“ESTUDIO PROTEÓMICO DEL ENDOMETRIO HUMANO”

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Bioquímica clínico-médica e inmunología.
TESIS DOCTORAL
“ESTUDIO PROTEÓMICO
DEL ENDOMETRIO HUMANO”
Autora:
Tamara Garrido Gómez
Licenciada en Biología
Directores:
Prof. Carlos Antonio Simón Vallés
Dr. Francisco Domínguez Hernández
Valencia 2012
Prof. Carlos Antonio Simón Vallés, Catedrático de Pediatría,
Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Valencia y Director
Científico del Instituto Valenciano de Infertilidad (IVI).
CERTIFICA:
Que
el
trabajo
de
investigación
titulado:
“ESTUDIO
PROTEÓMICO DEL ENDOMETRIO HUMANO” ha sido realizado
íntegramente por Dña. Tamara Garrido Gómez bajo mi dirección. Dicha
memoria está concluida y reúne todos los requisitos para su
presentación y defensa como TESIS DOCTORAL ante un tribunal.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo la presente
certificación en Valencia a 29 de Febrero de 2012.
Fdo. Prof. Carlos Antonio Simón Valles
Dr. Francisco Domínguez Hernández, Doctor en Biología e
Investigador de la Fundación IVI.
CERTIFICA:
Que
el
trabajo
de
investigación
titulado:
“ESTUDIO
PROTEÓMICO DEL ENDOMETRIO HUMANO” ha sido realizado
íntegramente por Dña. Tamara Garrido Gómez bajo mi dirección. Dicha
memoria está concluida y reúne todos los requisitos para su
presentación y defensa como TESIS DOCTORAL ante un tribunal.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo la presente
certificación en Valencia a 29 de Febrero de 2012.
Fdo. Dr. Francisco Domínguez Hernández
AGRADECIMIENTOS
En estas primeras líneas quiero intentar transmitir mi enorme
agradecimiento (aunque sé que no van a ser suficiente para reflejar todo lo que
me gustaría decir) a todas a aquellas personas que me rodean en los diferentes
ámbitos de mi vida y que estando a mi lado de una manera u otra han
contribuido a que salga adelante esta tesis.
En primer lugar mi director de tesis, el doctor Carlos Simón. Mi guía y
punto de referencia, del que he aprendido y aprendo muchísimo día a día.
Gracias por apoyarme, por la confianza que has depositado en mí desde el inicio
y por dejar un espacio para que me desarrolle como investigadora.
A mi codirector Paco, sin tí esta aventura no hubiera sido lo mismo, una
gran parte del mérito de esta tesis te la debo a tí. Eres mi gran compañero,
amigo y una gran persona, de la que he aprendido muchísimo y no solo a nivel
científico. Gracias por enseñarme a andar por estos mundos y sobre todo por
seguir andando a mi lado día tras día.
A los doctores Pellicer y Remohí por permitir la realización de la tesis
en los laboratorios de la Fundación IVI.
Gracias a aquellos miembros del IVI que han ayudado en la ejecución de
este trabajo proporcionando muestras o apoyo técnico. A los proteómicos Juan
Antonio y Emilio, que desde el CNIC me ha permitido formar en el mundo de las
“ómicas”. A Ana Conesa, por el toque bioinformático que permitió dar sentido a
todos nuestros datos.
A todos mis compis del labo, Paco, Ali, Sebas, Claudia, Horten, Aymara,
Isa, Leslie, Irene, Amparo, Carmen, Mercedes, Juanma, Felip, y a los recién
incorporados Jose Vicente y Ana. Mi segunda familia, que adoro y han hecho
que la realización de esta tesis sea algo fantástico. Gracias por vuestro cariño,
ayuda, apoyo en el día a día, y sobre todo por vuestras risas y todo lo que hemos
disfrutado juntos. Especialmente a mis chicas whatsapperas, gracias por
vuestra espontaneidad, por quererme tanto y hacerme sentir tan feliz a vuestro
lado.
Gracias a los que han estado con nosotros dejando una enorme huella y
a los que deseo todo lo mejor, Carlos Estella, Isabel Galarza, Laura, Federica,
Oscar, Paquillo, Josón, y especialmente mi gran amiga Patri, llenas mi vida con
tu espiritualidad y amor. Gracias por todos los momentos, por tus sabios
consejos y sobre todo por coexistir a mi lado.
A todos los miembros del grupo de investigación de Carlos Simón del
CIPF con los que hemos compartido buenos momentos y a los que deseo mucha
suerte. Gracias a: Diana, Maria Eugenia, Cristóbal, Amparo Galán, Anabel, Eva
Gómez, Eva Sánchez, Sonia, Marcia, y Vero.
Desde otros departamentos pero tan cercanos a nuestro labo gracias a
nuestro querido Jaime, a Marcos, Leo, Carmen, Mari carmen, Raquel y Loreto.
Nuestros Igenómicos David y nuestra alegre María. Y a nuestros vecinos
durante gran parte de esta tesis, y ahora aunque viven en el otro edificio pronto
volveremos a estar juntitos, Ana, Julio, Pere, Jose Antonio, Vicente, Mila, Mariaje,
y desde la distancia, nuestra turca Aylin. Y a nuestros recientes vecinos, amigos
y compañeros del FISH con el que espero compartir muy buenos momentos.
Un hueco gigante es para mi gran amiga, compañera y confidente, Alicia.
Sin ti nada hubiera sido posible, trabajar codo con codo es lo mejor que me ha
podido pasar, te debo esta tesis y muchísimo más. Gracias por guiarme y
apoyarme tanto en los buenos como en los malos momentos de mi vida. Solo
por haber cruzado mi camino con el tuyo, vale la pena todo esto.
A mi cari por siempre, Claudia. Eres increíble, y conocerte ha sido sin
duda lo mejor de mi etapa universitaria y nada podía hacerme más feliz que
hacer esta tesis a tu lado. Gracias por tu amistad incondicional, por tu apoyo,
por tu cariño, por quererme tanto y seguir a mi lado siempre.
A mis caris de la Uni, un pequeño gran grupo. Marta, Jessica y Claudia os
adoro desde el día uno de universidad, hemos compartido todo y me hace muy
feliz compartir también esta etapa. Gracias por estar siempre cercanas aunque
haya distancia entre nosotras.
A mis amigos de la Uni, Montse, Borja, Carlos, Mari Carmen, Carles,
Mariam y Jose. Cada uno me aportáis algo maravilloso y compartir con vosotros
los buenos momentos como este, me hace estar tremendamente agradecida de
haberos encontrado en este camino bioloco.
A Carlos, Marta, Quique y Amparo, mis amigos de siempre y por
siempre, no tengo palabras para describir lo que me alegro de teneros siempre
cerca, sois increíbles y os agradezco lo tantísimo que me queréis y apoyáis. A
Teresa, gracias por compartir todo este camino juntas. Jaime, gracias por tu
energía positiva con la que enriqueces mi vida desde que éramos nanos. A mi
Noelia y Jose, agradezco muchísimo que las casualidades hayan juntado
nuestras vidas y que ocupéis un hueco indispensable y tan especial. Y a tí
Noelia, te agradezco muchísimo que siempre estés ahí y que nos una esta
amistad tan intensa. Finalmente, mis queridos Ali y Ruben, sois más que unos
mejores amigos, gracias por todo lo que me daís y por los momentos increíbles
que compartimos, como vuestros encantadores amigos Raúl y Vanessa y sobre
todo a vuestro precioso Daniel. Os quiero a todos.
