Programa Capital Humano Avanzado
2o
Hora:
Firma:
UNNERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
GLUTAMATO REGULA EL DESTINO
ENDOCITÍCO DE LOS RECEPTORES
METABOTRÓPICOS DE GABA
TESIS DOCTORAL
KARINA JAZMINA VARGAS BARRIA
VALDIVIA- CHILE
2009
GLUTAMATO REGULA EL DESTINO
ENDOCITÍCO DE LOS RECEPTORES
METABOTRÓPICOS DE GABA
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad
Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para
optar al grado de Doctor en Ciencias mención Biología Celular y
Molecular
por
KARINA JAZMINA VARGAS BARRIA
VALDIVIA-CHILE
2009
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
INFORME DE APROBACIÓN DE TESIS DE DOCTORADO
La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Dr. Rodolfo Amthauer M.,
Director de la Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias que la tesis
de doctorado presentada por la candidata
KARINA JAZMINA VARGAS BARRIA
Ha sido aprobada en el examen de Defensa de Tesis rendido el día 27 de
octubre de 2009, como requisito para optar al grado de Doctor en Ciencias.
Y, para que así conste para todos los efectos firman:
Profesor Patrocinante de Tesis:
Dr. Andrés Couve C.
Comisión Evaluadora de Tesis:
Dr. Alejandro Claude R.
Dr. Carlos González F.
Dr. Brigitte Van Zundert
Agradecimientos
Quiero agradecer a todas las personas que me han apoyado en el desarrollo de esta tesis
doctoral. En especial a mi familia, la cual me enseño el valor del trabajo y la perseverancia. A
Guayec, el hombre que me acompaño en cada momento y compartió tanto mis éxitos como mis
fracasos, y me mostró que lo mas importante en la vida es siempre tener tiempo para amar.
Quiero agradecer también a mi laboratorio, en especial a mi tutor Andrés Couve, por todo el
entusiasmo por la ciencia y las ganas de hacer las cosas bien. También a mis compañeros de trabajo
Constanza Morales, René Vidal, Ornar Ramírez, Roger Koening con los que compartí arduas horas
de trabajo y discusión. A mis nuevos compañeros, Juan Manuel Rodríguez, Elizabeth Arancibia,
Consuelo Arias y Matías Jaureguiberry, que me han ayudado a enfrentar con éxito los últimos
momentos en el laboratorio. A Rebeca Baeza, gracias por todo el esfuerzo que haces por todos, sin
ti el laboratorio no funcionaria de la misma forma. Gracias por no ser solo mis compañeros de
trabajo sino también mis amigos y haber compartido momentos cotidianos pero muy especiales.
Quiero reconocer la labor de la Universidad Austral de Chile porque gracias a la formación
que me proporcionaron fui capaz de enfrentar con éxito el desarrollo de mi tesis doctoral y a la
Universidad de Chile que me dio un espacio para poder desarrollarme como científica. Mi
agradecimiento también a la escuela de graduados, a su director Rodolfo Amthauer, y en especial a
Sandra Cifuentes, que hace que todo lo que parece imposible no lo sea.
Finalmente quisiera agradecer a todos los financiamientos que permitieron el desarrollo de
esta tesis: Beca de tesis doctoral CONICYT D-21050545, beca de apoyo a la tesis doctoral
CONICYT AT-24071 048, Beca de asistencia a eventos científicos en el extranjero CONICYT,
Beca de término de tesis doctoral CONICYT, Beca MESESUP de estadías cortas, Beca MESESUP
de estadías en el extranjero, Beca Puelma de asistencia a eventos científicos en el extranjero y a la
Dirección de Investigación y Desarrollo (DID) de la Universidad Austral de Chile.
1. ÍNDICE DE CONTENIDOS.
l. ÍNDICE DE CONTENIDOS.
2. ÍNDICE DE FIGURAS.
iv
3. ÍNDICE DE ABREVIATURAS.
vi
4. RESUMEN.
5. SUMMARY.
2
6. INTRODUCCIÓN.
3
6.1. fenómenos cognitivos complejos y plasticidad en el sistema nervioso.
3
6.2. Plasticidad sináptica y disponibilidad de receptores de glutamato en la membrana
plasmática, un ejemplo de la interacción entre estos fenómenos.
6
6.3. Plasticidad neuronal y disponibilidad de receptores de GABA en la membrana
plasmática.
8
6.4. Receptores GABAB.
9
6.5. Disponibilidad de receptores GABA 3 en la superficie celular.
14
6.5.1. Tráfico exocítico de los receptores GABAB·
14
6.5.2. Tráfico endocítico de los receptores GABA3 .
15
6.5.2.1. Desensibilización de los receptores GABAB.
15
6.5.2.2. Endocitosis de receptores GABAB.
19
6.5.2.3. Consideraciones generales de la endocitosis de receptores en
neuronas.
21
7. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS.
23
8. MATERIAL Y MÉTODOS.
24
8.1. MATERIALES.
24
8. l.l. Reactivos Químicos.
24
8.1.2. Anticuerpos.
25
8.1.3. Material Biológico.
26
8.2. MÉTODOS.
27
8.2.1. Electroporación de líneas celulares.
27
8.2.2. Transfección mediante el método de fosfato de calcio.
27
8.2.3. Ensayo de endocitosis basado en anticuerpo (inmunoendocitosis)
27
8.2.4. Ensayo de endocitosis basado en biotinilización de proteínas de superficie.
28
8.2.5. Westem blot.
28
8.2.6 Inmunoprecipitación desde cerebro de rata.
29
8.2.7. Ensayo de reciclaje.
30
11
8.2.8. Marcaje de proteínas de superficie celular mediante biotinilización.
30
8.2.9. Ensayo de endocitosis basado en marcaje de receptor con bungarotoxinaAlexa488.
8.2.9. Adquisición y análisis de imágenes.
9. RESULTADOS.
31
31
32
9.l. Caracterización de la endocitosis de los receptores GABA 8 .
32
9.1.1. Evaluar la dependencia de agonista de la endocitosis de los receptores
GABAs.
32
9 .1.1.1 Los receptores GABA 8 son endocitados en fonna constitutiva en
células HEK293 y en neuronas.
9.1.2. Caracterizar el mecanismo de endocitosis del receptor GABA 8 .
32
37
9 .1.2.1. Los receptores GABA 8 son endocitado en dendritas de neuronas
hipocampales.
37
9 .1.2.2. La endocitosis del receptor GABA 8 es parcialmente dependiente de
clatrina y dinamina-1.
9.1.3. Detem1inar el destino de los receptores GABA 8 endocitados.
40
44
9.1.3.1. Los receptores GABA 8 son reciclados a la membrana plasmática a
través de un compartimento Rabll positivo.
44
9.2. Caracterizar los mecanismos de control de la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA8 en condiciones de estimulación excitatoria.
46
9.2.1. Detem1inar el efecto de glutamato sobre la disponibilidad en la membrana
de los receptores GABA 8 .
46
9.2.1.1. Glutamato disminuye la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA 8 mediante un proceso dependiente de endocitosis. 46
9.2.2. Detenninar si existen cambios en las rutas endocíticas de GABA 8 tras la
estimulación con glutamato.
53
9 .2.2.1. G1utamato induce cambios en la distribución subcelular de los
receptores GABA 8 endocitados desde un compartimento Rab 11
positivo a un compartimento rab !!negativo.
53
9.2.2.2. Glutamato induce cambios en la distribución subcelular de los
receptores GABA 8 mediante un proceso degradativo pero no es
acumulado en endosomas tardíos.
56
9.2.3. Localizar las detenninantes moleculares que controlan el destino de los
receptores GABA 8 endocitados.
60
lll
9.2.3.1. El estado de fosforilación de Ser783 en la submlidad GABA 8 2
controla la localización de los receptores GABA 8 endocitados.
60
9.2.4. Detenninar el efecto de neurotransmisores sobre la disponibilidad en la
membrana de los receptores GABA8 .
63
9 .2.4.1. Detenninar si la degradación inducida por glutamato de los
receptores GABA 8 es bloqueada por baclofen.
10. DISCUSIÓN.
lO. l. Endocitosis independiente de agonista de los receptores GABA 8 en neuronas.
63
65
65
10.2. Endocitosis del receptor GABA 8 es dependiente de clatrina y dinamina-1 en
neuronas.
66
10.3. Reciclaje.
66
10.4. Endocitosis en dendritas y axones.
67
10.5. Regulación de la disponibilidad en la superficie de los receptores GABA 8 por
glutamato.
10.6. Mecanismos que controlan el reciclcúe y la degradación de los receptores GABA8 .
68
69
1O. 7. El balance dinámico entre la degradación y el reciclaje controla la abundancia
de los receptores GABA 8 a través de un switch de fosforilación.
10.8. Glutamato, sobreexcitación y daño neuronal.
70
71
11. CONCLUSIONES.
74
12. PROYECCIONES.
75
12. BIBLIOGRAFÍA
76
lV
2. ÍNDICE DE FIGURAS.
Figura l. Potenciación a largo plazo.
5
Figura 2. Esquema de mtas de señalización en la fom1ación de LTP y L TD.
7
Figura 3. Esquema de la vía de señalización del receptor GABA8 .
12
Figura 4. La función de los receptores GABA8 es determinada por su localización.
13
Figura 5. Representación esquemática de la desensibilización y resensibilización de GPCRs.
17
Figura 6. Endocitosis constitutiva del receptor GABA 8 en células HEK293.
34
Figura 7. Endocitosis constitutiva del receptor GABA 8 en neuronas hipocampales.
35
Figura 8. Endocitosis constitutiva del receptor GABA 8 en neuronas cmiicales.
36
Figura 9. Los receptores GABA 8 son endocitados constihitivamente en dendritas de neuronas
hipocampales.
38
Figura lO. Los receptores GABA 8 son endocitados como heterodímeros.
39
Figura 11. El receptor GABAB es endocitado a través de una vía parcialmente dependiente de
clatrina y no interactúa con a. ó ~-adaptina.
41
Figura 12. La endocitosis de GABA 8 es dependiente de dinamina-1 en células HEK293.
42
Figura 13. La endocitosis de GABA 8 es dependiente de dinamina-1 en neuronas.
43
Figura 14. Los receptores GABA 8 endocitados reciclan a la membrana plasmática después de ser
endocitados.
45
Figura 15. La disponibilidad en la membrana de los receptores GABA 8 es disminuida por
glutamato.
48
Figura 16. La disponibilidad en la membrana de los receptores GABA 8 es disminuida por
NMDA.
49
Figura 17. La perdida dependiente de glutamato de los receptores GABA 8 en la membrana
plasmática es bloqueada por MG 132.
Figura I 8. MG 132 previene la endocitosis del receptor GABA 8 en un paso temprano.
50
51
Figura 19. La pérdida dependiente de glutamato de los receptores GABAB desde la membrana
plasmática es mediada por endocitosis.
Figura 20. Glutamato induce cambios en la localización de los receptores GABA8 endocitados.
52
54
Figura 21. Glutamato induce un cambio de localización del pool GABA 8 endocitado hacia un
compmiimento Rabi! negativo.
55
Figura 22. La vía degradativa inducida por glutamato de los receptores GABAB endocitados es
lisosomal.
58
V
Figura 23. La degradación de los receptores GABA 8 inducida por glutamato no produce su
acumulación en un compartimento rab7 positivo.
59
Figura 24. El cambio de localización del pool GABA 8 endocitado es simulado por la
expresión de la mutante GABA8 2 S783A en condiciones no estimuladas.
61
Figura 25. El cambio de localización del pool GABA 8 endocitado simulado por la expresión
de la mutante GABA 8 2 S783A se ve aumentado en presencia de glutamato.
62
Figura 26. La degradación de los receptores GABA 8 inducida por glutamato es bloqueada
por la presencia de baclofen.
64
Figura 27. Modelo de switch glutamatérgico para el tráfico endocítico de los receptores
GABA 8 .
72
VI
3. INDICE DE ABREVIATURAS.
AMPA: Ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazoloe-4-propionico
GABA: Ácido y-amino butírico
GDP: Guanidina difosfato
GPCR: G-protein coupled receptor
GST: Glutatión S transferasa
GTP: Guanidina trifosfato
hr: Hora
hrs: Horas
kDa: Kilo Dalton
M: Molar
mA: Mili amperes
mg: Mili gramos
min: Minutos
mJ/c1112: Mili joule por centímetro cuadrado
m!: Mili litro
mm: Mili metros
mM: Mili molar
NMDA: Ácido N-metil-D-aspartato
nm: Nano metros
PBS: Tampón fosfato salino:
p/v: Peso/volumen
seg: Segundos
tJ12: Tiempo medio de reacción
V: Voltios
v/v: Volumen/volumen.
J.l.F: Micro faradios
J.!.l: Micro litros
J.lg: Micro gramos
~tM:
Micro molar
~un:
Micro metros
J.lm2: Micro metros cuadrados
°C: Grados Celsius
4. RESUMEN
La disponibilidad de los receptores en membrana está controlada por mecanismos de tráfico
intracelular, los cuales han sido ampliamente estudiados para los receptores ele glutamato y
relacionados con fenómenos plásticos como LTP y LTD. Estos a su vez han sido relacionados con
procesos cognitivos como memoria y aprendizaje. Se conoce poco acerca de la importancia del
tráfico de los receptores gabaérgicos sobre la plasticidad. Este conocimiento es virtualmente nulo en
el caso de los receptores metabotrópicos de GABA.
GABA 8 es un receptor acoplado a proteína G que posee características únicas, como por
ejemplo ser un heterodímero obligatorio. La disponibilidad ele los receptores en la membrana
plasmática es el resultado de la llegada de receptores desde la ruta de síntesis y/o el reciclaje, y de la
salida por vías endocíticas. Existen pocos trabajos de las rutas endocíticas, y ellos han mostrado
resultados contradictorios. Por esta razón, el objetivo de esta tesis es explorar la endocitosis de
receptor GABA 8 y cómo su modulación afecta la disponibilidad del receptor en la membrana.
En este trabajo se demuestra que el receptor GABA 8 , en su conformación heterodimérica, es
endocitado en forma independiente de agonista en el soma y en las dendritas. La internalización es
dependiente de clatrina y dinamina-1. El receptor es reciclado a la membrana plasmática desde
endosomas de reciclaje rabll positivos. Glutamato, el principal neurotransmisor excitatorio, posee
una relación poco explorada con el sistema gabaérgico a nivel de tráfico intracelular. Glutamato
disminuye los niveles de receptor GABA 8 en la superficie celular a través de la activación del
receptor NMDA. Esta desaparición es mediada por un proceso endocítico que además se manifiesta
en un cambio de localización intracelular de los receptores endocitados desde los endosomas de
reciclaje hacia un compariimento rab 11 negativo ubicado en la cercanía de la membrana. Glutamato
induce degradación de este receptor pero no induce acumulación en compartimentos lisosomales. El
proceso degradativo de receptores GABA 8 producido por glutamato es inhibido por su agonista,
baclofen.
A partir de estas observaciones podemos concluir que glutamato, pero no GABA, controla la
abundancia de los receptores GABA 8 en neuronas centrales, en forma concordante con su
enriquecimiento en las sinapsis glutamatérgicas. Esto establece que el glutamato actúa como una
señal extracelular no convencional gatillando un mecanismo que controla la abundancia del receptor
GABA 8 en neuronas. Además, demuestra la existencia de un fenómeno de control de la
disponibilidad de receptores GABA 8 que responde a un balance de activación de receptores de
glutamato y GABA, lo cual puede explicar el efecto neuroprotector de baclofen en isquemia.
2
5.SUMMARY
The availability of membrane receptors is controlled by intracellular trafficking mechanisms.
These have been widely studied for glutamate receptors and are closely associated with plastic
phenomena such as LTP and LTD, which underlie higher order neural activities, such as memory
and learning. Although the implications of GABA receptors trafficking in synaptic plasticity has
been explored for ionotropic GABA receptors (GABAA) but little is known for metabotropic GABA
receptors (GABA 8 ).
GABA 13 receptors are G protein-coupled receptors that have unique characteristics, one of
which is being an obligatory heterodimer. Receptor availability in the membrane is controlled by de
novo inset1ion, recycling and endocytosis. There are only a few studies about GABA 8 receptor
endocytosis and they are controversia!. Therefore, the aim of this thesis is to explore whether
GABA 8 receptor endocytosis modulates the availability at the membrane.
We show that GABA13 receptors endocytosed independently of agonist in the cell body and
dendrites. Internalization was dependent on clathrin and dynamin-1. The receptor recycled from the
plasma membrane from rabi J positive recycling endosomes. Moreover, glutamate, the major
excitatory neurotransmitter decreased GABA 8 receptor levels at the cell surface through NMDA
receptor activation. This disappearance was mediated by an endocytic process followed by a
diversion from recycl ing endoso mes to a rab 11-negative compartment located in the vicinity of the
membrane of unknown identity. GABA13 receptors are degraded, but no accumulation in lysosomal
compartments was observed in the presence of glutamate. The glutamate-induced degradative
process of GABA 13 receptor is inhibited by baclofen.
Tbese observations indicate that glutamate but not GABA controls the availability of GABA 13
receptors in central neurons. They establish an important mechanism to control the abundance of
GABA 13 receptor in neurons and the efficacy of synaptic transmission. Furthermore, they
demonstrate that the availability of GABA13 receptors is controlled by a balance between activation
of glutamate and GABA receptors. These results are consistent with the enrichment of GABA 13
receptors in glutamatergic synapses
3
6. INTRODUCCIÓN
6.1. Fenómenos cognitivos complejos y plasticidad en el sistema nervioso.
Los cerebros de humanos adultos contienen sobre 100 billones de neuronas, con cada una
interconectada por miles de sinapsis. Una sola experiencia puede por lo tanto ser traducida en la
activación de una gran diversidad de posibles circuitos neuronales (Kessels and Malinow, 2009).
