efectos de filamentos de actina sobre la estructura y lisis de

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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2 151 517
kInt. Cl. : C12Q 1/28, C12N 9/76
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
C12N 5/00, G01N 31/00
G01N 33/48, G01N 33/86
C07K 1/00, A61K 31/00
A61K 38/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 93919997.2
kFecha de presentación : 13.08.1993
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 655 089
kFecha de publicación de la solicitud: 31.05.1995
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54 Tı́tulo: Efectos de filamentos de actina sobre la estructura y lisis de coágulos de fibrina.
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73 Titular/es:
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72 Inventor/es: Janmey, Paul A.;
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74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
30 Prioridad: 14.08.1992 US 929203
BRIGHAM AND WOMEN’S HOSPITAL
75 Francis Street
Boston, Massachusetts 02115, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.01.2001
ES 2 151 517 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.01.2001
Aviso:
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Lamb, Jennifer A.;
Lind, Stuart E. y
Stossel, Thomas P.
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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ES 2 151 517 T3
DESCRIPCION
Efectos de filamentos de actina sobre la estructura y lisis de coágulos de fibrina.
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a métodos
terapéuticos y diagnósticos para el tratamiento de
pacientes con lesión en los tejidos, en los que la actina extracelular libre está asociada con coágulos
sanguı́neos. La presente invención se refiere a
un método para determinar la cantidad de actina presente en un coágulo de fibrina. El método
implica la determinación in vitro de la cantidad
de actina en el coágulo, por incubación de dicho coágulo in vitro con proteı́nas que fijan actina. La invención se refiere especı́ficamente a la
incubación de tales coágulos en presencia de las
proteı́nas del plasma que fijan actina, gelsolina
y proteı́na que fija vitamina D. La invención se
dirige también a métodos para retirar la actina
de los coágulos sanguı́neos in vivo, por administración de proteı́nas que fijan actina a sujetos con
coágulos sanguı́neos.
Fundamentos de la invención
La lesión en los tejidos da como resultado la
activación de la cascada de coagulación, que conduce a la deposición de fibrina. Durante los eventos inflamatorios, moléculas que no se encuentran normalmente en el plasma pueden acceder
al espacio extracelular, afectando potencialmente
a la coagulación de la sangre. Algunas de estas moléculas pueden proceder de la acción de
las proteasas celulares sobre los componentes normales del plasma (por ejemplo, el fibrinógeno),
la liberación de gránulos de células inflamatorias
o la ruptura de las membranas del plasma celular. Estudios extensos acerca de los efectos de
los productos de degradación del fibrinógeno sobre la formación de coágulos de fibrina (Shen et
al., J. Biol. Chem. 252, 6184 (1977)) han suministrado información importante acerca de los
mecanismos por los que los eventos inflamatorios
conducen a alteraciones en el proceso de coagulación de la sangre. Las moléculas que alteran la
formación de geles de fibrina y la estructura de
los coágulos (Dhall et al., Thromb. Haemost. 35,
737 (1976); Carr y Gabriel, J. Lab. Clin. Med.
96, 985 (1980); Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med.
101, 545 (1983); Chow et al., Thromb. Res. 29,
243 (1983); Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 110,
747 (1987); Kamykowski et al., Biophys. Chem.
13, 25 (1981); Procyk y King, Biopolymers 29,
559 (1990)), pueden jugar un papel en la determinación de la eficacia hemostática de los coágulos
de fibrina, ası́ como de su capacidad para mediar
en la fibrinolisis dependiente de la fibrina (Suenson y Petersen, Biochim. Biophys. Acta 870, 510
(1986); Dhall et al., Thromb. Haemost. 49, 42
(1983)).
La lesión en los tejidos animales da como resultado la liberación de actina al espacio extracelular, incluyendo la corriente sanguı́nea. La actina es la proteı́na más abundante en las células
animales y constituye 10 a 20 % de la proteı́na de
muchas células nucleadas y 30 % de la proteı́na de
las células de los músculos. Las moléculas de actina fijan, cada una de ellas, una molécula de ATP
y se autoensamblan para dar filamentos largos,
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durante lo cual el ATP se hidroliza a ADP. Aunque aproximadamente la mitad de la actina de las
células que no son de los músculos es actina-F (la
forma de filamento de doble hélice, de tipo de varilla, que se ensambla a partir de los monómeros
de actina-G), las condiciones iónicas de los fluidos
extracelulares favorecen la polimerización de la
actina, de modo que virtualmente toda la actina
liberada a la sangre desde las células que mueren,
cabrı́a esperar que se polimerizase en filamentos
(Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138, 429-34
(1988)). En soluciones purificadas, en ausencia de
proteı́nas que acortan los filamentos, los filamentos de actina pueden alcanzar fácilmente longitudes de varios micrómetros. Sin embargo, si alguna
fracción de la actina liberada de las células lesionadas fuese desnaturalizada irreversiblemente, o
bien se uniese a una de las proteı́nas intracelulares que fijan actina, discutidas a continuación,
esta actina permanecerı́a monomérica.
Se ha encontrado actina a concentraciones micromolares en el plasma o suero de animales y seres humanos que experimentan una variedad de
tipos de lesión en los tejidos (Smith et al., J. Lab.
Clin. Med. 110, 189 (1987); Smith et al., Am. J.
Pathol. 130, 261 (1988); Smith et al., Blood 72,
214 (1988); Goldschmidt-Clermont et al., Gastroenterology 94, 1454 (1988); Lee et al., Hepatology 7, 825 (1987); Lee et al., Circ. Shock 28,
249 (1989); Lind et al., Am. Rev. Resp. Dis.
138, 429 (1988)). In vitro, esta proteı́na globular se ensambla para dar filamentos del tipo de
varilla, de muchos micrómetros de longitud; e in
vivo, experimenta intercambios rápidos entre formas monoméricas y poliméricas, un proceso regulado en el citoplasma por varias proteı́nas que
fijan actina (Stossel et al., Ann. Rev. Cell Biol.
1, 353 (1985)). Cuando se añaden a soluciones de
fibrinógeno, los filamentos de actina pueden interferir con el proceso de formación de coágulos
de fibrina, al impedir estéricamente la difusión
de protofibrillas de fibrina para dar lugar a haces
(Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841, 151
(1985)).
Debido a las grandes cantidades de actina que
hay en las células, la liberación de la actina de las
células que mueren suministra suficiente actina
para que tenga un efecto significativo sobre el micromedio, por aumento de la viscosidad de los fluidos extracelulares del plasma, por atrapamiento
de las células, por otros efectos tóxicos todavı́a no
identificados, y, como se discute más abajo, por
cambio de las propiedades fisicoquı́micas de los
coágulos de fibrina. La incorporación de actina
extracelular libre es tóxica para los tejidos animales, y especialmente para los sistemas renal y cardiopulmonar (Harper et al., Clin. Res. 36, 625A
(1988); Haddad et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87, 1381-85 (1990)). El fallo renal agudo es
una complicación de una lesión muscular, y las infiltraciones de actina en ratas causan elevaciones
transitorias del BUN y de los niveles de creatinina, coherentes con el fallo renal.
Además, puesto que cada molécula de actina
extracelular en un filamento tiene una molécula
de ADP asociada con ella, la presencia de actina
extracelular en la sangre puede tender a inducir o
aumentar la agregación de las plaquetas, en una
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manera que puede no ser ventajosa para el hospedante (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis.
138, 429-34 (1988); Scarborough et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 100, 1314-19 (1981)).
Hay muchas proteı́nas que de un modo natural
se asocian con la actina (para una revisión de las
proteı́nas que fijan actina, véanse Stossel et al.,
Ann. Rev. Cell Biol. 1, 353-402 (1985); Pollars
et al., Ann. Rev. Biochem. 55, 987-1035 (1986)).
Se cree, sin embargo, que hay dos proteı́nas, gelsolina (también llamada “brevina” y “factor despolimerizante de la actina”) y la proteı́na que fija vitamina D (también llamada globulina Gc) (DBP),
que son principalmente responsables de la fijación
de actina extracelular (Janmey et al., Blood 70,
529-30 (1987)).
El plasma de la sangre de los mamı́feros contiene concentraciones micromolares de estas dos
proteı́nas, que se unen a la actina con alta afinidad (Jammey y Lind, Blood 70, 524 (1987)).
Las proteı́nas que fijan actina con alta afinidad
se unen a la actina con una Kd inferior a 10−8 .
Ambas, gelsolina y DBP, se unen a la actina en
el suero y tienen actividad despolimerizante de la
actina. La DBP fija preferencialmente la actina
monomérica, mientras que la gelsolina fija preferencialmente filamentos de actina.
El documento WO-A-9115770 describe un método para disminuir la concentración de actina
libre en el plasma de animales, que comprende la
administración de proteı́nas que fijan actina, por
ejemplo, gelsolina.
La gelsolina es una proteı́na multifuncional
que fija actina, obtenida del citoplasma y fluidos
extracelulares de los mamı́feros. La gelsolina del
plasma difiere de la gelsolina celular sólo por la
adición de 25 aminoácidos en el extremo amino
de la molécula, y ambas gelsolinas son producto
de un gen único. La gelsolina del plasma tiene
tres sitios de fijación de actina y se une con alta
afinidad a la actina-G ó a la actina-F.
La gelsolina del plasma fija una segunda molécula de actina con una afinidad mayor que la
correspondiente a la fijación de una primera molécula de actina, y por consiguiente, forma complejos 2:1 con preferencia a los complejos 1:1, y fija
filamentos con preferencia a monómeros. Cuando
se añade a la actina-F, la gelsolina del plasma
separa el filamento de un modo no proteolı́tico
y permanece unida a un extremo del nuevo filamento formado. Si están presentes moléculas
de gelsolina libre, éstas separarán el filamento de
actina de manera sucesiva, hasta que sólo haya
presentes complejos de actina-gelsolina 2:1, despolimerizando ası́ rápidamente al filamento.
Las moléculas de gelsolina libre y complejada
(con actina), difieren en sus propiedades funcionales. Aunque la gelsolina libre puede separar
los filamentos de actina, los complejos de actinagelsolina no pueden.
La función primaria de la gelsolina en el
plasma es separar los filamentos de actina. Si
la gelsolina está presente en exceso respecto a
la actina, sólo resultarán complejos de gelsolinaactina; si la actina está en exceso muy grande,
hay oligómeros de actina libre y complejos de
gelsolina-actina. La separación de la actina
tiene lugar por medio de una escisión no pro-
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teolı́tica del enlace no covalente entre moléculas
de actina adyacentes (subunidades). La actividad de separación de la gelsolina se incrementa
por concentraciones micromolares de Ca2+ , y
se ha puesto de manifiesto que se inhibe por
el fosfatidil-inositol-bisfosfato (PIP2) y por el
fosfatidil-inositol-monofosfato (PIP). Puesto que
las concentraciones de Ca2+ extracelular están a
niveles milimolares y los fluidos extracelulares no
contienen normalmente PIP ó PIP2 en una forma
que inhiba la gelsolina, la gelsolina del plasma es
constitutivamente activa en los fluidos extracelulares.
La proteı́na que fija vitamina D (DBP), por
su parte, tiene un solo sitio de fijación de actina
y se une sólo a la actina monomérica (Van Baelin
et al., J. Biol. Chem. 255, 2270 (1980); Haddad,
J.G., Arch. Biochem. Biophys. 213, 538 (1982)).
Ambas, la gelsolina del plasma y la DBP, sirven
para desalojar a la actina de la circulación (Lind
et al. J. Clin. Invest. 78, 736 (1986); Harper et
al., J. Clin. Invest. 79, 1365 (1987); GoldschmidtClermont et al., J. Clin. Invest. 81, 1519 (1988)).
Se ha puesto de manifiesto recientemente que la
DBP previene la trombosis microvascular ocasionada por la inyección de actina monomérica a animales experimentales (Haddad et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 1381 (1990)). La gelsolina del
plasma y DBP constituyen ası́ un sistema de defensa diseñado para proteger al hospedante frente
a los efectos perjudiciales de la actina liberada a
la circulación.