A toda mi familia, a la que me hace tan feliz y orgullosa pertenecer y que
siempre ha valorado todo mi esfuerzo, animándome a seguir. En especial a mis
tíos Paco, Manolo y Antonio, a los que agradezco muchísimo todo su apoyo. No
me puedo olvidar de mis primos, sobre todo de mi prima Laura y Bea. Y quiero
destacar muchísimo la enorme parte de mi corazón que siempre estará contigo,
te quiero tía.
Quiero resaltar el enorme agradecimiento hacia mi abuela Carmela, te
adoro. Tener una abuela como tú me hace ser la nieta más orgullosa del mundo.
Te quiero muchísimo.
A mi familia adoptativa que me conoce desde que era una jovencita y
habéis contribuido tantísimo a mi felicidad durante todo este tiempo. Gracias a
todos, en especial a Salva y Marisol, Sole, Salvita y a la recién incorporada y que
me alegro muchísimo de haber conocido y compartir tanto, Mari Angels. A Elda,
Jose y Eldita, y destacando especialmente mi enorme agradecimiento a Rafa y
Mari Carmen, mi cuñao Rafa y a Marisa.
También gracias a los que sin ser familia ocupáis un espacio muy
importante en esta, Pili, Lumi, Nerea, Sheila, Aitor, Pablo y Bego.
A mi padre por el amor incondicional hacía tus tres chicas, por
quererme tanto, protegerme, guiarme y servirme como ejemplo de superación
y lucha durante toda mi vida. Te quiero.
A mi teta Naila, mi pequeña. Gracias por ser como eres, por esta relación
tan maravillosa que compartimos, por tu ayuda, por hacerme sentir un modelo
a seguir y sobre todo por quererme tanto. Vivir la vida sin una hermana como
tú no sería lo mismo. Te quiero.
A mi madre, no sé como agradecerte todo lo que has hecho y haces por
mí siempre, desde el esfuerzo enorme al tenerme hasta los increíbles valores
que me has transmitido como el esfuerzo, el cariño, la superación, el respeto…
Me encanta ser un reflejo tuyo porque te admiro y te quiero con locura.
Y para finalizar, por encima de todo quiero destacar a la persona que
ilumina todos los días de mi vida desde hace 12 añazos, mi cari PABLO. Gracias
por comprenderme, ayudarme, mimarme, protegerme y sobre todo por
amarme como lo haces. Eres el pilar fundamental de mi vida y sin ti no podría
conseguir todo esto. No tengo palabras para expresar la felicidad que me aporta
compartir nuestras vidas. Te quiero. Gracias, gracias y más gracias.
Gracias a todos.
El presente trabajo de tesis doctoral ha sido realizado en los laboratorios
de la Fundación IVI, gracias a la infraestructura del Instituto Valenciano de
Infertilidad (IVI) y a la beca de Formación de Personal Universitario concedida
por el Ministerio de Ciencia e Innovación (AP2007-04066).
SIGLAS, ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS Y ANGLICISMOS
ADN: Ácido DesoxiriboNucleico
AMPc: Adenosine MonoPhosphate cyclic (Adenosín Monofosfato cíclico)
ARN: Ácido RiboNucleico
ARNm: Ácido RiboNucleico mensajero
ARNi: Ácido RiboNucleico interferencia
BRCA1: BReast CAncer 1 (Cáncer de mama 1)
BSA: Bovine Serum Albumin (albúmina de suero bovino)
CCL7 y CCL23: Chemokine (C-C motif) ligand 7 y 23 (Ligando 7 y 23 de quimoquinas)
CCR1 y CCR2: Chemokine (C-C motif) Receptor 1 y 2 (Receptor de quimoquina 1 y 2)
CD80: Cluster of Differentiation 80 (Grupo de diferenciación)
CHAPS: 3-[(3-Colamidopropil) dimetilAmonio]-1-PropanoSulfonato
CID: Collision Induced Decomposition (descomposición inducida por colisión)
COX-2: CicloOXigenasa-2
2-DE: Two- Dimensional Electrophoresis (Electroforesis bidimensional)
2D-DIGE:
BiDimensional-Diferential
In
Gel
Electrophoresis
bidimensional diferencial en gel)
(electroforésis
DEPC: DiEtil PiroCarbonato
DIU: Dispositivo IntraUterino
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Medio de cultivo)
dNTP: DeoxyriboNucleotide TriPhosphate (Dexoxiribonucleótido trifosfato)
DTT: DiTioTreitol
E2: Estradiol 2 (beta estradiol)
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbert Assay (Ensayo inmunoabsorberte ligado a
enzima)
EMEM: Eagle's Minimal Essential Medium (Medio de cultivo)
ESC: Endometrial Stromal Cell (Célula estromales endometriales)
ESI: ElectroSpray Ionization (ionización mediante electronebulización)
ESR1: EStradiol Receptor 1
ESR2: EStradiol Receptor 2
F-ACTINA: Filamentosa-Actina
FRAT1: Frequently Rearranged in Advanced T-cell lymphomas (frecuentemente
reorganizado en linfomas avanzados de células T)
FT: Factor Transcripción
G-ACTINA: Globular-Actina
GAP: GTPasas Activing Proteins (proteínas activadoras de GTPasas)
GAPDH: GlycerAldheyde-3 Phosphate DeHydrogenase (Gliceraldheido 3 fosfato
deshidrogenasa)
GDI: Guanine Dissociation Inhibitor (Inhibidor de la disociación de guanina)
GDP: Guanosine DiPhosphate (Guanosín Difosfato)
GEF: Guanin Exchange Factor (factor de intercambio de guanina)
GFP: Green Fluorescence Protein (Proteína verde fluorescente)
G-LISA: Small G protein- Linked ImmunoSorbert Assay (Ensayo inmunoabsorbente
ligado a protein G)
GST: Glutation S Transferasa
GTP: Guanosine TriPhosphate (Guanosín Trifosfato)
GTPasas: Guanosine TriPhosphatase (Guanosín Trifosfatasa)
hCG: human Chorionic Gonadotrophin (gonadotrofina coriónica humana)
HEC-1-A: Human Endometrial Cancer-1-Adenocarcinome (Cáncer endometrial humano
tipo adenocarcinoma)
hEEC: human Endometrial Epithelial Cells (Células endometriales epiteliales humanas)
HOXA10: Homeobox A10
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía liquida de alto
rendimiento)
HRP: HorserRadish Peroxidase (Peroxidasa de rábano)
HUVEC: Human Umbilical Vein Endothelial Cells (Células endoteliales de cordón
umbilical humano)
ICAT: Isotope-Coded Affinity Tags (marcaje isotópico diferencial)
IGFBP-1: Insulin-like Growth Factor-Binding Protein-1 (Proteína 1 de unión al factor de
crecimiento similar a insulina)
IL-1, IL-6, IL-10, IL-21: InterLeuquina-1, -6, -10 y -21
IL1R-II: Receptor-II de la InterLeuquina-1
IMC: Índice de Masa Corporal
IPG: Inmobilized PH Gradient (gradiente de pH inmovilizado)
LH: Luteinizing Hormone (Hormona luteinizante)
LIF: Leucemia Inhibitor Factor (Factor inhibidor de leucemia)
MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización mediante
láser asistida por matriz)
MALDI-TOF/TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight/ Time
Of Flight (espectometría de masas en tándem)
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1 (Proteína quimioatrayente de monocito)
MEC: Matriz ExtraCelular
Min: Minuto
MMLV: Moloney- Murine Leucemia Virus (Virus de la leucemia murina)
MMP2, MMP3 y MMP14: Matriz MetaloProteinasas 2, 3 y 14
MPIF-1: Myeloid Progenitor Inhibitory Factor-1 (Factor 1 inhibidor del progenitor
mieloide)
MS: Mass Spectrometry (Espectrometría de masas)
MS/MS: Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry (Espectrometría de masas en tándem)
MUC1: Mucina 1
N: Número de muestras
NFKB1: Nuclear Factor-Kappa-B ( Factor nuclear kappa B)
NgR1: Nogo-66 Receptor 1
NL: No Lineal
NKu: Natural Killer uterine (Asesina natural uterina)
NMDA: N-Metil-D-Aspartato
NR4A: Nuclear Receptor subtype 4A (Receptor nuclear subtipo 4A)
P: Progesterona
2D-PAGE: 2
Dimensional- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (Electroforesis
bidimensional en gel de poliacrilamida)
PBS: Phosphate Buffered Saline (tampon fosfato salino)
PC6: Proproteína Convertasa 6
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)
PECAM-1: Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule- 1 (Molécula de adhesion de
células de plaquetas endoteliales)
PGR: ProGesterone Receptor (receptor de progesterona)
pI: punto Isoeléctrico
PMSG: Pregnant Mare Serum Gonadotropin (Gonadotropina sérica de yegua preñada)
PVDF: Polifluoruro de Vinilideno ()
Rac1: Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (substrato 1 de la toxina botulinica
C3 relacionada con Ras)
RANTES: Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted (Células T
expresión y secreción tras su activación regulada)
RBD: Rho Binding Domain (Dominio de unión a Rho)
ROCK: RhO-associated, Coiled-coil Kinase (quinasa asociada a Rho)
rpm: revoluciones por minuto
RT: Reverse Transcription (Transcripción reversa)