¿Cómo puede una experiencia llevar a cambios en los circuitos que subyacen a un comportamiento
adaptativo? Caja! originalmente hipotetizó que el guardado de la información se basa en cambios en
la fuerza de las conexiones sinápticas entre neuronas que están activas. Hebb apoyo esta hipótesis y
propuso que si dos neuronas están activas al mismo tiempo, la eficacia sináptica de las sinapsis
apropiadas será fortalecida (Lynch, 2004). En otras palabras las experiencias pueden modificar las
sinapsis, favoreciendo algunas vías neuronales en un circuito y debilitando otras.
Los cambios en la fuerza sináptica dependientes de la experiencia son el mejor nexo causal
para actividades neuronales de orden superior tales como el aprendizaje y la memoria hasta el
momento. Al menos dos componentes de la memoria pueden ser discernidos: memoria de corto
plazo, la cual perdura desde minutos hasta horas, y la memoria a largo plazo, la cual persiste por
varios días y frecuentemente mucho más. A nivel celular, el guardado de las memorias a largo plazo
es asociado con expresión genética, síntesis de novo de proteínas, y formación de nuevas
conexiones sinápticas. Consistente con esto, los inhibidores de la síntesis proteica pueden bloquear
la persistencia de la memoria pero no afectan la memoria a cmto plazo, sugiriendo que las
memorias a largo plazo se basan en la activación de genes que es gatillada cerca o en el mismo
momento de la experiencia (Abraham and Williams, 2008; Cooke and Bliss, 2006).
La mayoría de las teorías neurocientíficas del aprendizaje se refieren a la potenciación a largo
plazo (LTP) y a su proceso opuesto, depresión a largo plazo (LTD), como la base celular para el
aprendizaje y la memoria. El LTP (Fig.l) se explica como un fortalecimiento a largo plazo de la
conexión entre dos células nerviosas. Experimentalmente, una serie de estimulaciones cmtas de alta
frecuencia sobre una sinapsis de células nerviosas puede fortalecer, o potenciar, la nusma,
prolongando su duración desde minutos hasta horas (Neves et al., 2008).
Al igual que la memoria, el LTP tiene distintas fases que involucran diferentes mecanismos
moleculares. La fase temprana del LTP (E-L TP), la cual dura 2-3 hrs, es independiente de síntesis
de proteína, mientras que Ja fase tardía de] LTP (L-L TP), la cual dura varias horas in vitro y
semanas in vivo, requiere síntesis de nuevas proteínas (Sweatt et al., 1998). Los cambios de corta
4
duración involucran la modificación de proteínas presentes en la sínapsís de forma prevía a su
activación; cambios de larga duración requieren la síntesis de nuevas proteínas, que
presumiblemente llegarán a ser residentes de la sinapsis activadas (Huang et al., 2002). Además, los
inhibido res de LTP hipocampal bloquean también el aprendizaje y retención de tareas (Morris et al.,
1986). Esta dinámica provee los fundamentos de un sistema nervioso altamente adaptable.
5
CA3
300
lOO
-15
15
30
45
Iime{min)
Figura l. Potenciación a largo plazo. Cambios a través del tiempo en la amplitud de los
potenciales excitatorios postsináptícos (EPSPs) evocados por la estimulación de las vías 1 y 2. La
estimulación de alta frecuencia de la vía l causa un prolongado aumento en la amplitud de los
EPSPs en esta vía (púrpura). Esta potenciación de la transmisión sináptica en la vía 1 persiste por
varías horas, mientras que la amplitud de los EPSPs producidos por la vía 2 (naranjo), la cual no
recibió estímulos de alta frecuencia, permanece constante (Figura extraída de Purves, 2004).
6
6.2. Plasticidad sináptica y disponibilidad de receptores de glutamato en la membrana
plasmática, un ejemplo de la interacción entre estos fenómenos.
El tráfico de los receptores de a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
(AMPA) hacia y desde la membrana postsináptica se ha involucrado en el establecimiento de
cambios en la fuerza sináptica inducidos por actividad que son íntimamente asociados al
aprendizaje y a la formación de la memoria. Existe evidencia sobre la impo1iancia de estos
fenómenos de tráfico, por ejemplo, al inhibir la asociación entre PI3K y AMPA (Man et al., 2003) o
al bloquear el transporte de los endosomas de reciclaje hacia la membrana (Park et al., 2004) se
bloquea el aumento de los receptores AMPA en la membrana y también la producción del LTP.
El LTP en el área CA 1 del hipocampo es inhibido por un antagonista del receptor de N-methyl
D-aspartate (NMDA) llamado ácido 2-amino 5-fosfonopentanoico (AP5); la activación de este
receptor produce un influjo de calcio a través del canal de calcio sensible a voltaje y a ligando, e
inicia la cascada celular como resultado de la estimulación tetánica. Se ha establecido que la
mayoría de las sinapsis que apoyan el LTP, en el hipocampo o en algún otro lugar, lo hacen en una
manera dependiente del receptor NMDA. La activación de este receptor permite un influjo de iones
calcio en la espina postsináptica, lo cual es necesario y suficiente para la inducción de LTP
hipocampal (B liss and Collingridge, 1993 ). Los iones Ca
2
+
entran a la espina postsináptica y
activan proteínas quinasas (CaMKil, PKC). Estas quínasas actúan sobre el pool de receptores
AMPA, los cuales son transportados desde los endosomas de reciclaje hacía la membrana
plasmatica, por lo tanto incrementando la disponibilidad de los receptores AMPA en la superficie
celular y como resultado también la sensibilidad a glutamato (Fig 2) (Kessels and Malinow, 2009;
Mal en ka, 2003; Park et al., 2004 ).
El número de receptores AMPA es determinado por el balance entre la inserción y la
remoción de los receptores en los sitios postsinápticos y tiene una intima relación con los
fenómenos plásticos. Esta relación ha sido poco estudiada para los receptores gabaérgicos y
permanece casi inexistente para los receptores metabotrópícos de GABA (GABAB).
7
Figura 2. Esquema de rutas de señalización en la formación de LTP y LTD. A-La
depolarización expulsa el Mg2+ desde el canal de NMDA, permitiendo que la corriente fluya dentro
de la célula postsináptica. Esto lleva a la entrada de calcio, lo cual a su vez gatilla el LTP y
mediante una compleja vi a deseñalizacion produce la inserción de los receptores AMPA. B-La baja
activacion de los receptores AMPA produce una reduccion del influjo de Ca2+ que produce la
intemalización de los receptores AMPA (Figura extraída de Purves, 2004).
8
6.3. Plasticidad neuronal y disponibilidad de receptores de GABA en la membrana
plasmática.
La mayoría de las sinapsis del sistema nervioso central utilizan ácido y-amino-butírico
(GABA) para controlar la inhibición. GABA, al igual que otros neurotransmisores como Lglutamato, serotonina y acetilcolina, activa tanto receptores ionotrópicos como metabotrópicos
(Kaupmann et al., 1997). Los receptores de GABA ionotrópicos (GABA"/GABAc) son canales
iónicos activados por ligando que median la inhibición rápida de la transmisión sináptica. Sin
embargo, los receptores GABAA parecen ser más importantes en el control de este fenómeno. La
regulación de esta inhibición es vital en la modulación de la actividad neural. Se ha probado que el
bloqueo de los receptores GABAA facilita la inducción de L TP en rebanada de hipocampo. Esto
sugiere un importante rol de este receptor en memoria y aprendizaje, lo cual alienta el uso clínico de
los antagonistas GABAA en el mejoramiento de desordenes cognitivos (Matsuyama et al., 2008).
En forma similar a los receptores de glutamato se postula que cambios en la disponibilidad en
la membrana de los receptores GABAA afectan fenómenos de orden superior. Se demostró
recientemente que la ausencia total de la subunidad a3 del receptor GABAA afecta las funciones
cognitivas y afectivas (Fiorelli et al., 2008) y que diferentes sustancias que son responsables de
cambios plásticos en el sistema nervioso central tales como insulina (Vetiska et al., 2007) y BDNF
(Joshi and Kapur, 2009) modulan la abundancia en la membrana plasmática de los receptores
ionotrópicos GABAA. Insulina aumenta la asociación entre el receptor GABAA y PI3K y activa
PI3K, incrementando la disponibilidad de los receptores GABAA en la membrana plasmática, lo que
aumenta las corrientes inhibitorias miniaturas mediadas por el receptor GABAA (Vetiska et al.,
2007). También se ha descrito que el factor neurotrófico derivado de cerebro o BDNF a través de la
activación del receptor TrkB modula la función del receptor GABAA sináptico en neuronas
hipocampales (Jovanovic et al., 2004). BDNF aumenta la disponibilidad en la membrana de la
subunidad 8 del receptor GABAA y en paralelo disminuye su acumulación intracelular. Este
fenómeno es producido por un mecanismo dependiente de la activación del receptor TrkB, PLCy y
PKC pero no de PI3K (Joshi and Kapur, 2009). BDNF también aumenta la disponibilidad en la
membrana de las subunidades
~2/3
a través de un mecanismo que involucra la activación de TrkB,
PLC y PI3K (Jovanovic et al., 2004). Esto demuestra que cambios en la disponibilidad en la
membrana plasmática de los receptores GABAA son impo1iantes para su funcionalidad y que están
asociados a vías de transducción de señal activadas por otros receptores en la membrana plasmática.
9
Por otro lado, en un modelo de status epilepticus se demostró la existencia de importantes
cambios en la disponibilidad en la membrana plasmática de los receptores GABAA, indicando que
estos cambios no solo son importantes para estados fisiológicos sino que también estarían
sucediendo estados patológicos. Un prolongado bursting epileptiforme resulta en una reducción de
la inhibición mediada por GABA. El incremento en la actividad neuronal asociada a estos ataques
acelera la tasa de endocitosis constitutiva de los receptores GABAA, mientras que la inhibición de la
actividad neuronal la reduce. Esto sugiere que la tasa de internalización del receptor GABAA es
regulada por la actividad neuronal y que la aceleración contribuye a la reducción de la transmisión
inhibitoria observada durante ataques prolongados (Goodkin et al., 2005). El mecanismo molecular
de este fenómeno fue recientemente dilucidado. El status epilepticus disminuye selectivamente la
fosforilación en el residuo 408/9 (S408/9) en la subunidad
~3
de los receptores GABAA producida
por la asociación íntima con PKC. La desfosforilación de este residuo desenmascara el motivo de
unión básico para la unión de clatrina y AP2 aumentando así la endocitosis de los subtipos de
receptores GABAA seleccionados desde la membrana plasmática durante el status epilepticus. De
acuerdo con esto, el aumento en la fosforilación en S408/9 o el bloqueo selectivo de la unión de la
subunidad
~3
a AP2 aumentaría la disponibilidad de los receptores GABAA en la superficie celular
y restauraría la eficacia de la inhibición sináptica en status epilepticus. Estas observaciones proveen
nuevas estrategias terapéuticas para el mejoramiento del status epilepticus (Terunuma et al., 2008).
Los antecedentes anteriores dan cuenta del avance tanto en el conocimiento del efecto de la
disponibilidad en la membrana sobre fenómenos complejos como en los mecanismos moleculares
que controlan la disponibilidad de los receptores de glutamato y GABA en la membrana. Estos
mecanismos no son conocidos para los receptores GABA 8 , jugadores centrales en la modulación de
la actividad sináptica excitatoria e inhibitoria, permanece menos entendida.
6.4. Receptores GABAB.
Los receptores GABA 8 son proteínas de transmembrana acopladas a proteína G, y median la
inhibición
sináptica
prolongada
y
lenta.
Los
receptores
GABA 8
fueron
descritos
farmacológicamente por primera vez en 1981 como receptores metabotrópicos insensibles a
bicuculline (inhibidor de los receptores GABAA) y que pueden ser activados por baclofen, un
análogo sintético de GABA y agonista del receptor GABA8
Se piensa que la disfunción de la transmisión sináptica modulada por GABA 8 es la causa de
varios desórdenes del sistema nervioso central. Por ejemplo, la hipoactividad del sistema GABA 8 se
10
asocia con epilepsia, espasticidad, ansiedad, stress, desórdenes del sueño, depresión, adicción y
dolor (Fairfax et al., 2004 ). Por el contrario, la hiperactividad de los sistemas GABAérgicos se
asocia con la esquizofrenia (Benes and Berretta, 2001). Baclofen, ha sido utilizado en el tratamiento
de la espasticidad provocada por esclerosis múltiple o daño espinal. Recientemente han surgido
otras potenciales aplicaciones clínicas de este fármaco, incluyendo el tratamiento de la epilepsia, la
ansiedad, la depresión y el déficit atencional (Cryan and Kaupmann, 2005).
Se han identificado dos subunidades para el receptor GABA 8 , la subunidad GABA 8 l y la
subunidad GABA 8 2, las cuales conforman un heterodímero obligatorio. Además, existen diversas
variantes de empalme alternativo para GABA 8 l, de las cuales solo GABA 8 1a y GABA 8 lb han sido
detectadas como proteínas en tejido cerebral (Calver et al., 2002; Couve et al., 2000; Kaupmann et
al., 1997).
La distribución de los receptores GABA 8 en el sistema nervioso central de humanos y
roedores
ha
sido
caracterizada usando
unión
de
radioligando,
hibridación
in
situ
e
inmunohistoquímica. Los datos desde varios estudios están de acuerdo en la localización de los
receptores GABA 8 . Áreas con altos niveles de receptores incluyen el núcleo talámico, cerebelo,
corteza, hipocampo, ganglio basal y hasta dorsal de la espina dorsal (Billinton et al., 2000; Bowery
et al., 1987).
Las variantes de empalme alternativo de GABA 8 1 son diferencialmente expresadas a través
de diferentes áreas del cerebro y durante el desarrollo pero siempre están asociadas con GABA 8 2
(Fritschy et al., 1999). GABA 8 1a se expresa preferencialmente en densidades postsinápticas,
mientras que GABA 8 lb se expresia principalmente en sitios presinápticos o extrasinápticos (Benke
et al., 1999). Esto es claramente observado en los cuerpos celulares del núcleo cerebelar profundo,
los cuales se tiñen para GABA 8 1a, mientras que los terminales que rodean los cuerpos celulares son
marcados con anticuerpo para GABA 8 1b (Poorkhalkali et al., 2000).
Los receptores metabotrópicos GABA 8 se encuentran acoplados a la proteína Gcx.i/Gcw, y
modulan la transmisión sináptica a través de la subunidad Gpy. Esta modulación puede tener lugar
en el compartimiento presináptico, donde Gpy inactiva los canales de Ca2+ tipo N dependientes de
voltaje y provoca la inhibición de la liberación del neurotransmisor (Fig 3A), o en el
compa1iimiento postsináptico, donde Gpy activa los canales rectificadores hacia adentro de K+
(Kir), evocando los potenciales de acción postsinápticos inhibitorios lentos modulando la
transmisión sináptica (Fig 3B) (Billinton et al., 2001; Ling and Benardo, 1994). Adicionalmente, los
receptores GABA 8 producen la inhibición de la síntesis de AMPc en ambos compartimientos, a
través de la subunidad Gcx.i/Gcx.o de la proteína G (Fig 3 ).
11
Los receptores GABA 8 presinápticos se dividen en dos grupos: autoreceptores, es decir,
aquellos que regulan la liberación de GABA; y heteroreceptores, los cuales regulan la liberación de
otros neurotransmisores, como L-glutamato, noradrenalina, dopamina, 5-hidroxitriptamina,
sustancia P, colecistocinina o somatostatina (Kaupmann et al., 1997). Además, se ha postulado que
los receptores GABA 8 postsinápticos localizados perisináptica y extrasinápticamente son activados
sólo en presencia de niveles muy elevados de GABA en la sinapsis, Jo que provoca un spillover o
derramamiento del neurotransmisor hacia el espacio extrasináptico, tal como ocurre durante la
estimulación de múltiples interneuronas o pooling (Scanziani, 2000) (Fig 4 ).
12
B
A
Compartimento presináptico
Compartimento postsináptico
j-·"'""'.'
1,'-j--d:s
~1.--
SO¡.¡M (+)Bac
~r CorUm!
Figura 3. Esquema de la vía de señalización del receptor GABAB. A- La proteína G activada se
separa en la subunidad a, la cual inhibe a la enzima adenilato ciclasa (AC), y la subunidad
~Y.
que
inactiva los canales de calcio voltaje dependientes y produce la disminución de la corriente de
calcio, como se observa en el registro. B- La proteína G activada se separa en la subunidad a la cual
inhibe a la enzima Adenilato Ciclasa, y la subunidad
~y
que activa los canales de potasio
rectificadores hacia adentro produciendo, como se observa en el registro, un aumento en la corriente
de potasio.
13
GABAs
autoreceptors
soma
.¡...-
Figura 4. La función de los receptores GABAB es determinada por su localización Los
receptores GABAB son localizados presinápticamente, postsinápticamente y en membranas
extrasinápticas. Los autorreceptores presinápticos (localizados en terminales que liberan GABA)
inhiben la liberación de GABA, mientras que los heterorreceptores inhiben la liberación de varios
otros neurotransmisores (por ejemplo: glutamato) y péptidos bioactivos. Los receptores GABAB
postsinápticos activan los canales de potasio e inducen potenciales postsinápticos inhibitorios
lentos, la componente rápida es mediada por receptores GABAA. Los receptores extrasinápticos son
activados por el spillover o derramamiento de GABA desde las sinapsis adyacentes (Figura extraída
de Bettler, 2006).
14
6.5. Disponibilidad de receptores GABA 8 en la superficie celular.
La disponibilidad en la superficie celular de los receptores GABA 8 está determinada por un
balance entre la inserción y remoción desde la membrana plasmática. A partir de la evidencia
previamente detallada en sistemas glutamatérgicos se deprende que estos procesos son altamente
dinámicos y fueJiemente regulados, probablemente involucrando exocitosis, endocitosis y difusión
lateral en la membrana plasmática. Procesos que podrían representar un punto de control de
procesos complejos como la plasticidad sináptica.