Se ha sugerido que la unión de actina extracelular a la gelsolina o a DBP protege frente
a la formación de actina-F en la circulación, y
puede ser el mecanismo por el que dicha actina
se hace diana para su eliminación de la corriente
sanguı́nea (Lind et al., J. Clin. Invest. 78, 736-42
(1986); Sanger et al., Clin. Res. 36, 625A (1988)).
Por ejemplo, es sabido que se encuentran complejos de actina-gelsolina en la circulación después de
una lesión del pulmón inducida por ácido oleico
en conejos y gatos (Smith et al., Am. J. Path.
130, 261-67 (1988)), y en la hemolisis inducida
por fenil-hidrazina en conejos (Smith et al., Blood
72, 214-18 (1988)). En el marco clı́nico, los niveles de gelsolina disminuyen en pacientes que padecen el sı́ndrome de dolor respiratorio de adultos
(ARDS) (Lind et al., Am. Rev. Resp. Dis. 138,
429-34 (1988)), y en el plasma de pacientes que
padecen infección aguda de malaria falciparum
(Smith et al., Blood 72, 214-18 (1988)), y en la
sangre de tales pacientes son detectables complejos de gelsolina-actina. Asimismo, se han observado complejos de actina con DBP en el plasma
de pacientes que padecen necrosis hepática fulminante (Young et al., J. Lab. Clin. Med. 110, 83
(1987)). También se ha sugerido que una vez que
se ha rebasado la capacidad de las proteı́nas del
plasma para fijar actina extracelular libre, puede
detectarse la formación de filamentos intravasculares y la lesión endotelial (Harper et al., Clin.
Res. 36, 625A (1988); Haddad et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87, 1381-89 (1990)).
La gelsolina ha sido clonada (Kwiatkowski et
al., Nature 325, 455-58 (1986); Kwiatkowski et
al., J. Cell. Biol. 106, 375-84 (1988)) y se han
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identificado fragmentos de la proteı́na nativa que
retienen la capacidad de fijar la actina (Bryan, J.,
J. Cell Biol. 106, 1553-62 (1988); Yin et al., J.
Cell. Biol. 107, 465a (1988), resumen n◦ 2616;
Kwiatkowski et al., J. Cell. Biol. 108, 1717-26
(1989); Way et al., J. Cell. Biol. 109, 593-605
(1989)). DBP también ha sido clonada (Cooke
et al., J. Clin. Invest. 76, 2420-24 (1985); Yang
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7994-98
(1985)).
La hemostasis depende de un equilibrio entre la formación y la disolución de coágulos compuestos de redes de fibrina y proporciones variables de otras proteı́nas del plasma y células de la
sangre. Estas redes se forman por la polimerización de monómeros de fibrina en protofibrillas,
y la posterior asociación lateral de las protofibrillas en haces, que tiene lugar in vivo en una mezcla compleja (y potencialmente variable) de otras
proteı́nas. Puesto que la formación de coágulos
de fibrina es sensible a los efectos de las macromoléculas que impidan la difusión de las cadenas polı́meras en crecimiento, varias moléculas fisiológicamente importantes, tales como IgG, fibronectina, albúmina, glucosamino-glucanos, etc.
(Carr y Gabriel, J. Lab. Clin. Med. 96, 985
(1980); Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med. 101,
545 (1983); Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 110,
747 (1987); Carr et al., J. Lab. Clin. Med. 107,
199 (1986); Carr et al., Thromb. Res. 45, 539
(1987); Carr et al., Biochemistry 28, 1384 (1989)),
alteran la estructura de los geles de fibrina. Muchas de estas sustancias son componentes normales del plasma, y pueden explicar, en parte, las diferencias conocidas entre los coágulos del plasma
y los formados a partir de fibrinógeno purificado.
Los estudios de estos efectos sobre los coágulos
de fibrina han sugerido mecanismos por los que
los eventos inflamatorios conducen a alteraciones
en el proceso de coagulación de la sangre (Carr,
M.E., Thromb. Haemost. 59, 535 (1988)).
Sin embargo, los coágulos que se forman en los
sitios de lesión en los tejidos es probable que sean
diferentes de los preparados a partir de plasma
normal, y pueden contener proteı́nas liberadas
de plaquetas, glóbulos blancos, células endoteliales u otros tipos de células lesionadas, ası́ como
proteı́nas en fase aguda. Mientras que mucha investigación anterior sobre la sangrı́a y las tendencias trombóticas observadas en pacientes que padecen diferentes formas de lesión en los tejidos, se
ha centrado en la distorsión de la regulación de
los sistemas de coagulación y fibrinolı́tico, conocida conjuntamente como coagulación intravascular diseminada, se ha prestado poca atención a la
estructura y función de los coágulos que se forman
en tales pacientes, que podrı́an estar alterados
de modos clı́nicamente significativos. Por ejemplo, los cambios conformacionales en los coágulos
de fibrina pueden volverlos más susceptibles a su
ruptura por fuerzas mecánicas, sea que se encuentren de modo natural en el sistema vascular
o que se impongan por dispositivos médicos, tales como oxigenadores de membrana o ventiladores mecánicos. Alternativamente, las alteraciones
en la estructura de los coágulos pueden afectar
a su sensibilidad a la plasmina de las proteı́nas
fibrinolı́ticas, volviéndolos resistentes a la acción
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de la plasmina, de una manera análoga a la comunicada para un paciente que padecı́a una disfibrinogenemia congénita (Carrell et al., Blood 62,
439 (1983)). La posibilidad de que la actina, y
quizá otras proteı́nas intracelulares liberadas durante el trauma de los tejidos, puedan ejercer estos efectos, está sugerida por el hallazgo de que el
material liberado de las plaquetas altera tanto la
estructura, como la lisis de los coágulos de fibrina
in vitro (Dhall et al., Thromb. Haemost. 49, 42
(1983)).
Es sabido que la actina deteriora la secuencia normal de coagulación de la sangre y eventos fibrinolı́ticos. Los hallazgos recientes acerca
de la interacción de la actina con las proteı́nas fibrinolı́ticas, indican que la actina podrı́a afectar a
la estructura y función de los geles de fibrina. La
actina es capaz de promover la formación de plasmina cuando se añade a soluciones que contienen
Glu-plasminógeno y t-PA (Lind y Smith, J. Biol.
Chem. 266, 17673 (1991)). Sin embargo, cuando
los coágulos que contienen actina se ponen en un
baño de lisis que contiene plasminógeno y t-PA, se
inhibe la lisis de los coágulos. Aunque los experimentos con proteı́nas purificadas sugieren que la
actina es un inhibidor no competitivo de la plasmina (Lind y Smith, J. Biol. Chem. 266, 5273
(1991)), un efecto de la actina sobre la estructura de los coágulos de fibrina puede también ser
responsable de algunos de sus efectos inhibidores
sobre la lisis de los coágulos.
Se ha puesto de manifiesto anteriormente que
la actina interacciona con la fibrina (Laki y Muszbek, Biochim. Biophys. Acta 371, 519 (1974)) y
puede reticularse con ella in vitro bajo la acción
del Factor XIIIa (Mui y Ganguly, Am. J. Physiol. 233, H346 (1977)). Se ha comunicado que
los filamentos de actina alteran la estructura de
los coágulos de fibrina, dando como resultado la
formación de coágulos finos, menos turbios. La
adición de gelsolina, una proteı́na que acorta los
filamentos de actina, suprime este efecto, lo que
indica que los filamentos de actina se entrelazan con las fibrillas de fibrina, inhibiendo su asociación lateral (Janmey et al., Biochim. Biophys.
Acta 841, 151 (1985)).
La reologı́a de los coágulos de fibrina es, por
consiguiente, un aspecto importante de su funcionamiento fisiológico. La presente invención
se basa en el descubrimiento de los efectos de
la actina sobre las propiedades mecánicas de los
coágulos de fibrina.
Un ensayo que pueda utilizarse para evaluar
la cantidad de actina en los coágulos de fibrina in
vivo, particularmente cuando se ha producido una
lesión extensa en los tejidos, tiene valor clı́nico.
Tal método puede emplearse como diagnóstico
para determinar los regı́menes terapéuticos necesarios para contrarrestar el efecto de la actina
extracelular libre en los pacientes que sufren lesiones. Un régimen de tratamiento que elimine
la actina de un coágulo que contiene actina, es
asimismo de importancia terapéutica respecto al
restablecimiento de las propiedades viscoelásticas
normales de los coágulos in vivo.
Descripción de las figuras
Figura 1. Efecto de la actina-F sobre la reologı́a de la fibrina. Aumento del módulo de alma-
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cenamiento dinámico (G’) después de la adición
de trombina al fibrinógeno, medido por deformaciones por cizalladura oscilantes de 2 % de amplitud de deformación y frecuencia angular de 10
rad/s (1,6 Hz). La concentración de fibrinógeno
fue 2,0 mg/ml, y la concentración de actina (en
mg/ml) fue: 0 (cı́rculos blancos); 0,2 (triángulos
blancos); 0,4 (triángulos negros); y 1,0 (cı́rculos
negros). Todas las soluciones contenı́an NaCl 150
mM, CaCl2 2,2 mM, ATP 150 µM, MgCl2 1,9
mM, pH 7,4. Se añadió actina-G al fibrinógeno,
y 10 s más tarde se añadió 0,1 unidad NIH/ml de
trombina.
Figura 2. Eliminación del endurecimiento por
deformación, producido por la actina-F en geles
de fibrina. El módulo de cizalladura de los geles
de fibrina que contienen diversas concentraciones
de actina-F, a las concentraciones mostradas, se
ha medido a lo largo de un intervalo de magnitudes de la deformación, a una frecuencia angular
constante de 10 rad/s (1,6 Hz). Las condiciones
de reacción y los significados de los sı́mbolos se
dan en la leyenda de la Figura 1.
Figura 3. El acortamiento de la actina-F por
la gelsolina invierte su efecto sobre el endurecimiento por deformación y la histéresis de la fibrina. Se presenta el módulo de cizalladura G’
para medidas a 10 rad/s, a lo largo de un intervalo de amplitudes de deformación que comienza
en el 1 % y aumenta a 37 % (A) ó a 30 % (B y C)
(cı́rculos blancos). Después de la deformación a
la amplitud de deformación máxima, las medidas
de G’ se repitieron a amplitudes de deformación
máxima secuencialmente decrecientes, para indagar la recuperación de las muestras después de
la deformación (cı́rculos negros). Los tres paneles muestran los resultados para: 2 mg/ml de fibrina sola (A); fibrina más 0,2 mg/ml de actina-F
(B); y fibrina más oligómeros de actina (complejos
de actina-gelsolina, 3:1) (C). Otras condiciones se
dan en la leyenda de la Figura 1.
Figura 4. Unión de filamentos de actina y
complejos a geles de fibrina. Cantidades diversas
de actina-F sola marcada con rodamina (cı́rculos
blancos) o de actina polimerizada en presencia de
DBP (cı́rculos negros) o gelsolina (triángulos), se
añadieron al fibrinógeno (2 mg/ml; 6 µM) en T7
(NaCl 100 mM, Tris-Cl 50 mM, pH 7,4), antes de
la formación de coágulos por adición de 1,7 unidades NIH/ml de trombina. La relación molar de
DBP a actina fue 2:1, y la relación molar de gelsolina a actina fue 1:2 (triángulos negros) o bien
1:12 (triángulos blancos). La actina fijada se retiró de la solución por enrollamiento del coágulo
insoluble en una pipeta de vidrio, y la cantidad
de actina unida al coágulo se midió a partir de la
diferencia entre la fluorescencia de la muestra antes y después de la separación del coágulo, como
se describe en el texto.
Figura 5. Efecto de Ca2+ y de la longitud de
los filamentos de actina sobre la unión de actina
a la fibrina. La actina se polimerizó con diversas
relaciones molares de gelsolina, para producir filamentos de longitudes medias comprendidas en
el intervalo de 34 nm a 2,7 µm. La actina polimerizada a una concentración 6 µM se mezcló
con fibrinógeno 6 µM en soluciones que contienen
NaCl 100 mM, Tris-Cl 50 mM, pH 7,4, sea con
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CaCl2 3 mM (cı́rculos negros) o sin él (cı́rculos
blancos); y la actina unida a la fibrina después de
la adición de 1,7 unidades NIH/ml de trombina,
se midió como se describe en el texto.
