcanzan el hipoblasto, al que desplazan, formando el endodermo intraembrionario. Por otro lado, la mayor parte de células que abandonan el epiblasto por la línea primitiva forman una población mesenquimatosa que forma el mesodermo. Este proceso que sufren las células epiblásticas se denomina involución. El resto superficial de epiblasto se transforma en un epitelio que se denomina ahora ectodermo, con lo que ya tendremos las tres hojas germinales del embrión. Acompañando a este proceso la línea primitiva, tras llegar a su máximo desarrollo, sufre una regresión durante la cual se forma el esbozo de la notocorda y el mesodermo paraaxial o somítico. Este mesodermo forma los somitos, que son bloques pares que irán apareciendo y que nos servirán, junto con otras características, a asignar al embrión un estadio conforme a la clasificación de Hamburger y Hamilton (1951). Estos somitos se diferenciarán en dermatomo (origen de la dermis), miotomo (origen de músculos) y esclerotomo (origen de estructuras esqueléticas). A partir de este momento, y contando ya con las tres hojas germinales embrionarias, comienza el PERIODO ORGANOGENÉTICO. A partir de dichas hojas, aparecen los esbozos de los órganos. En primer lugar se produce un fenómeno de neurulación inducido por la notocorda. C. Neurulación y formación del Sistema Nervioso en aves Durante la fase de la neurulación tiene lugar la formación del tubo neural, y además el comienzo del desarrollo del tubo digestivo, del corazón y de la delimitación del cuerpo embrionario a partir de las tres hojas embrionarias. La neurulación comienza con un engrosamiento del ectodermo en la línea media dorsal, que formará la placa neural, cuyos bordes laterales se elevan dando los pliegues neurales. Posteriormente la depresión de la placa conforma el canal neural. La confluencia en la línea media de los pliegues termina en la fusión de los mismos, formándose el tubo neural. La parte más dorsal de los pliegues dará además la cresta neural. Los extremos son los últimos en cerrarse, dejando los denominados neuroporo rostral y caudal. Simultáneamente a la formación del tubo neural, la región cefálica del embrión crece sobre la superficie del blastodisco y se alarga, formando el pliegue cefálico. El conjunto de tejidos cefálicos elongados se llaman proceso cefálico. La porción cefálica del tubo neural, que presenta en un principio tres vesículas que rostrocaudalmente son: prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo. La primera de ellas se dividirá a su vez (estadio 12) en telencéfalo y diencéfalo, y la última en otras dos (estadio 11): metencéfalo y mielencéfalo. El sistema nervioso periférico se forma desde células de la cresta neural que darán, entre otros tipos celulares, neuroblastos que producirán células sensoriales y autónomas, que a su vez formarán parte del sistema simpático y parasimpático. En su conjunto, la cresta neural produce muy diversos derivados en el individuo, y sufre durante el desarrollo una interesante migración celular, muy estudiada utilizando el pollo como modelo. IV. TÉCNICAS DE ESTUDIO Existen muchas y variadas técnicas de estudio que utilizan el embrión de pollo como modelo experimental. A continuación pasaremos a comentar algunos aspectos prácticos de su uso en una experimentación, aportando ejemplos concretos que muestren las ventajas que proporciona dicha utilización. A. Incubación Comenzaremos hablando sobre cómo obtener embriones de pollo, primer paso a la hora de plantear cualquier estudio en embrión de ave. Normalmente se trabaja con huevos fertilizados o embrionados proporcionados por granjas productoras de los mismos o de pollos de un día, que son los que se venden habitualmente a las granjas para su engorde. Estos huevos deben mantenerse a una temperatura ideal de 10-12ºC antes de incubar, tiempo que debe ser el menor posible pues darán mejor resultado los huevos “frescos”. Huevos conservados por debajo de 4ºC reducen su viabilidad para incubar. Por encima de 27ºC comienza el desarrollo aunque de forma alterada. Utilizaremos un incubador comercial que consta de una cámara con termostato ajustado a la temperatura idónea, que será de 3738ºC, la cual debe mantenerse constante. Debe también evitarse la deshidratación del embrión, para lo que se dispondrá de un recipiente con agua en la base del incubador, que asegura una humedad alta. Además, si se realizan experiencias que sobrepasen la semana de incubación, deberá contar el incubador con un sistema de volteo del huevo que favorecerá el desarrollo del animal y evitará que éste se pegue a las membranas testáceas o de la cáscara. B. Datación del embrión Es importante conocer “la edad” del embrión en el momento concreto de su utilización. La mayoría de los procesos embriológicos tienen una historia muy definida y elegiremos un momento concreto para realizar nuestro experimento. Por ello existen diversas