6.5.1. Tráfico exocítico de los receptores GABA8 •
El receptor GABA 8 es uno de los pocos GPCRs que se caracterizan por ser heterodímeros
obligatorios. Cuando la subunidad GABA 8 1 es expresada en un sistema heterólogo, ésta no alcanza
la superficie celular debido a que es retenida en el retículo endoplasmático (Couve et al., 1998). En
cambio, al expresar GABA 8 2 en un sistema similar, la proteína alcanza la membrana celular y
produce la inhibición de adenilato ciclasa en respuesta a GABA , pero es incapaz de activar los
canales Kir (Martín et al., 1999). Finalmente, cuando se expresan in vitro las dos subunidades,
GABA 8 1 y GABA 8 2, se logra la expresión funcional del receptor GABA 8 en la membrana
plasmática, exhibiendo un perfil farmacológico equivalente a los receptores GABA 8 silvestres en
cerebro (White et al., 1998). Esto se debe a que ambas subunidades se asocian a través del dominio
coiled-coil presente en el carboxilo terminal de cada una de ellas, enmascarando así una secuencia
de retención en el retículo endoplasmático presente en la subunidad GABA13 1 (Jones et al., 1998;
Kaupmann et al., 1998; Kuner et al., 1999; Margeta-Mitrovic et al., 2000; White et al., 1998). Se ha
demostrado que los dominios de tipo coiled-coil median un número de interacciones proteínaproteína en otros sistemas, pero ésta fue la primera vez que se describió una interacción de esta
naturaleza en receptores de siete dominios de transmembrana. Este es un principio totalmente nuevo
de procesamiento de receptor y transducción de señales en que dos proteínas receptoras no
funcionales se asocian para formar un receptor acoplado a proteína G funcional.
La subunidad GABA 8 1 ha sido implicada en la unión a ligando (Galvez et al., 2001;
Malitschek et al., 1999; Margeta-Mitrovic et al., 2001), y la subunidad GABA 8 2 ha sido implicada
en el acoplamiento del receptor a proteína G (Margeta-Mitrovic et al., 2001; Robbins et al., 2001).
También existe evidencia de que este ensamblaje de los receptores GABA 13 sucede in vivo, ya que
15
las proteínas GABA 8 2 y GABA 8 la/b coinmunoprecipitan desde extractos cerebrales y colocalizan
en la misma subpoblación de neuronas, específicamente en las espinas dendríticas de las mismas
(Jones et al., 1998; Kaupmann et al., 1997).
Recientemente se demostró que en neuronas hipocampales las subunidades del receptor
GABA 8 están segregadas y tienen movilidad independiente en compartimientos intracelulares
dendríticos y que también existe una alta proporción de subunidades no asociadas en fracciones
microsomales de cerebro. Los heterómeros ensamblados se localizan predominantemente en la
membrana plasmática, consistente con un fenómeno de flujo masivo de subunidades segregadas a
través del ER y no así con un transporte vesicular post-golgi de receptores GABA 8 preensamblados
que recorren largos trayectos hasta su sitio de inserción en la membrana plasmática dendrítica
(Ramirez et al., 2009).
El receptor GABA 8 se encuentra asociado a un número creciente de proteínas a través de su
extremo carboxilo terminal intracelular, muchas de las cuales podrían afectar su funcionalidad a
través de la modulación del tráfico exocítico. Se han realizado varios estudios que han determinado
que varias proteínas se asocian a la subunidad GABA 8 2 (CHOP (Sauter et al., 2005), NSF (Pontier
et al., 2006), MUPPI (Milligan and White, 2001)) y otros se asocian a la subunidad GABA 8 1 (143-3 (Couve et al., 2001), COPI (Brock et al., 2005), CREB2/ATF4 (Nehring et al., 2000; White et
al., 2000), Marlin-1 (Couve et al., 2004). Algunas de estas proteínas cambian la expresión y otras el
trafico de las subunidades del receptor GABA 8 en sistemas heteorólogos y también en neuronas,
representando posibles blancos para la modulación de la disponibilidad de Jos receptores GABA 8 en
la membrana plasmática.
Estos datos nos hablan de un particularmente complejo sistema de trafico exocítico por
síntesis de novo. El control de este proceso podría ser de vital importancia para la disponibilidad de
los receptores GABA 8 en la membrana plasmática en condiciones fisiológicas o patológicas del
sistema nervioso.
6.5.2. Tráfico endocítico de los receptores GABA 8 •
6.5.2.1. Desensibilización de los receptores GABA.
En general, los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) participan en varias vías de
señalización que inician respuestas celulares y juegan un rol clave en la regulación hormonal y
neuronal. La eficacia de la señalización de los receptores es regulada por diversos procesos que
contribuyen a fenómenos tales como tolerancia y taquifilaxis (pérdida rápida de la respuesta)
16
(Perroy et al., 2003). La estimulación de GPCRs acoplados a proteínas G sensibles a la toxina de
pertussis produce la apertura de canales Kir en milisegundos. Cuando la estimulación es persistente,
la amplitud de la corriente disminuye con el tiempo. Esta reducción de los niveles de corriente es
conocida como desensibilización y corresponde a una respuesta adaptativa de la célula que previene
la señalización excesiva del receptor (Mutneja et al., 2005). La desensibilización es la consecuencia
de una combinación de diferentes mecanismos, tales como el desacoplamiento del receptor y la
proteína G heterotrimérica en respuesta a la fosforilación del primero, y la endocitosis del receptor
desde la superficie celular a los compartimentos membranosos intracelulares (Bohm et al., 1997;
Ferguson, 2001 ). Este último paso permite la desfosforilación y posterior resensibilización del
receptor (Fig.5). En cambio, cuando la estimulación es crónica, el receptor sufre desregulación, es
decir, una disminución del número de receptores. Esta disminución se debe tanto a la degradación
de la proteína como a la reducción del estado estacionario del mRNA (debida principalmente a la
disminución de la estabilidad del mismo) (Chuang et al., 1996).
Se
han
caracterizado
dos
patrones
impmiantes
de
desensibilización,
llamados
desensibilización homóloga o específica de agonista y desensibilización heteróloga o no específica
de agonista.
El término desensibilización homóloga implica que cuando un receptor es activado por su
agonista, solamente resulta afectada la respuesta subsecuente del mismo receptor, y no existe
ningún efecto sustancial sobre otros sistemas de receptores presentes en la misma célula.
Los procesos de desensibilización homóloga en la mayoría de los GPCRs parecen ser
mediados principalmente por dos familias de proteínas: las quinasas de receptor acoplado a proteína
G (GRKs, G-protein receptor kinases) y las arrestinas (Ferguson et al., 1996). De acuerdo al
modelo generalmente aceptado para los GPCRs clase 1, las GRKs se unen específicamente al
receptor en su conformacion activa y catalizan su fosforilación. Este hecho incrementa la afinidad
del mismo por proteínas del tipo arrestina, las cuales se unen al receptor y evitan la interacción entre
el receptor y la proteína G. En muchos casos, la unión de arrestina también provoca la
internalización del receptor desde la membrana plasmática vía endocitosis mediada por clatrina
(Goodman et al., 1997; Krupnick et al., 1997; Laporte et al., 2000; Laporte et al., 1999).
Por el contrario, la desensibilización heteróloga implica que la activación de un sistema
agonista/receptor atenúa la respuesta evocada por Jos agonistas en respectivos receptores. La
fosforilación es un paso esencial para la desensibilización homóloga y heteróloga, pero los
mecanismos moleculares son absolutamente distintos (Chuang et al., 1996).
17
DOWN REGU!.ATION
NUCLEUS
Figura 5. Representación esquemática de la desensibilización y resensibHización de GPCRs.
La unión del agonista (H) a un GPCR produce la activación de proteínas G heterotriméricas (G) y
enzimas efectoras (E). El término de esta señal es producido por el desacoplamiento de la proteína
G. Para los GPCRs de clase 1 generalmente es un proceso dependiente de fosforilación mediado por
quinasas de receptor acoplado a proteína G (GRK); grupo fosfato (P).Esta fosforilación promueve la
interacción del GPCR con B-arrestina (Barr) desencadenando su reclutamiento hacia los pits
recubiertos de clatrina (Clathrin coated pits). Posteriormente se produce la endocitosis de los
receptores a través de la escisión de la vesículas de la membrana plasmatica mediada por dinamina
(Dynamin) y el tráfico de estas vesículas hacia los endosomas (Endosome). Después de ser
desfosforilados por fosfatasas de receptor acoplado a proteína G (GRP) los receptores pueden ser
reciclados a la membrana plasmática en su conformación inactiva (Recycling) o ser degradados en
lisosomas (Lysosome), proceso conocido como desregulación de receptores (Down Regulation).
18
Aunque los procesos de desensibilización tanto homóloga como heteróloga han sido
profusamente estudiados para los GPCRs clase 1 (a la cual pertenecen rodopsina y
~2-adrenérgico ),
se sabe mucho menos acerca de los procesos de desensibilización de los receptores clase 2 y 3.
Entre los receptores de clase 3 se encuentran los receptores metabotropicos de glutamato (mGluR) y
los receptores GABA 8 . La desensibilización de GluR del tipo l es debido en parie a la fosforilacion
mediada por GRK2 y 4, mientras que para el receptor GABA8 la interaccion con GRK4 no produce
fosforilación del receptor per si desensibilización (Perroy et al., 2003). Aunque los efectos agudos
de la activación de GABA 8 son bien conocidos, se han llevado a cabo muy pocos estudios sobre su
desensibilización. Couve y colaboradores (2002) sugieren que la reducción de la corriente de
potasio evocada porGABA tras la estimulación sostenida de Jos receptores GABA 8 es producto de
desensibilización homóloga. Sin embargo, el mismo grupo demostró que la fosforilación del
receptor GABA 8 en Ser892 por PKA inhibe la desensibilización de la corriente, desafiando el
paradigma de la fosforilación como modulador negativo universal de los GPCRs. En líneas
celulares y cultivo primario se han obtenido resultados variados y contradictorios son respecto a la
desensibilización del receptor GABA 8 . Una estimulación breve (2s) pero repetida de GABA 8 en
cultivo neuronal provoca una disminución del 60% de la amplitud de las corrientes Kir tras un
periodo de ensayo de 10-15 m in. La fosforilación de los extremos e-terminales atenúa este
decrecimiento, sugiriendo que la estabilidad de los receptores GABA 8 en la membrana aumenta con
la fosforilación dependiente de PKA (Couve et al., 2002). La estimulación prolongada (lh) de los
receptores GABA 8 produce desensibílización cuando GRK4 es coexpresada con el receptor en
células HEK-293. Sorpresivamente, el dominio quínasa, y por lo tanto la fosforilación vía GRK4,
no fue requerida para la desensibílización (Perroy et al., 2003). En células CHO, la estímulación a
largo plazo (>2 h) de los receptores GABA 8 induce desensibilización e internalización del receptor
(Gonzalez-Maeso et al., 2003). Por otro lado, en estudios realizados en slices agudos se determinó
que en neuronas grises periacueductales, la estimulación de los receptores GABA 8 por 5 min
produce escasa desensibilización de las corrientes Kir, mientras que la misma estimulación de
neuronas en el área tegmentallaterodorsal resulta en más de un 25% de desensibilización (Chieng et
al., 1995). Además, en el área ventral tegmental, la desensibilizacíón producida por Baclofen se
observa en neuronas dopaminérgicas pero no en neuronas GABAérgicas del mismo núcleo. Así, la
extensión de la desensibilización del receptor GABA 8 es variable, dependiendo del tipo de neurona
(Cruz et al., 2004), tipo celular y tiempo del estímulo.
El estudio de la desensibilización del receptor GABA8 es de particular interés si
consideramos su organización estructural atípica (heterodímero obligatorio). Aún no ha sido
19
demostrado que estos receptores heterodiméricos sigan el paradigma clásico de desensibilización.
La importancia de GABA 8 en la mediación de la inhibición sináptica lenta en el sistema nervioso
central (Billinton et al., 2001; Couve et al., 2000) justifica el estudio del mecanismo que regula la
eficacia de su señalización.
6.5.2.2. Endocitosis de receptores GABAn
Existen distintos tipos de endocitosis de GPCRs. La endocitosis constitutiva corresponde a la
internalización de receptores en su conformación inactiva no asociada a ligando, proceso que
posibilita el recambio natural de las proteínas de membrana o la acumulación de proteínas en un
pool intracelular, en espera de un estímulo que induzca la exocitosis (van Rijnsoever et al., 2005).
Por otro lado, la endocitosis inducida por agonista está asociada a la finalización de la respuesta del
receptor y a su posterior resensibilización (Prossnitz, 2004; Tanowitz and von Zastrow, 2003).
Además, dependiendo del mecanismo de internalización de los receptores, la endocitosis se clasifica
en dependiente o independiente de clatrina (Henley et al., 1999). Esta última incluye la endocitosis
asociada a caveola y otro(s) tipo(s) de endocitosis aún no caracterizado(s) (Nabí and Le, 2003).
Muchos GPCRs sufren endocitosis inducida por ligando vía pits recubiertos por clatrina. Este
proceso puede ser promovido por un mecanismo altamente conservado que involucra la interacción
del receptor con
~-arrestina
(Tsao et al., 2001 ). El primer paso de la endocitosis de GPCRs
dependiente de clatrina involucra la interacción del receptor con la proteína adaptadora AP2 y el
posterior sorting de los receptores hacia las vesículas recubiertas en fonnación (Roth et al., 1998).
El pit recubierto crece por la adición de nuevas subunidades de clatrina y reaneglo concomitante de
los constituyentes de la cubierta. Esto provoca que el patrón de clatrina inicialmente plano adquiera
curvatura y forme un pit recubierto cada vez más profundo y esférico. Estos estados tempranos de la
invaginación son seguidos por un paso de constricción del cuello del pit. Finalmente el pit
recubierto se separa de la membrana plasmática para generar una vesícula cubieiia de clatrina
(VCC) libre. La GTPasa dinamina es esencial para la formación de las VCCs (Nankoe and Sever,
2006). Algunos receptores que sufren endocitosis dependiente de clatrina parecen estar sujetos
también a mecanismos de internalización diferentes. El receptor
~2
adrenérgico es endocitado vía
pits recubie1ios de clatrina en varios tipos celulares, pero estudios morfológicos sugieren que estos
receptores pueden endocitarse en otras células mediante invaginaciones de membrana similares a
caveolas. Por otra palie, los receptores de colecistocinina han sido observados en pits recubiertos
por clatrina y en caveolas en las mismas células (Tsao et al., 2001). La endocitosis de varios GPCRs
20
no resulta inhibida por la presencia de dominantes negativos de dinamina, los cuales bloquean la
endocitosis de pits recubietios de clatrina y de caveolas, lo que sugiere que otros mecanismos de
endocitosis estarían involucrados. Efectivamente, la endocitosis de los receptores de angiotensina
ATIA acoplados a proteína G y los receptores muscarínicos M2 implica mecanismos
independientes de dinamina (Vickery and von Zastrow, 1999). Por lo tanto, distintos GPCRs
difieren en su habilidad para sufrir endocitosis por pits recubiertos, y es probable que existan
además diferencias dependientes del tipo celular.
A través de los años se ha intentado demostrar por distintos métodos y en distintas ventanas
de tiempo la endocitosis constitutiva y mediada por agonista del receptor GABA 8 , pero Jos
resultados han sido negativos hasta la realización de este trabajo (Fairfax et al., 2004; Mutneja et al.,
2005; Perroy et al., 2003). Solo existe un antecedente de endocitosis de receptores GABA 8
recombinantes expresados en células CHO, donde se observa internalización tras 2 horas de
estimulación con GABA (Gonzalez-Maeso et al., 2003). Este resultado difiere de los experimentos
de internalización y de biotinilación de proteínas de superficie en neuronas co1iicales en cultivo
primario, en los cuales no se observó internalización de GABA 8 tras un estímulo con baclofen (15
min a 6 hrs). Sólo después de 60 hrs de estimulación con baclofen se observa una disminución
significativa de la cantidad de receptores GABA 8 en la superficie celular con respecto a la
disminución basal (Fairfax et al., 2004). La sorprendente estabilidad del receptor GABA 8 es otra
característica inusual de este GPCR.
Podemos concluir que el fenómeno de desensibilización de los receptores GABA 8 es un
fenómeno complejo que a la luz de los antecedentes difiere de los paradigmas clásicos establecidos
para los GPCRs. Y que la estabilidad en la membrana que presenta hasta el momento no está de
acuerdo con la disminución en el tiempo que presentan las respuestas a su activación. La
desensibilización por tanto podría estar dada por otro mecanismos, como el desacoplamiento de la
proteína G desde su interacción con el receptor, la internalización de los canales de K+ tipo Kir y
varios otros posibles mecanismos. Sin embargo, la disponibilidad en la membrana de los receptores
GABA 8 es importante en la desensibilización de las corrientes Kir. Esto queda demostrado cuando
la desensibilización de esta corriente es bloqueada por la fosforilación de GABA 8 2 en Ser892 y el
aumento de GABA 8 en la membrana plasmática (Couve et al., 2002). Esto demuestra que este
fenómeno de desensibilización es preferencialmente controlada por la cantidad de receptor GABA 8
más que por la cantidad de canal de K+ en la membrana plasmática. A partir de estos antecedentes
surge el interés de estudiar en detalle los mecanismos de tráfico que modulan la disponibilidad en la
membrana plasmática de los receptores GABA 8 .
21
6.5.2.3. Consideraciones generales de la endocitosis de receptores en neuronas
En algunas sinapsis coexisten múltiples subtipos de receptores. Cambios dependientes de
actividad en el número de receptores en la sinapsis han sido detectados durante protocolos de LTP y
LTD. Cuando los receptores son removidos de la membrana plasmática por endocitosis, antes de la
internalización se produce sorting de los receptores hacia la zona activa, las cuales son adyacentes a
la densidad postsináptica o perisinápticas. Se postula que esto ocurriría por difusión específica y
subsecuente captura en pits recubiertos de clatrina (Lu et aL, 2007). Los pits recubiertos han sido
observados principalmente fuera de las áreas sinápticas mediante la utilización de microscopía de
luz o electrónica (Triller and Choquet, 2005). En esta línea se ha demostrado que la remoción de los
receptores AMP A sinápticos, inducida por NMDA, es precedida por la endocitosis transitoria de los
receptores AMPA extrasinápticos (Ashby et al., 2004).