Figura 6. Imágenes de fluorescencia confocal
(a, c, e, g, h) y de contraste de fase (b, d, f),
de coágulos de fibrina que contienen actina. La
adición de actina-F marcada con rodamina al fibrinógeno, antes de la formación de coágulos inducida por trombina, dio como resultado filamentos marcados fluorescentemente (panel a). La correspondiente imagen de contraste de fase (panel b) muestra que la fluorescencia de la actina
marcada se localiza junto con las hebras de fibrina. La incubación de la rodamina-actina con
gelsolina (paneles c y d) antes de la formación de
coágulos, dio como resultado un marcaje fluorescente reducido de la red de fibrina. En ausencia
de trombina, los filamentos de actina fluorescentes no pueden resolverse con el microscopio confocal (panel e). La correspondiente imagen de
contraste de fase (panel f) muestra que no se ha
formado un coágulo de fibrina. La inhibición de
la polimerización de actina por DBP dio como
resultado un marcaje fluorescente reducido de las
hebras de fibrina (panel g). La especificidad de la
interacción de la actina con la fibrina se pone de
manifiesto en el panel h, que muestra la ausencia de fibrina fluorescente cuando se añadió fluoresceı́na-avidina al fibrinógeno, antes de la formación de coágulos inducida por la trombina (panel h). Los paneles c y g se relacionan con datos
que muestran la fijación reducida de monómeros
de actina complejados con gelsolina y DBP, a geles de fibrina (véanse las Figs. 4 y 5). Barra en
el panel h=9 µm para todos los paneles.
Figura 7. Efecto de la longitud de los filamentos de actina sobre la reologı́a de la fibrina,
durante la lisis de los coágulos con plasmina. Aumento y disminución del módulo de cizalladura
dinámica (G’), medido en el péndulo de torsión,
de la fibrina sola (cı́rculos blancos) o de la fibrina con actina (cı́rculos negros), en función del
tiempo. La concentración de fibrinógeno fue 3
mg/ml y la concentración de actina-F fue 0,25
mg/ml. Los paneles A y B muestran los resultados en ausencia y en presencia de gelsolina, a una
relación molar de 1:12 respecto a la actina, respectivamente. Todas las soluciones contienen NaCl
140 mM, Tris-Cl 20 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2,5
mM, pH 7,4, con 0,4 unidades NIH/ml de trombina, y 0,3 unidades/ml de plasmina.
Figura 8. Efecto de la gelsolina externa sobre
la liberación de la actina de los coágulos de fibrina. Coágulos que contienen fibrina y actina se
prepararon en tubos de vidrio, por adición de 1,5
unidades NIH/ml de trombina. Las concentraciones de ambos, el fibrinógeno y la actina marcada
con rodamina, fueron 6 µM (2,0 mg/ml y 0,25
mg/ml, respectivamente). Una vez formados, los
coágulos se separaron con pipetas de vidrio, y se
sumergieron en baños que contienen tampón B
(cı́rculos blancos) ó tampón B + 0,2 mg/ml (2
µM) de gelsolina (cı́rculos negros). La liberación
de la actina del coágulo se midió como fluorescencia liberada al medio del baño, como se describe
en el texto. La liberación máxima de fluorescencia se obtuvo después de la lisis de los coágulos,
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con 1,3 unidades/ml de plasmina, en el tiempo
indicado por la flecha.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en la consideración de los inventores, de que la administración,
a los sujetos, de compuestos que fijan actina, o
sus derivados biológicamente activos, después de
una lesión en los tejidos, proporcionará protección
a otros tejidos sanos, por restablecimiento de las
propiedades viscoelásticas normales a los coágulos
que contienen actina. Es, por tanto, un objetivo
de la invención, crear un método para disminuir
los niveles de actina en los coágulos formados en la
corriente sanguı́nea y en el espacio extracelular de
un animal. Es, por consiguiente, un objetivo de la
invención, crear un método para liberar la actina
en los coágulos que contienen actina formados in
vivo. Un objetivo más de la invención es proporcionar tratamientos terapéuticos que puedan emplearse para tratar un animal, con el fin de protegerlo frente a una lesión secundaria en los tejidos,
que se produce debido a niveles de actina anormales, tales que se forman in vivo coágulos que contienen actina con propiedades viscoelásticas alteradas.
La presente invención se basa también en el
descubrimiento de los inventores de que los filamentos de actina atrapados en los coágulos de
fibrina pueden eluirse del coágulo por incubación
en presencia de una proteı́na que fija actina, y
cuantificarse. En consecuencia, la presente invención se dirige también a un procedimiento de
importancia terapéutica potencial, en el que se
aı́sla plasma de pacientes que sufren lesión en
los tejidos, se deja que se formen coágulos, y dichos coágulos se incuban luego en presencia de
una proteı́na que fija actina, y se cuantifica la actina liberada de ellos. Este procedimiento proporciona un ensayo para evaluar la cantidad de actina
atrapada en los coágulos de fibrina in vivo, en el
plasma de pacientes con diversos tipos de lesión
en los tejidos.
Es, por tanto, un objetivo de la invención
crear un método para evaluar con precisión las
propiedades de los coágulos en pacientes in vivo,
en el que dichos pacientes sufren una extensa
lesión en los tejidos, por determinación de la cantidad de filamentos de actina atrapados en dichos
coágulos.
Descripción de las realizaciones preferidas
A fin de facilitar una comprensión más clara
y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, que incluya el alcance que se da a
los términos empleados, se ofrecen a continuación
las siguientes definiciones.
Compuesto que fija actina. La expresión
“compuesto que fija actina” se entiende que incluye cualquier compuesto, y especialmente cualquier proteı́na (o péptido), que es capaz de fijar la
actina, de tal modo que se modifique cualquiera
de las muchas funciones de la actina, incluyendo
la supresión de la capacidad de los monómeros
de actina para polimerizarse en filamentos, y que
está sustancialmente libre de contaminantes naturales que se asocien con tal compuesto, sea in vivo
(en un hospedante procariótico o eucariótico) o
in vitro (como resultado de una sı́ntesis quı́mica).
Tales compuestos incluyen, pero sin limitarse a
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ellas, proteı́nas extracelulares que fijan actina, tales como la gelsolina y la DBP, y proteı́nas intracelulares que fijan actina, tales como las que más
abundan en las células (por ejemplo, miosinas,
tropomiosinas, profilina y cofilina) y las que más
abundan en células que no sean de los músculos.
Los compuestos que fijan actina, dentro del alcance de los métodos de la invención, también
incluyen, pero sin limitarse a ellos: a) compuestos que fijan actina, que secuestran predominantemente los monómeros de actina, es decir, fijan
los monómeros en un complejo que es resistente
a la polimerización (por ejemplo, DBP, profilina,
depactina, cofilina, y ADNasa I); b) compuestos
que fijan actina, que secuestran monómeros y poseen actividad de separación de filamentos (por
ejemplo, gelsolina, villina, fragmina y severina);
c) compuestos que fijan actina, que bloquean predominantemente los extremos de los filamentos de
actina e impiden el intercambio de monómeros
con esos extremos (por ejemplo, proteı́na para
protección terminal, β-actinina y acumentina); y
d) moléculas no proteináceas que fijan actina, que
tienen tales efectos sobre la actina (por ejemplo,
citocalasina o sus derivados biológicamente activos, que bloquean los extremos de los filamentos
de actina).
Si se desea, tales compuestos pueden administrarse al sujeto en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.
Evento trombótico. La expresión “evento
trombótico” se entiende que designa cualquier
afección vascular, en la que una oclusión vascular,
trombosis, infarto u otra perturbación biológica,
da como resultado una fibrinolisis.
Coágulo que contiene actina. La expresión
“coágulo que contiene actina” se entiende que designa, para los fines de la presente invención, un
coágulo de acuerdo con la definición que figura inmediatamente a continuación, en el que el coágulo
contiene filamentos de actina y/o monómeros de
actina sobre la fibra del coágulo, o filamentos de
actina atrapados en los intersticios de la red de
fibrina. La actina contenida en el coágulo puede
ser el resultado de un atrapamiento, de un enlace
covalente, y de otros tipos de enlace, tales como
el de hidrógeno, iónico y otros tipos no covalentes de interacción fı́sicoquı́mica. La actina puede
también estar contenida en el coágulo como un
mero resultado del atrapamiento.
Coágulo. El término “coágulo” se entiende
que designa, para los fines de esta invención, una
masa insoluble, blanda, no rı́gida, que se forma
cuando la sangre se gelifica. El término “coágulo”
se aplica particularmente a la fase coagulada de
la sangre; es decir, la masa roja blanda, consistente, gelatinosa, resultante de la conversión del
fibrinógeno en fibrina, que atrapa ası́ los glóbulos
rojos (y otros elementos formados) dentro del
plasma coagulado. El coágulo puede formarse
dentro o fuera del cuerpo. Algunos coágulos pueden parecer amarillos, debido al sedimento de
los eritrocitos antes de la aparición de la coagulación. Este tipo de coagulación puede tener
lugar cuando se deja que los coágulos se formen
fuera del cuerpo. Los coágulos sanguı́neos pueden ser también coágulos de tipo externo, que son
coágulos formados fuera de un vaso sanguı́neo.
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Los coágulos internos se forman dentro de un
vaso sanguı́neo. Los coágulos de los músculos
pueden formarse por coagulación del plasma del
músculo. Un coágulo sanguı́neo puede también
estar compuesto de fibrina y plaquetas. Cuando
se forma ası́, el coágulo se denomina coágulo lavado o blanco.
Lesión en los tejidos. La expresión “lesión en
los tejidos” significa, para los fines de esta invención, una lesión en los tejidos que da como
resultado una trombosis. Tales lesiones incluyen,
pero sin limitarse a ellas, neumonı́a, trauma, infarto de miocardio o infarto de cualquier órgano,
pero, en particular, infarto de miocardio, porque el corazón contiene cantidades significativas
de actina. Las lesiones por aplastamiento son
también relevantes para la presente invención,
porque el músculo voluntario contiene cantidades
significativas de actina. El tipo de lesión que es
relevante para la presente invención es el tipo de
lesión que libera actina al espacio extracelular a
través de las células de la sangre o de las células
de los tejidos fijos, ası́ como la liberación de materiales tromboplásicos, que origina la formación
de coágulos de fibrina en tales áreas, de modo que
el coágulo de fibrina atrapa la actina. En general, la lesión celular a la que la invención se dirige
es una lesión en la que hay inflamación y lesión
celular, ası́ como formación de coágulos, de modo
que la lesión celular podrı́a ser una fragmentación
de neutrófilos o plaquetas en la sangre o daños a
órganos fijos como el corazón o el hı́gado.
Animal. El término “animal” se entiende que
incluye todos los animales en los que la acumulación de actina libre o filamentos de actina en
la corriente sanguı́nea o en el espacio extracelular serı́a perjudicial para la fisiologı́a del animal.
Los principales entre tales animales son los seres
humanos; sin embargo, la invención no pretende
limitarse a ellos, estando dentro de la contemplación de la presente invención el tratamiento
de cualesquiera animales que puedan experimentar el efecto beneficioso de la invención.
Cantidad eficaz. Una “cantidad eficaz” de un
compuesto que fija actina es una cantidad suficiente para liberar actina de un coágulo con actina
unida, formado en un animal que padece lesión en
los tejidos.
Una cantidad eficaz de un compuesto que fija
actina es también una cantidad que es suficiente
para reducir o eliminar la cantidad de actina encontrada en un coágulo que contiene actina in
vivo.