RT-PCR: Reverse Time- Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la
polimerasa a tiempo real)
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (dodecilsulfato sódico)
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (electroforesis
en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico)
SELDI:
Surface
Enhanced
Laser
Desorption
ionización/desorción inducida por láser)
Ionization
(Superficie
SEM: Standard Error Media (error estándar de la media)
Ser: Serina
SM22: Smooth Muscle 22 (proteína 22 músculo liso)
TIMP1: Tissue Inhibitor of MetalloProteinases (Inhibidor de metaloproteinasas en
tejido)
TMB: TetraMetilBenzidina
TOF: Time Of Flight (Tiempo de vuelo)
TOF/TOF: Time Of Flight (Tiempo de vuelo en tandem)
de
UI: Unidades Internacionales
WA: Witaferina A
WOI: Window Of Implantation (Ventana de implantación)
ANGLICISMOS:
Fold change (FC): tasa de cambio.
Forward: secuencia del primer 5´-3´ que se une en la cadena que va en dirección 3´-5´
del ADN.
In vivo: En el cuerpo. Conjunto de experimentos y de fenómenos observados que se
efectúan directamente sobre el organismo vivo.
In vitro: Conjunto de fenómenos observados en el laboratorio, investigando y
manipulando fuera del organismo vivo.
Microarray de proteínas: micro matriz. Matriz bidimensional de soporte sólido en las
que están unidos anticuerpos que detectan específicamente determinadas proteínas.
Pull-down: ensayo de unión de proteínas mediante soporte (por ejemplo bolas de
sefarosa).
Reverse: secuencia del primer 3´-5´ que se une en la cadena que va dirección 5´-3´ del
ADN.
Software: programa informático.
Spot: cada uno de los puntos de luz del microarray que se corresponde a la medida de
expresión de una proteína. También se llama spot a cada una de las manchas que
aparece en un gel se poliacrilamida.
Window of implantation (WOI): ventana de implantación. Días del ciclo menstrual en
los que el endometrio posee un fenotipo receptivo que le permite que el blastocisto
implante.
Upstream: Flujo ascendente referido a una ruta biológica.
Wild-Type: tipo silvestre
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCIÓN________________________________________________________________________
1
1.1.1 Definición___________________________________________________________________________
3
1.1.3 Ciclo menstrual_____________________________________________________________________
9
1.1 El endometrio___________________________________________________________________________ 3
1.1.2 Anatomía____________________________________________________________________________
3
1.2 Receptividad endometrial____________________________________________________________ 11
1.2.1 Definición___________________________________________________________________________ 11
1.2.2 Marcadores de receptividad endometrial_________________________________________ 12
1.3 Implantación embrionaria____________________________________________________________ 16
1.3.1 Fase de aposición____________________________________________________________________ 18
1.3.2 Fase de adhesión_____________________________________________________________________ 19
1.3.3 Fase de invasión_____________________________________________________________________ 21
1.4 El proceso de decidualización_________________________________________________________ 22
1.5 Annexin A2, RhoA y el citoesqueleto de actina_____________________________________ 24
1.5.1 Annexin A2__________________________________________________________________________ 24
1.5.2 RhoA_________________________________________________________________________________ 27
1.5.3 Citoesqueleto de actina_____________________________________________________________ 30
1.6 Proteómica del endometrio___________________________________________________________ 34
1.6.1 Metodologías de separación________________________________________________________ 37
1.6.2 Técnicas analíticas: espectrometría de masas____________________________________ 40
1.6.3 Bioinformática______________________________________________________________________ 41
1.6.4 Arrays de proteínas_________________________________________________________________ 42
2. HIPÓTESIS________________________________________________________________________ 47
3. OBJETIVOS_______________________________________________________________________ 51
3.1 Objetivos generales__________________________________________________________________ 53
3.2 Objetivos específicos________________________________________________________________ 53
4. MATERIAL Y MÉTODOS_________________________________________________________ 55
4.1 Muestras biológicas_____________________________________________________________________ 57
4.1.1 Criterios de inclusión_______________________________________________________________ 57
4.1.2 Obtención de las muestras__________________________________________________________ 60
4.1.3 Separación de la fracción estromal y epitelial_____________________________________ 60
4.1.4 Decidualización in vitro_____________________________________________________________ 62
4.2 Líneas celulares_________________________________________________________________________ 63
4.3 Estudio proteómico_____________________________________________________________________ 64
4.3.1 Preparación de las muestras________________________________________________________ 64
4.3.2 Separación por 2D-DIGE____________________________________________________________ 65
4.3.3 Adquisición de imágenes y análisis________________________________________________ 67
4.3.4 Digestión del gel con tripsina_______________________________________________________ 68
4.3.5 Espectrometría de masas___________________________________________________________ 69
4.3.6 Bases de datos_______________________________________________________________________ 70
4.4 Análisis de secretómica: Array de proteínas_______________________________________ 71
4.5 Bioinformática__________________________________________________________________________ 72
4.6 Tratamientos para Anexina A2 y RhoA_____________________________________________ 75
4.6.1 Inhibición de Annexin A2__________________________________________________________ 75
4.6.2 Activación/inactivación de RhoA__________________________________________________ 76
4.7 Ensayo de adhesión en cocultivo_____________________________________________________ 77
4.7.1 Obtención de los embriones de ratón_____________________________________________ 77
4.7.2 Cultivo de los esferoides JEG-3____________________________________________________ 78
4.7.3 Ensayos de adhesión_______________________________________________________________ 79
4.8 Ensayo de expansión de trofoblasto_________________________________________________ 79
4.9 Ensayo migración/proliferación celular: “Cierre del surco”_____________________ 80
4.10 PCR cuantitativa_______________________________________________________________________ 81
4.10.1 Aislamiento de ARN_______________________________________________________________ 81
4.10.2 Retrotranscripción________________________________________________________________ 82
4.10.3 RT-PCR____________________________________________________________________________ 83
4.11 Análisis de proteínas ________________________________________________________________ 85
4.11.1 Extracción de proteínas__________________________________________________________ 85
4.11.2 Cuantificación_____________________________________________________________________ 85
4.11.3 Western blot_______________________________________________________________________ 86
4.12 Inmunohistoquímica e inmunosfluorescencia___________________________________ 88
4.13 Análisis ELISA_________________________________________________________________________ 89
4.14 Ensayo de medir actividad de RhoA: Pull-down y G-LISA______________________ 90
4.14.1 Ensayo Pull-down de RhoA-GTP_________________________________________________ 90
4.14.2 Detección de RhoA activo por G-LISA___________________________________________ 91
4.15 Ensayo para medir F-actin/G-actin in vivo_______________________________________ 92