La velocidad de internalización de los GPCRs parece ser receptor específico. Por ejemplo, el
receptor Al de Adenosina se internaliza muy lentamente (tl/2
receptor A3 (t 1/2
=
=
90 min) en comparación con el
19 min) (Ferguson et al., 2000). Estas diferencias cinéticas sugieren que la
internalización de los GPCRs puede ser mediada por múltiples mecanismos endocíticos y/o que la
heterogeneidad entre los subtipos de receptores modula su afinidad relativa para unir proteínas
adaptadoras endocíticas. Otra posibilidad para estas diferencias es el grado de dificultad que
presentan los receptores para difundir fuera de la sinapsis. La localización perisináptica de los
receptores GABA 8 (Kulik et al., 2003) y la presencia de la maquinaria endocítica en las
inmediaciones de la espina sináptica (Racz et al., 2004) evitarían la necesidad de difusión de estos
receptores. Esto permitiría que la velocidad de endocitosis de los receptores GABA 8 fuera
extremadamente rápida con respecto a los receptores que están concentrados en la sinapsis.
La diversidad de modelos y aproximaciones experimentales, además de los resultados
conflictivos estimulan el estudio detallado de las vías endocíticas en modelos neuronales. Los
estudios previos sugieren de preferencia un modelo de endocitosis constitutiva. Por lo tanto es de
gran impotiancia enfocarse en posibles candidatos que modulen el trafico endocítico de los
receptores GABA 8 . Debido a la expresión de los receptores GABA 8 en la región adyacente a la
densidad postsináptica de las sinapsis excitatorias, es posible que exista una interacción entre los
sistemas GABAérgico y glutamatérgico (Kulik et al., 2003). Por otro lado existen evidencias de
modificación de la cantidad de receptor GABA 8 bajo condiciones experimentales que simulan un
estado de excitabilidad excesiva, lo que nos da un indicio de un posible cross talk entre estos
sistemas (Cimarosti et al., 2009).
22
A partir de los antecedentes recopilados, que nos muestran que los receptores GABAB tienen
una compleja ruta de tráfico, la cual es casi desconocida en sistemas neuronales y las importancia
del control de la disponibilidad de los receptores en la membrana plasmática, surge la pregunta de
¿Cómo se controla la disponibilidad de los receptores GABAB en la membrana plasmática de
neuronas?
23
7. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Con los antecedentes presentados y considerando i) la importancia de la diponibilidad en la
membrana de receptores de neurotransmisor en la eficacia sináptica ii) la inexistencia de trabajos
detallados sobre endocitosis de los receptores GABA 8 en neuronas. iii) la evidencia sobre
endocitosis constitutiva. La esta tesis propone la siguiente hipotesis:
"La dúponibilidad en la membrana plasmática de los receptores GABA 8 es controlada por
endocitosis independiente de su agonista"
Objetivo general
"Definir los mecanismos endocíticos que regulan la disponibilidad del receptor GABA 8 en
neuronas
Objetivos específicos
!-Caracterizar la endocitosis de los receptores GABA 8
1.1- Evaluar la dependencia de agonista de la endocitosis de los receptores GABA 8 .
1.2- Caracterizar el mecanismo de endocitosis del receptor GABA 8 .
1.3- Determinar el destino de los receptores GABA 8 endocitados.
2- Caracterizar los mecanismos de control de la disponibilidad en la membrana de los receptores
GABA 8 en condiciones de estimulación glutamatérgica.
2.1- Determinar el efecto de glutamato sobre la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA 8 .
2.2- Determinar si existen cambios en la ruta endocíticas del receptor GABA 8 tras la
estimulación con glutamato.
2.3- Localizar las determinantes moleculares que controlan el destino de los receptores
GABA 8 endocitados.
2.4- Determinar el efecto de glutamato sobre la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA 8 .
24
8. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1. MATERIALES.
8.1.1. Reactivos Químicos.
De Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU) se obtuvieron los siguientes reactivos:
Acetato de sodio, ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido etilen glicol bis(2-aminoetil eter)N,N,N'N'-tetra acetico (EGTA), ácido deoxicolico (DOC), Acrilamida/Bis-acrilamida, Agarosa,
Ampicilina, Bromuro de etidio, Cloruro de amonio (NH4Cl), Cloruro de Magnesio (MgC12),
Cloruro de Potasio (KCl), Cloruro de Sodio (NaCI), D-Giucosa, Ditiotreitol (DTT), Dodecil Sulfato
de Sodio (SDS), Fosfato dihidrogenado de Potasio (KH2P04), Fosfato hidrogenado disodico
(Na2HP04), Glicina, Glutatión, Kanamicina, L-Glutamina, Medio Eagle Mínimo (MEM), N,N,N,N
-Tetrametil-Etilenediamina (TEMED), Solución salina balanceada Hank(HBSS) IX, Octilfenoxi
poli(etilenoxi)etanol (NP-40), Paraformaldehido (PFA), Persulfato de amonio (APS), Poli-L-lisina,
Triton X-1 00, Tween-20, 2-mercaptoetanol.
De GIBCO (Carlsbad, CA, EE.UU) se obtuvieron los siguientes reactivos:
Azul de bromofenol, Bicarbonato de sodio, Cianol de xileno, Fungizona, Hepes, Medio Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) alta glucosa, Medio Neurobasal, Opti-MEM, Penicilina/
Estreptomicina, Suero de Caballo, Suplemento B27, Tripsina/EDTA 1OX.
De Merck & Co, Inc (Darmstdt, Germany) se utilizaron los siguientes reactivos:
Etanol, Hidróxido de sodio, Isopropanol, Metano!, Sacarosa.
De Fermentas (Hanover, MD, EE.UU) se obtuvieron los siguientes reactivos:
Enzimas de restricción, Fosfatasa alcalina intestinal de bovino (CIAP), Ligasa T4, Marcador de
peso molecular 1kb, Polinucleotido quinasa T4 (PNK)
De BD Fa!con (San Jose, CA, EE.UU.) se utilizaron:
Placas para cultivo celular, Tubos plásticos, Medio LB
De Winlder (Lampa, STGO, Chile) se utilizaron:
Acetato de amonio, Albúmina de suero bovino (BSA), Marcador de peso molecular de proteínas
preteñido, rango amplio 19-118 kDa.
De Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.) se obtuvieron los siguientes reactivos:
Membrana de nitrocelulosa
De lnvitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU) se obtuvieron:
Agar
25
De Pierce (Rockford, IL, EE.UU.) se obtuvo:
Super Signa! West Pico Chemiluminescent Substrate, Slide-A-Lyzer Dialysis Casete
De QIAGEN (Valencia, CA, EE.UU.) se obtuvo:
Columnas para purificación de ADN plasmidial QIAGEN Plasmid Midi Kit
De Biologicallndustries Ltd. (Kibbutz Beit Haernek, Israel) se obtuvo:
Suero fetal de bovino (SFB)
De Arnersharn Biosciences (Piscataway, NJ, EE.UU) se obtuvo:
Proteína G sefarosa recombinante, Fast Flow
De Vecto1· lab01·atories (Burlingarne, CA, EE.UU.) se obtuvo:
Vectashield
De Kodak (Brasil) se obtuvo:
Liquido revelador y liquido fijador
De Arnersharn Pharrnacia Biotech (Inglatena) se obtuvo:
Placas fotográficas Hyperfilm ECL
De Calbiochern (San Diego, CA, EE.UU.) se obtuvo:
Cóctel de inhibidores de pro teas as 100 X
8.1.2. Anticuerpos.
Anticuerpos primarios
Anti-HA hecho en ratón de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU).
Anti-MYC hecho en conejo y pollo de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU).
Anti-RECEPTOR GABAB 1 hecho en pollo, donación del laboratorio del Dr. S. Moss
(Pennsylvania, EEUU).
Anti-RECEPTOR GABAB2 hecho en pollo, donación del laboratorio del Dr. S. Moss
(Pennsylvania, EEUU).
Anticuerpos secundarios
Anti-IgG de conejo, pollo y ratón acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) de Jackson lnmuno
Research Laboratories (West Grove, PA, EE.UU.)
Anti-IgG de conejo y ratón acoplado Cy5 (azul) de Jackson Immuno Research Laboratories (West
Gro ve, PA, EEUU).
Anti-IgG de conejo y ratón acoplado a TRITC (rojo) de Jackson Immuno Research Laboratories
(West Grave, PA, EEUU).
26
Anti-IgG de conejo y ratón acoplado a FITC (verde) de Jackson Immuno Research Laboratories
(West Grove, PA, EEUU).
8.1.3. Material Biológico.
Para realizar ensayos de expresión heteróloga se utilizaron la línea celular HEK-293T (ATCC
N° CRL-11268), origen: Riñón, especie: Hommo sapiens de A TCC (Manassas, VA, E E. UU).
Para la realización de los cultivos primarios de neuronas se utilizaron ratas Sprague-Dawley
proporcionadas por el vivero central de la Facultad Ciencias de la Universidad Católica de Chile.
Para los ensayos bioquímicos de cerebro de rata adulta se usaron ratas Sprague-Dawley y
proporcionadas por el Bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.
27
8.2. MÉTODOS
8.2.1. Electroporación de líneas celulares.
Se cultivó la línea celular de interés hasta obtener células en fase de crecimiento exponencial.
Las células fueron despegadas de su sustrato por incubación con tripsina, entonces se lavaron con
Optimem. Para proceder a la electroporación, las células fueron resuspendidas en 1OO¡..tl de
Optimem más la cantidad de DNA apropiada para la transfección. Esta mezcla se introdujo en una
cubeta de electroporación de 0,5mm de diámetro BIORAD. El protocolo de electroporación que se
utilizó para las líneas celulares HEK293 fue el recomendado por BIORAD.
8.2.2. Transfección mediante el método de fosfato de calcio.
Para la transfección de neuronas cultivadas en un cubreobjetos redondo de 12mm de diámetro
se preparó una mezcla conteniendo el DNA de 25 fll totales: 2flg de cada DNA a transfectar, 2,5 fll
de CaCl2 y agua. La mezcla de DNA fue agregada gota a gota sobre 25 ul de HeBs2X pH6.9. Se
agitó ligeramente el tubo con los dedos después de que cada gota fue agregada y la mezcla se dejo
incubar por 25 min en oscuridad. Las células fueron ubicadas en una placa de 24 pocillos y
cubiertas con DMEM (pH6.9) sin suero, entonces la mezcla final de transfección fue agregada gota
a gota y llevada a la estufa por 1O min. La formación del precipitado de fosfato de calcio-DNA fue
detectada visualmente y entonces el medio de transfección fue reemplazado por el medio
condicionado de las neuronas. Los experimentos realizados con estas células fueron llevados a cabo
dos días post-transfección.
8.2.3. Ensayo de endocitosis basado en anticuerpo (inmunoendocitosis).
Las células fueron transfectadas con las dos subunidades del receptor GABAB: la subunidad 1
y la subunidad 2 la cuales están etiquetadas con myc y HA respectivamente. Después de dos días de
transfección las células fueron enfriadas por lavados con HBSS pre enfriado. Luego fueron
incubadas con anticuerpo especifico para la etiqueta myc por 1hr a 8°C. Posteriormente se eliminó
el exceso de anticuerpo con lavados con HBSS y uno de los cubreobjetos con células fue fijado. El
resto de los cubreobjetos fue incubado con HBSS en presencia o ausencia de diferentes drogas a
37°C. Entonces, las células fueron fijadas e incubadas directamente con un anticuerpo secundario
28
acoplado a un fluoróforo. Posteriormente las células fueron permeabilizadas e incubadas con un
anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo de otro color. Las imágenes fueron capturadas y
procesadas para análisis utilizando Metamorph.
8.2.4. Ensayo de endocitosis basado en biotiniiización de proteínas de superficie.
Neuronas corticales en cultivo primario 7div fueron lavadas con solución PCM fría (PBS
conteniendo calcio y magnesio). Posteriormente fueron incubadas con una solución de biotina
1mg/ml por 15 m in bajo agitación constante. Para eliminar el exceso de biotina se lavaron las
células 3 veces, y la biotina libre que no es eliminada por lavados se bloqueó con solución PCM
conteniendo glicina. Entonces, se de dos placas en hielo y las demás fueron incubadas en una estufa
a 37°C por l hr. Después, una de las placas en hielo y las placas a 37°C fueron incubadas con una
solución conteniendo glutatión lo cual produce la liberación de la biotina desde las proteínas que
permanecen en la superficie y no así desde las proteínas que se movilizaron a compartimentos
intracelulares. Posteriormente, todas las placas fueron lisadas utilizando tampón RIPA. Se
solubilizaron por 1hr con agitación constante. Se centrifugaron a 13000 rpm por 15 min para
eliminar los núcleos. Se tomó el 10% de la muestra postnuclear y se mezclo con tampón de carga.
El extracto restante se mezcló con esferas de agarosa que tienen acopladas moléculas de
estreptoavidina y la mezcla se incubó por 4 horas bajo agitación constante. Las esferas fueron
sedimentadas y lavadas en condiciones astringentes con tampón RIPA conteniendo una alta
concentración de sales. Las muestras se mezclaron con tampón de carga y junto con sus
correspondientes l 0% fueron sometidas a western blot para la detección de los receptores GABA 8 y
posterior análisis de la cantidad de receptor endocitado.
8.2.5. Western blot.
Las muestras de proteínas desde los diferentes experimentos fueron separadas por tamaí'ío en
geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE) según el método de Laemmli
(1970) de tampón discontinuo con algunas modificaciones. Se utilizó un gel apilador al 5% (0.06 M
Tris-HCI pH 6.8, 5% acrilamida-bis-acrilamida, 0.1% SDS, 0.1% persulfato de amonio y 0.06%
TEMED). Para detectar la subunidades del receptor GABAB (118 Kd) se realizó un gel separador
con 10% de acrilamida (0.38 M Tris-HCl pH 8.3, 10% acrilamida-bis-acrilamida, 0.1% SDS, 0.1%
persulfato de amonio y 0.06% TEMED). La electroforesis de las proteínas fue realizada con tampón
29
de corrida (Tris 25 mM, glicina 250 mM, SDS 0.1%) a un voltaje constante de 90 V por
aproximadamente 12 hrs
Las proteínas ya separadas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La
transferencia se realizó a 370 mA por 2.5 hrs a 4 °C usando tampón de transferencia frío (Tris 48
mM, Glicina 39 mM, SDS 0.037%, metano! 20 %).
Las membranas se bloquearon en una solución que contenía: 4%leche descremada, 0.1%
(v/v) tween-20 en PBS por 15 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Entonces se
incubaron con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo toda la noche a 4 °C. El exceso
de anticuerpo primario fue retirado lavando la membrana tres veces con solución de bloqueo por 10
min a temperatura ambiente agitando constantemente. Para detectar el anticuerpo primario se
incubaron las membranas las membranas con anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo.
Las membranas fueron lavadas tres veces en solución de bloqueo por 1O min a temperatura
ambiente y con agitación constante. La detección final fue obtenida mediante la catalización del
sustrato Super Signa! West Pico Chemioluminescent Substrate por la enzima HRP acoplada al
anticuerpo secundario. El producto de esta reacción (quimioluminiscencia) fue detectada en placas
fotográficas.
8.2.6. lnmunoprecipitación desde cerebro de rata.
Un cerebro de rata adulta fue disectado para posteriormente ser homogeneizado en tampón
TNTO (50mM Tris-HCI, 150mM NaCl, 1% Tritón X-100, 60mM b-Octylglucopyranoside, !mM
DTT, inhibidores de proteasas) en un homogeneizador Potter. Los núcleos fueron eliminados por
centrifugación (4000rpm durante 1Omin). El lisado fue preincubado con esferas de sefarosa
acopladas a proteína A, para eliminar las proteínas que se unen inespecíficamente a la proteína A.
Posteriormente, 100¡J.I del lisado preaclarado fueron incubados toda la noche con 1¡J.g de anticuerpo
específico para la proteína de interés. Se agregaron las esferas de sefarosa acopladas a proteína G y
esta mezcla se incubó por 2hrs. Las esferas fueron aisladas por centrifugación (3000rpm por 3min)
y lavadas con tampón TNTO conteniendo una alta concentración de NaCI (350mM).
Posteriormente, se mezclan las esferas con buffer de carga de proteínas. El complejo proteico
inmunoprecipitado es separado en un gel de poliacrilamida al 10% y entonces sometidas a western
blot.
30
8.2.7. Ensayo de reciclaje.
Neuronas de hipocampo transfectadas con plasmidios codificantes para las dos subunidades
del receptor GABA 8 y diferentes para proteínas recombinantes fueron enfriadas mediante lavados
con HBSS frío. Posteriormente se incubaron con anti-myc por 15 min a 8°C. Las neuronas fueron
incubadas a 37°C por un periodo de tiempo de 1 hr y sometidas a un tratamiento de stripping ácido,
el cual consiste en incubar por 3 min con la solución de striping (0.2 M glicina, pH 2.5, 0.5 M
NaCl). Este proceso permitió marcar solo los receptores que fueron endocitados en un periodo de
lhr y que no fueron reciclados a la membrana plasmática, ni fueron enviados a degradación. Se
procedió entonces a una segunda incubación a 37°C por 1,5hrs. Las células fueron fijadas en 4%
paraformaldehido, sacarosa e incubadas por 2hrs con anticuerpo secundario acoplado a TRITC. El
exceso de secundario fue removido mediante 3 lavados con solución de IF, entonces se procedió a
la permeabilización y bloqueo de las neuronas mediante la incubación por 30 min con solución de
permeabilización. Finalmente fueron incubadas por 2 hrs con anticuerpo secundario acoplado a
FITC. Para su visualización las células fueron lavadas 3 veces con solución de IF, montadas con
Vectashield y fijadas con esmalte.
8.2.8. Marcaje de proteínas de superficie celular mediante biotinilización.
Neuronas coiiicales en cultivo primario 7div fueron sometidas a diferentes tratamientos
farmacológicos. Posteriormente fueron lavadas con solución PCM fría (PBS conteniendo calcio y
magnesio) e incubadas con una solución de biotina 1mg/ml por 15 min bajo agitación constante.