Sustancialmente libre de contaminantes naturales. Un material se dice que está “sustancialmente libre de contaminantes naturales”, si
ha sido sustancialmente purificado de materiales con los que se encuentra normalmente y de
un modo natural antes de tal purificación. Los
ejemplos de contaminantes naturales con los que
podrı́an asociarse los compuestos que fijan actina son: péptidos que no fijan actina, carbohidratos, péptidos glicosilados, lı́pidos, membranas, etc. Un material se dice que está sustancialmente libre de contaminantes naturales, si los
contaminantes encontrados normalmente y de un
modo natural con la sustancia in vivo o in vitro
están sustancialmente ausentes de una muestra
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del material. Por “sustancialmente ausentes” se
entiende que tales contaminantes están completamente ausentes o que están presentes a concentraciones tan bajas, que su presencia no interfiere
con el efecto deseado del agente activo (en este
caso, el compuesto que fija actina) en la preparación, cuando tal preparación se incuba con el
coágulo de fibrina que contiene actina al que se
dirige la presente invención.
Por “sustancialmente ausentes” se entiende
también que tales contaminantes están completamente ausentes o que están presentes a concentraciones tan bajas, que su presencia no interfiere
con el efecto terapéutico deseado del agente activo
(en este caso, el compuesto que fija actina) en la
preparación, cuando tal preparación se administra a un animal y no perjudica al animal, como
resultado de la administración de la preparación.
Administración. El término “administración”
se entiende que incluye la introducción de compuestos que fijan actina a cualquier animal, por
cualquier medio apropiado conocido en la técnica
médica, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, la
administración entérica y parenteral (por ejemplo, intravenosa).
Tratamiento. El término “tratamiento” se entiende que incluye la administración de compuestos que fijan actina a un sujeto, con fines que pueden incluir profilaxis, mejoramiento, prevención o
curación de trastornos relacionados con la actina.
Incubación. El término “incubación” se entiende que incluye la introducción de compuestos
que fijan actina.
Sal farmacéuticamente aceptable. La expresión “sal farmacéuticamente aceptable” se entiende que incluye sales de los compuestos que
fijan actina de la invención. Tales sales pueden
formarse a partir de ácidos o bases farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, ácidos
como el sulfúrico, clorhı́drico, nı́trico, fosfórico,
etc., o bases como los hidróxidos de metales alcalinos o alcalino-térreos, hidróxidos de amonio,
hidróxidos de alquil-amonio, etc.
Vehı́culo farmacéuticamente aceptable. La expresión “vehı́culo farmacéuticamente aceptable”
se entiende que incluye disolventes, excipientes,
diluyentes y similares, que se utilizan como aditivos para preparaciones de los compuestos que
fijan actina de la invención, de modo que proporcionen un excipiente o coadyuvante para la administración de tales compuestos.
Fragmento. El término “fragmento” se entiende que incluye cualquier porción de una molécula que proporciona un segmento de un compuesto que fija actina, que es capaz de fijar monómeros de actina; el término se entiende que incluye los fragmentos que fijan actina, que están
hechos de cualquier fuente, tal como, por ejemplo,
de secuencias de péptidos que se encuentran en
la naturaleza, secuencias de péptidos sintéticos o
sintetizados quı́micamente, y secuencias de péptidos obtenidas por ingenierı́a genética. Además, si
tal fragmento es un péptido, un fragmento de un
péptido de tal proteı́na que fija actina se entiende
que incluye cualquier variante de la proteı́na que
fija actina.
Variante. Una “variante” de un compuesto tal
como un compuesto que fija actina, se entiende
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que se refiere a un compuesto sustancialmente similar en estructura y actividad biológica al compuesto nativo o a uno de sus fragmentos.
La actividad biológica de los compuestos de la
invención es su capacidad para fijar actina y modificarla a una forma tal que pueda ser liberada
de un coágulo de fibrina in vitro. Tal modificación
puede ser el resultado de la unión de los compuestos por sı́ mismos, o el resultado de una reacción
quı́mica o enzimática que resulta de tal unión.
Derivado funcional. Un “derivado funcional”
de un compuesto que fija actina es un derivado
que posee una actividad biológica que es sustancialmente similar a la actividad biológica del compuesto que fija actina. Por “sustancialmente similar” se entiende la actividad que es cuantitativamente diferente pero cualitativamente igual. Por
ejemplo, un derivado funcional de una proteı́na
que fija actina de la invención contendrı́a la
misma cadena principal de aminoácidos que una
proteı́na que fija actina, pero contiene además
otras modificaciones, tales como modificaciones
posteriores a la traducción, como, por ejemplo,
fosfolı́pidos unidos o un carbohidrato enlazado
covalentemente, dependiendo de la necesidad de
tales modificaciones para la eficiencia del ensayo
diagnóstico o el tratamiento terapéutico. Tal
como se usa en la presente invención, el término se
entiende que incluye también un derivado quı́mico
de un compuesto que fija actina. Tales derivados
pueden mejorar la solubilidad del compuesto, la
absorción, la semivida biológica, etc. Los derivados pueden también disminuir la toxicidad de la
molécula, o eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la molécula, etc. Los derivados, y especı́ficamente restos quı́micos capaces de mediar en tales efectos, están descritos en
“Remington’s Pharmaceutical Sciences” (1980).
Los procedimientos para acoplar tales restos a
una molécula son bien conocidos en la técnica.
La expresión “derivado funcional” se entiende que
incluye los “fragmentos”, “variantes”, “análogos”
o “derivados quı́micos” de una molécula.
Análogo. Un “análogo” de los compuestos que
fijan actina de la invención se entiende que se refiere a un compuesto sustancialmente similar en
su función al compuesto nativo que fija actina o a
uno de sus fragmentos. Por ejemplo, un análogo
de una proteı́na que fija actina es una proteı́na
que no tiene la misma secuencia de aminoácidos
que una proteı́na que fija actina, pero que es suficientemente homóloga a una proteı́na que fija
actina, como para retener la actividad biológica
de tal proteı́na que fija actina.
Los Solicitantes han descubierto que hay dos
tipos de interacciones actina-fibrina. Una interacción relativamente no especı́fica es debida al
atrapamiento de filamentos de actina dentro del
gel de fibrina, y un tipo más especı́fico de unión
ocurre incluso cuando los filamentos de actina son
más cortos que el tamaño medio de poro del gel
de fibrina. La adición de la proteı́na que fija vitamina D, que se une a los monómeros de actina e
impide su polimerización en filamentos de actina,
tiene un efecto sobre la cantidad de actina unida a
los coágulos, que se parece al efecto de la gelsolina
del plasma. Ambas proteı́nas inhiben la unión,
apoyando la idea de que los coágulos de fibrina
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atrapan filamentos de actina. El descenso del contenido en el plasma de una u otra proteı́na en la
vecindad de un coágulo en formación, darı́a, por
tanto, probablemente como resultado cantidades
aumentadas de actina asociada con el coágulo.
No es sorprendente que algo de actina se una a
la fibrina, incluso cuando están presentes concentraciones equimolares de estas proteı́nas que fijan
actina, puesto que la reticulación de la actina con
la fibrina por medio del Factor XIIIa supone una
interacción especı́fica entre actina y fibrina (Muti
y Ganguly, Am. J. Physiol. 233, H346 (1977)).
Las propiedades reológicas de los coágulos que
contienen actina difieren de las de los coágulos de
fibrina pura, como cabrı́a esperar cuando se mezclan entre sı́ dos redes de filamentos que se entrelazan. Investigadores anteriores han puesto de
manifiesto que las propiedades reológicas de las
redes de actina y fibrina difieren tanto cuantitativamente como cualitativamente, y la viscoelasticidad de una mezcla de dos de tales polı́meros
es difı́cil de predecir (Janmey et al., J. Cell. Biol.
113, 155-60 (1991); Janmey et al., J. Rheol. 27,
135 (1983)). Los Solicitantes han descubierto
que la incorporación de actina a un coágulo de
fibrina conduce a una desaparición de una de
sus propiedades inusuales, el endurecimiento por
deformación, y reduce su capacidad para resistir grandes deformaciones sin cambio estructural. Los coágulos que contienen actina son, por
consiguiente, más frágiles que los que carecen de
ella. La adición de gelsolina, que gelatiniza la red
de actina, impide este efecto, lo que sugiere que
la fragilidad de los coágulos de actina/fibrina se
debe más a interacciones estéricas entre los dos
tipos de filamentos, que a la unión directa actina/fibrina. En términos breves, la actina puede
incorporarse a los coágulos de fibrina sin comprometer sus propiedades fı́sicas, en tanto que los
filamentos no sean demasiado largos.
La gelsolina ejerce, por tanto, un efecto protector sobre los coágulos de fibrina, cuando se
añade a la actina antes de que se forme el coágulo
de fibrina. Por acortamiento de la actina, la
gelsolina disminuye la cantidad de actina asociada con el coágulo y mantiene las propiedades
reológicas del coágulo. Adicionalmente, la gelsolina es capaz de acortar los filamentos de actina atrapados en un coágulo de fibrina, permitiendo que buena parte de la actina asociada con
el coágulo se difunda desde el coágulo. Estos experimentos también confirman que la actina asociada con el coágulo inhibe la fibrinolisis mediada
por plasmina. La eliminación de la actina de un
coágulo por la gelsolina del plasma puede, por
consiguiente, considerarse que es beneficiosa, en
tanto que ayuda al restablecimiento de los mecanismos homeostáticos que regulan la formación y
disolución de los coágulos.
Por consiguiente, la presente invención se dirige a un método para eliminar o reducir la actina de un coágulo in vivo, por la administración
de cantidades eficaces de una proteı́na que fija
actina. En una realización preferida, se administran al sujeto que necesita el tratamiento, gelsolina, DBP o sus fragmentos que fijan actina, o una
combinación de gelsolina y DBP y/o sus fragmentos que fijan actina.
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En una realización, los niveles eficaces de compuestos que fijan actina se administran de modo
que se libere la actina asociada con los coágulos
in vivo, y se contrarreste ası́ el efecto de una excesiva actina extracelular sobre la formación de
coágulos in vivo. Por “niveles eficaces de compuestos que fijan actina” se entiende los niveles a
los que los efectos tóxicos de la actina extracelular libre sean, como mı́nimo, mejorados. Los efectos tóxicos de la actina extracelular libre son, por
lo que se refiere a la presente invención, aquellos
efectos tóxicos que constituyen el resultado de
alteraciones perjudiciales en las propiedades viscoelásticas o la velocidad de lisis de los coágulos
in vivo. Por “actina extracelular excesiva” se entiende una cantidad de actina extracelular que excede la capacidad de las proteı́nas que fijan actina
para fijar y desalojar la actina de los fluidos extracelulares, sin un daño incidental secundario a los
tejidos o sin producir efectos tóxicos. Por “daño
secundario a los tejidos o efectos tóxicos” se entiende el daño a los tejidos o los efectos tóxicos
que tienen lugar en tejidos, órganos y células de
los mismos, por lo demás sanos, debido a la presencia de coágulos que contienen actina, usualmente como resultado de una lesión primaria de
los tejidos en otra parte del cuerpo.
En los métodos de la invención, la incorporación de compuestos que fijan actina, tales como
la gelsolina, DBP o sus fragmentos que fijan actina, da como resultado la reducción o la eliminación completa de la actina de los coágulos que
contienen actina in vivo.
Los compuestos que fijan actina pueden conjugarse, sea quı́micamente o por ingenierı́a genética,
a fragmentos de otros agentes que hacen que tales compuestos que fijan actina se dirijan a un
sitio de acción deseado. Alternativamente, otros
compuestos pueden conjugarse, sea quı́micamente
o por ingenierı́a genética, a otro compuesto que
fija actina o sus fragmentos activos, de modo que
se mejore tal compuesto que fija actina o se le
impartan propiedades adicionales, especialmente
propiedades que mejoren la capacidad del compuesto para promover la liberación de los efectos
tóxicos de la actina. Por ejemplo, puesto que la
actina promueve la coagulación de la sangre intravascular e inhibe la fibrinolisis, por conjugación
del activador del plasminógeno de los tejidos y/o
de una antitrombina, tal como la hirudina o sus
fragmentos activos, con el compuesto que fija actina, se puede dirigir un agente fibrinolı́tico a los
sitios donde la lesión en los tejidos liberaba la actina que promovı́a la formación de coágulos que
fijan actina.