4.16 Estadística_____________________________________________________________________________ 93
5. RESULTADOS___________________________________________________________________________ 95
5.1. Proteómica receptividad endometrial_____________________________________________ 97
5.1.1. Análisis proteómico del endometrio receptivo comparado con
pre-receptivo mediante DIGE e identificación por MALDI-MS____________________________ 97
5.1.2. Validación análisis proteómico del endometrio receptivo comparado con el
pre-receptivo mediante DIGE e identificación por MALDI-MS___________________________ 103
5.1.3. Inmunolocalización de estatmina 1 y anexina A2 en el endometria
pre-receptivo y receptivo___________________________________________________________________ 105
5.1.4. Modelo de endometrio humano refractario para testar la relevancia
funcional de estatmina 1 y anexina A2____________________________________________________ 106
5.2. Proteómica del proceso de decidualización_______________________________________ 108
5.2.1. Evaluación de la decidualización in vitro___________________________________________ 108
5.2.2. Análisis proteómico de las células decidualizadas respecto a las control_________ 110
5.2.3. Validación de la tecnología proteómica por western blot__________________________ 113
5.2.4. Análisis secretómico de las células decidualizadas respecto a las control_________ 114
5.2.5. Validación del análisis secretómico mediante ELISA_______________________________ 116
5.2.6. Generación del interactoma de la decidualización__________________________________ 118
5.3. Análisis de Anexina A2 y RhoA en la receptividad endometrial________________ 121
5.3.1. Análisis de Anexina A2 en el endometrio humano total a lo largo del
ciclo menstrual________________________________________________________________________________ 121
5.3.2. Efecto de la inhibición de ANXA2 endometrial sobre adhesividad________________ 124
5.3.3. Estudio del fenómeno de expansión del trofoblasto cuando
ANXA2 es inhibida____________________________________________________________________________ 127
5.3.4. Análisis de la migración/proliferación de las células epiteliales
endometriales (hEEC) tras inhibir ANXA2__________________________________________________ 129
5.3.5. Efecto de inhibir ANXA2 sobre la proteína RhoA___________________________________ 131
5.3.6. Efecto de inactivar RhoA sobre los niveles de ANXA2______________________________ 132
5.3.7. Análisis de RhoA en el endometrio humano total a lo largo del
ciclo menstrual_______________________________________________________________________________ 133
5.3.8. Efecto de la activación/inactivación de RhoA sobre la capacidad de
adhesión de embriones sobre las células HEC-1-A_________________________________________ 136
5.3.9. Función de ANXA2 y RhoA en la regulación de la adhesividad de las células
hEEC al embrión______________________________________________________________________________ 139
5.3.10. Regulación de la reorganización de las fibras de F-actina del citoesqueleto
por ANXA2 y RhoA___________________________________________________________________________ 141
6. DISCUSIÓN_______________________________________________________________________________ 145
7. CONCLUSIONES_________________________________________________________________________ 171
8. BIBLIOGRAFÍA__________________________________________________________________________ 175
9. ANEXOS___________________________________________________________________________________ 199
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCION
1
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
2
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
1.1.
El endometrio
1.1.1. Definición
El endometrio humano es la mucosa que tapiza la cavidad uterina. Es un
órgano especializado que se regula hormonalmente sufriendo una serie de
cambios periódicos que son la base del ciclo menstrual, exclusivo de seres
humanos y primates superiores. El endometrio se ha considerado
tradicionalmente como la membrana de un receptáculo inerte que constituye la
parte pasiva del proceso de gestación. Sin embargo, el endometrio es un órgano
activo y dinámico entre cuyas funciones básicas se encuentra la de desarrollar
temporalmente un estado en el que se permite la adhesión del blastocisto
después de la fecundación, para posibilitar la implantación. Este tejido además,
permite que se produzca la posterior invasión controlada del trofoblasto que
dará lugar a la placentación, que resulta imprescindible para al desarrollo fetal
en los mamíferos. Es, por tanto, un tejido clave en la vida reproductiva de la
mujer (Simón y Valbuena, 1999; Simón y cols., 2009).
1.1.2. Anatomía
El endometrio humano se encuentra constituido por los compartimentos
epitelial, estromal y vascular, con la existencia, además, de una población de
células inmunes residentes. Todo ello se distribuye en dos regiones
denominadas funcionalis y basalis. La funcionalis se transforma y regenera cada
mes durante la menstruación, mientras que la basalis permanece formando la
base para regenerar cíclicamente la capa funcionalis (Fig. 1).
3
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 1.
Endometrio Humano. (A) Localización del endometrio en la cavidad
uterina. (B) Esquema histológico del endometrio dentro del contexto del útero. E:
endometrio; M: miometrio. (C) Detalle del esquema histológico del endometrio. EP
Luminal: Epitelio endometrial luminal; EP Glandular: Epitelio endometrial glandular;
ES: estroma endometrial; B: capa basalis; F: capa funcionalis (Simón, 2009).
Compartimento epitelial
El epitelio endometrial es una monocapa de células cuboidales
polarizadas que tapizan el interior de la cavidad uterina. Está constituido por
un componente luminal y otro glandular (Martín y cols., 2002). Esta monocapa,
como el resto de las mucosas, actúa como barrera para proporcionar protección
contra los patógenos que logran acceder hasta la cavidad endometrial, pero
también debe permitir la adhesión del embrión humano que es, en esencia, la
función primordial del endometrio.
El epitelio endometrial está regulado por las hormonas esteroideas
ováricas que, directamente o a través del estroma (Cooke y cols., 1995),
4
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
inducen cambios morfológicos y bioquímicos cíclicos. Estos cambios ayudan a
preparar el microambiente adecuado para la adhesión del embrión, dónde el
epitelio actúa también como primer mediador del diálogo entre el embrión y el
endometrio materno (Simón y cols., 1998).
La morfología del epitelio luminal varía según la fase del ciclo
menstrual, inducido por un programa transcripcional específico (Horcajadas y
cols., 2008), en un proceso denominado “transformación de la membrana
plasmática” (Murphy y cols., 1994). Estos cambios estructurales incluyen
modificaciones en la membrana plasmática (Murphy y cols., 1994; 1995) y la
disrupción del citoesqueleto (Martin y cols., 2000). Además, se produce un
remodelado de la polarización epitelial para preparar el polo apical para la
adhesión embrionaria (Thie y cols., 1995). Existen evidencias que muestran la
enorme relevancia de la interacción entre la membrana y el citoesqueleto en el
desarrollo del estado de receptividad endometrial (Hitt y cols., 1994; Thie y
cols., 1997; Murphy y cols., 1995).
La célula epitelial, en respuesta a los estrógenos, desarrolla unas
microvellosidades largas y unas cortas uniones estrechas en la membrana
lateral más apical. El cinturón de actina es prominente y los desmosomas son
comparativamente más numerosos. Durante la fase secretora, los microvillis
disminuyen y las protuberancias apicales se hacen más prominentes en el
lumen uterino (Fig. 2). Mediante microscopía electrónica de barrido se
observan unas proyecciones ectoplásmicas denominadas pinópodos (Martel y
cols., 1981; Murphy, 2000) que parecen actuar en la modulación del ambiente
uterino, absorbiendo por endocitosis de forma activa líquido endometrial (Fig.