Para eliminar el exceso de biotina se lavaron las células tres veces, y la biotina libre que no es
eliminada por lavados se bloqueo con PCM conteniendo glicina. Posteriormente, todas las placas
fueron Jisadas utilizando tampón RIPA. Se solubilizaron por 1hr con agitación constante. Se
centrifugaron a 13000 rpm por 15 min para eliminar los núcleos. Se tomó el 10% de la muestra
postnuclear y se mezclo con tampón de carga. El extracto restante se mezcló con esferas de agarosa
que tienen acopladas moléculas de estreptoavidina y la mezcla se incubó por 4 horas bajo agitación
constante. Las esferas fueron sedimentadas y lavadas en condiciones astringentes con tampón RIPA
conteniendo una alta concentración de sales. Las muestras se mezclaron con tampón de carga y
junto con sus correspondientes 10% fueron sometidas a western blot para la detección de los
receptores GABA 8 y posterior análisis de la cantidad de receptor endocitado
31
8.2.9. Ensayo de endocitosis basado en marcaje de 1·eceptor con bungarotoxina-Aiexa488.
Células HEK293 fueron transfectadas con la subunidad Rl modificada con una secuencia de
unión a bungarotoxina y la subunidad GABA 8 2, después fueron cultivadas sobre cubreobjetos. Las
células fueron utilizadas después de 48 hrs de expresión. Se agregó l O¡..tg/ml bungarotoxina
acoplada a alexa-488 en el medio junto con diferentes drogas por lh a 37°C. Las células fueron
lavadas 3 veces con PBS y fijadas con 4% paraformaldehido/sacarosa. Posteriormente, los
cubreobjetos fueron montados con Vectashield sobre un pmiaojetos y sellados con esmalte.
8.2.9. Adquisición y análisis de imágenes.
Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal Zeiss LSM-5 Pascal 5 Axiovert
200 y un objetivo con contraste de interferencia diferencial de aceite 63x/1.4 Plan-Apochromat
usando el software de captura y análisis de imágenes LSM 5 3.2. Las imágenes de confocal crudas
fueron deconvolucionadas por Huygens Scripting software (Scientific Volume Imaging, Hilversum,
Netherlands). La cuantificación de la internalización fue realizada usando el software MetaMorph.
La cantidad de receptor endocitado fue expresada como el porcentaje de intensidad internalizada
(intensidad internalizada ele un canal excluyendo la intensidad de superficie de ambos canales)
relativa a la intensidad total (intensidad internalizada de un canal mas la intensidad en la superficie
de los dos canales).
Algunas imágenes fueron obtenidas usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX61 WI
acoplado a un DSU (disk scanning unit) Olympus. Las imágenes fueron capturadas usando el
software Fluoview.
Todas las figuras fueron construidas usando el software Adobe Photoshop CS2.
32
9. RESULTADOS
9.1. Caracterización de la endocitosis de los receptores GABA 8 •
9.1.1. Evaluar la dependencia de agonista de la endocitosis de los receptores GABA 8 •
9.1.1.1 Los ¡·eceptores GABA 8 son endocitados en forma constitutiva en células HEK293 y en
neuronas.
Existe una gran controversia con respecto a la endocitosis de los receptores GABA 8 . Por lo
cual, en una primera instancia, se llevaron a cabo experimentos de inmunoendocitosis del receptor
GABA 8 . En este tipo de experimentos, el pool de receptores de membrana plasmática es
sincronizado mediante marcaje con un anticuerpo primario a 1ooc y el tráfico de este complejo es
monitoreado en un lapso de tiempo determinado a 37°C. Este tipo de esperimento nos permite
visualizar los receptores que permanecieron en la membrana plasmática con un anticuerpo
secundario acoplado a un fiuoroforo X y posterior a la permeabilización de las células los receptores
que fueron endocitados utilizando un anticuerpo acoplado a un fiuoroforo Y. Las células HEK
fueron transfectadas con la subunidad GABA 8 1 y GABA 8 2 del receptor. El receptor heterodimérico
fue claramente acumulado en la membrana plasmática después de 48 hrs de expresión (Fig. 6A,
Control). El destino de los receptores en la superficie celular fue monitoreado después de 60 min de
incubación a 37°C. Se observó endocitosis constitutiva del receptor GABA 8 como una acumulación
de vesículas endociticas conteniendo a GABA 8 en condiciones no estimuladas (Fig. 6B, NE), las
cuales no fueron encontradas en la condición control. Por otro lado, en presencia de 100 ¡.¡M
GABA, el agonista natural de los receptores GABA 8 , no se observó un incremento del receptor
endocitado (Fig. 6C, GABA).
Los receptores GABA 8 son principalmente expresados en neuronas del sistema nervioso
central, por lo cual es impo1iante realizar estos experimentos en un contexto fisiológico como lo son
neuronas hipocampales en cultivo primario.
De la misma forma que en células HEK293, los receptores fueron robustamente expresados
en la superficie celular de las neuronas hipocampales después de 48hrs de expresión (Fig. 7A,
Control). Después de 60 min de incubación a una temperatura permisiva para la endocitosis se
observaron estructuras como vesículas en el interior de las neuronas (Fig. 7B, non stimulated).
Sorprendentemente, no se observó una mayor acumulación intracelular en presencia de baclofen o
GABA (Fig. 7C, Baclofen y D, GABA). La carencia de endocitosis inducida por agonista de
GABA 8 es una característica inusual para los receptores acoplados a proteína G.
33
Para corroborar estas observaciones, se llevaron a cabo experimentos de endocitosis basados
en el marcaje con biotina de proteínas de superficie en neuronas corticales en cultivo primario. La
subunidad GABA 8 1 fue eficientemente detectada en la superficie celular (Fig. 8A, carril 1), y una
fracción significativa fue acumulada en compartimentos intracelulares bajo condiciones basales (Fig
8. A, carril 3). Sin embargo, la acumulación intracelular de los receptores GABA 8 no aumentó al
estimular las neuronas con baclofen o GABA (Fig. 8A, carriles 4 y 5), lo que concuerda con las
observaciones de microscopia (Fig. 7). Al cuantificar el receptor internalizado como una fracción
del receptor total presente en la superficie celular se observa que la endocitosis después de la
estimulación de las neuronas con baclofen o GABA no es significativamente diferentes desde la
condición control (Fig. 8B).
La acumulación de receptores GABA 8 en compartimentos intracelulares podría estar
enmascarada por la liberación de trazas de GABA por las neuronas en el medio. Si este fuera el
caso, en condiciones basales ya se encontraría internalizado el receptor activado por GABA y al
estimular con agonistas agregados al cultivo no se observaría un aumento en la tasa de endocitosis.
Para descartar esta posibilidad, neuronas corticales fueron estimuladas con saclofen, un antagonista
específico del receptor GABA 8 , y no se observó cambio en la tasa de endocitosis presentada por
estos receptores con respecto a la condición basal (Fig. 8C). Estos resultados indican que una
proporción de los receptores GABA 8 sufren endocitosis independiente de su agonista tanto en un
sistema heterólogo, células HEK293 como en un sistema homólogo, neuronas corticales en cultivo
primario.
34
A
B
e
Figura 6. Endocitosis constitutiva del receptor GABAB en células HEK293. (A-C) Células
HEK293 fueron transfectadas en forma simultánea con las subunidades GABABl-myc y GABAB2HA. Se marcó la población de receptores GABABI (heterodímero) ubicada en la membrana
plasmática de células vivas con un anticuerpo específico para el epítope myc a 10°C (A-control). Se
incubó a 37°C en condición no estimulada (B-NE) o en presencia de 100 ¡.tM GABA (C-GABA)
por 60 min. El receptor en la membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo
secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente. Finalmente las células fueron
penneabilizadas y el receptor internalizado fue detectado utilizando un anticuerpo secundario
conjugado a TRITC (rojo). (barra=lO ¡.tm)
35
E
GABABR1
Control
Non
Stimuiated
NS
Sadofen
GABA
Figura 7. Endocitosis constitutiva del receptor GABA8 en neuronas hipocampales. A-D Las
subunidades GABABl y GABAB2 del receptor, etiquetadas con myc y HA respectivamente, fueron
coexpresadas en neuronas hipocampales de 16 días in vitro (DIV). Se marcó la población de
receptores GABABl (heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas con un
anticuerpo específico para el epítope myc a l0°C (A-Control). Posteriormente, fueron incubadas a
37°C por 60 minen ausencia (B-Unstimuled) o en presencia de baclofen lOOf.lM (C, Badofen) o
GABA lOO f1M (D, GABA). Posterionnente, el receptor en la membrana plasmática fue detectado
incubando con un anticuerpo secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente.
Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor internalizado fue detectado utilizando
un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). E- Los experimentos de inmunoendocitosis
fueron cuantificados, la cantidad de fluorescencia intracelular fue expresada con respecto a la
fluorescencia total de cada célula y los resultados fueron graficados. (barra= 10 Jllll)
36
A
B
GABABR1
Neutravidin
WB Antí-GABABR1
10% Total Lysate
WB Anti-GABABR1
1
2
3
4
5
Surface
Non
Baclofen
Stimulated
GASA
lnternalized
e
GABAsR1
NS
Non Stimulated
Saclofen
Figura 8. Endocitosis constitutiva del receptor GABAB en neuronas corticales. A-C Las
proteínas de superficie de neuronas corticales 5div fueron marcadas utilizando biotina 1 mg/ml, y la
subunidad GABA8 l de esta fracción, fue detectada por Western blot (A, carrill). Para determinar
la intemalización de GABA 8 1, las neuronas fueron incubadas 60 mina 37°C en ausencia (A, carril
3) o presencia de 100 ¡.tM baclofen (A, carril 4) y de 100 ¡.tM GABA, su agonista natural (A, carril
5). La biotina de superficie fue escindida utilizando un medio reductor. B- Cuantificación de los
experimentos de endocitosis basados en biotina. La subunidad GABA 8 1 intemalizada fue expresada
como una fracción del receptor total presente en la superficie celular. C- La cantidad de GABA8 1
internalizado en presencia de 1 mM saclofen fue comparada con la condición no estimulada (cada
barra en el grafico representa el valor promedio± SE de 4 experimentos independientes).
37
9.1.2. Caracterizar el mecanismo de endocitosis del receptor GABAB.
9.1.2.1. Los receptores GABAB son endocitados en dendritas de neuronas hipocampales.
Las neuronas son células altamente polarizadas que presentan una arquitectura compleja. Los
receptores GABA 8 son expresados tanto en compartimentos pre- como post-sinápticos. Para
determinar si la endocitosis de los receptores GABA 8 difiere entre estos compartimentos, se
llevaron a cabo experimentos de inmunoendocitosis en dendritas y axones.
Los receptores recombinantes fueron expresados en la membrana plasmática de las dendritas
en condiciones control (Fig. 9A). Una gran cantidad de endosomas positivos para el receptor
GABA 8 fueron encontradas en dendritas de alto calibre (Fig. 98), y también en dendritas de bajo
calibre (Fig. 9C). El receptor GABA 8 también fue expresado abundantemente en la superficie de los
axones (Fig. 9D), pero no se observó acumulación intracelular a lo largo del shaft axonal, como lo
indica la ausencia de inmunodetección exclusivamente roja (Fig. 9E). Esta observación puede estar
alterada por falta de resolución de la técnica y serán necesarias otras aproximaciones experimentales
que permitan concluir si existe o no endocitosis del receptor GABA 8 en los axones.
Ha sido ampliamente documentado que los receptores GABA8 deben formar un heterodímero
para ser expresados en la membrana, pero el destino de los heterodímeros durante la endocitosis no
ha sido estudiado. Para determinar si las subunidades del receptor GABA 8 son endocitadas como
monómeros o continúan como dímero en la ruta endocítica, se realizó un experimento de
coinmunoendocitosis de estas subunidades.
Los receptores GABA 8 fueron expresados como heterodímeros en la membrana plasmática
(Fig. 1OC). Después de 60 m in de endocitosis ambas subunidades presentaron un alto nivel de
colocalización en endosomas tanto en el cuerpo neuronal como en las dendritas (Fig. 1OA-B). Esto
demuestra que cuando los receptores son endocitados en forma constitutiva permanecen en el
mismo endosoma.
38
Figura 9. Los receptores GABAB son endocitados constitutivamente en dendritas de neuronas
hipocampales. Las subunidades Rl y R2 del receptor, etiquetadas con myc y HA respectivamente,
fueron coexpresadas en neuronas de 16 DIV. Se marcó la población de subunidades GABA3 1
(heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas con un anticuerpo específico
para el epítope myc a 10°C (A y D). Entonces fueron incubadas a 37°C por 60 minen ausencia de
cualquier agonista (B, C y
Posteriormente, el receptor en la membrana plasmática fue detectado
incubando con un anticuerpo secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente.
Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado utilizando
un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). (barra= lO ¡.tm)
39
Figura 10. Los receptores GABA3 son endocitados como heterodímeros. A-C Neuronas
hipocampales 16 div fueron transfectadas en forma simultánea con GABA3 1-myc y GABA 3 2-HA.
Se marcó la población de receptores GABA 8 1 y GABA 8 2 ubicada en la membrana plasmática de
células vivas con anticuerpos específicos para los epítopes myc y HA respectivamente a l0°C (C).
Se incubó a 37°C por 60 min en ausencia de agonista (A-B). Para A y B, el receptor en la
membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a Cy5 (azul)
en solución sin detergente. Luego, las células fueron permeabilizadas y los receptores internalizados
fueron detectados utilizando anticuerpos secundarios conjugados a FITC (verde, GABA 8 1) y
TRITC (rojo, GABA 8 2). En C, el receptor en la membrana plasmática fue detectado incubando con
un anticuerpo secundario acoplado a FITC (verde, GABA 8 1) un anticuerpo secundario conjugado a
TRITC (rojo, GABA 8 2). (barra= lO J.Lm)
40
9.1.2.2. La endocitosis del ¡·eceptor GABA 8 es parcialmente dependiente de clatrina y
dinamina-1.
Se han descrito varías formas de endocítosis para receptores de membrana, siendo la
endocítosís dependiente de clatrina la más común para los receptores acoplados a proteína G. Para
determinar si la endocitosis de los receptores GABA 8 pe1ienece a esta categoría se realizaron
ensayos de ínmunoendocitosis en condiciones control o de baja concentración de K+, tratamiento
que bloquea la endocitosis mediada por clatrina.
En neuronas hipocampales ( 16DIV) no estimuladas se observó que el receptor GABA 8
endocitado se ditribuyó a través de todo el soma (Fig. IIA, Control). Al bloquear la endocitosis
mediada por clatrina se observó que solo algunas endosomas conteniendo a GABA 8 son
encontrados en las cercanías de la membrana celular de las neuronas (Fig. 11 A, low K+). A paiiir de
la cuantificación de varios experimentos se demostró que la disminución en la endocitosis de los
receptores GABA 8 al bloquear la endocitosis dependiente de clatrina fue significativa (Fig. 11 B).
El adaptador clásico entre el receptor y clatrina en la endocitosis mediada por clatrina es AP2,
el cual se compone de dos subunidades grandes estructuralmente relacionadas a y 02-adaptinas; una
subunidad mediana f12; y una subunidad pequeña a2. Además, dinamina-1 escinde las vesículas
cubiertas por clatrina desde la membrana plasmática. Por lo tanto, AP2 y dinamina-1 podrían
interactuar con el receptor GABA 8 . Para evaluar esta posibilidad se llevaron a cabo experimentos
de coinmunoprecipitación desde cerebro de rata.
Sorprendentemente, las subunidades a y 0-adaptina no fueron coinmunoprecipitadas con
GABA 8 1 o GABA 8 2 en neuronas corticales en cultivo primario (5DIV) (Fig. 11C), mientras que
dinamina-1 fue coinmunoprecipitada con GABA 8 1 desde membranas de cerebro de rata (Fig. 13F).
Para determinar la participación de dinamina-1 directa en la endocitosis de los receptores
GABA 8 se utilizaron las construcciones dinamina-1 WT y K44A (dominante negativo funcional).
La endocitosís constitutiva de GABA 8 en células HEK293 fue inhibida por la transfección del
dominante negativo de dinamina-1 (Fig. l 2). En neuronas, se determinó que la endocitosis
constitutiva fue bloqueada por el uso de dinamina-1 K44A pero no asi por dinamina-2 K44A (Fig.
13).
Estos resultados demostraron que los receptores GABA 8 fueron endocitados en forma
constitutiva dependiente de clatrina y dinamina-1.
41
GABABR1
Control
e
IPigG
IP R1
IPR2
Low K+
+
.
1
+
2
+
3
-
Input
-
o:-Adaptin
~-adaptin
4
Figura 11. El receptor GABAB es endocitado a través de una vía parcialmente dependiente de
datrina y no interactúa con a ó
~-adaptina.
A-Las subunidades GABABl y GABAB2 del
receptor, etiquetadas con myc y HA respectivamente, fueron coexpresadas en neuronas
hipocampales 16 DIV. Se marcó la población de subunidades GABABI (heterodímero) ubicada en
la membrana plasmática de células vivas con un anticuerpo específico para el epítope myc a l0°C.
Entonces, fueron incubadas con medio hipotónico a 37°C por 5 min seguido de un medio isotónico
libre de K+ por 30 min. Posteriormente, el receptor en la membrana plasmática fue detectado
incubando con un anticuerpo secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente.
Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado utilizando
un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). B-Gráficos obtenidos de la cuantificación de
varios experimentos. C-Extractos de neuronas corticales 5 div fueron inmunoprecípitadas con IgG
control (carrill), anticuerpos GABABI (carril 2) o anticuerpos GABAB2 (carril3). Lisados control
(20 ¡.tg) previos a la inmunoprecipitación fueron usados como control (carril4). Las muestras fueron
separadas por SDS-PAGE e inmunodetectadas con anticuerpos a-adaptina y p-adaptina.
