seminario nk 2009
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Cél l NK Células Dr. Norberto W. Zwirner - Laboratorio de Inmunopatología - IBYME La lógica g del sistema inmune y las células NK Respuesta inmune “lo microbiano no-propio” o “microbial non-self” “lo propio ausente” o “missing-self” Lo propio alterado/inducido” alterado/inducido o “altered/induced self” RRPs NKRs Células NK e importancia en humanos humanos. Casos de deficiencias de células NK y susceptibilidad a patógenos Deficiencias absolutas Deficiencias funcionales Caso Infecciones (patógenos) Caso 1 2 3 4 5 6 VZV, CMV, HSV VZV, M. avium CMV VZV VZV neumonía viral, EBV 1 2 3 4 5 6 Infecciones (patógenos) EBV EBV virus respiratorios CMV, VZV neumonía viral, EBV, HSV, VZV HSV, virus respiratorios F nciones Funciones ¾ Actividad anti-tumoral (citotoxicidad y secreción de IFN-γ) ¾ Actividad anti-viral ((lisis de células infectadas y secreción de IFN-γ) ¾ Inmunidad contra infecciones por bacterias y parásitos intracelulares (secreción de IFN-γ) ¾ ADCC ¾ Regulación de la respuesta inmune a través de un diálogo recíproco í con CDs CD y secreción ió d de citoquinas it i Dos escenarios posibles para que las células NK ejerzan sus funciones: Tejidos periféricos infectados/inflamados ec ados/ a ados Extravasación y migración Células Cél l NK en circulación sanguínea Órganos linfoides secundarios Células NK: ¿Cómo las definimos? 5-15% de CMSP CD3CD3-CD161+ CD161: NKR-P1C (humano), NK1.1 (ratón) ¿Cómo las definimos? CD3-CD57+ CD57: HNK-1, Leu7 Subpoblaciones CD3-CD56+ CD56: NCAM; ausente en ratón CD56dimCD16bright CD56brightCD16dim CD3-NKp46+ • 90% de las células NK de sangre periférica • CCR7-CD62L- (no trafican a OLS) • Expresan p receptores p de q quimocinas q que les permiten migrar a tejidos inflamados y mucosas • Capacidad de mediar CCDA • Intensa expresión de perforinas y granzimas, y alta actividad citotóxica natural • Baja capacidad de secreción de citoquinas • 10% de las células NK de sangre periférica • CCR7+CD62L+ (trafican a OLS) • No migran a tejidos inflamados • Baja capacidad de mediar CCDA • Débil expresión de perforinas y granzimas, y baja actividad citotóxica natural • Alta capacidad de secreción de citoquinas CD3 CD D56 Cél l NK: Células NK CD56bright y CD56dim CD56bright CD56dim Células NK de ratón 3% de células de bazo 6-10% de PBL Casi no se encuentran en ganglios linfáticos NK1.1+ (PK136) CD49b (DX5) CD3-NKp46 NK 46+ Células NK ¿Cómo las estudiamos en el laboratorio? Células NK: estrategias experimentales de estudio: aislamiento Fuente: sangre periférica, bazo, ganglios Células NK y actividades efectoras ¿un cambio de pensamiento? Células NK Células blanco: K562, YAC-1 ¿Todas son citotóxicas? ¿o son y secretoras de IFN-γ? γ mayoritariamente En este caso, ¿son “NKs” o son células inmunorregulatorias? ¿requieren algún ¿ g tipo de activación para ser citotóxicas? ¿qué se requiere para que alcancen funcionalidad completa? Waltzer T. y col. Curr. Opin. Immunol. 