Las cantidades y regı́menes de administración
de los compuestos que fijan actina pueden determinarse fácilmente por las personas con experiencia normal en la técnica clı́nica de tratamiento de
los trastornos relacionados con la actina, lesión en
los tejidos e inflamación. Generalmente, la dosificación para el tratamiento con el compuesto que
fija actina variará dependiendo de consideraciones
tales como: tipo de compuesto que fija actina empleado; edad; salud; afecciones que están siendo
tratadas; clase de tratamiento concurrente, si es
que lo hay, frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado; alcance del daño en el te-
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jido; género; duración de los sı́ntomas; y contraindicaciones, si las hay; ası́ como otras variables que
han de ser ajustadas por el médico responsable.
La dosis puede administrarse en una o más aplicaciones para obtener los resultados deseados.
La dosificación puede calcularse de la siguiente
manera. La concentración normal de gelsolina en
la sangre es 2,4 µM (2,4 µmol/l) y la concentración normal de DBP en la sangre es 5 µM (5
µmol/l). Para la gelsolina, la capacidad normal
de fijación de actina es 4,8 µM. Por consiguiente,
la capacidad total de fijación de actina en la sangre (ABC) es aproximadamente 9,8 µmol/l. El
volumen de la sangre es 6 % del peso corporal; por
tanto, una persona de 70 kg tiene 4,2 l de sangre,
y por consiguiente, (4,2 l × 7,5 µmol/l) 31,5 µmol
de ABC. Puesto que la DBP y la gelsolina se distribuyen por todo el espacio extracelular (que es
10 % del peso corporal), el cuerpo contiene (7,5 ×
7) 52,5 µmol de ABC.
Puede desearse administrar entre 32 y 53 µmol
de un compuesto que fija actina (ó 0,46 µmol/kg
de peso corporal) para cubrir el complejamiento
total o agotamiento de la ABC endógena. Puesto
que 42,5 mg de actina es igual a 1 µmol, y
puesto que hay 4,86 mg de actina por cada gramo
de músculo voluntario, cada gramo de músculo
contiene 0,114 µmol de actina, ó una destrucción de 460 g de músculo podrı́a neutralizar
la ABC total del cuerpo. Sin embargo, puesto
que los efectos tóxicos de la actina son presumiblemente locales (por ejemplo, inhibición de
la lisis de los coágulos), aislados o determinados
por la cinética (por ejemplo, la actina penetra
en un órgano en menos tiempo que el necesario
para que la neutralicen las proteı́nas de fijación),
es probable que una dosis mı́nima teórica tenga
que ser ajustada en sentido creciente, para lograr
efectos terapéuticos cinéticamente favorables. El
efecto cinético puede ser importante, por ejemplo, puesto que la hemolisis de aproximadamente
la mitad del eritrón, que liberarı́a sólo 4,2 µmol
de actina, reduce agudamente a la mitad la concentración de gelsolina en el plasma (Smith et al.,
Blood 72, 214-2181 (1988)), sugiriendo un equilibramiento lento entre los compartimientos extravascular y de la sangre. Inversamente, un estado
terapéuticamente eficaz, capaz de desintegrar los
depósitos locales de actina, puede ser alcanzable
por sólo un pulso transitorio de una alta concentración de moléculas que fijan actina.
Los compuestos de la invención pueden administrarse en cualquier excipiente farmacológico
adecuado para la administración. Pueden administrarse en cualquier forma que propicie condiciones profilácticas, paliativas, preventivas o curativas de la lesión de los tejidos, en seres humanos
y animales.
Las preparaciones de las proteı́nas que fijan
actina de la invención, para administración parenteral, incluyen disolventes estériles acuosos o
no acuosos, suspensiones y emulsiones. Ejemplos
de disolventes no acuosos son el propilenglicol,
polietilenglicol, aceite vegetal, aceite de pescados y ésteres orgánicos inyectables. Los excipientes acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones
o suspensiones agua-alcohol, incluyendo solución
salina y vehı́culos médicos parenterales tampona9
17
ES 2 151 517 T3
dos, como la solución de cloruro de sodio, solución
de dextrosa de Ringer, solución de dextrosa más
cloruro de sodio, solución de Ringer que contiene
lactosa, o aceites fijos. Los vehı́culos intravenosos
incluyen reaprovisionadores de fluidos y nutrientes, reaprovisionadores de electrolitos, tales como
los basados en la dextrosa de Ringer y similares.
Las proteı́nas que fijan actina de la invención
pueden también administrarse por medio de bombas, o en una forma de liberación prolongada,
especialmente cuando la lesión primaria se prolonga o demora más bien que hacerse aguda. Un
ejemplo en el que la lesión primaria frecuentemente se prolonga o demora más bien que hacerse aguda, es un infarto de miocardio en el
que el daño al músculo del corazón no se revela (o persiste) hasta dı́as después del ataque
primario al corazón. Las moléculas que fijan actina de la invención pueden suministrarse también
a órganos especı́ficos, a alta concentración, por
medio de catéteres adecuadamente insertados, o
proveyendo tales moléculas como parte de una
molécula quimérica (o complejo) que se diseña
para dirigirla a órganos especı́ficos.
La administración en una forma de liberación
prolongada es más conveniente para el paciente,
cuando están indicadas inyecciones repetidas durante perı́odos prolongados de tiempo. Por ejemplo, es deseable administrar las proteı́nas que fijan actina de la invención en una forma de liberación prolongada, cuando los métodos de la
invención están utilizándose para tratar una enfermedad genética o crónica, basada en un trastorno relacionado con la actina, de modo que se
maximice la comodidad del paciente.
Las proteı́nas que fijan actina de la invención
pueden emplearse en formas de dosificación tales
como comprimidos, cápsulas, paquetes de polvo o
soluciones lı́quidas para administración oral, si la
actividad biológica de la proteı́na no se destruye
por el proceso digestivo y si las caracterı́sticas del
compuesto permiten que sea absorbido a través
del tejido intestinal.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican de una manera que es
conocida en sı́ misma, por ejemplo, por medio de
un proceso de mezcla convencional, granulación,
preparación de grageas, disolución, liofilización o
procedimientos similares. Las composiciones de
la presente invención, en sı́ mismas, encuentran
utilidad en el control del daño fisiológico inducido
por la actina, sea crónico o agudo. Las composiciones de la invención gobiernan los propios mecanismos del cuerpo para hacer frente al exceso de
actina en la corriente sanguı́nea o tejidos extracelulares, a su máximo potencial. En una forma de
dosificación intravenosa, las composiciones de la
presente invención tienen un comienzo de acción
suficientemente rápido para ser útil en el manejo
agudo del daño potencial de los tejidos.
Adicionalmente, una versión de baja potencia
es útil en el manejo de trastornos relacionados con
la actina suaves o crónicos.
Asimismo, las composiciones de la presente
invención proporcionan los reactivos necesarios
para el ensayo de laboratorio de los niveles de
actina en la corriente sanguı́nea o tejidos extracelulares de un animal.
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Cantidades eficaces de una proteı́na que fija
actina, particularmente DBP, gelsolina o cualquiera de sus fragmentos activos, que estén sustancialmente libres de contaminantes naturales,
pueden administrarse a un paciente que ha tenido un infarto de miocardio grave u otro evento
trombótico, en un momento y perı́odo a través del
cual se revela el daño al corazón o tejido. La cantidad del péptido que ha de administrarse puede
determinarse después de analizar la relación de
la gelsolina total a la ligada en el plasma del paciente, para hallar la fracción de la gelsolina total
que ya ha sido saturada con la actina liberada
por las células del corazón que mueren, y calculando la cantidad necesaria para suministrar,
como mı́nimo, suficiente capacidad de fijación de
actina para devolver esta relación a los valores
encontrados en los individuos sanos. Además, los
indicadores del daño renal, tales como el BUN del
paciente y los niveles de creatinina, pueden controlarse fielmente, y la dosis de la molécula que
fija la actina puede ajustarse a un nivel más alto,
si es necesario, cuando tales indicadores revelan
que se puede estar produciendo un daño renal.
Por consiguiente, la presente invención puede
utilizarse para administrar compuestos que fijan
actina a animales, en niveles suficientes para: (a)
prevenir la formación de filamentos de actina; y/o
(b) elaborar los filamentos de actina a un estado
monomérico “estable”, en cantidades suficientes
para tratar y/o prevenir los efectos fisiológicos no
deseables de la acumulación o liberación de actina
libre a la corriente sanguı́nea.
Las moléculas particulares que fijan actina,
que son el objeto de los métodos de la invención,
son proteı́nas que fijan actina, nativas y recombinantes, purificadas, y otras moléculas que fijan actina no proteináceas, y sus fragmentos
biológicamente activos, que se caracterizan por
la presencia de dominios singulares de fijación
de actina, que poseen la actividad biológica de
ser capaces de secuestrar la actina en una forma
monomérica, o de desagregar o despolimerizar
rápidamente los filamentos de actina, o de cubrir los sitios de la actina libre que son tóxicos
a las células hospedantes. Dominios individuales de fijación de actina que poseen esta actividad
biológica pueden producirse también por métodos
sintéticos, enzimáticos, proteolı́ticos, quı́micos o
de ADN recombinante.
Los métodos de la invención se basan también,
en parte, en el descubrimiento inesperado de los
Solicitantes, en el sentido de que un coágulo de
fibrina que contiene filamentos de actina, si se
incuba en presencia de la proteı́na que fija actina,
gelsolina, libera la actina al medio de incubación,
en el que la actina puede ser cuantificada.
En una realización preferida, la gelsolina,
DBP o sus fragmentos que fijan actina, o una
combinación de gelsolina y DBP y/o sus fragmentos que fijan actina, se incuban in vitro con el
coágulo que contiene actina.
En una realización, niveles eficaces de los compuestos que fijan actina se administran de modo
que se libere la actina asociada con coágulos formados in vitro, a partir de plasma de sujetos que
sufren lesión en los tejidos. Por “niveles eficaces”
de compuestos que fijan actina, se entiende niveles
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ES 2 151 517 T3
a los que la actina asociada con los coágulos pueda
liberarse y medirse, y permitir ası́ un diagnóstico
de los efectos de un exceso de actina extracelular sobre la formación de coágulos in vivo. Por
“exceso” de actina extracelular se entiende una
cantidad de actina extracelular que excede la capacidad de las proteı́nas del plasma para fijar y
desalojar la actina de los fluidos extracelulares,
sin daño secundario a los tejidos o sin producir
efectos tóxicos.
En una realización preferida de la invención,
se retira plasma de un sujeto que sufre lesión en
los tejidos y se deja que se formen coágulos in vitro. Las condiciones preferibles para la formación
de coágulos se describen en el Ejemplo V. Los
coágulos se retiran luego del recipiente en el que se
formaron y se incuban con cantidades crecientes
de una proteı́na que fija actina, preferiblemente
gelsolina o DBP. El coágulo se disuelve en SDS o
urea u otro agente solubilizante conocido y luego
se somete a electroforesis en gel. Los geles pueden
estar basados en poliacrilamida o en cualquiera de
los otros medios de tipo gel bien conocidos por los
expertos en la técnica, como eficaces para separar
las proteı́nas. Después de la electroforesis en gel,
se aplica un procedimiento de transferencia Western y la actina liberada del coágulo, si la hay,
se detecta con un anticuerpo anti-actina. A fin
de evaluar la cantidad de gelsolina necesaria para
liberar la actina del coágulo, se añaden diversas
cantidades de gelsolina a diversos coágulos, con
el fin de evaluar la cantidad necesaria para liberar la mayorı́a de la actina del coágulo o toda
ella. Cuando se alcanza la concentración a la
que se completa la liberación de la actina o se
llega a una meseta, esa cantidad de gelsolina se
señala como eficaz. Seguidamente, el medio de incubación procedente del procedimiento en el que
se ha añadido la proteı́na de máxima eficacia que
fija actina, puede usarse para valorar la cantidad
de actina liberada del coágulo, por inmunoprecipitación de los complejos de actina y proteı́na que
fija actina en el medio de incubación. Después de
la liberación máxima de actina de los coágulos,
la cantidad de actina puede valorarse por completo mediante la adición de proteı́na exógena
que fija actina, por ejemplo, gelsolina o DBP. Los
anticuerpos anti-fijación de actina, tales como el
anti-gelsolina o anti-DBP, pueden emplearse para
inmunoprecipitar y seguidamente cuantificar los
complejos. Alternativamente, pueden utilizarse
anticuerpos anti-actina para detectar la actina liberada al medio de incubación, por inmunoprecipitación del complejo de actina y anticuerpo antiactina.