42
Figura 12. La endocitosis de GABAB es dependiente de dinamina-1 en células HEK293.
GABA8 1-myc, GABA8 2-HA y la forma silvestre (A, Din-1 WT) o dominante negativo (B, Din-1
K44A) de dinamina-1 fueron expresadas en células HEK293. La población de subunidades
GABA 8 1 (heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas fue incubada con un
anticuerpo específico para el epítope myc a 10°C e incubada a 37°C por 60 minen una condición no
estimulada. El receptor en la membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo
secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente. Finalmente las células fueron
permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado utilizando un anticuerpo secundario
conjugado a TRITC (rojo). (barra= lOflm)
43
E
GA8ABR1
F
IPI¡¡G
+
IP R1
.,
+
Input
Oynamin1
1
2
3
Figura 13. La endocitosis de GABAB es dependiente de dinamina-1 en neuronas. A-D Las
subunidades GABAB1 y GABAB2 del receptor, etiquetadas con myc y HA respectivamente, fueron
coexpresadas junto con la forma silvestre (WT) o dominante negativo (K44A) para dinamina-1 (A y
B respectivamente) y para dinamina-2 (C y D respectivamente) en neuronas hipocampales 16 DIV.
Se marcó la población de subunidades GABABI (heterodímero) ubicada en la membrana plasmática
de células vivas con un anticuerpo específico para el epítope myc a 1Ü°C. Entonces, fueron
incubadas a 37°C por 60 min en ausencia de cualquier agonista. Posteriormente, el receptor en la
membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a Cy5 (azul)
en solución sin detergente. Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor internalizado
fue detectado utilizando un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). E- Cuantificación de
varios experimentos de inmunoendocitosis como en las figuras A-D. F-Extractos cerebrales fueron
inmunoprecipitados con IgG control (carril 1) o anticuerpos anti-GABABI (carril 2). Lisados
control previos a la IP se utilizaron como controles de carga (carril 3). Las muestras fueron
separadas por SDS-PAGE e inmunodetectadas con anti-dinamina-1. (barra= 1O¡.tm)
44
9.1.3. Determinar el destino de los receptores GABA 8 endocitados.
9.1.3.1. Los receptores GABA 8 son reciclados a la membrana plasmática a través de un
compartimento Rab11 positivo.
Con respecto a las posibles vías de destino de Jos receptores GABA 8 endocitados una de las
posibilidades es el reciclaje, es decir, el regreso del receptor endocitado a la membrana plasmática.
Experimentos de inmunoendocitosis fueron realizados en células transfectadas con las subunidades
GABA 8 1, GABA 8 2 y Rab 11 wt-EGFP, una proteína marcadora del los endosomas de reciclaje. Las
vesículas endocíticas positivas para GABA 8 presentaron un alto grado de colocalización con las
vesículas positivas para Rabll lo que sugirió que el receptor GABA 8 recicla a la membrana
plasmática (Fig. 14A). Para determinar si efectivamente estos receptores son reciclados se realizó
un tratamiento de stripping ácido posterior a la inmunoendocitosis y se permitió que los receptores,
protegidos de este tratamiento en vesículas endocíticas reciclaran a la membrana plasmática.
Después de 60 min de reciclaje se observó un robusto reciclaje de los receptores GABA 8 (Fig. 14BD).
45
Figura 14. Los receptores GABAB endocitados reciclan a la membrana plasmática después de
ser endocitados. A-D Las subu11idades GABA3 1 y GABA3 2 del receptor, etiquetadas con myc y
HA respectivamente, fueron coexpresadas en neuronas hipocampales 16 DIV. Solo en A también se
transfectó Rabll-GFP. La población de subunidades GABA 3 1 (heterodímero) ubicada en la
membrana plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo específico para el epítope
myc a l0°C. Después, fueron incubadas a 37°C por 60 minen ausencia de cualquier estimulo para
permitir la endocitosis del receptor (B, Rl Surface), los anticuerpos que permanecen unidos a los
receptores de membrana fueron removidos mediante striping acido (C, Rl Surface (Strip)). Se
permitió que los receptores reciclaran a la membrana plasmática a 37°C por 60 min(D, Recycled
RlSurface). Posteriormente, los receptores en la membrana plasmática fueron detectados incubando
con un anticuerpo secundario acoplado a FITC (verde) en solución sin detergente. Finalmente las
células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado utilizando un anticuerpo
secundario conjugado a TRITC (rojo). (barra=lOJlm)
46
9.2. Caracterizar los mecanismos de control de la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA 3 en condiciones de estimulación excitatoria.
9.2.1. Detuminar el efecto de glutamato sobre la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABA 3 •
9.2.1.1. Glutamato disminuye la disponibilidad en la membrana de los receptores GABA 8
mediante un proceso dependiente de endocitosis.
Tomando en cuenta la falta de endocitosis inducida por agonista de los receptores GABA 8 y
los antecedentes sobre la alta expresión de los receptores en la región perisináptica de las espinas
sinápticas glutamatérgicas se realizaron experimentos de disponibilidad en la membrana en
presencia de glutamato.
Estos experimentos mostraron una disminución significativa de los receptores GABA 8 en la
membrana dependiente de glutamato (Fig. 15A-D). Este efecto fue mediado por la activación del
receptor NMDA (Fig. 16) y fue bloqueada por el uso de un inhibidor de proteosoma MG132 (Fig.
17A-D).
MG 132 es una droga inespecífica en la inhibición de la degradación proteosomal de
proteínas. Esta droga inhibe la degradación mediada por proteosoma de algunos receptores, inhibe
la degradación por endonucleasas diferentes de las residentes en el proteosoma y además se
demostró recientemente que inhibe la endocitosis mediada por ubiquitina (Patrick et al., 2003;
Steinhilb et al., 200 I; van Kerkhof et al., 2001 ). Por esta razón, fue importante demostrar cuál es la
vía que esta droga esta inhibiendo para impedir la desaparición inducida por glutamato de los
receptores GABA 8 desde la membrana plasmática.
Para explorar el posible mecanismo de acción de MG132 sobre la endocitosis de GABA 8 se
llevaron a cabo ensayos de endocitosis basados en la unión específica a la subunidad GABA 8 1
modificada de a-bungarotoxina, mediante los cuales es fácilmente diferenciable entre un proceso de
bloqueo de endocitosis y un proceso de inhibición de la degradación.
Para esto, células HEK293 fueron transfectadas con la sub unidad GABA 8 1 modificada con
una secuencia de unión a bungarotoxina derivada del receptor nicotínico y con la subunidad
GABAs2. a-bungarotoxina presenta alta afinidad por la secuencia de unión a la misma y es incapaz
de atravesar la membrana plasmática. Las células fueron incubadas con a-bungarotoxina por 1 hr en
presencia o ausencia de MG 132. El proceso de endocitosis fue afectado en un paso temprano lo que
produjo una acumulación en la cercanía de la membrana plasmática a diferencia del control donde
47
fueron observadas estructuras similares a vesículas a través de toda la célula (Fig. 18A). Además,
neuronas hipocampales fueron sometidas a un experimento de inmunoendocitosis en presencia y
ausencia de MG 132. De la misma forma que ocurrió en células HEK, esta droga bloqueó la
desaparición de los receptores GABA 8 desde la membrana en pasos tempranos del proceso de
endocitosis (Fig. 18B). De la misma forma, mediante técnicas bioquímicas fue observado que
distintas concentraciones de MG 132 bloquearon la endocitosis constitutiva de los receptores
GABAB (Fig. 17E).
Estos resultados sugieren que la pérdida inducida por glutamato de los receptores GABA 8
desde la membrana podría estar mediada por un proceso endocítico. La endocitosis constitutiva de
los receptores GABA 8 marcados con bungarotoxina fue bloqueada porphenylarsine oxide (PAO)
en células HEK demostrando que la droga es efectiva en bloquear este fenómeno (Fig.
19A). Se realizó un experimento de marcaje de proteínas de superficie después de diferentes
tratamientos y la desaparición de la membrana del receptor GABA 8 inducida por glutamato fue
robustamente bloqueada por el inhibidor de la endocitosis PAO (Fig. 19B).
A partir de estos datos podemos concluir que glutamato induce la desaparición del receptor
GABA 8 desde la membrana plasmática a través de un proceso de endocitosis.
48
A
B
GABABR1
GABABR1
,[!~
es-
.S
vá'
#'
~
,:¡>
(;-.::;
::>
u
~~
ee
S~
·~ 8
Surface
~e
~
>
ji
~
Total
Control Glutamate
e
D
GABABR2
es-
.S
0<:-
v
GABABR2
,!!J
§:'l!i
,:¡>
l!1
"
:::>
&.::;
"
~"-'
ee
Surface
~~
~"
.
t!ll~
>
!!!
Total
"'
"'"
Control Glutamate
Figura 15. La disponibilidad en la membrana de los receptores GABAB es disminuida por
glutamato. A-D Neuronas corticales en cultivo primario 5 DIV fueron dejadas no tratados (control)
o expuestas a 20 ¡.tM glutamato por 30 ruin (Glutamate). Las neuronas fueron entonces marcadas
con lmg/ml de biotina. Los lisados fueron precipitados con esferas de sefarosa-neutravidina y las
respectivas muestras separadas por SDS-P AGE. Inmunodetección de las proteínas totales y
asociadas a superficie fueron realizadas con anticuerpos GABA 3 1 (A) y GABA 3 2 (C). Las
inmunodetecciones fueron analizados por densitometria, y los valores promedio más S.E. fueron
graficados para GABA 3 1 (B) y GABA 3 2 (D).
49
Total
o
3
Surface
10
o
3
10
NMDA (min}
R2
Figura 16. La disponibilidad en la membrana de los receptores GABAB es disminuida por
NMDA. Neuronas corticales de rata 5 div fueron expuestas a 20 ¡.tM NMDA por O, 3 y 1O min. Las
neuronas fueron entonces marcadas con lmg/ml de biotina. Las células fueron lisadas, y las
proteínas biotiniladas fueron precipitadas con esferas de sefarosa-neutravidina y las muestras
separadas por SDS-PAGE. Inmunodetección de las proteínas totales (Total) y asociadas a superficie
(Surface) fueron realizadas con anticuerpos GABA 8 2.
50
GABAeR1
+
+
+
MG132
Glutamata
R1 Surface
R1 Total
NS
o
E-
"'"'
E o
o~
:t::l
:!,!w
~~
"'J!!
> ·~t::
2l::l
e
"'
0::
+
+
+
MG132
Glutamate
R2 Surface
R2 Total
Ctrl
D
Glut
MG132
Glut
GABAaR2
o
·¡:
1i)";'
E o
.2~
!!!w
~é
"'J!!
~·¡:
·- :::1
2
20
200 MG132{¡¡M)
R1
lntemalized
2!::>
<!)
0::
Ctrl
Glut
Glut
MG132
Figura 17. La pérdida dependiente de glutamato de los receptores GABAB en la membrana
plasmática es bloqueada por MG132. A, Neuronas corticales de rata 5 div fueron no tratadas o
expuestas a 20 ¡..tM glutamato (Glutamate, +)en ausencia (MG 132, -)y presencia de 20¡..tM MG 132
(MG 132, +) por 30 min. Las neuronas fueron entonces marcadas con 1 mg/ml de biotina. Las
células fueron lisadas, y las proteínas biotiniladas fueron precipitadas con esferas de sefarosaneutravidina y las muestras separadas por SDS-PAGE. Immunodetección de proteínas totales y
asociadas a superficie fueron realizados con anticuerpos GABA3 l. B- immunodetecciones para
GABA3 l de superficie fueron analizados por densitometría, y los valores promedio más S.E. fueron
graficados para cada condición (control, Ctrl; glutamato, Glut). C y D, lo mismo que en A y B para
GABA 3 2. E, Neuronas corticales de rata 5 div fueron incubadas con 1 mg/ml de biotina y
regresadas al incubadora 37 oc en ausencia(-) o presencia(+) de 10, 20, o 200 ¡..tM MG 132 por 60
min. La biotina remanente después de los periodos de incubación fue removida por corte con
glutatión. Los lisados precipitados con esferas sefarosa-neutravidina, y las muestras separadas por
SDS-PAGE. Immunodetecciones de proteínas asociadas a superficie fueron realizados con
anticuerpos GABAsl. Proteínas totales fueron detectadas con anticuerpos GABA 3 1 o tubulina
(datos no mostrados).
51
B
e
Figura 18. MG132 previene la endodtosis del receptor GABAB en un paso temprano. ACélulas HEK293 expresando la subunidad GABA3 1 modificada con la secuencia de unión para
bungarotoxina y la subunidad GABA3 2 fueron incubadas con 10 ¡.tg/ml bungarotoxina-Alexa488
(verde) por 1 ha 37°C en ausencia (Control) o presencia de 20 ¡.tM MG132 (MG132). B-Neuronas
hipocampales 16 DIV expresando la subunidad GABA 3 1-myc y la subunidad GABA 3 2-HA fueron
incubadas con el anticuerpo a-myc 15min a l0°C y posteriormente se incubaron a 37°C por lhr en
ausencia (Control) o presencia de 20 ¡.tM MG132 (MG132). El receptor en la membrana plasmática
fue detectado con un anticuerpo secundario acoplado a TRITC (rojo). Posteriormente las células
fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado con un anticuerpo secundario
acoplado a FITC (verde). (barra=lO¡.tm)
52
A
B
Surface
R1
Total
Tubulin
Figura 19. La pérdida dependiente de glutamato de los receptores GABAB desde la membrana
plasmática es mediada por endocitosis. A-Células HEK293 expresando la subunidad GABA3 1
modificada con la secuencia de unión para bungarotoxina y la subunidad GABA3 2 fueron
incubadas con 10 ¡.tg/ml bungarotoxina-Alexa488 por 1 ha 37°C en ausencia (control) o presencia
de 20 ¡.tM PAO (PAO). (barra=IO¡.tm) B-Neuronas corticales de rata 5 DIV fueron dejadas no
tratadas (ctl) o expuestas a 20 ¡.tM glutamato (glut), 20 ¡.tM phenylarsine oxide (PAO) y w1a
combinación de ellos (glut P AO) por 30 min. Las neuronas fueron entonces marcadas con 1 mg/ml
de biotina. Los lisados fueron precipitados con esferas de sefarosa-neutravidina y las muestras
separadas por SDS-PAGE. Inmunodetección de las proteínas totales y asociadas a superficie fueron
realizadas con anticuerpos GABA 3 2.
53
9.2.2. Determinar si existen cambios en las rutas endocíticas de GABA 8 tras la estimulación
con glutamato.
9.2.2.1 Glutamato induce cambios en la distribución subcelular de los receptores GABAB
endocitados desde un compartimento rabll positivo a un compartimento rabll negativo.
Glutamato provoca la desaparición de los receptores GABA 8 desde la membrana plasmática
a través de un proceso endocítico. Por esto, el siguiente paso a seguir fue determinar si para
producir esta desaparición, glutamato desvía al receptor GABA8 de su vía endocítica constitutiva
que se caracteriza por un reciclaje eficiente desde endosomas rab 11 positivos.
Las neuronas fueron estimuladas con 20 ¡..tM de glutamato por 30 min lo que provocó un
notorio cambio en la distribución de los receptores endocitados. En condiciones no estimuladas
(Fig. 20A), estructuras como vesículas fueron observadas a través de todo el cuerpo celular en una
forma más o menos homogénea, mientras que al incubar con glutamato, las estructuras
intracelulares fueron reclutadas preferencialmente a una localización sub-membrana plasmática
(Fig. 20B).
Para identificar la naturaleza del compartimento al cual se desplazó el receptor GABA 8 , las
neuronas fueron transfectadas además de con las subunidades del receptor con la proteínas
recombinante rab11wt-GFP, la cual ha sido caracterizada como marcador de los endosomas de
reciclaje. Como ya se mostró en la Fig 14, los receptores endocitados en forma constitutiva fueron
encontrados asociados al compartimento de reciclaje (Fig. 21A). Los receptores endocitados en
presencia de glutamato cambiaron su localización hacia un compartimento negativo para rabll, un
compmiimento endocítico diferente de los endosomas de reciclaje (Fig. 21 B).
54
Figura 20. Glutamato induce cambios en la localización de los receptores GABAB endodtados.
A-B Las subunidades GABABl y GABAB2, etiquetadas con myc y HA respectivamente, fueron
coexpresadas en neuronas hipocampales 16 DIV. La población de subunidades GABABI
(heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo
específico para el epítope myc a 10°C. Después, fueron incubadas a 37°C por 60 minen ausencia
(A-control) o en presencia glutamato 20 ¡.tM (B-glutamato). Posteriormente, el receptor en la
membrana plasmática fue detectado incubando con
lill
anticuerpo secundario acoplado a TRITC
(rojo) en solución sin detergente. Finalmente las células fueron pem1eabilizadas y el receptor
internalizado fue detectado utilizando un anticuerpo secundario conjugado a FITC (verde).
(barra= 1O¡.tm)
55
A
8
Figura 21. Glutamato induce un cambio de localización del pool GABAB endocitado hacia un
compartimento rabll negativo. Las subunidades GABABI y GABAB2, etiquetadas con myc y
HA respectivamente, y la proteína de fusión rabll-GFP fueron coexpresadas en neuronas
hipocampales 16 DIV. La población de subunidades GABABl (heterodímero) ubicada en la
membrana plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo específico para el epítope
myc a 10°C. Después, fueron incubadas a 37°C por 60 minen ausencia (A-control) o en presencia
glutamato 20 11M (B-glutamato). Posteriormente, el receptor en la membrana plasmática fue
detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a Cy5 (azul) en solución sm
detergente. Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado
utilizando un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). (barra=l011m)
56
9.2.2.2. Glutamato induce cambios en la distribución subcelular de los receptores GABA 8
mediante un proceso degradativo, pero no es acumulado en endosomas tardíos.