19:1-8, 2007 Células NK - “Mi i self “Missing lf hypothesis” h th i ” No lisis Monitoreo de los niveles de expresión p de moléculas de clase I del CMH + Célula NK Célula blanco Activadores + Inhibidores Lisis Receptores inhibidores: ITIMs Receptores activadores: sin ITIMs Mecanismos de citotoxicidad de las células NK NK Granzimas – perforinas Muerte mediada por receptores de superficie: FasL TRAIL Receptores activadores e inhibidores: motivos ITAM e ITIM Receptores activadores e inhibidores Ligandos reconocidos desconocidos Ligandos reconocidos Receptores activadores CD16 NCRs NKp30 Receptores inhibidores NKp46 KIR2DL KIR3DL KIR2DL, Kp44 MICA/B, ULBPs HLA-E Moléculas de clase I del CMH CD94/NKG2A NKG2D CD94/NKG2C Moléculas de clase I del CMH HLA-E Células NK CD85 (ILTs, LIRs) HLA-G KIR2DS, KIR3DS NCRs: familia de Receptores de Citotoxicidad Natural KIR: killer Ig-like receptors Cél l NK: Células NK KIRs KIR - clasificación l ifi ió KIR2DS1 KIR2DS2 KIR2DS3 . . . KIR3DL1 KIR3DL2 . . . Ly49 Los receptores inhibidores se distribuyen en forma solapada en diferentes células NK • Cada célula NK expresa al menos 3-4 receptores t inhibidores i hibid KIR o L Ly49. 49 • Todas las combinaciones permitidas por el haplotipo del individuo están representadas. • Estos receptores se expresan en foma variegada (monoalélica). • No existe recombinación genética entre genes de receptores de células NK NK. Ly49 y KIRs Ontogenia de las células NK (esquema simplificado) Sangre Célula NK inmadura PNK Célula NK maduras (no citotóxicas) g t CD56bbright IL-15 IL-7 CD34+ CD161+ IL-15R+ PLC: progenitor PLC p ogenito linfoide común CD34+ Ganglios linfáticos Célula NK madura (no citotóxica) Médula ósea Célula NK maduras (citotóxicas) CD56dim Bazo Células del estroma de la médula ósea Receptor de IL-15 (cadenas β -CD122- y γc) Precursor de células NK CD34+CD122+ Célula NK inmadura KIR+NKG2D+ Expresión de receptores de células NK humanas durante la ontogenia CD16 CD56 NKp46 CD161 NKG2D CD122 PNK Célula NK inmadura Médula ósea Célula NK Célula NK Célula NK CD56bright CD56dim activada Periferia Estadíos de maduración y Factores de transcripción NKP: precursor de células NK NKi: Célula NK inmadura NKm: Célula NK madura NKm (en periferia): ausentes NKPs y NKi: ausentes KO en Ikaros, Ets-1, PU.1 o Id2 KO en GATA-3, GATA 3 T T-bet, bet IRF-2 IRF 2 NKm (en periferia): casi ausentes GATA-3-/-: NKs ausentes en hígado IRF-2 -/-: NKs ausentes en sangre g periférica p -/T-bet : NKs ausentes en periferia (hígado, sangre) NKs en periferia: NKi (citotoxicidad y producción de IFN-γ baja) NKPs: normales NKm (en periferia): 50% / , MEF-// : baja citotoxicidad y CEBP γ-/CEBP-γ producción de IFN-γ (MEF: target en promotor de perforina) KO en MEF ((myeloid y Elf-like factor), ) MITF NKPs: normales; NKi: normales (microphtalmia-associated TF), CEBP-g (CCAAT/enhancer BP-g) Células NK: fenotipo y ontogenia Timo Progenitor linfoide Hígado g PNK Célula NK inmadura Célula NK madura PNK Célula NK inmadura Célula NK madura Célula NK inmadura Célula NK madura Médula ósea Célula madre Ganglios linfáticos PNK Célula NK inmadura Célula NK madura PNK Célula NK inmadura Célula NK madura Bazo PNK Células NK: N : ¿tole ¿tolerancia? a c a? 1) desarrollo normal en individuos y ratones deficientes en clase I (ausencia de ligandos para receptores inhibitorios) pero tolerantes a tejidos propios porque son hipo-respondedoras (baja citotoxicidad y secreción de IFN-γ). 2) El CMH del hospedador influencia el repertorio de receptores de células NK periféricas y su competencia funcional (distinto background genético -CMH- induce distinto repertorio de receptores de células NK). 