En una realización alternativa preferida, se
forma un coágulo en un pequeño tubo de cromatografı́a. A través del tubo, se aplica una solución
de proteı́na que fija actina, preferiblemente gelsolina o DBP o sus fragmentos. El eluido se mide
seguidamente por ELISA estándar o la proteı́na
que fija actina se inmunoprecipita, y la presencia
de complejos con actina se ensaya por electroforesis en gel, preferiblemente por electroforesis en gel
de poliacrilamida. Los parámetros se describen a
continuación.
El fibrinógeno se prepara a una concentración
entre 0,1 y 10,0 mg/ml, preferiblemente 2 a 3
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mg/ml. El pH está entre 6 y 8,5, preferiblemente es 7,4. La fuerza iónica está entre 50 y 500
mM, preferiblemente es 100 mM. El tampón es un
tampón de imidazol o Tris. La concentración de
calcio está entre 0,1 y 10 mM, preferiblemente es
alrededor de 0,3 mM. La concentración de ATP
está entre 10 µM y 10 mM. Alrededor de 0,5 ml
de fibrinógeno se añade a una columna de cromatografı́a de 1 cm de diámetro y se deja que
se forme un coágulo de aproximadamente 1 mm,
por adición de entre 0,01 y 10 unidades NIH, preferiblemente 0,1 unidades NIH/ml de trombina.
El coágulo ası́ formado es suficientemente fuerte,
desde el punto de vista mecánico, para resistir la
penetración del fluido sin colapsar, y es suficientemente poroso para permitir que la penetración
tenga lugar a una velocidad de aproximadamente
0,2 ml/min. La formación del coágulo requiere
aproximadamente 1 a 10 min. Al cabo de un intervalo de tiempo diez veces superior al tiempo
de coagulación, se aplica al tubo de cromatografı́a una presión de entre 1 y 10 cm. El nivel
del tampón de incubación se ajusta seguidamente
hasta que el caudal es de aproximadamente 0,2
ml/min. La presión se ajusta observando el menisco del coágulo. Cuando el menisco del coágulo
comienza a colapsar, se reduce ligeramente la
presión. Ası́, el fluido es capaz de penetrar, a
través del coágulo, en el tampón arriba descrito.
Al principio, el tampón no contiene gelsolina. El
tampón se emplea para lavar el coágulo, de modo
que quede libre de la proteı́na no especı́ficamente
retenida. Se añade entonces gelsolina al tampón,
y el tampón que contiene gelsolina se pasa, para
un lavado a través del coágulo, en aproximadamente 1 a 5 min. Las fracciones eluidas se ensayan
para determinar la actina, mediante aplicación de
dichas fracciones a un gel, particularmente poliacrilamida con SDS, e inmunotransferencia con un
anticuerpo anti-actina. La concentración de gelsolina está entre 50 nM y 5 µM, preferiblemente
entre 1 y 5 µM.
En un análisis alternativo, puede utilizarse un
ensayo de lisis por plasmina para determinar la
cantidad de actina liberada y la velocidad de liberación de los coágulos por una proteı́na que fija
actina, preferiblemente gelsolina o DBP. Puesto
que la actina inhibe la lisis basada en plasmina,
la velocidad de lisis de un coágulo puede utilizarse como medida de la liberación de la actina.
La velocidad de lisis se incrementa a medida que
la actina se elimina de un coágulo que contiene
actina. En los casos en que se usa este tipo de
ensayo, los coágulos se forman en tubos de cromatografı́a, como se describió anteriormente, o se
sacan del tubo y se incuban en un tampón con
o sin la proteı́na que fija actina, preferiblemente
gelsolina o DBP.
Otros métodos alternativos de detección de
la actina liberada de un coágulo, aprovechan el
parámetro de endurecimiento por deformación.
El endurecimiento por deformación puede medirse por métodos descritos con detalle en el
material de los ejemplos que figuran más adelante. El endurecimiento por deformación disminuye en los coágulos que contienen actina y
puede recuperarse cuando la actina se elimina de
los coágulos. Por lo tanto, la liberación de la ac11
21
ES 2 151 517 T3
tina en los coágulos puede cuantificarse por las
medidas reológicas descritas en el material de los
ejemplos.
Las proteı́nas que fijan actina y que están
sustancialmente libres de contaminantes naturales pueden aislarse y purificarse a partir de sus
fuentes natural o recombinante, de acuerdo con
condiciones y procedimientos convencionales en
la técnica, usados con anterioridad para aislar dichas proteı́nas, tales como la extracción, precipitación, cromatografı́a, cromatografı́a de afinidad,
electroforesis, o similares.
Un experto en la técnica puede identificar el
dominio o dominios que fijan actina de un compuesto que fija actina, utilizando procedimientos conocidos en la técnica, sin excesiva experimentación, y tales dominios son preferidos en los
métodos de la invención. Por ejemplo, derivados
de las proteı́nas nativas que fijan actina, o derivados de las proteı́nas que fijan actina producidas
por vı́a recombinante, pueden prepararse por escisión proteolı́tica de la proteı́na de longitud completa que fija actina, con proteasas comunes, tales
como, por ejemplo, tripsina, quimotripsina y subtilisina. La cromatografı́a de afinidad con actinaresinas derivatizadas puede emplearse para analizar dichos fragmentos respecto a su capacidad de
fijación de actina.
Cuando se desea la identificación de compuestos o sus fragmentos que poseen actividad de separación de actina, tales compuestos o fragmentos pueden también identificarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo,
haciendo un seguimiento de la velocidad de despolimerización de la actina-F marcada con pireno.
Asimismo, tales fragmentos pueden identificarse por su homologı́a a otros dominios conocidos que fijan actina o separan actina, en los
que pueda predecirse que la función seguirá la
homologı́a. Por ejemplo, se sabe que la severina,
gelsolina y villina, y en especial los residuos de
aminoácidos 40 a 351 en la severina, y los residuos
de aminoácidos 63 a 383 en la gelsolina, presentan
una extensa homologı́a en el dominio responsable
de la actividad de separación de la actina-F.
La mitad N-terminal de la gelsolina, por ejemplo, un fragmento trı́ptico N-terminal, conocido
como CT45, es capaz de separar la actina-F y
contiene dos sitios de fijación de actina. Uno de
estos sitios reside en un fragmento quimotrı́ptico,
CT15N (residuos 24 a 150 de la gelsolina humana), que fija los extremos de los monómeros y
filamentos de actina con alta afinidad; el otro sitio
está contenido en el fragmento adyacente CT28N
(residuos 151 a 406), que se une al flanco de la
actina-F, de una manera regulada por polifosfoinosı́tido. Ninguno de los fragmentos separa los filamentos de actina por sı́ mismos. El polipéptido
de gelsolina más pequeño que es capaz de separar la actina-F, abarca los residuos 25 a 165 de la
gelsolina del plasma.
Otro punto a señalar es que los compuestos
tales como las proteı́nas que fijan actina están
altamente conservados entre las especies y pueden aislarse fácilmente, en grandes cantidades,
del plasma no humano (bovino, porcino) y/o de
los tejidos del músculo, y los fragmentos de estas proteı́nas pueden prepararse por vı́a quı́mica
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o enzimática, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Ası́, tales compuestos que
fijan actina pueden administrarse a un sujeto que
necesita los métodos terapéuticos de la invención,
sin provocar una respuesta inmune importante.
Tras esta descripción general de la invención,
los siguientes ejemplos describen con más detalle
los materiales y métodos usados para realizar la
invención. No se pretende que los ejemplos limiten la invención en modo alguno.
Ejemplos
Materiales. El fibrinógeno (Mosher y Blout,
J. Biol. Chem. 248, 6896 (1973)) y la gelsolina (Chaponnier et al., J. Cell. Biol. 103, 1473
(1986)) se purificaron a partir de plasma de sangre humana, y la actina a partir de músculo voluntario de conejo, por métodos descritos con
anterioridad (Janmey et al., J. Biol. Chem.
261, 8357 (1986)). La actina se marcó con
pireno-yodoacetamida ó con tetrametil-rodamina
5-(y-6)-yodoacetimida (T-488, Molecular Probes,
Eugene, OR), como se describe en otro lugar
(Symons y Mitchison, J. Cell. Biol. 114, 503
(1991)). La proteı́na que fija vitamina D se
preparó a partir de sangre humana, por cromatografı́a de afinidad, utilizando actina-sefarosa
(Haddad et al., Anal. Biochem. 146, 96 (1985)),
o bien se adquirió en Calbiochem (San Diego,
CA). Ambos materiales mostraron una afinidad
similar hacia la actina, basada en su capacidad
para inhibir la polimerización de la actina, tal
como se mide por los cambios de fluorescencia
de la actina marcada con pireno. La trombina de
plasma humano (T-6759, Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) y la plasmina (810655 Kabi Vitrum,
Franklin, OH) se diluyeron con agua a 100 unidades/ml y 10 unidades/ml, respectivamente, y
se congelaron inmediatamente. Porciones de ellas
se derritieron, se mantuvieron a 4◦ C y se utilizaron dentro de las 10 h siguientes. La faloidina
marcada con rodamina se obtuvo de Molecular
Probes, la avidina marcada con fluoresceı́na de
Enzo Diagnostics, NY, y la DNasa 1 de Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.
Ejemplo I
Medidas viscoelásticas
Las propiedades viscoelásticas de los geles de
fibrina se determinaron por medidas reológicas,
empleando un instrumento Rheometrics o un
péndulo de torsión. El principio en que se basan estas medidas es que, cuando se aplica una
fuerza en una dirección paralela a la cara de una
muestra (una fuerza de cizalladura, o esfuerzo
= fuerza/área, expresado en unidades de Pa =
10 dyn/cm2 ), una muestra viscoelástica se deforma en una extensión (la magnitud de la deformación o “strain”, una magnitud sin unidades)
que depende del valor del esfuerzo y de la longitud del intervalo de tiempo en que se aplica el
esfuerzo. Parte de la energı́a de deformación se
almacena elásticamente en el material y parte se
disipa por el movimiento viscoso lento de la muestra, que conduce a una deformación irrecuperable
después de retirar el esfuerzo. Estas propiedades viscoelásticas pueden describirse cuantitativamente por el módulo de cizalladura: la relación
del esfuerzo a la magnitud de la deformación, que
es, él mismo, función del tiempo, y para algunos
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ES 2 151 517 T3
materiales y valores de la deformación, también
de la magnitud de la deformación. A menudo,
los módulos de cizalladura de almacenamiento y
de pérdidas (viscoso) se miden aplicando deformaciones oscilantes, y entonces, los módulos de
cizalladura, designados por G’ para el de almacenamiento y G” para el módulo de pérdidas, se
calculan a partir de la magnitud y desplazamiento
de fase entre los esfuerzos y deformaciones oscilantes.
El dispositivo Rheometrics aplica una deformación por cizalladura oscilante a una muestra
confinada entre un cono y una placa, y hace posible las medidas del módulo de almacenamiento
de la elasticidad, G’, en función del tiempo, de
la frecuencia o de la amplitud de deformación.
El péndulo de torsión puede medir el módulo de
cizalladura dinámico, a partir de la oscilación libre, o bien la deformación por la fuerza de cizalla
(relación de la magnitud de la deformación al esfuerzo), a partir de medidas de la deformación (es
decir, de la magnitud de la deformación) cuando
un esfuerzo de cizalla constante se aplica a una
muestra de forma de disco, mantenida entre las
placas del péndulo. Los principios del funcionamiento de estos dos instrumentos se describen en
otro lugar (Janmey et al., Biochemistry 27, 8218
(1988); Janmey, P., J. Biochem. Biophys. Meth.
22, 41 (1991)).