3). Estas estructuras se consideran marcadores morfológicos de la receptividad
endometrial (Nikas y Makrigiannakis., 2003).
5
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 2. Transformación de la membrana plasmática del epitelio endometrial.
Diagrama (A, B) y Microscopía Electrónica de Transmisión (Transmision Electron
Microscopy, TEM) (C, D, E). Parte izquierda: se muestra el esquema de la
transformación de la membrana plasmática y del citoesqueleto, de la situación no
receptiva (A) a la receptiva (B). Parte derecha: observamos el proceso de cambio en la
superficie de la membrana plasmática, desde la situación no receptiva (C) a la receptiva
(E), mostrándose la transición (D) (Murphy, 2004). Microvellosidades (mv); uniones
estrechas (tj); cinturón de actina (tw); desmosomas (d).
El epitelio también forma glándulas endometriales, las cuales proliferan
durante la fase secretora temprana formando estructuras largas y sinuosas, que
van aumentando a medida que la fase secretora avanza. La función del epitelio
glandular es la producción y secreción de moléculas necesarias para la
nutrición e implantación del blastocisto.
6
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura. 3 Microscopía electrónica de barrido (SEM) del epitelio endometrial
durante la ventana de implantación. (A) LH+2 donde las células ciliadas simples
están separadas por células epiteliales con superficies lisas y no hay pinópodos aún. (B)
LH+5, la superficie endometrial presenta células recubiertas por pinópodos, entre las
que se intercalan células ciliadas simples. (C) LH+7, algunos pinópodos están en pleno
desarrollo con superficie lisa arrugada, otros están en desarrollo con superficie lisa.
Compartimento estromal
El estroma endometrial es un tejido conectivo compuesto por células y
matriz extracelular (MEC). El tipo celular que compone mayoritariamente el
estroma es el fibroblasto, y está implicado en la remodelación de la matriz
extracelular a lo largo del ciclo menstrual. Esta remodelación ocurre
principalmente en la fase lútea mediante el proceso de decidualización. Se
denomina así a una serie de cambios morfológicos, bioquímicos y génicos de
los fibroblastos en respuesta a la exposición a los estrógenos y progesterona.
Dichos cambios van dirigidos a regular la implantación mediante el control de
la invasión del trofoblasto en el útero materno. Este proceso lo trataremos en
profundidad posteriormente.
Compartimento vascular
La angiogénesis es el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a
partir de la vascularización preexistente (Folkam y Shing, 1992; Klagsburn y
7
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Moses, 1999). En los tejidos adultos, este proceso fisiológico tiene lugar
solamente durante los mecanismos de cicatrización en heridas y fracturas. Sin
embargo, el aparato reproductor femenino es una excepción debido a su
comportamiento cíclico. La angiogénesis se induce durante el desarrollo del
folículo ovárico hasta la formación del cuerpo lúteo, en el desarrollo
endometrial, en la implantación y placentación durante la gestación, así como
en el tejido mamario durante la lactancia (Findlay, 1986; Augustin, 2000). La
arquitectura vascular intrauterina está compuesta por una intricada red que
comienza en el miometrio. Además, el crecimiento vascular inapropiado está
asociado con estados patológicos como el crecimiento de tumores, algunas
retinopatías, endometriosis, hemangiomas, fibrosis y artritis reumatoide
(Klagsburn y D´Amore, 1991; Augustin, 2000).
Células inmunes residentes
El endometrio humano contiene células del sistema inmunológico que son
relevantes para la fisiología endometrial, especialmente en la regulación de la
respuesta inmune local. La población leucocitaria encontrada en el endometrio
normal supone entre un 10-15% de la población celular del estroma, fluctúa
cíclicamente y es máxima en la fase secretora tardía y premenstrual (Bulmer y
Johnson, 1985). El conjunto de células inmunes residentes está formado
fundamentalmente por células natural killer uterinas (NKu), macrófagos y
linfocitos T. Su función primordial es la de proteger el tracto genital frente a
infecciones y evitar el rechazo inmunológico durante la implantación
embrionaria.
8
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1.1.3. El ciclo menstrual
El ciclo menstrual es exclusivo de primates, el resto de mamíferos poseen
un ciclo estral que se caracteriza por la reabsorción de su endometrio. En
cambio, durante el ciclo menstrual, el endometrio es destruido y expulsado en
lo que conocemos como menstruación (Jolivet y Gautray, 1978; Jabbour y cols.,
2006). El endometrio humano posee un ciclo menstrual, cuyo aspecto cíclico es
debido a la exposición periódica de ambas hormonas esteroideas ováricas, los
estrógenos y la progesterona (Critchey y cols., 2000).
El ciclo menstrual se divide en dos fases: proliferativa y secretora (Fig. 4).
En la fase proliferativa el endometrio pasa de un grosor de 2 hasta 12
milímetros que puede llegar a alcanzar en la fase secretora. En la fase
proliferativa dominan los estrógenos, que regulan la proliferación de las células
endometriales y su vascularización (Critchey y cols., 2000). Por el contrario, en
la fase secretora, aparece la progesterona, aunque también siguen existiendo
niveles elevados de estrógenos. Los progestágenos contrarrestan esas acciones
proliferativas de los estrógenos por varias vías. Una de estas vías es la
reducción del nivel de sus receptores, otra el aumento de la tasa del
metabolismo del estradiol (E2) a compuestos inactivos (estrona y metabolitos
sulfatados), y otra es la interferencia en sus acciones transcripcionales (Strauss
III y Gurpide, 1993). Por ello, en la fase secretora los componentes celulares
sufren diferenciación, produciéndose la secreción glandular. La fase secretora
se divide a su vez en secretora temprana, media y tardía.
9
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 4. Ciclo menstrual y ovárico. En la parte superior de esta figura se muestran
los niveles hormonales que acoplan el ciclo ovárico con el ciclo menstrual (P,
progesterona; E, estradiol; LH, hormona luteinizante; FSH, hormona folículo
estimulante). En la parte intermedia se pueden observar los cambios que suceden en el
ciclo ovárico en función de los niveles hormonales. En la zona inferior se indican los
cambios que acontecen en el endometrio en cuanto al grosor, desarrollo glandular y
vascular. En la parte de debajo del endometrio se marcan los días del ciclo y se
muestran las fases del ciclo menstrual: proliferativa y secretora, dentro de la cual
podemos distinguir un periodo secretor temprano (STE), medio (SM), y tardía (STA)
que culmina con la menstruación.
10
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
El ciclo menstrual y el ciclo ovárico se encuentran acoplados por la
acción cíclica de las hormonas esteroideas (Fig. 4). De modo que, atendiendo a
las fases del ciclo ovárico, la fase proliferativa del endometrio se corresponde
con la folicular ovárica, y la fase secretora del endometrio con la lútea.
1.2. Receptividad endometrial
1.2.1. Definición
En humanos así como en otros mamíferos, el endometrio humano no es
adhesivo al embrión en la mayor parte del ciclo menstrual. Conocemos como
receptividad endometrial al proceso biológico en el que, de forma única y
exclusiva, es posible la adhesión del blastocisto al endometrio (Finn y Martin,
1974). La receptividad endometrial se produce con cada ciclo menstrual,
independientemente de que haya posibilidad de implantación. Dicha
receptividad acontece durante un periodo concreto de tiempo de la fase
secretora media que es conocido como ventana de implantación (Wilcox y cols.,
1999). Esta ventana en humanos se abre entorno al día 19 y se cierra en el 21
de un ciclo menstrual ideal (Bergh y Navot, 1992; Psychoyos, 1993).