3) La competencia funcional se adquiere durante la ontogenia, cuando los receptores inhibitorios reconocen a las moléculas de clase I del CMH propias del hospedador: “licenciamiento”. Requiere de ITIMs pero no de SHP-1 SHP-1. Tolerancia en Células NK: ¿ ¿licenciamiento o desarme? Licenciamiento Expresión estocástica de receptores inhibitorios Célula NK inmadura con receptores inhibitorios con especificidad hacia el CMH del individuo Célula del estroma de la médula ósea Cél l NK respondedora Célula d d X Receptores inhibitorios Receptores activadores Célula NK inmadura con Cél l del Célula d l estroma t receptores inhibitorios sin de la médula ósea especificidad hacia el CMH del individuo Célula NK hipo-respondedora M lé l de Moléculas d clase l I del d l CMH Yokoyama & Kim. Immunity 24;249, 2006 Tolerancia en Células NK: ¿ ¿licenciamiento o desarme? Desarme Expresión estocástica de receptores inhibitorios Ajuste correcto del balance inhibición-estimulación Célula NK inmadura con receptores p inhibitorios con especificidad hacia el CMH del individuo X Receptores inhibitorios Receptores activadores Célula NK inmadura con receptores p inhibitorios sin especificidad hacia el CMH del individuo Célula del estroma de la médula ósea Célula NK respondedora Sobre-estimulación Célula del estroma de la médula ósea Célula NK hipo-respondedora Moléculas de clase I del CMH Ligandos de Receptores activadores Yokoyama & Kim. Immunity 24;249, 2006 Células NK: CD94 y NKG2 NKG2D DAP10 Ligandos de NKG2D en humanos y ratón BALB/c C57BL/6 humano MICA/B C / MULT1 H60 α2 α1 Rae1α, β, γ α2 α1 Rae1δ, ε MULT1 α2 α1 α2 α1 ULBP-1, -2, -3 α2 α1 ULBP-4 Raet1G α2 α1 α2 α1 α3 3 HLA de clase I MICA/B TNF B C MICB MICA L α1 α2 • • • • • α3 TM E MICC A MICD CYT No asociada a β2-m Regulada l d por estrés é celular l l Expresión restringida p celular Molécula de superficie No presenta antígeno (“binding groove” cerrado) G F MICE MICA-NKG2D MICA NKG2D TCR (αβ or γδ) HLA clase I CMV M. tuberculosis Eliminación del patógeno; Inmunidad Lisis; homeostasis de epitelios Linfocitos Tγδ Vδ1 Linfocitos T αβ C28- CD8+ MICA Citotoxicidad, Producción de IFN-γ Linfocitos Tγδ Vγ2δ2 Lisis A B Estrés (choque térmico) Infección bacteriana (M. tuberculosis) Infección viral (CMV) ¿Consecuencias funcionales? gliadina; IL-15 (enterocitos) Factor/es desconocido/s en sinoviocitos Activación D Expresión intracelular de MICA en linfocitos TCD4+ y CD8+ Célula normal Transformación maligna Linfocitos T αβ CD4+ CD28- NKG2D+ Linfocitos T αβ CD8+ Células NK IL-15, TNF-α IL-15 Citotoxicidad, producción de IFN-γ Tumor Linfocitos T CD8+ intrapiteliales Destrucción celular y atrofia de vellosidades E Linfocitos T αβ CD4+ CD28NKG2DDestrucción celular y daño a las articulaciones Autoinmunidad Inmunovigilancia Zwirner N.W. et al., Inmunología (España) 25:25-38 (2006) C Papel en la inmunovigilancia contra tumores Cumulative incidence rates of cancer by cytotoxic activity of PBLs Crecimiento tumoral in vivo de A20 clase Ibaja. Mocikat R. y col. Immunity. 19:561-569, 2003 Célula MICA neotransformación NKG2D Cél l NK Célula IFN-γ Perforinas/ Granzimas Imai K., y col. Lancet 356:1795, 2000 Vigilancia inmunológica Diefenbach A. y col. Nature 43:3165-171, 2001 Cerwenka A. y col. PNAS 98:11521-11526, 2001 Friese M. y col. Cancer Res. 63:8996-9006, 2003 ¿Receptores activadores y sus ligandos? g Inmunoterapia clon C clon 1 clon 2 clon 3 FL-2 1250 1000 750 500 250 0 Cerwenka A. y col. PNAS 98:11521-11526, 2001 ** 30 40 50 60 70 day Fuertes M.B. y col. J. Immunol. 