clasificaciones de los distintos estadios del desarrollo. Estas clasificaciones se denominan tablas normales, y la más ampliamente utilizada en el caso del pollo es la tabla de Hamburger y Hamilton (1951, 1992), basada en signos externos apreciables en el embrión y permite un rápido reconocimiento del estadio a utilizar. En las prácticas manejaremos estas tablas para familiarizarnos con la datación del embrión. No obstante y como en algunas edades plantea algún problema de correlación, sobre todo en fases muy tempranas, y también en relación con las horas para cada estadio, lo mejor es realizar una tabla personal de horas con el incubador a utilizar y su correlación con la tabla de Hamburger y Hamilton. Además si trabajamos con animales mayores de 4 días lo normal es referir cada edad en base al número de días de incubación. C. Técnicas in ovo Se pueden realizar muchos experimentos permitiendo que el desarrollo del animal continúe tras nuestra manipulación, pudiendo comprobar el resultado de nuestra intervención en el tiempo. En este tipo de experimentos el embrión de pollo es muy interesante, y la existencia del huevo facilita mucho el manejo y las manipulaciones a realizar en el embrión. En esta línea están todas las experiencias de quimeras, que tantos resultados han prestado y prestan en la actualidad a la embriología experimental. Por medio de las quimeras podemos realizar transplantes de grupos de células o tejidos en otra especie que permita una diferenciación del hospedador y el injerto. Esto es posible con la codorniz y el pollo. Las células de la codorniz presentan un gran nucleolo, con una heterocromatina densa, mientras que en el pollo normalmente hay dos o más nucleolos (le Douarin, 1969). De esta forma se pueden diferenciar los tejidos mediante la técnica de Feulgen (que marca ADN) o una modificación del método de hematoxilina de Harris. codorniz pollo Diversos injertos autólogos o heterólogos en la misma especie se pueden también realizar para comprobar como se desarrolla el injerto en otro lugar diferente al fisiológico. El grado de implantación y supervivencia en el pollo es muy alto, lo que convierte a esta especie y al modelo embrionario en el de elección para muchas experiencias con injertos. Otras técnicas in ovo serán las inyecciones o “duchas” de alguna sustancia como pueden ser anticuerpos bloqueantes, o las bolitas impregnadas de una molécula a testar, o transferencia de genes por medio de virus, que permitan sobreexpresar la molécula que nos interese estudiar. La secuencia de trabajo en todas estas técnicas será la misma. Tenemos que exponer el embrión a nuestra manipulación pero de manera que el animal pueda proseguir su desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Este porcentaje varía según la técnica realizada, el estadio del que se parte y al que queremos llegar, etc. D. Otras técnicas de estudio. Dentro de este epígrafe comentaremos algunas técnicas ampliamente utilizadas que no se realizan in ovo. Por un lado hablaremos de técnicas o estudios de expresión, por las que evidenciaremos aspectos morfológicos (histología e inmunohistoquímica) o bien analizaremos la expresión del elemento que nos interese estudiar (inmunohistoquímica e hibridación in situ). La mayoría de experiencias in ovo terminan con un estudio morfológico en el que se busca encontrar un marcador determinado para evidenciar las modificaciones provocadas por nuestra actuación. Todas estas técnicas tienen como denominador común la extracción del embrión en un estadio determinado (tabla de Hamburger-Hamilton) y una posterior preparación para la realización de la técnica, que habitualmente se inicia con la fijación del embrión o región del embrión a estudiar. Otras técnicas serán los estudios in vitro, donde se realizan cultivos de partes u órganos en formación del embrión, constituyendo un modelo experimental muy interesante para el estudio de mecanismos del desarrollo. V. DESARROLLO PRÁCTICO DEL TALLER Realizaremos el estudio del desarrollo de las primeras fases del embrión de pollo con el fin de comprender como tienen lugar algunos de los procesos fundamentales en embriología, así como la utilidad de este modelo en experimentación animal y la importancia de conocer los distintos fenómenos ontogénicos. Realizamos la apertura del huevo como si quisiéramos realizar alguna técnica in ovo. Tenemos que exponer el embrión a nuestra manipulación pero de manera que el animal pueda proseguir su desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Para exponer el embrión se realizan dos orificios en los polos del huevo y a continuación se levanta la cáscara con cuidado, y ayudados por la punta de una tijera, se rasgan las membranas testáceas y se añade suero o un tampón, que separa el embrión y vitelo de la cáscara. Ahora se extrae albúmina (“clara”) para conseguir reducir un poco el volumen del contenido del huevo, y