En ambos instrumentos, el gel de fibrina o
de fibrina/ actina se forma entre las placas del
reómetro, poniendo una cantidad de 400 µl a 800
µl de una solución de la proteı́na en la placa del
fondo, inmediatamente después de la adición de
trombina para iniciar la polimerización de la fibrina. La concentración de trombina se eligió
para dar un tiempo de coagulación de unos pocos minutos, que permitiese colocar la muestra
en el reómetro antes de que ocurriera la coagulación. Las medidas se comenzaron tı́picamente
un minuto después de que la muestra se pusiera
entre las placas, y el tiempo de coagulación fue
aproximadamente 3 min. Las medidas de la dependencia de la magnitud de la deformación se hicieron en muestras envejecidas durante 90 min, o
al menos 30 veces el tiempo de coagulación, para
asegurarse de que la formación de coágulos era
prácticamente completa y no cambiarı́a durante
el curso de estas medidas. Cuando la actina o
los complejos de actina-gelsolina se añadieron a
la solución de fibrinógeno, la actina-G se polimerizó primero a actina-F, en presencia o ausencia
de gelsolina, por incubación durante 1 h en tampones que contienen MgCl2 2 mM y KCl 150 mM.
Propiedades viscoelásticas de los geles de
fibrina-actina. La presencia de filamentos de
actina durante la polimerización del fibrinógeno
afecta fuertemente a las propiedades mecánicas
de la red de geles de fibrina. La Figura 1 muestra el efecto sobre el módulo de cizalladura, una
medida de la resistencia elástica del coágulo a los
esfuerzos de deformación, cuando cantidades crecientes de actina-F se incorporan al coágulo. La
actina-F aumenta el módulo de cizalladura en un
grado que depende de la concentración de actina.
La viscoelasticidad de los propios filamentos de
actina puede ser responsable de una parte del aumento del módulo de cizalladura, pero un com-
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ponente significativo procede también de la alteración de la estructura de los geles de fibrina,
producida por la inhibición de la formación de
haces de protofilamentos anteriormente descrita
(Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841, 151
(1985)). El efecto de la actina-F es hacer el coágulo más fino, y los coágulos finos cabe esperar
que tengan módulos de cizalladura más bajos que
los coágulos bastos, puesto que contienen filamentos más delgados. Sin embargo, los coágulos finos
pueden también presentar módulos de cizalladura
elevados si la inhibición de la formación de haces
de fibrina está acoplada a un aumento del número de puntos de ramificación (Roberts et al.,
Biorheology 10, 29 (1973); Rosser et al., Biophys.
Chem. 7, 153 (1977)), y módulos de cizalladura
altos para coágulos finos han sido comunicados
para la fibrina polimerizada en presencia de IgG
(Gabriel et al., J. Lab. Clin. Med. 101, 545
(1983)).
Una de las propiedades viscoelásticas llamativas de los geles de fibrina es la del endurecimiento
por deformación: su módulo de elasticidad aumenta con el crecimiento de las amplitudes de
deformación. La Figura 2 muestra que esta caracterı́stica de la reologı́a de la fibrina, que puede
ser crucial para su función fisiológica como tapón
hemostático flexible, pero resistente a la rotura,
se elimina completamente por los filamentos de
actina-F largos.
No sólo inhibe la actina el endurecimiento
por deformación de la fibrina, sino que también
reduce la recuperación de la elasticidad de los
coágulos. La Figura 3A muestra la reversibilidad casi total del módulo de cizalladura observada cuando un gel de fibrina se deforma primero por incrementos a una magnitud de la deformación máxima grande, y luego experimenta
deformaciones sucesivamente más pequeñas. La
reproducibilidad de G’ después de estas deformaciones grandes refleja el alto grado de elasticidad de estos geles y su resistencia al fallo
mecánico, incluso cuando están fuertemente deformados. La presencia de una cantidad incluso
baja (0,2 mg/ml) de actina-F reduce el grado
de endurecimiento por deformación y conduce a
disminuciones irreversibles de aproximadamente
40 % en el módulo de cizalladura, después de haberse producido la deformación, indicando que
los geles de fibrina/actina se dañan por deformaciones en el intervalo que podrı́a ocurrir in vivo
(Figura 3B). Este fenómeno requiere filamentos
de actina largos, porque cuando los filamentos
de actina se acortan por la gelsolina, se observa
de nuevo el endurecimiento por deformación, y la
recuperación de la elasticidad aumenta a niveles
próximos a los de la fibrina sola (Figura 3C).
Ejemplo II
Experimentos de unión
La cantidad de actina unida a la fibrina se
midió por la pérdida de fluorescencia de la solución, después de la incorporación de actina marcada con rodamina a 2 mg/ml de coágulos de fibrina. Los coágulos se formaron en tubos de vidrio de borosilicato para cultivo de tejidos, por
adición de 1,7 unidades NIH/ml de trombina a 2
mg/ml de fibrinógeno en T7 (NaCl 100 mM, TrisCl 50 mM, pH 7,4) con actina-F, polimerizados en
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Tampón B (Tris 20 mM, ATP 0,5 mM, DTT 0,2
mM, CaCl2 0,2 mM, KCl 150 mM, MgCl2 2 mM,
pH 7,4). La gelificación de la fibrina se produjo
dentro de un tiempo de 10 min y los coágulos se
incubaron durante 1 a 2 h, a 24◦ C. Los coágulos
insolubles, que contienen más de 97 % de la fibrina
total, se retiraron por enrollamiento en una pipeta
de vidrio, y se determinó la fluorescencia de la solución restante. Antes y después de la formación
de los coágulos, la fluorescencia se determinó con
un espectrómetro de luminiscencia Perkin-Elmer
LS-5B, con excitación a 547 nm y emisión a 573
nm. Los ensayos previos de sedimentación de la
actina marcada con rodamina indicaron que 15 %
de la fluorescencia total no estaba ligada o estaba
unida a actina no funcional, y este valor se restó
de todas las lecturas. El porcentaje de actina total unida al coágulo de fibrina se calculó como
% unido = 100(FL0 -FL1 )/FL0 , donde FL0 es la
fluorescencia inicial antes de la polimerización de
la fibrina y FL1 es la fluorescencia de la solución
menos la del coágulo de fibrina.
Unión fibrina-actina. Los ensayos de unión
mostraron que la cantidad de actina unida a los
coágulos de fibrina depende de la longitud de los
filamentos de actina añadidos (Figura 4). En ausencia de proteı́nas que acorten la actina, la unión
resulta ser insaturable, y la relación molar de actina a fibrina en el coágulo es mayor que 1:1 a
las concentraciones de actina más altas mostradas. Este hallazgo es debido, probablemente, al
hecho de que los filamentos de actina polimerizados en ausencia de proteı́nas especı́ficas que fijan actina, alcanzan por lo general longitudes de
filamento de varios micrómetros (Pollard y Cooper, Annu. Rev. Biochem. 55, 987 (1986)), y
pueden no sólo unirse al coágulo de fibrina, sino
quedar enmarañados en él (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta 841, 151 (1985)). Cuando
la longitud de los filamentos está limitada por
una relación molar de gelsolina de 1:12 (que da
como resultado filamentos rematados con gelsolina, cuya longitud media es 32 nm [Janmey et
al., J. Biol. Chem. 261, 8357 (1986)]), la unión
resulta alcanzar un lı́mite a una relación molar de
aproximadamente 2:3 de subunidades de actina a
fibrina (Figura 4). Si se impide que la actina se
polimerice por incubación de los monómeros de
actina-G con la proteı́na DBP que fija monómeros
de actina (Figura 4), la cantidad de actina unida
al coágulo disminuye fuertemente, pero no se elimina por completo. Resultados similares se observaron cuando se impidió que la actina se polimerizase por medio de DNasa I, que forma complejos fuertes con los monómeros de actina, pero
fija la actina en un sitio diferente del que lo hace
DBP (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que, aunque los filamentos de actina largos
pueden estar atrapados de forma no especı́fica en
el coágulo de fibrina en formación, también tiene
lugar una unión especı́fica de los filamentos cortos y los monómeros complejados. Esta unión se
considera que es especı́fica, porque tanto los filamentos de actina cortos (32 nm), como los complejos de monómeros de actina y DBP se unen a
coágulos cuyos tamaños medios de poro son de
varios micrómetros de diámetro (Rosser et al.,
Biophys. Chem. 7, 153 (1977)). La afinidad de
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los monómeros de actina o de los fragmentos de
filamento hacia el gel de fibrina es difı́cil de evaluar con precisión, porque la presencia de la actina perturba la estructura de la matriz a la que
se une (Janmey et al., Biochim. Biophys. Acta
841, 151 (1985)), pero los datos de la Figura 4 sugieren que la afinidad es suficientemente grande
(Kd<1 µM) para ser significativa a las concentraciones de actina y de fibrina que probablemente
se presentan in vivo.
El efecto de la longitud del filamento sobre la
cantidad de actina-F incorporada al coágulo, se
muestra con más detalle en la Figura 5. En este
experimento, una cantidad constante de actina
(12 µM; 0,5 mg/ml) se polimerizó en presencia
de diversas cantidades de gelsolina, y se añadió
fibrinógeno 6 µM (2,0 mg/ml) antes de la adición
de trombina. Puesto que cada gelsolina nuclea
y remata un filamento, y en estas condiciones de
la solución no existen filamentos sin rematar, el
número medio de subunidades de actina por filamento es igual a la relación actina:gelsolina (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261, 8357 (1986)), y
la longitud media se calcula a partir del hallazgo
de que hay 370 subunidades en un micrómetro de
filamento (Hanson y Lowly, J. Mol. Biol. 6, 46
(1963)). Según este cálculo, la longitud media de
los filamentos de actina presentes en la solución de
polimerización del fibrinógeno estaba en el intervalo de 34 nm a 2,7 µm. Más del 80 por cien de la
actina total se unió al coágulo cuando la longitud
media del filamento era muy grande, pero incluso
los filamentos de actina muy cortos, formados a
altas relaciones de gelsolina:actina, se unı́an significativamente. Además, la unión de los filamentos
cortos, de longitud inferior a 300 nm, no dependı́a
de su longitud, sugiriendo que la interacción no se
debe enteramente al atrapamiento del filamento
dentro de los poros del gel de fibrina, sino a una
interacción especı́fica entre la actina y la fibrina.
Estos resultados confirman que la actina se une a
la fibrina, en parte, con independencia de las interacciones estéricas. La Figura 5 también muestra
que la unión de la actina-F a la fibrina no depende
de los cambios en la estructura de la fibrina, originados por concentraciones milimolares de iones
calcio.
Ejemplo III
Microscopı́a confocal
2 mg/ml de fibrinógeno se mezclaron con
rodamina-actina 6 µM, en presencia o ausencia
de gelsolina o DBP, a relaciones molares con respecto a la actina de 1:4 ó 2:1, respectivamente. La
polimerización de la fibrina se inició por adición
de 0,1 unidades/ml de trombina, y 10 µl de cada
solución se pusieron sobre una platina de microscopio, en una cámara humidificada, que consta de
un papel de filtro hidratado en una placa de Petri
cubierta. Aproximadamente 5 min después de la
adición de la trombina, en un tiempo próximo al
tiempo de coagulación, una funda a modo de cubierta se aplicó a la muestra y los bordes se sellaron con esmalte para uñas. En un experimento de
control, avidina 10 µM marcada con fluoresceı́na
se mezcló con fibrinógeno y la polimerización se
inició por adición de trombina. Comenzando un
minuto después de la preparación de las platinas,
se examinaron las muestras utilizando un micros-
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copio confocal de láser de barrido Bio-Rad MRC
600, agregado a un microscopio Zeiss Axiovert.
Un objetivo Plan-neofluar 100X (NA 1.3) se utilizó para la formación de imagen, y la abertura
confocal se puso al valor mı́nimo. Esto ayudó a
eliminar la fluorescencia por encima y por debajo
del plano del foco, aumentando ası́ la resolución
y haciendo posible visualizar las hebras de fibrina
individuales. El mismo montaje del láser, ganancia y marcos acumulados se utilizaron para todas
las muestras. Esto permitió una comparación más
precisa de las intensidades de fluorescencia.