Antecedente previos muestran que en un estado de alto input excitatorio, se observa
degradación de GABA 8 2 total en rebanadas de.hipocampo (Cimarosti et al., 2009). Por lo tanto, la
desaparición de membrana del receptor GABA 8 podría ser el resultado de un proceso degradativo
mediado por lisosoma, el cual sería dependiente de la endocitosis de los receptores. Para explorar
esta idea, se llevaron a cabo experimentos de inmunoendocitosis en presencia de glutamato y en
presencia o ausencia de una mezcla de inhibidores del tráfico hacia el lisosoma y la actividad
lisosomal (200nM Bafilomicina, 1OOflM leupeptina), la cual ha sido usada con éxito por otros
investigadores para inhibir esta ruta la degradación mediada por lisosoma (Moore et al., 1999).
Las neuronas transfectadas con las subunidades GABA 8 1 y GABA 8 2 fueron tratadas con
g1utamato e inhibidores lisosomales y se observó un patrón endocítico diferente al de las células que
solo fueron incubadas con glutamato. La localización cambió desde un patrón que fue
preferencialmente ubicado bajo la membrana plasmática hacia uno distribuido homogéneamente a
través del soma. También, fue observado un aumento claro en el receptor que permanece en la
membrana plasmática al bloquear la ruta de degradación lisosoma (Fig 22). Así, la ruta degradativa
estaría jugando un rol en el destino endocítica estimulada por glutamato que toman los receptores
GABA 8 al divergir desde la ruta que toman en condiciones no estimuladas.
Si los receptores que salen de la membrana plasmática por estimulación con glutamato hacia
compa1iimentos endocíticos son degradados, se observaría una acumulación de los receptores en
compartimentos de la ruta degradativa al estimular con glutamato. Para explorar esta posibilidad, se
llevaron a cabo experimentos de inmunoendocitosis en neuronas coexpresando las subunidades
GABA 8 l, GABA 8 2 y rab7wt-GFP, el cual ha sido caracterizado como un marcador de cuerpos
endosoma tardío, un compartimento endocítico que será fusionado con el lisosoma para la
degradación de su contenido.
Los receptores GABA 8
endocitados constitutivamente fueron localizados en forma
homogénea a través del cuerpo celular de la misma forma que los endosomas positivos para rab7,
pero claramente ambas poblaciones fueron encontradas separadas (Fig 23A). Los receptores
endocitados en presencia de glutamato fueron encontrados concentrados bajo la membrana
plasmática y estas estructuras no fueron positivas para rab7 de la misma forma que en las
condiciones control (Fig 23B). Por lo tanto el cambio de localización inducido por glutamato de los
receptores enditados no es hacia un compartimento rab7 positivo.
57
Estos datos nos sugieren que la desaparición de los receptores GABAB desde la membrana
está al menos en
pa~te
basada en un proceso degradativo dependiente de enzimas lisosomales, sin
embargo, los receptores no son acumulados en estructuras asociadas a la ruta degradativa lisosomal.
58
Figura 22. La vía degradativa inducida por glutamato de los receptores GABAB endocitados
es lisosomal. A-B Las subunidades GABAsl y GABAs2 del receptor, etiquetadas con myc y HA
respectivamente, fueron expresdas en neuronas hipocampales 16 DIV. La población de subunidades
GABAsl (heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas fue marcada con un
anticuerpo específico para el epítope myc a 10°C. Después, fueron incubadas con 20 )lM glutamato
a 37°C por 60 ruin en ausencia (A-control) o en presencia de 100 )lM leupeptina y 200 nM
bafilomicina (B-inh lisosoma). Posteriormente, el receptor en la membrana plasmática fue
detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a TRITC (rojo) en solución sin
detergente. Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado fue detectado
utilizando un anticuerpo secundario conjugado a FITC (verde). (barra=IO)lm)
59
A
B
Figura 23. La degradación de los receptores GABAB inducida por glutamato no produce su
acumulación en un compartimento rab7 positivo. A-B Las subunidades GABABl y GABA 3 2 del
receptor, etiquetadas con myc y HA respectivamente, y la proteína de fusión rab7-GFP fueron
coexpresadas en neuronas hipocampales 16 DIV. La población de subunidades GABABl
(heterodímero) ubicada en la membrana plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo
específico para el epítope myc a 10°C. Después, fueron incubadas a 37°C por 60 rnin en ausencia
(A-control) o en presencia glutamato 20 ¡..tM (B-glutamato). Posteriormente, el receptor en la
membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a Cy5 (azul)
en solución sin detergente. Finalmente las células fueron perrneabilizadas y el receptor intemalizado
fue detectado utilizando un anticuerpo secundario conjugado a TRITC (rojo). (barra= lO¡..tm)
60
9.2.3. Localizar las determinantes moleculares que controlan destino de los receptores GABAB
endocitados.
9.2.3. 1. El estado de fosforilación de serina 783 en la subunidad GABAB2 controla la
localización de los receptores GABAB endocitados.
A partir del estudio del las vías de señalización responsables de la desaparición de la
membrana de los receptores GA8A 8 , se determinó que la desfosforilación del residuo serina en
posición 783 es fundamental para este proceso (Terenuma, datos no publicados). Por lo tanto, la
mutación de este residuo podría producir alteraciones en el proceso endocítico de los receptores
GA8A 8 y/o en el proceso degradativo inducidos por glutamato. Para evaluar estas posibilidades se
llevaron a cabo experimentos de inmunoendocitosis usando la subunidad GA8A8 2 silvestre y la
subunidad GA8A 8 2 en la cual se reemplazo la serina 783 por alanina (GA8A 8 2 S783A) evaluando
los cambios del pool endocitado con respecto a rabll.
En condiciones no estimuladas, el patrón de localización de los receptores GA8A 8
endocitados fue cambiado totalmente al coexpresar la subunidad GA8A 8 1 con la subunidad
mutante GA8A 8 2 S783A (R2-783) (Fig. 248). Los receptores GA8A 8 endocitados silvestres
fueron localizados en endosomas rabll positivos (Fig. 24A) mientras que los receptores
endocitados conteniendo la subunidad GA8A 8 2 S783A fueron localizados en endosomas rabll
negativos (Fig. 248). Este comportamiento simula el cambio de localización inducido por
glutamato en la forma silvestre de los receptores GA8A 8 endocitados (Fig. 21B).
En presencia de glutamato, los receptores GA8A 8 endocitados silvestres presentaron un
patrón rabll negativo y una localización preferencialmente bajo la membrana (Fig. 25A) similares
a los observados previamente (Fig. 218). El patrón de los endosomas conteniendo el receptor
mutado es mantenido, pero se observa un ligero aumento en el tamaño de las estructuras tipo
vesículas rab 11 negativas (Fig. 258) si se compara con las observadas en la condición receptor
mutante no estimulada (Fig. 248).
Esto nos lleva a postular que la mutación de este residuo aminoacídico simula la
desfosforilación inducida por glutamato en el receptor generando un fenotipo como de degradación
de GABA 8 inducido por glutamato y exacerba el fenotipo al ser estimulado con glutamato. Esto
proporciona un punto de control central y directo sobre la vía degradativa del receptor GA8A 8
inducida por glutamato.
61
Figura 24. El cambio de localización del pool GABAB endodtado es simulado por la expresión
de la mutante GABAB2 S783A en condiciones no estimuladas. A-B Neuronas hipocampales 16
DIV fueron transfectadas para coexpresar la proteína de fusión rabll-GFP, la subunidad GABABlmyc y la subunidad GABAB2-flag wt (A-R2-wt) o la subunidad GABAB2-flag mutante S783A (BR2-783). La población de subunidades GABABI (heterodímero) ubicada en la membrana
plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo específico para el epítope myc a 1ooc.
Después, fueron incubadas a 37°C por 30 min. Posteriormente, el receptor en la membrana
plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo secundario acoplado a TRITC (rojo) en
solución sin detergente. Finalmente las células fueron permeabilizadas y el receptor intemalizado
fue detectado utilizando un anticuerpo secundario conjugado a FITC (verde). (barra=lO¡.tm)
62
Figura 25. El cambio de localización del pool GABAB endocitado simulado por la expresión de
la mutante GABAB2 S783A se ve aumentado en presencia de glutamato. A-B Neuronas
hipocampales 16 DIV fueron transfectadas para coexpresar la proteína de fusión rabll-GFP, la
subunidad GABABl-myc y la subunidad GABAB2-flag wt (A-R2-wt) o la subunidad GABAB2-flag
mutante S783A (B-R2-783). La población de subunidades GABABl (heterodímero) ubicada en la
membrana plasmática de células vivas fue marcada con un anticuerpo específico para el epítope
myc a l0°C. Después, fueron incubadas con 20 11M glutamato a 37°C por 30 min. Posteriormente,
el receptor en la membrana plasmática fue detectado incubando con un anticuerpo secundario
acoplado a TRITC (rojo) en solución sin detergente. Finalmente las células fueron permeabilizadas
y el receptor internalizado fue detectado utilizando un anticuerpo secundario conjugado a FITC
(verde). (barra=lü)lm)
63
9.2.4. Dete¡·minar el efecto de neurotrasmisores sobre la disponibilidad en la membrana de los
receptores GABAs
9.2.4.1. Determinar si la degradación inducida por glutamato de los receptores GABA 8 es
bloqueada por baclofen.
Existe evidencia de que baclofen, agonista específico de los receptores GABA 8 , aumenta la
tasa de reciclaje de estos receptores en neuronas corticales (Grampp et al., 2008) y que además,
inhibe la degradación de estos receptores inducida por hipoxia, proceso directamente relacionado
con un aumento en la transmisión excitatoria (Cimarosti et al., 2009). Por esta razón se llevaron a
cabo experimentos de estimulación con baclofen, glutamato o una combinación de ambas y
posterior marcaje de proteínas de membrana.
Fue mostrado que la incubación con baclofen no produjo cambios en la disponibilidad de los
receptores GABA 8 en condiciones basales (Fig 26, control v/s baclofen). Al exponer las neuronas a
glutamato, la abundancia en la membrana de los receptores fue disminuida (Fig 26, control v/s
glutamato ). Mientras que al ser simultáneamente estimuladas con glutamato y baclofen, el proceso
degradativo inducido por glutamato de los receptores GABAB fue bloqueado (Fig 26 glutamato v/s
glutamato+baclofen), manteniendo estable la cantidad de receptor en la membrana (Fig 26 control
v/s glutamato+baclofen).
El mecanismo por el cual baclofen produce este efecto no puede deducirse con esta
aproximación experimental. Probablemente, baclofen produce un aumenta en la velocidad de
inserción de los receptores GABA 8 desde los endosomas de reciclaje, lo que impediría el paso de
estos receptores hacia la ruta degradativa. Así, baclofen impediría la degradación inducida por
glutamato ele los receptores GABA 8 .
64
B
o
A
(j
o
(j
(-)
"'
lll
"'
+
lll
:;
(;
:;
5
Surface
Total
Ctl
Sacio
Glut
GM
Sacio
Figura 26. La degradación de los receptores GABAB inducida por glutamato es bloqueada por
la presencia de badofen. A-B Neuronas corticales de rata 5 DIV fueron no tratadas (Ctl),
expuestas a lOO ¡..tM baclofen (Bado) o 20 ¡..tM glutamato (Glut), y una combinación de ellos (Glut
Baclo) por 30 min. Las neuronas fueron entonces marcadas con 1 mg/ml de biotina. Los lisados
fueron precipitados con esferas de sefarosa-neutravidina y las muestras separadas por SDS-PAGE.
Inmunodetección de las proteínas totales y asociadas a superficie fueron realizadas con anticuerpos
GABAB2.
65
10. DISCUSIÓN
10. 1. Endocitosis independiente de agonista de los receptor·es GABAu en neuronas.
Varios estudios controversiales han abordado la endocitosis del receptor GABA 8 . En líneas
celulares se ha demostrado que los receptores GABA 8 no sufren endocitosis independiente de
agonista (Mutneja et al., 2005; Perroy et al., 2003) y otros han mostrado endocitosis inducida por
agonista (Gonzalez-Maeso et al., 2003). En neuronas, también existe la misma controversia sobre la
existencia de endocitosis constitutiva (Fairfax et al., 2004; Perro y et al., 2003) o inducida por
agonista (Lafft·ay et al., 2007). La discrepancia entre estos resultados puede tener su origen en los
diferentes sistemas utilizados. Si bien los estudios de Perroy se centraron en las neuronas de
cerebelo y los de Fairfax en neuronas de corteza e hipocampo, en el trabajo de Laffray se utilizó un
modelo de ca-cultivo de ganglio de la raíz dorsal y médula espinal.
Los resultados de esta tesis apoyan firmemente que la internalización del receptor GABA 8 es
independiente de su agonista en neuronas, teniendo en cuenta su contexto fisiológico (neuronas
corticales e hipocampales), y una metodología de cuantificación adecuada (biotinilación). Esta es
una característica inusual para un receptor acoplado a proteína G. Por lo general, los GPCRs en su
proceso de desensibilización desaparecen de la membrana plasmática, lo cual les permite terminar
la respuesta celular mediada por el agonista. Aunque Jos receptores GABA 8 muestran una
composición molecular única en todo el sistema nervioso, estas diferencias no son suficientes para
explicar las discrepancias con los estudios de otros autores. Se ha sugerido que proteínas asociadas
al receptor GABA 8 (CHOP, NSF, MUPPl, 14-3-3, COPI, CREB2/ATF4, Marlin-1) pueden cumplir
un rol en diversos estadías de las rutas de tráfico, pero las consecuencias funcionales de las
interacciones han sido poco exploradas (Brock et al., 2005; Couve et al., 2001; Couve et al., 2004;
Milligan and White, 2001; Nehring et al., 2000; Pontier et al., 2006; Sauter et al., 2005; White et al.,
2000).
Además, los resultados obtenidos con la utilización de saclofen, un antagonista del receptor
GABA 8 indican que la activación de los receptores GABA 8 no tiene efecto sobre la endocitosis
constitutiva corroborando así que la internalización no es el resultado de la activación de los
receptores por trazas de GABA liberados en el medio por las neuronas.
Estos resultados fueron confirmados por las observaciones realizadas con posterioridad por
otro grupo en células HEK293 (Grampp et al., 2007) y en neuronas corticales (Grampp et al., 2008).
66
Si la abundancia del receptor GABA 8 no es controlada por su agonista, debería existir otra
forma de control de la cantidad de receptor, la cual podría involucrar otros neurotransmisores
presentes en el sistema nervioso central.
10.2. Endocitosis del receptor GABA 8 es dependiente de clatrina y dinamina-1 en
neuronas.
Hemos encontrado que la endocitosis constitutiva de los receptores GABA 8 fue dependiente
de clatrina en neuronas. La endocitosis dependiente de clatrina es una ruta clásica de la endocitosis
de GPCRs y en esta vía AP2 es el adaptador que interactúa por un lado con el receptor y por otro
con la maquinaria responsable de la internalización. En nuestro grupo no detectamos una
interacción entre las subunidades del receptor con las subunidades mayores de este adaptador (a y
~-adaptina).
Al contrario Grampp y colaboradores (Grampp et al 2008) demostraron esta
interacción, por lo cual todavía existe un punto de controversia con respecto al posible adaptador de
clatrina en la endocitosis constitutiva de los receptores GABA 8 .
La participación de dinamina-1 sobre este fenómeno en líneas celulares y neuronas amplía
previos descubrimientos sobre la participación genérica de las dinaminas en la endocitosis de los
receptores
GABA 8
en
líneas celulares (Grampp et al.,
2007).
Aunque dinamina-1
es
preferentemente pre-sináptica, se ha encontrado en los sitios pre- y post-sinápticos (Gray et al.,
2003 ). Nuestros estudios no descubren una función preferente del dinamina-1 sobre los receptores
GABA 8 pre- o post-sináptica y se necesitan más experimentos para abordar esta tema, la cual puede
tener imp01iantes implicaciones fisiológicas si tomamos en cuenta que la ausencia constitutiva de
GABA 8 1a (pre-sináptico) pero no la de GABA8 1b (post-sináptico) resulta en el deterioro de la
plasticidad sináptica y de la memoria dependiente de hipocampo (Vígot et al., 2006).
10.3. Reciclaje
Hemos demostrado el reciclaje de los receptores GABA 8 hacía la membrana plasmática
después de su acumulación en endosomas Rabll positivos. Previamente el reciclaje en las neuronas
ha sido indirectamente examinado usando bloqueadores farmacológicos del reciclaje (Laffray et al.,
2007). Como los autores indican, monensina inhibe el reciclado de proteínas internalizadas a la
membrana plasmática. Sin embargo, monensina es un ionóforo selectivo de iones que neutralizan la
acidificación de los compmiimentos y pueden tener efectos notorios en el aparato de Golgi,
67
endosomas y lisosomas (Mollenhauer et al., 1990). Para evitar estos efectos nosotros demostramos
la reinserción de los receptores GABA8 directamente en la membrana plasmática de neuronas
hipocampales. Nuestros datos no están de acuerdo con datos obtenidos en células HEK-293
(Grampp et al., 2007) pero si con aquellos obtenidos en neuronas corticales por el mismo grupo
(Grampp et al., 2008). En la actualidad no podemos explicar esta discrepancia, pero el recambio de
receptores GABA 8 probablemente contenga pasos y checkpoints adicionales en neuronas los cuales
no han sido contemplados en nuestro análisis (Restituito et al., 2005).
10.4. Endocitosis en dendritas y axones.
El receptor GABA 8 es heteromérico y está compuesto por la subunidad GABA 8 1 y la
subunidad GABA 8 2 las cuales conforman el receptor funcional en la membrana plasmática
neuronal (Jones et al., 1998; Kaupmann et al., 1998; Kuner et al., 1999; Margeta-Mitrovic et al.,
2000; White et al., 1998). En esta tesis, se ha demostrado que el receptor es intemalizado en el soma
y las dendritas de neuronas de hipocampo. La endocitosis de un heterómero ensamblado
representaría un mecanismo eficiente para reinsertar a los receptores en la membrana plasmática. Se
observó que las 2 subunidades del receptor GABA 8 se encuentran colocalizando en los endosomas
de reciclaje, y se necesitan experimentos adicionales para determinar si además continúan en su
forma ensamblada. En la ruta de síntesis, los receptores se encuentran segregados y posiblemente se
ensamblan en la cercanía del sitio de inserción (Ramirez et al., 2009). La co-endocitosis se ha
demostrado para otros tipos de receptores diméricos, donde se define el tráfico y señalización de
rutas alternativas (Lenferink et al., 1998). Entonces, existe la posibilidad de que el pool de reciclaje
represente un sustrato de uso inmediato ante la necesidad de aumentar el input inhibitorio a través
de su inserción en la membrana plasmática.