En torno al día 13 del ciclo se produce un pico de la hormona luteinizante
(LH) y 36 horas después ocurre la ovulación (Fig. 4). De este modo, se
denomina día LH 0 al día en que se produce el pico, y siguiendo con esta
nomenclatura, el endometrio pre-receptivo correspondería al intervalo de
LH+1 a LH+5 (días 14 al 18 del ciclo menstrual); el endometrio receptivo,
correspondiente a la ventana de implantación, al intervalo de LH+6 a LH+8
11
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
(días 19 al 21 del ciclo); y el endometrio post-receptivo al intervalo de LH+9 a
LH+13 (días 22 al 26 del ciclo).
Durante este periodo se producen una serie de cambios que se
materializan a nivel histológico, celular y molecular, de modo que el
endometrio adopta un fenotipo receptivo. Las células endometriales epiteliales
experimentan una serie de cambios morfológicos y bioquímicos conocidos
como “transformación de la membrana plasmática” (Murphy y Shaw, 1994), en
el que se originan cambios estructurales que modifican dicha membrana celular
(Murphy y Shaw, 1994; Murphy, 2004) y el citoesqueleto (Murphy, 1995; Thie y
cols., 1995; Martin y cols., 2002). La zona apical de la membrana plasmática
desarrolla propiedades adhesivas, aparecen microvillis largos que se
transforman poco a poco en proyecciones aplanadas (Murphy, 2000). Estos
cambios ocurren junto con cambios en el compartimento estromal (Irwin y
cols., 1989) y la vasculatura endometrial.
1.2.2. Marcadores de receptividad endometrial
Los marcadores de receptividad endometrial son aquellos parámetros
que nos permiten caracterizar a un endometrio como receptivo (Achache y
Revel, 2006). Es por ello que los marcadores pueden ser utilizados para datar el
endometrio en fase receptiva y evaluar el estatus de receptividad endometrial.
Existen distintos tipos de marcadores atendiendo al nivel de estudio en el
que se obtiene información. De este modo, se habla de marcadores de
receptividad endometrial morfológicos cuando es la morfología la que nos
informa; de marcadores de receptividad moleculares clásicos cuando son las
moléculas de forma aislada las que nos caracterizan el endometrio; y de
12
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
marcadores moleculares “ómicos” cuando son las moléculas en su conjunto las
que nos permiten caracterizar dicho proceso biológico (Aghajanova y cols.,
2008a).
Marcadores morfológicos
Los cambios cíclicos en la morfología del tejido endometrial han sido
descritos mediante la observación por microscopía óptica de cortes histológicos
de endometrio. Durante la fase lútea del ciclo natural pueden observarse
cambios morfológicos en el endometrio que, día a día, permiten su dataje.
Actualmente la anatomía patológica rutinaria data el endometrio según los
criterios de Noyes que fueron obtenidos a partir de 8.000 biopsias de
endometrio de pacientes estériles (Noyes y cols., 1950 y 1975). Los criterios de
Noyes consideran ocho características histológicas básicas del endometrio:
grado de mitosis glandular, pseudoestratificación de los núcleos, vacuolas
basales, secreción, edema del estroma, reacción pseudodecidual, mitosis del
estroma e infiltración leucocitaria (Noyes y cols., 1950 y 1975). La precisión del
dataje endometrial depende de múltiples factores. Estos factores son el método
de determinación del día de la ovulación; el momento de toma de la biopsia; el
estado de la biopsia; las técnicas de fijación y la interpretación del patólogo.
Se han intentado buscar otros marcadores morfológicos que permitan
determinar el estado receptivo tal como, la presencia de proyecciones
ectoplásmaticas, denominadas pinópodos. A pesar de desconocerse su función
real, parecen ser inducidos por la endocitosis de líquido endometrial por parte
de las células epiteliales luminales y se consideran unos marcadores
morfológicos del periodo de receptividad uterina (Nikas, 1999). Una limitación
13
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
de su uso como marcador es que se ha visto que los pinópodos permanecen en
el endometrio post-receptivo no siendo representativos únicamente del estatus
de receptividad (Quinn y Casper., 2009).
Marcadores moleculares clásicos
Existen multitud de publicaciones en las que se documenta la expresión
de determinadas moléculas en el endometrio humano en los distintos
compartimentos celulares y durante las diferentes fases del ciclo menstrual
(Aghajanova y cols., 2008b), tales como las integrinas (Lessey y cols., 1992), la
mucina MUC1 (Meseguer y cols., 1998), calcitonina (Kumar y cols., 1998), LIF
(Stewart, 1992), COX-2 (Davis y cols., 1999) y HOXA10 (Taylor y cols., 1999).
Como consecuencia de estos estudios, se han intentado aplicar como
marcadores bioquímicos de la receptividad endometrial pero no siempre han
dado resultados concluyentes. De hecho, aunque ha habido intentos para
proponerlos como métodos de diagnóstico, su uso nunca se ha consolidado.
Marcadores moleculares “ómicos”
Con la secuenciación del genoma humano y el desarrollo de nuevas
tecnologías, se han desarrollado lo que se ha denominado ciencias “ómicas”
(Quackenbush, 2006a). Esto ha supuesto un cambio drástico en el enfoque de
las investigaciones, ya que se ha pasado del análisis molécula a molécula a
estudiar todo el conjunto de genes/proteínas de un organismo en sólo un
experimento. El patrón transcriptómico ha sido investigado en múltiples
estudios empleando técnicas basadas en la tecnología de los microarrays para
examinar los niveles de expresión de mRNAs en las diferentes fases del ciclo
menstrual del endometrio (Tabla 1). Todos estos estudios han demostrado la
14
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
existencia de diferentes patrones de expresión génica según la fase del ciclo
menstrual (Horcajadas y cols., 2007). Estos hallazgos abren la posibilidad de
clasificar el estado molecular del endometrio según la firma transcriptómica
(Haouzi y cols., 2009; Aghajanova., 2008; Tapia y cols., 2011), en un intento de
sustituir el empleo de otros marcadores morfológicos o bioquímicos cuya
efectividad ha sido cuestionada (Horcajadas y cols., 2004; Martín y cols., 2002;
Coutifaris y cols., 2004).