180:4606-4614, 2008 tumor siize (mm3) E humanos: En h MICA tumor siize (mm3) Diefenbach A. y col. Nature 413:165-171, 2001 1250 1000 750 500 250 0 ** 30 40 50 60 70 day Smyth M. y col. J. Exp. Med. 202:583-588, 2005 Neutralización ó de NKG2D in vivo con AcMo Célula NK NKG2D MCA Perforinas/ Granzimas NKG2DLs C57BL/6, BALB/c Fibrosarcomas IFN-γ Groh V. y col. Nature 419:734-738, 2002 En humanos Down-regulación g de NKG2D en linfocitos T CD8 p por cocultivo con rsMICA C1R-MICA C1R Sueros de pacientes con tumores MIC+ y MICSalih H. y col. J. Immunol. 169:4098-4102, 2002 Consecuencias: disminución de citotoxicidad y secreción de IFN-γ dependiente de NKG2D Nat Immunol Nat. Immunol. 6:928 6:928-937 937, 2005 Células NK y escape tumoral Crecimiento tumoral, metástasis, escape Expresión de NKG2DL por los tumores Vigilancia inmunológica dependiente de NKG2D tiempo Zwirner N.W. y col. CGFR 18:159-170 (2007) Problemas de la inmunoterapia Toxicidad Ef i id d Efectividad Selección natural de variantes tumorales refractarias a la inmunoterapia o fenotipos resistentes Inmunoterapia efectiva Vacunación, transferencia adoptiva d células, de él l etc t Nuevas variantes tumorales Células NK y fisiología fi i l í de d la l respuesta t inmune u e Diálogo recíproco con células dendríticas Fernandez N. et al. Nat. Med. 5:405, 1999 mDCs humanas estimulan ti l a células él l NK Down-regulación de MHC de clase I en A20 por transfección con m152 de MCMV. Mocikat R. y col. Immunity. 19:561-569, 2003 Crecimiento tumoral in vivo de A20 clase Ibaja. Priming in vivo Mailliard R. y col. J. Immunol. 171:2366-2373, 2003 Células NK + DCs: cocultivo El cocultivo induce la secreción de IL-12 en forma parcialmente dependiente del contacto célula-célula. DCs polarizadas por cocultivo con células NK (DC1) y uso para estimular linfocitos T CD4 + SEB. Respuestas Th1. DCs pulsadas con péptido específico de EBV y polarizadas por cocultivo con células NK (DC1) y uso para estimular li f it T CD8. linfocitos CD8 Estimulan respuestas por linfocitos T CD8 HLA A2 (targets: HLA-A2 (t t : células él l linfoblastoides li f bl t id B infectadas con EBV). Martín-Fontecha A. y col. Nat. Immunol. 5:1260-1265, 2005 a, b) mDCs DC (LPS) – inyección i ió en planta l del d l pie – recuento de células NK en ganglios a los 2 d. c) inyección en planta del pie de mDCs + inyección i.v o s.c de NKs marcadas con fluorocromo – recuento de células NK en ganglios a los 2 d. d, e) Fenotipo activado de las NKs (CD69) y producción de IFN-γ. c d e Las células NK son reclutadas a los OLS desde sangre, tienen fenotipo activado y producen IFN-γ. Depleción in vivo de células NK y respuesta proliferativa (CFSE) y producción de IFN-γ por células T CD4 tg (OVA-específicas). Ratones – transferencia de tgCD4s – 2d – inyección de mDCs/OVA – 1d – mediciones. Ferlazzo G. y col. PNAS 101:16606-16611, 2004 Células NK humanas co-localizan en áreas T de ganglios linfáticos humanos, en contacto cercano con DCs. Pero son CD16- Células NK human aisladas de ganglios linfáticos producen IFN-γ luego del contacto con mCDs (LPS). Y también proliferan en contacto con DCs en un proceso dependiente de IL-15. Zwirner N.W. et al., CGFR 18:159-170 (2007) Papel de receptores TLR en células NK Células NK humanas 24 h + citoquinas (IL-12, IL-15 o IFN-α) + agonistas de TLRs: poly(I:C) (TLR3), loxoribine (TLR7) o ODN-A, ODN-B, ODN-Ac or ODN-Bc (TLR9). • IFN-g • Expresión de NKG2D, TLR3, TLR7, TLR9, IL-12Rβ1, IL-12Rβ2 e IFN-αR • Citotoxicidad contra células blanco MICA- y MICA+ Girart M.V. y col. J. Immunol. 