que el embrión “descienda”, quedando un espacio entre las membranas testáceas y el contenido del huevo. Ahora disecamos las membranas testáceas y añadimos una solución del colorante rojo neutro al disco embrionario o al embrión, que nos permitirá visualizar mejor el embrión in toto y el resto de las estructuras. Procederemos a la datación (clasificación Hamburger y Hamilton, 1951) y estudio de embriones de ave de distintos estadios HH, que corresponderán a 24, 48, 72, 96 horas de incubación. También procederemos a aislar el embrión y observarlo detenidamente tras una sección en “U” de las envueltas del mismo, lo recogeremos con unas pinzas finas sin tocarle. Posteriormente lo depositaremos en una placa de Petri con una solución tampón o agua, y bajo lupa realizaremos una disección consistente en eliminar todas las envueltas que acompañan al embrión (restos de vitelo, membrana vitelina, amnios...) para una mejor visualización de las distintas estructuras y regiones de interés embrionario. Embrión de los estadios HH 4-6 (18-24 horas de incubación). Identificación de las áreas pelúcida y opaca y formación de la línea primitiva, surco primitivo y nodo de Hensen. Embrión de los estadios HH 13-15 (48-55 horas de incubación). Estudio de los derivados de las capas germinales primordiales. Derivados ectodérmicos: vesículas encefálicas (prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo), esbozo de las vesículas óptica y ótica o auditiva, tubo neural y neuroporo caudal, flexura craneal. Derivados mesodérmicos: notocorda, somitos. Endodermo: tubo digestivo. Inicio de la vascularización extraembrionaria (venas vitelinas, área vasculosa y seno terminal). Corazón latiendo y estableciéndose la circulación embrionaria primitiva. Formación del primer par de arcos viscerales y arcos aórticos. Cabeza rotada hacia la izquierda y pliegue cefálico amniótico revistiendo las vesículas encefálicas. Embrión del estadio HH 20-25 (72-96 horas de incubación). Establecimiento de los pliegues corporales laterales y rotación del cuerpo. Cierre del amnios. Esbozo de miembros torácicos y pelvianos. Cuatro-cinco arcos viscerales o branquiales y arcos aórticos. Flexura cervical y cabeza rotada centralmente. Diferenciación de las vesículas encefálicas definitivas. Circulación embrionaria y extraembrionaria. Nivel del corte para extraer el embrión. Bibliografía A series of normal stages in the development of the chick embryo. V. Hamburger and H.L. Hamilton. J. Morphol. 88, 49-92 (1951). (Reprinted 1992, Develop. Dynamics 195, 231-272) Atlas of Avian Radiographic Anatomy. S.A. Smith and B.J. Smith, Philadelphia: Saunders, 1992 The Avian Egg: Chemistry and Biology. R.W. Burley and D.V. Vadehra, John Wiley & Sons, New York, 1989 Genetics and Evolution of the Domestic Fowl. L. Stevens, CambridgeUniversity Press, New York, 1991 A Stereotaxic Atlas of the Brain of the Chick (Gallus domesticus). W.J. Kuenzel and M. Masson, The Johns Hopkins University Press,Baltimore, MD; 1988 Essential developmental biology: a practical approach. C.D. Stern and P.W.H. Holland, IRL Press at Oxford University Press, 1993 (avian embryos, pp.45-54) The atlas of chick development. R. Bellairs and M. Osmond, Academic Press, 1998 Embriología de los animales domésticos. D.M. Noden y A DeLahunta, Acribia, 1990 An atlas of embriology. Freeman and Bracedirdle, Heinemann educational books, 1972 Developmental biology. W.A. Müller, Springer, 1997 Lecciones de embriología veterinaria. A. Sánchez y I. Von Lawzewitsch, Ed. Hemisferio Sur, 1984 Embriología básica de Patten. B.M. Carlson, Interamericana-McGraw-Ill, 1990. “Transplantation in avian embryos” C.D. Stern, from Essential developmental biology: a practical approach, IRL Press at Oxford University Press, 1993. Atlas y guía de laboratorio de embriología de vertebrados. S. Wischnitzer, Ed. Omega, 1980. Páginas de interés en la red: Muchas de estas páginas están relacionadas con el desarrollo en general o de aves en particular, y otras tratan exclusivamente del “mundo del ave” http://www.ucalgary.ca/UofC/eduweb/virtualembryo/chick.html http://www.devbio.com/ http://www.vlib.org/Biosciences.html http://sdb.bio.purdue.edu/Other/VL_DB.html http://ag.ansc.purdue.edu/poultry/ http://anatomy.med.unsw.edu.au/cbl/embryo/Embryo.htm http://www.med.unc.edu/embryo_images/ http://www.med.uc.edu/embryology/contents.htm http://prex.las.vet.uu.nl/nca/ http://www.msichicago.org/exhibit/chick/chick.html http://www.urbanext.uiuc.edu/eggs/index.html http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm http://www.augie.edu/perry/ear/portalaudiology.htm http://www.lehman.cuny.edu/depts/biology/aisemberg/LabGuide.html#four http://www.uoguelph.ca/zoology/devobio/24hrchck/24ckintr.htm http://www.bib.ub.es/www4/4wembrio.htm#ema http://chickscope.beckman.uiuc.edu/resources/weblinks/ http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm#stages