Proceso estudiado
Microarray
Compañia
Decidualización
Decidualización
Cáncer Endometrial
WOI
Endometriosis
WOI
Endometriosis
Endometriosis
WOI
RU486
WOI
Endometriosis
Cáncer Endometrial
Efecto progesterona
WOI
Cáncer Endometrial
Decidualization
Cáncer Endometrial
Cáncer Endometrial
Endometriosis
Ciclos estimulados
Ciclo menstrual
Cáncer Endometrial
Modelos in vitro
Cáncer Endometrial
Ciclos estimulados
Modelos in vitro
Endometriosis
Cáncer Endometrial
WOI
Ciclo menstrual
Modelos in vitro
RU486
Ciclos estimulados
Ciclo menstrual
Modelos in vitro
Fase proliferativa
Cáncer Endometrial
Endometriosis
DIU
Modelos in vitro
Cáncer Endometrial
Modelos in vitro
Endometriosis
Cáncer Endometrial
Endometriosis
WOI
Modelos in vitro
Endometriosis
Endometriosis
Cáncer Endometrial
Endometriosis
Cáncer Endometrial
Embarazo
Ciclo menstrual
Clontech
Incyte human GEM-V
Hu6800
HG-U95A
Human gene genefilter GF211
HG-U95A
Atlas human cDNA expression Array
Home-made
HG-U95A-E
Home-made
Human cytokine expression array
HG-U95A
Oncochip
Human Chip 1K set 1
HG-U95A
Home-made
HG-U95A
GEMarray clones
HG-U133A
Atlas human 1.2 cDNA expression array
HG-U95Av2
Home-made
Home-made
1-cDNA Array
HG-U133A
HG-U133A
HG-U133A 2.0
Atlas human 1.2 cDNA expression array
HG-U133A – U133B
HG-U95Av2
HG-U133A
Home-made
Home-made
HG-U133A
HG-U133 Plus 2.0
Home-made
BD Atlas nylon cDNA expression array
Human Unigen1
HG-U133 Plus 2.0
Home-made
HG-U133 Plus 2.0
UniGEM V cDNA microarray
HG-U133 Plus 2.0
Home-made
HG-U133A – U133B
CodeLink Whole Human Genome
Home-made
HG-U133 Plus 2.0
Atlas human 1.2 Array
miRNA Bioarray
35K Human oligo microarray
HG-U133A 2.0
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133A 2.0
Sentrix Human Illumina 6V1 Expression
Atlas array Stanford University
Incyte Genomics
Affymetrix
Affymetrix
Research Genetics
Affymetrix
Clontech
University of Tokio
Affymetrix
University of Cambridge
R&D Systems
Affymetrix
CNIO
Takara Shuzo
Affymetrix
National Cancer Institute
Affymetrix
Incyte Genomics
Affymetrix
Clontech
Affymetrix
Peter MacCallum Cancer Institute
University of Cambridge
Agilent
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Clontech
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
University of Cambridge
University of Cambridge
Affymetrix
Affymetrix
University of Cambridge
BD Biosciences Clontech
Incyte Genomics
Affymetrix
University of Cambridge
Affymetrix
Incyte Genomics
Affymetrix
Medical College of Wisconsin
Affymetrix
GE-Amersham Biosciences
University of Cambridge
Affymetrix
Clontech
Ambion
Norwegian Microarray Consortium
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Illumina
15
Número de genes
588
6918
6000
12686
4133
12686
597
23040
>60000
~1000
375
12686
6386
1000
12686
9984
12686
18098
>22000
1172
12686
1000
1056
12814
>22000
>22000
14500
1176
>22 000
12686
>22000
>15000
>15000
>22000
> 47000
>15000
588
9600
> 47000
>16000
> 47000
7800
> 47000
9600
>22000
45674
>16000
> 47000
1176
287
24650
14500
> 47000
14500
> 47000
Estudio
Popovici et al. (2000)
Brar et al. (2001)
Mutter et al. (2001)
Carson et al. (2002)
Eyster et al. (2002)
Kao et al. (2002)
Lebovic et al. (2002)
Arimoto et al. (2003)
Borthwick et al. (2003)
Catalano et al. (2003)
Domínguez et al. (2003)
Kao et al. (2003)
Moreno-Bueno et al.
Okada et al. (2003)
Riesewijk et al. (2003)
Risinger et al. (2003)
Tierney et al. (2003)
Cao et al. (2004)
Ferguson et al. (2004)
Matsuzaki et al. (2004)
Mirkin et al. (2004)
Ponnampalam et al.
Saidi et al. (2004)
Barbier et al. (2005)
Ferguson et al. (2005)
Horcajadas et al. (2005)
Krikun et al. (2005)
Matsuzaki et al. (2005)
Maxwell et al. (2005)
Mirkin et al. (2005)
Punyadeera et al. (2005)
Rossi et al. (2005)
Sharkey et al. (2005)
Simón et al. (2005)
Talbi et al. (2005)
White et al. (2005)
Yanahiara et al. (2005)
Gielen et al. (2006)
Hever et al. (2006)
Horcajadas et al. (2006)
Huang et al. (2006)
Matsumura et al. (2006)
Sarno et al. (2006)
Wu et al. (2006)
Dainty et al. (2007)
Eyster et al. (2007)
Feroze-Zaidi et al.
Gielen et al. (2007)
Mettler et al. (2007)
Pan et al. (2007)
Paulssen et al. (2007)
Van Langendonckt et
Wong et al. (2007)
Bersinger et al. (2008)
Cloke et al. (2008)
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Proceso estudiado
Microarray
Compañia
Embarazo
Señalización
Cáncer Endometrial
Ciclos estimulados
Decidualización
Endometriosis
Ciclos estimulados
Ciclo menstrual
Ciclo menstrual
Embarazo
Endometriosis
WOI
Ciclos estimulados
Ciclo menstrual
Efectos paracrinos
WOI
Ciclos estimulados
Adenomiosis
WOI
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133 Plus 2.0
Cancer profiling array
HG-U133A
HG-U133 Plus 2.0
HG-U95Av2
HG-U133A
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133 Plus 2.0
Home-made
Home-made
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133A
Home-made
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133 Plus 2.0
HG-U133 Plus 2.0
Whole Human Genome Oligo Microarray
Affymetrix
Affymetrix
Clontech
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
University of Cambridge
National Cancer Institute
Affymetrix
Affymetrix
University of Cambridge
Affymetrix
Affymetrix
Affymetrix
Agilent
Número de genes
> 47000
> 47000
241
> 22000
> 47000
12686
> 22000
> 47000
> 47000
> 47000
22000
9128
> 47000
> 22000
>15000
> 47000
> 47000
> 47000
> 40000
Estudio
Evans et al. (2008)
Gielen et al. (2008)
Hamm et al. (2008)
Horcajadas et al.
Horne et al. (2008)
Hull et al. (2008)
Liu et al. (2008)
Lu et al. (2008)
Macklon et al. (2008)
Savaris et al. (2008)
Sherwin et al. (2008)
Tapia et al. (2008)
Zhou et al. (2008)
Ball et al. (2009)
Germeyer et al.(2005)
Haouzi et al. (2009)
Van Vaerenbergh et
Chen et al.(2010)
Labarta et al. (2011
Tabla 1. Estudios de transcriptómica realizados en el endometrio humano. Toda
la
información
génica
se
encuentra
http://www.endometrialdatabase.com.
disponible
en
la
base
de
datos:
Otras tecnologías “omicas” tales como la Proteómica, que estudia la
colección de proteínas y su expresión, o la Metabolómica, que estudia todos
aquellos metabolitos no incluidos en la categoría de genes, ARNm o proteínas,
han comenzado a ser empleadas con el fin de identificar marcadores del
proceso de receptividad endometrial.
1.3. Implantación embrionaria
La implantación del embrión en el útero comienza entre el sexto y
séptimo día después de la fecundación del óvulo por el espermatozoide y se
extiende hasta 14 días después de la fecundación en un ciclo natural. Este
proceso es clave en el establecimiento de un embarazo exitoso. En la especie
humana, en condiciones naturales sólo el 35% de los embriones consiguen
implantar, es decir, fisiológicamente sólo 1/3 de los ciclos considerados fértiles
acaban en embarazo. Las causas de esta baja tasa de éxito se comparten entre el
16
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
embrión (ya que in vivo el 30% de los blastocistos son morfológicamente
anómalos) y un diálogo defectuoso entre el embrión y el endometrio materno,
que se puede objetivar por la existencia de un 30% de pérdidas gestacionales
precoces antes del momento de la menstruación. Este porcentaje de pérdidas es
aún mayor en pacientes sometidas a tratamientos de reproducción asistida
(Simón y cols., 1999). Se comprobó que en fecundación in vitro (FIV) y donación
de ovocitos las pérdidas embrionarias precoces suponían un 43% y 38%,
respectivamente (Simón y cols., 1999). Lo que supone que la alteración
endometrial propia de los tratamientos farmacológicos utilizados, junto con la
mayor incidencia de alteraciones cromosómicas embrionarias altera el diálogo
inicial entre embrión y endometrio.