Microscopı́a de fluorescencia. La microscopı́a
confocal de coágulos de fibrina que contienen actina se realizó para examinar directamente la interacción de la actina con la fibrina. La Figura 6a
muestra una imagen de fluorescencia tı́pica, obtenida cuando se añadió actina-F marcada con rodamina a una solución de fibrinógeno, antes de la
formación de coágulos, y la Figura 6b muestra la
correspondiente imagen de contraste de fase de las
hebras de fibrina. La fluorescencia de la actina-F
marcada coincide con la estructura de la red de
fibrina, demostrando la asociación directa de la
rodamina-actina con la fibrina. Imágenes similares se obtuvieron utilizando actina-F marcada con
fluoresceı́na (datos no mostrados). La coincidencia de las hebras de actina-F y de fibrina sugiere
que estos polı́meros se asocian lateralmente y no
interaccionan enteramente por un solapamiento
puramente estérico no especı́fico. Cuando la longitud de los filamentos de actina se reduce a 32
nm por medio de la gelsolina, el marcaje fluorescente de la red de fibrina es mucho más débil
(Figura 6c) y se ven algunas zonas de fluorescencia brillante, correspondientes a manchas de alta
densidad en contraste de fase (Figura 6d). Estas
zonas pueden representar sitios en los que los filamentos cortos de actina se fijan o son atrapados
en el coágulo. La red de actina-F, en ausencia
de fibrina, no puede visualizarse por microscopı́a
confocal, puesto que los filamentos de actina delgados (9 nm) formados en estas condiciones no
forman haces (Janmey et al., J. Biol. Chem. 261,
8357 (1986)) y por tanto, producen una red demasiado fina para que se resuelva usando microscopı́a confocal (Figuras 6e y 6f). La incubación
de la rodamina-actina con DBP antes de la formación de coágulos, redujo significativamente la
intensidad del marcaje fluorescente de la fibrina,
pero todavı́a era visible un diseño claro de fluorescencia, coincidente con las hebras de fibrina (Figura 6g). Estos resultados son coherentes con los
datos de las Figuras 4 y 5, que mostraban la unión
reducida, pero todavı́a medible, de monómeros
complejados de actina a coágulos de fibrina. La
especificidad de la unión de la actina-F a la fibrina está apoyada por el hallazgo de que, cuando
se añade fluoresceı́na-avidina a una solución de fibrinógeno, en lugar de actina-F marcada con rodamina, antes de la formación de coágulos, no
tiene lugar el marcaje fluorescente de las hebras
de fibrina (Figura 6h).
Ejemplo IV
Experimentos de fibrinolisis
Los coágulos de fibrina que contienen actina
se sometieron a lisis por dos métodos diferentes.
En el primero, la fibrina, con o sin actina, se po-
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limerizó por adición de una concentración relativamente alta de trombina y una concentración
relativamente baja de plasmina, elegidas de modo
que la gelificación fuese casi completa antes de que
pudiera ocurrir una degradación significativa de
la fibrina o del fibrinógeno, siguiendo el método
de Shen et al. (Shen et al., J. Biol. Chem. 252,
6184 (1977)). Los geles de fibrina se polimerizaron en un péndulo de torsión y las propiedades reológicas de los coágulos se midieron tanto
durante la formación de los coágulos como durante su disolución. Las muestras contenı́an 3 g/l
de fibrina, 0,42 unidades NIH/ml de trombina y
0,3 CU/ml de plasmina, en soluciones que contienen NaCl 140 mM, Tris-Cl 10 mM, MgCl2 2 mM,
CaCl2 2,5 mM, pH 7,4.
En el segundo método, los coágulos de fibrina
(6 µM), que contienen rodamina-actina filamentosa 6 µM, se formaron en tubos de vidrio de borosilicato para cultivo, por adición de trombina.
La coagulación se inició por la adición de trombina (concentración final: 0,8 unidades NIH/ml).
Los coágulos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se retiraron con cuidado de los tubos y se sumergieron en un volumen igual de tampón B (Tris 2 mM, ATP 0,5
mM, CaCl2 2 mM, DTT 0,2 mM, KCl 150 mM,
MgCl2 2 mM, pH 7,4), en presencia o ausencia
de cantidades fisiológicas de gelsolina (2 µM). A
diversos intervalos de tiempo, se retiró la solución
que rodea al coágulo y se midió la fluorescencia
para determinar la cantidad del marcador de rodamina liberada del coágulo.
Efecto de los filamentos de actina sobre la lisis
de coágulos de fibrina. La incorporación de actina a un coágulo de fibrina da como resultado la
inhibición de su velocidad de lisis por plasmina,
tal como se mide por la liberación de fragmentos de fibrina radiactiva (Lind y Smith, J. Biol.
Chem. 266, 5273 (1991)), que tiene su manifestación más obvia después de varias horas. Puesto
que la pérdida de la integridad estructural de un
coágulo (tal como se refleja en su módulo de elasticidad) es una de las primeras consecuencias de
la lisis (Shen et al., J. Biol. Chem. 252, 6184
(1977)), se realizaron los experimentos mostrados en la Figura 7 para determinar si el efecto
de la actina sobre la lisis del coágulo podrı́a detectarse muy precozmente. La incorporación de
filamentos de actina largos (Figura 7A) y cortos
(Figura 7B) a los geles de fibrina retardó el crecimiento del módulo de cizalladura durante la formación del coágulo, ası́ como la disminución del
módulo de cizalladura inducida por plasmina durante la lisis. Los efectos de los filamentos de actina incorporados (tanto unidos a la fibrina como
atrapados estéricamente), se hicieron evidentes 20
min después del comienzo de la lisis. Por consiguiente, los efectos de la incorporación de actina
a un coágulo, dan como resultado un cambio más
rápido en las propiedades fı́sicas del coágulo en
condiciones de lisis, que el que se refleja por la velocidad de liberación de fragmentos de fibrina al
baño de lisis. Las medidas viscoelásticas de control confirmaron que la propia actina-F no se degradaba por la plasmina durante el curso temporal de estos experimentos (datos no mostrados).
Ejemplo V
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Elución de la actina de los coágulos de fibrina
Puesto que es de importancia terapéutica potencial saber si los filamentos de actina atrapados en los coágulos de fibrina pueden eluirse de
los mismos, coágulos que contienen actina se incubaron en presencia o ausencia de gelsolina del
plasma. El fibrinógeno purificado se preparó a
una concentración entre 2 y 3 mg/ml, en un
tampón de imidazol o tris. El pH fue 7,4. La
fuerza iónica no fue superior a 150 mM y de
modo óptimo 100 mM. El calcio estaba presente
a una concentración 0,3 mM. La actina estaba
presente a una concentración de 6 a 20 µM. ATP
estaba presente a una concentración de 10 µM a
10 mM. Fue entonces posible formar un coágulo
de 1 mm en una columna de cromatografı́a de
1 cm de diámetro, por taponamiento de la columna, llenado de la misma con 0,5 ml de solución
de fibrinógeno y coagulación del fibrinógeno con
aproximadamente una décima de unidad NIH/ml
de trombina. De este modo, una vez formado
el coágulo, tenı́a suficiente resistencia mecánica
para soportar la penetración de fluido sin colapsarse y era suficientemente poroso para permitir
que la penetración del fluido se realizase a una
velocidad de aproximadamente 0,2 ml/min.
El coágulo de fibrinógeno se formó en aproximadamente 1 a 10 min. Después de transcurrido
diez veces el tiempo de coagulación, se aplicó una
presión de entre 1 y 10 centı́metros al tubo de
cromatografı́a. Es decir, el fluido empleado para
penetrar en el coágulo se mantuvo aproximadamente entre 1 y 10 cm por encima de la parte
superior del coágulo. El nivel del tampón de incubación se ajustó entonces hasta que el caudal
fuese aproximadamente 0,2 ml/min. Se hizo un
seguimiento del menisco del coágulo durante el
colapso. Se hizo un seguimiento de la presión
observando el menisco del coágulo. Se dejó que
el tampón penetrase a través del coágulo. El
tampón era idéntico a aquel en el que estaba disuelto el fibrinógeno (el tampón en el que se formó
el coágulo). Este tampón no contenı́a gelsolina.
El tampón lavó al coágulo, dejándolo libre de
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proteı́na no retenida especı́ficamente. Se añadió
gelsolina al tampón y se hizo con él un lavado a
través del coágulo, durante aproximadamente 1 a
5 min. La actina contenida en el coágulo se separó
por la gelsolina y se eluyó. Las fracciones eluidas
se analizaron para determinar la actina por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
SDS, e inmunotransferencia con anticuerpo antiactina. En los primeros experimentos, se hizo un
seguimiento espectrofotométrico de la actina marcada fluorescentemente. Por este método, ha sido
posible retirar aproximadamente 80 % de la actina
total retenida en el coágulo, haciéndole pasar soluciones que contienen gelsolina a concentración
entre 1 y 5 µM.
Como se muestra en la Figura 8, la incubación
de los coágulos que contienen rodamina-actina en
concentraciones fisiológicas (2 µM) de gelsolina
del plasma, dio como resultado una pérdida de la
mayor parte de la actina de los coágulos. Puesto
que la fluorescencia de la actina-F marcada con
rodamina es más alta que la de la rodamina libre o la de los monómeros de rodamina-actina,
la cantidad del marcador liberado al medio puede
ser algo subestimada por la fluorescencia del medio en comparación con la de la solución inicial
de actina-F marcada. La cantidad de actina marcada que permanece asociada al coágulo es coherente con los resultados que se muestran en la
Figura 2. Además, la elución de la actina de los
coágulos restableció su susceptibilidad a la lisis
mediada por plasmina, como se decidió visualmente. La inspección al cabo de 18 h reveló restos
macroscópicos de aquellos coágulos que no habı́an
sido expuestos a la gelsolina del plasma, mientras
que los coágulos incubados en soluciones que contienen gelsolina del plasma se disolvieron totalmente. La pérdida de la rodamina asociada con
el coágulo no refleja la lisis total del coágulo, sino
más bien la escisión conocida del dipéptido terminal de la actina marcado con rodamina, por la
acción de la plasmina (Mornet y Ue, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81, 3680 (1984)).
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REIVINDICACIONES
1. Un método para eluir y cuantificar la actina en un coágulo que contiene actina, que comprende las etapas de: (1) retirar plasma de un
sujeto que padece lesión en los tejidos; (2) permitir que dicho plasma forme un coágulo in vitro;
(3) aislar dicho coágulo formado en la etapa (2);
(4) incubar dicho coágulo en un medio lı́quido con
un compuesto que fija actina; (5) determinar la
cantidad de actina en dicho medio.
2. Uso de, al menos, un compuesto que fija
actina, para la preparación de una composición
farmacéutica para reducir la cantidad de actina
en un coágulo que contiene actina, en un sujeto
portador de dicho coágulo que contiene actina.
3. Uso de, al menos, un compuesto que fija
actina, para la preparación de una composición
farmacéutica para restablecer las propiedades viscoelásticas normales y la susceptibilidad a la lisis
mediada por plasmina, a los coágulos formados
en un sujeto después de una lesión en los tejidos.
4. El método de acuerdo con la reivindicación
1 ó el uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó la
reivindicación 3, en el que dicho compuesto que
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fija actina es gelsolina o uno de sus fragmentos
activos.
5. El método o uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho fragmento activo es el
fragmento quimotrı́ptico CT45.
6. El método o uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho fragmento activo
contiene los residuos de aminoácidos 25 a 165 de
la gelsolina.
7. El método o uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho fragmento activo
contiene los residuos de aminoácidos 1 a 260 de
la gelsolina.
8. El método de acuerdo con la reivindicación
1 ó el uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó la
reivindicación 3, en el que dicho compuesto que
fija actina es la proteı́na que fija vitamina D o
uno de sus fragmentos activos.
9. El método de acuerdo con la reivindicación
1 ó el uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó la
reivindicación 3, en el que un compuesto que fija
actina es gelsolina o uno de sus fragmentos activos
y otro compuesto que fija actina es la proteı́na que
fija vitamina D o uno de sus fragmentos activos.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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