Se detectó muy baja internalización de los receptores GABA 8 en los axones, a pesar del
hecho de que los receptores se expresan en forma abundante en la membrana plasmática axonal. La
existencia de endocitosis de GPCR en el axón se ha establecido previamente, un ejemplo es el
receptor mGluR5, el cual es eficientemente endocitado en el axón de neuronas de hipocampo
cultivadas (Fourgeaud et al., 2003). Lo que sugeriere que el shafi axonal podría ser incompetente
para la endocitosis con respecto al receptor GABA 8 o que la tasa de receptores internalizados podría
ser significativamente menor en comparación con las dendritas. Por lo tanto, la internalización en
las terminales del axón es un blanco para futuras investigaciones. También sería interesante
68
determinar sí existen diferentes mecanismos o tasas de la internalización para las subunidades
GABA 8 1a y GABA 8 1b en los axones y dendritas.
10.5. Regulación de la disponibilidad en la superficie de Jos receptores GABAn por glutamato.
En esta tesis se ha demostrado que la aplicación de glutamato reduce significativamente los
niveles del receptor GABA 8 en la membrana plasmática de neuronas. Este hallazgo tiene
implicaciones fisiológicas directas debido a que los receptores GABA 8 se localizan en los
terminales pre- y post-sinápticos de las sinapsis glutamatérgicas en varias regiones del cerebro
como el hipocampo (Kulik et al., 2003). En estas sinapsis, las fluctuaciones de la concentración de
GABA pueden ser relativamente lentas y pequeñas en comparación con las rápidos y concentrados
bursts de la liberación de glutamato. Por lo tanto, es concebible que la regulación aguda de la
disponibilidad en la superficie celular del receptor GABA 8 sea controlado por el neurotransmisor
que presenta una mayor variabilidad en la sinapsis. Funcionalmente, la supresión del receptor
GABA 8 después de la exposición a glutamato puede actuar para facilitar la transmisión sináptica en
los terminales glutamatérgicos por la reducción del efecto de hiperpolarización postsináptica
producido por el receptor GABA 8 y/o por la reducción de la inhibición de la liberación de
neurotransmisores en los sitios presinápticos.
Datos obtenidos por nuestros colaboradores, Dr Moss et al., mostraron que la desaparición
tanto de la subunidad GABA 8 1 como GABA 8 2 se observa claramente a los 30 min de estimulación
con glutamato al realizar una curva de tiempo de disponibilidad de proteínas de membrana mediante
biotinilización. Ademas, ellos demostraron que un ionoforo de calcio (2 ¡..tM A23187) produce el
mismo efecto, por lo cual se puede descartar un efecto directo de glutamato sobre el receptor
GABA 8 y sugerir la existencia de un mecanismo mediado por calcio. La desaparición de GABA 8
desde la membrana plasmática fue paralela a una disminución en su estado de fosforilación del
residuo serina 783 de la subunidad GABA 8 2. La disminución en el estado de fosforilación de
GABA 8 2 no solo fue producida por una estimulación por 30 min con glutamato sino también por el
uso de 20 ¡..tM NMDA ó 2 ¡..tM A23187. Este efecto fue bloqueado por el uso del inhibidor de AP5
pero no por el uso de BNQX. Sugiriendo que el efecto de glutamato sobre el estado de fosforilación
del serina 783 de la subunidad GABA 8 2 es mediado por la entrada de calcio dependiente de los
receptores NMDA. Además, demostraron a través de experimentos de biotinilización de proteínas
de membrana que la activación de AMPK y PP2A-B es necesaria y suficiente para la desaparición
69
del receptor GABA 8 desde la membrana de neuronas. Esto sugiere que los cambios en el estado de
fosforilación de serina 783 en la subunidad GABA 8 2 son inducidos por glutamato a través de una
ruta de signaling activada por este (datos no publicados).
La inhibición de la desaparición inducida por glutamato del receptor GABA 8 de membrana
causada por MG 132 plantea la posibilidad de que la endocitosis del receptor de GABA 8 este
mediada por ubiquitina. Esta interpretación de los resultados se apoya en el hecho de que MG132
agota ubiquitina libre evitando así la endocitosis de proteínas ubiquitinadas (Melikova et al., 2006;
Patrick et al., 2003). No hemos podido detectar una acumulación del receptor GABA 8 intracelular
después del tratamiento con glutamato, incluso en presencia de inhibidores de las rutas lisosomal o
proteasomal, sin embargo la desaparición mediada por glutamato del receptor GABA 8 desde la
superficie celular fue inhibida por el inhibidor proteasomal MG 132. Efectivamente MG 132 inhibió
el trafico endocítico en un paso temprano. Y la dependencia de endocitosis de la desaparición de
GABA 8 inducida por glutamato fue comprobada al usar el inhibidor de la endocitosis phenylarsine
oxide (PAO).
Por lo tanto, los receptores GABA 8 son endocitados basalmente y glutamato provoca una
aceleración del proceso de endocitosis, al no observar una acumulación del pool endocítico luego de
la endocitosis inducido por glutamato, estos receptores serían rápidamente dirigidos a una ruta
degradativa.
10.6. Mecanismos que controlan el reciclaje y la degradación de los receptores GABAB.
La maquinaria molecular responsable de la generación del sorting post-endocítico del
receptor de GASA 8 ya sea a la degradación o al reciclaje, en otras palabras, el switch en sí,
permanece inexplorado. Sin embargo, varios resultados descritos en la presente tesis contribuyen de
manera significativa a aclarar algunas de sus características. En primer lugar, los receptores GABA 8
endocitados son preferencialmente ubicado en endosomas de reciclaje en condiciones basales,
sugiriendo un alto grado de reposición de los receptores endocitados hacia la membrana plasmática.
Esta observación está de acuerdo con la gran estabilidad en la membrana del receptor GASAs que
ha sido mostrada con anterioridad (Fairfax et al., 2004)
Nuestras observaciones indican que, después de endocitosis, los receptores GABA 8 se
dirigen predominantemente a los lisosomas tras la estimulación con glutamato. Los receptores
GABA 8 endocitados en presencia de glutamato cambian su localización desde un compartimento
rab ll positivo hacia uno negativo para este marcador, indicándonos que este receptor ya no está en
70
la vía de reciclaje que mantiene la disponibilidad de receptores GABAB en la membrana plasmática
estable. La idea de que estos receptores cambian hacia una ruta degradativa fue confirmada por el
descubrimiento de que un bloqueo de las proteasas lisosomales por leupeptina y bafilomicina en
presencia de glutamato resulto en un incremento en la acumulación de receptores intracelulares y de
membrana comparado con la estimulación con glutamato.
La ruta degradativa que induce glutamato es en extremo rápida debido a que no se observa
una acumulación en los endosomas tardío. No hay un cambio con respecto a la localización en
endosomas tardíos con respecto a la que se observa en condiciones basales. En conjunto estas
conclusiones son apoyadas por datos de inmunohistoquímica observados en núcleo supraóptíco, los
cuales indican la presencia de una muy baja proporción de receptores GABAB en lisosomas en
condiciones basales (Richards et al., 2005).
Aunque la ruta de reciclaje sea mayoritaria, la degradación existe en condiciones basales
como ha sido mostrado por otros autores en líneas celulares (Kantamneni et al., 2009), donde la
degradación ele los receptores es mediada por la proteína TSG 1O1(tumour susceptíbility gene 101),
un miembro de la maquinaria ele sortíng lisosomal ESCRT (endosomal sorting complex required
for transport). Baclofen provoca un aumento en la degradación después ele la estimulación
prolongada (60 horas), y la inhibición de las proteasas lisosomales con leupeptina resulta en la
acumulación ele los receptores internalizaclos. Es importante destacar que el bloqueo del reciclaje
con monensina produce un aumento en la degradación lisosomal, lo que simula el efecto que tiene
glutamato (Grampp et al., 2008). Sin embargo, la presencia ele los receptores GABAB en los
lisosomas ha sido difícil ele demostrar. Un motivo ele cli-leucina en el dominio C-terminal del
receptor GABABJ puede actuar como una señal ele la degradación lisosomal debido a que su
eliminación resulta en la acumulación del receptor GABABI en la membrana plasmática. Esta idea
es coherente con la evidencia de que los motivos de cli-leucinajugar múltiples papeles como sefíales
ele exocitosis, endocitosis, reciclaje o destinación lisosomal ele GPCRs, pero no ha sido demostrado
directamente.
10.7. El balance dinámico entre la degradación y el reciclaje controla la abundancia de los
receptores GABA 8 a través de un switch de fosforilación.
En esta tesis se han descubierto una serie ele mecanismos moleculares que convergen para
alterar el equilibrio dinámico entre la enclocitosis, el reciclado y la degradación del receptor de
GABAB. Estas observaciones son consistentes con un modelo integrado ele tráfico intracelular, que
71
tiene en cuenta el efecto la activación de los receptores de glutamato y GABA en el control de la
disponibilidad de receptores GABA 8 en las neuronas. En pocas palabras, el receptor GABA 8 es
internalizado en forma constitutiva y la activación del receptor no tiene ningún efecto sobre los
niveles de estado estacionario de los receptores en la membrana plasmática. Sin embargo, los
agonistas aceleran la endocitosis y el reciclaje desde los compartimentos intracelulares (Grampp et
al., 2008). Así, el efecto de los agonistas sobre la endocitosis de los receptores GABA 8 está
enmascarado por un rápido y simultáneo aumento en la reinserción de los receptores, manteniendo
los receptores en la superficie celular en niveles constantes. La activación de los receptores de
glutamato aumenta el Ca2+ intracelular activando AMPK y PP2A-B (Terunuma, datos no
publicados). Cambios en el estado de fosforilación de la S783 en el receptor GABA 8 2 activan un
desvío del pool de receptores GABA8 endocitado desde una ruta de reciclaje hacia una vía de
degradación. La activación del receptor GABA 8 supera el efecto de glutamato, probablemente por
la prevención de la despolarización persistente, favoreciendo la ruta de reciclaje por sobre la
degradación. Este modelo ha sido llamado el modelo de switch glutamatérgico (Fig 27). En general,
este modelo es similar al control de la disponibilidad de los receptores AMPA por de la activación
de diferentes receptores de glutamato (Ehlers, 2000).
La postulación de un desvió de la ruta desde el reciclaje hacia una ruta degradativa es
apoyada por la observación de que al bloquear el reciclaje de los receptores con monensina resulta
en una dramática pérdida de los receptores endocitados en condiciones no estimuladas y que esta
pérdida es prevenida al inhibir la degradación lisosomal (Grampp et al., 2008).
10.8. Glutamato, sobreexcitación y daño neuronal.
El stroke o isquemia cerebral es la principal causa de muerte y discapacidad severa
prolongada sobre el tiempo. Esto se debe a la excesiva excitación neuronal y la consecuente muerte
celular. La pm1icipación de los receptores de glutamato en la mue11e celular inducida por la
isquemia ha sido estudiada profundamente. La contribución de los receptores inhibitorios no ha sido
establecida aún. Sin embargo, baclofen es neuroprotector in vivo y en rodajas de hipocampo
organotípicas durante la deprivación de glucosa y oxigeno (OGD) y agonistas de GABAA and
GABA 8 pueden proteger a neuronas de la muerte celular inducida por isquemia/perfusión in vivo a
través de un mecanismo que involucra la inhibición de la producción inducida por NMDA de oxido
nítrico a través de la oxido nítrico sintasa neuronal (Cimarosti et al., 2009).
72
Endosoma
lisosoma
ER
Figura 27. Modelo de tráfico intracelular del receptor GABAB en diferentes condiciones
de estimulación. La activación del receptor GABA3 por baclofen produce un aumento en la tasa de
endocitosis y a la vez de reciclaje, lo que mantendría la tasa de receptores en la membrana
plasmática constante. Glutamato, a través de un signaling mediado por receptores de glutamato tipo
NMDA produce un aumento en la endocitosis y no asi en el reciclaje mediante una disminución en
el estado de fosforilación del receptor GABA3 , lo que provocaría un desvío desde una vía
netamente de reciclaje a la membrana plasmática hacia una vía degradativa dependente a el
lisosoma.
73
Estudios elegantes de microscopía electrónica han demostrado que el receptor GABA 8 se
encuentra en la periferia de las sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas, tanto en la corteza visual,
el cerebelo, el tálamo y el hipocampo. Más importante aún, reconstrucciones cuantitativas en 3D de
imágenes de alta resolución han demostrado que los receptores GABA 8 son fundamentalmente
enriquecidos en las proximidades de las sinapsís glutamatérgicas en las espinas dendríticas en las
células de Purkinje del cerebelo y las neuronas piramidales del hipocampo (Kulík et al., 2003 ).
Estas observaciones proporcionan una evidencia robusta de la regulación de la transmisión
glutamatérgica por el receptor GABA 8 y están de acuerdo con su papel en la inducción del LTP en
el hipocampo. El control de receptor GABA 8 por glutamato ha sido descubierta recientemente. En
primer lugar, el glutamato produce una rápida desaparición de los receptores receptor GABA 8 1 y
GABA 8 2 de la membrana plasmática en neuronas en cultivo primario, lo cual ha sido descrito en
esta tesis. En segundo lugar, la activación del receptor NMDA produce una disminución
pronunciada en los niveles totales del receptor GABA 8 2 en rodajas organotípicas de hipocampo de
rata (Cimarosti et al., 2009). Así, la reducción en la abundancia de receptores GABA 8 se ha
asociado a la activación excitotóxica del receptor NMDA sugiriendo que la sobreexcitación puede
incluir la eliminación del componente inhibitorio. Es impoiiante destacar, en este contexto, la
activación del receptor GABA 8 ha sido considerado neuroprotectora. Por último, la activación de
los receptores de kainato produce una disminución en los niveles del receptor GABA 8 , después de
24 horas en ratones adultos, posiblemente contribuyendo a la epilepsia del lóbulo temporal.
Los elatos presentados en esta tesis junto con los antecedentes desde otros trabajos ofrecen
evidencia contundente que demuestra que la activación del receptor de glutamato en forma
persistente elimina el componente inhibitorio mediado por GABA 8 , favoreciendo la sobreexcitación
neuronal y, posiblemente, el daño excitotóxico. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una
explicación molecular integrada para el efecto neuroprotector ele la actividad del receptor GABA, y
la muerte celular inducida por NMDA (Cimarosti et al., 2009).
74
11. CONCLUSIONES
Tomando en cuenta los resultados de este trabajo de tesis, podemos concluir lo siguiente:
1- Los receptores GABA 8 son endocitados en forma constitutiva a través de una ruta dependiente de
clatrina y dinamina-1.
2- Los receptores GABA 8 son reciclados a la membrana plasmática.
3- Glutamato induce la degradación de los receptores GABA 8 a través de un proceso dependiente
de endocitosis.
4- El estado de fosforilación de Ser783 de la subunidad GABA8 2 controla el destino endocítico de
los receptores GABA 8 en condición basal o estimulada por glutamato.
5- Existe un mecanismo de control de la disponibilidad en la membrana plasmática modulado por el
equilibrio entre sistema inhibitorio y excitatorio.
75
12. PROYECCIONES
Los receptores GABA 8 juegan un rol crítico en la inhibición prolongada de la transmisión
sináptica en el sistema nervioso central (Bowery, 1993; Mott and Lewis, 1994 ). La regulación de la
función del receptor GABA 8 ha sido implicada en el aumento de la percepción y en la inducción de
la potenciación a largo plazo (Davies et al., 1991; Olpe et al., 1993 ). Además, la participación de los
receptores GABA 8 en un número de anomalías del sistema nervioso central tales como la epilepsia,
ansiedad, depresión, hiperalgesia y deficiencia en la percepción los hacen un atractivo blanco para
agéntes terapéuticos (Bittiger et al., 1993; Kerr and Ong, 1995; Dichter, 1997).
La existencia de un mecanismo de control de la disponibilidad de los receptores GABA 8 en
la membrana plasmática por un agonista excitatorio genera una variedad de posibles escenarios en
respuesta al agonista GABAérgico. Esto, debido a que la disponibilidad en la membrana plasmática
de este receptor condicionará distintas respuestas intracelulares. Dos escenarios aparecen como
posibles candidatos de importancia terapéutica. El primero, es la muerte celular excitotóxica
inducida por isquemia, donde la activación masiva de receptores glutamatérgicos podría inducir la
degradación del receptor GABA 8 de membrana disminuyendo así el componente inhibitorio,
autopotenciando su efecto excitatorio, y como resultado produciendo muerte masiva de neuronas.
Baclofen podría contrarrestar este efecto por desviar el destino del pool de receptores GABA 8 desde
la degradación al reciclaje, manteniendo así el componente inhibitorio intacto y posiblemente
protegiendo a las neuronas de la excitotoxicidad.
El segundo es el dolor neuropático, donde ante estimulo no doloroso se produce un aumento
en la liberación de neurotransmisor desde las aferente nociceptivas de primer orden aumentando así
la activación de los receptores excitatorios. Aumentando la transmisión sináptica de las neuronas
espinales de segundo orden hacia los núcleos cerebrales, produciendo la sensación equivoca de
dolor. La activación de receptores glutamatérgicos en la neurona de segundo orden podría estar
produciendo una disminución en la disponibilidad de los receptores GABA 8 en la membrana y al
disminuir la componente inhibitoria contribuir a la sobreestimulación de esta vía del dolor. El
mecanismo de acción de la inhibición del dolor mediada por baclofen podría deberse no solo a su
efecto sobre la activación de Jos receptores y su posterior sígnalíng inhibitorio sino también al
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glutamato regula el destino endocitíco de los receptores