179:3472-3479, 2007 Secreción de IFN-γ Girart M.V. y col. J. Immunol. 179:3472-3479, 2007 Ganglios linfáticos NKp30L Patógenos, PMAPs NKp30 p Células dendríticas inmaduras IFN-γ, TNF-α Patógenos, PMAPs PRR Lisis (edición) IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 Células NK en circulación sanguínea CD56bright CD16dim CD56dim CD16bright Extravasación y migración a ganglios IFN-γ IFN-α Células dendríticas plasmacitoides Extravasación y migración a tejidos inflamados IL-12, IL 12 IL IL-15, 15 IL-18, IL-21 Macrófagos TH1 CTL Células dendríticas maduras Tejidos inflamados Estallido respiratorio AICL IFN-γ, TNF-α Receptores activadores CCR5, CCR7 TLRs Patógenos, PMAPs NKp80 Receptores inhibitorios IL-12, IL-15 IL-8 NK 30 NKp30 IFN TNF-α TNF IFN-γ, IFN-α Lisis (edición) IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 CD62L CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CX3CR1 Células dendríticas inmaduras NKp30L Células dendríticas plasmacitoides Patógenos, PMAPs IFN-γ IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 Migración a ganglios Células dendríticas maduras Células NK: ¿Quién las controla? Células NK en transplante de médula ósea Efecto GVL Ruggeri L. y col. Blood 94:333-339, 1999 KIR2DL1: HLA-C grupo 2: Asn77/Lys80 KIR2DL2, KIR2DL3: HLA-C grupo 1: Ser77/Asn80 TMO con donante haploidéntico D t clínicos Datos lí i Incompatibilidad KIR M j “engraftment” Mejor “ ft t” Protección de GVH Recidiva de la AML NO no (15,5% (15 5% off rejection) j ti ) no (GVHD=13,7%) si (75% al 5º año) SI yes (no ( rejection) j ti ) yes (no GVHD) no (0% al 5º año Células NK: ¿memoria inmunológica? O´Leary J. y col. Nat. Immunol. 7:507, 2006 Rag2-/- Se observa con DNFB, OXA y otros haptenos típicos Se transfiere por transferencia adoptiva de células Ly49C-I+ de hígado Dermatitis por contacto: hipersensibilidad Sun J.C. & Lanier L.L. Eur. J. Immunol. 39:2059, 2009 Células NK: ¿memoria inmunológica? Pyzik M. & Vidal S. Immunol. & Cell Biol. 87:261, 2009 Células NK: ¿presentadoras de antígeno? H Hanna J. J y col. l JCI 114:1612, 2004 Proteómica de fracciones de membrana de células NK (de amígdalas): clase II del CMH, CD80, CD86. ANKs: PHA+IL PHA+IL-2 2 Péptido HA Células NK: Luego del desarrollo de citotoxicidad, 1)) down-regulación g de NKp30, p , NKp46, p , NKG2D 2) captación de Ag (libre o complejos inmunes) 3) expresión de clase II del CMH 4) expresión de CD80/CD86 5)) p procesamiento/presentación p de Ag g 6) Estimulación de linfocitos T ¿respuestas Th1, Th2? HA recombinante Efectoras de la inmunidad innata: ¿Qué aprendimos? Papel crítico en el control de la iniciación, progresión y metástasis tumoral a través de receptores tales como los NCRs y NKG2D Modulación de la expresión de ligandos de receptores activadores de células NK para inducir una respuesta inmune anti-tumoral más eficiente No están exentas de mecanismos de escape tumoral Están sometidas a procesos de licenciamiento Primera fuente de IFN IFN-γγ en respuesta a agentes infecciosos (PMAPs) Moduladoras de la respuesta inmune adaptativa: Diál Diálogo recíproco í con CD CDs a ttravés é d de NK NKp30 30 Desvío de la respuesta inmune adaptativa hacia un perfil Th1 P Promoción ió del d l desarrollo d ll de d respuestas t citotóxicas it tó i por linfocitos li f it T CD8+ (CTLs) (CTL ) Migración a ganglios linfáticos por mecanismos dependientes de L-selectina ¿Funcionan F i con CPA CPAs?? ¿Poseen memoria inmunológica?