La implantación embrionaria no es un hecho puntual, sino que se trata
de un proceso que consta de tres fases consecutivas y diferenciadas. En la fase
de aposición, el blastocisto se orienta hacia una zona determinada de la
superficie luminal de la cavidad endometrial donde posteriormente se fijará. En
la fase de adhesión, el trofoectodermo del blastocisto contacta directamente
con el epitelio endometrial y, en la invasión, el embrión induce la rotura de la
membrana epitelial y penetra en el estroma endometrial decidualizado (Fig. 5).
El estudio de la relación entre el sistema inmune y el sistema reproductor ha
permitido demostrar la función de determinadas citoquinas, factores de
crecimiento y moléculas de adhesión en los órganos del tracto reproductor. De
hecho, el proceso de implantación embrionaria presenta muchas similitudes
con el proceso de migración leucocitaria (Domínguez y cols., 2005), ya que el
leucocito en su migración a través del endotelio presenta unas fases similares a
las del embrión cuando atraviesa el epitelio endometrial e incluso comparten la
funcionalidad de determinados grupos de moléculas como integrinas, selectinas
y tetraspaninas (Domínguez y cols., 2005).
17
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 5. Esquema de las diferentes fases del proceso de implantación. En primer
lugar el embrión se orienta, se aposiciona, se adhiere al epitelio luminal y finalmente
experimenta un proceso de invasión a través del estroma endometrial.
1.3.1. Fase de aposición
La fase de aposición u orientación es la menos estudiada y tiene lugar
entre los días 5 y 6 postovulación, cuando el blastocisto tiene un tamaño
aproximado de 100 μm de diámetro. El blastocisto humano permanece libre en
el lumen uterino, que se ha estrechado, haciéndose prácticamente virtual. El
blastocisto se posiciona habitualmente en una zona determinada del útero que
depende de la especie. En seres humanos, es el fundus uterino y el tercio
superior de la cara posterior uterina. Esto es importante porque va a
determinar la localización de la placenta. El disco embrionario (masa celular
interna), que dará origen al embrión propiamente dicho, también se posiciona
en un lugar específico según la especie. En nuestra especie, se encuentra en la
región donde el trofoblasto se vuelve invasor, al contrario que ocurre en
roedores.
18
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
La salida del embrión de la zona pelúcida o “eclosión”, es un requisito
necesario para la implantación. El embrión es capaz de salir de la zona pelúcida
in vitro (o fuera del endometrio) en lugares ectópicos, lo que indica que no
necesita la interacción con el endometrio para este proceso. Sin embargo, cabe
destacar que en condiciones in vitro, la salida de la zona pelúcida se retrasa al
menos un día en comparación con las condiciones intraútero. Esta rotura no
implica capacidad de adhesión instantánea, sino que debe ser adquirida en un
período que oscila entre minutos y horas. Se desconoce todavía cómo el
blastocisto llega a su lugar final de implantación, pero se cree que puede estar
relacionado con la presencia de receptores de quimoquinas en su superficie
como el CCR2 (receptor de MCP-1) o CCR5 (receptor de RANTES) (Domínguez y
cols., 2003) y puesto que el endometrio secreta multitud de quimoquinas en el
momento de la implantación (Paria y cols., 2002), se piensa que el blastocisto
podría ser atraído por estas quimoquinas hacia el sitio de implantación
(Domínguez y cols., 2005).
1.3.2. Fase de adhesión
En el proceso de implantación, la fase de adhesión es el resultado de los
cambios morfológicos y moleculares en la superficie del trofoblasto y del
endometrio. Es particularmente interesante porque están implicadas la unión
de dos organismos que son genética e inmunológicamente distintos,
concretamente de las superficies apicales de sus epitelios (endometrial y
trofoectodermo) (Enders, 1994). Dicha adhesión está mediada por la inducción
esteroidea (Aplin, 1997) y/o embrionaria (Simón y cols., 1998) de moléculas de
adhesión en la superficie celular del epitelio luminal durante la ventana de
implantación.
19
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Las moléculas de adhesión implicadas en la adhesión célula-célula y en
la adhesión célula-matriz extracelular son cruciales para la unión del
blastocisto al endometrio materno. Así pues, estas primeras interacciones que
mencionábamos anteriormente podrían venir seguidas de eventos de adhesión
mediados por integrinas, cadherinas y selectinas (Domínguez y cols., 2005;
Genbacev, 2003). La expresión de las cadherinas y selectinas también ha sido
descrita en el epitelio endometrial y en el trofoblasto (MacMalman y cols.,
1996). Una de las selectinas descritas como fundamentales para el proceso de
implantación es la L-selectina. La existencia de sus ligandos en el endometrio ha
sido demostrada, así como la existencia de L-selectina en células trofoblásticas
del embrión humano (Genbacev, 2003). Entre las moléculas de adhesión más
relevantes en el proceso de implantación se encuentran las integrinas
implicadas en la fase de adhesión, como la integrina β3, cuya expresión se ve
reducida en mujeres infértiles (Lessey y cols., 1994; González y cols., 2000).
Además, el blastocisto es capaz de aumentar selectivamente la expresión de
esta molécula a través del sistema de la IL-1 (Simón y cols., 1994).
Existen modelos in vitro ampliamente extendidos para estudiar la base
molecular de las interacciones iníciales entre el trofoblasto y el epitelio
endometrial durante la adhesión embrionaria. Estos ensayos consisten en el cocultivo de una monocapa celular confluente de células epiteliales endometriales
humanas con embriones, ya bien sean humanos, de ratón (en un modelo
heterólogo), o con esferoides de la línea celular trofoblástica humana JEG-3. La
adhesión se mide mediante un ensayo mecánico y aquellos embriones flotantes
son clasificados como no adheridos mientras que los no flotantes se consideran
adheridos (Shiotani y cols., 1993).
20
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1.3.3. Fase de invasión
El siguiente paso es la penetración del blastocisto a través del epitelio
endometrial y la invasión del estroma por parte del trofoblasto. En la especie
humana, el blastocisto se adhiere a la capa del epitelio endometrial
comenzando un proceso llamado expansión del trofoblasto que es inducido por
una reacción apoptótica paracrina mediada por el sistema Fas-Fas ligando
(Galán y cols., 2000) que permite al blastocisto atravesar la barrera epitelial.
Posteriormente, el blastocisto se embebe en el estroma y el sitio de entrada en
el epitelio es rápidamente cubierto por fibrina, sobre la cual las células
epiteliales inician un proceso de cierre mediante migración/proliferación
celular con el fin de sellar la superficie epitelial (Aplin, 2007). Este mecanismo
es clave para proteger al endometrio de la entrada de patógenos, así como para
que comience la invasión a través del estroma y tenga lugar una placentación
adecuada.
En la especie humana, la placentación es hemocorial, para ello el
trofoblasto invadirá el estroma y formará las vellosidades coriales en contacto
con las lagunas de sangre maternas, garantizándose la supervivencia fetal. Este
proceso necesita una regulación muy precisa para prevenir posibles invasiones
patológicas por exceso, como ocurre en los casos de placenta ácreta o, por
defecto, como es el caso de la preeclampsia. El control de este proceso invasivo
es mediado por diversas proteasas que degradan matriz extracelular (MEC),
entre ellas las serinproteasas, metaloproteasas y colagenasas.
21
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1.4. El proceso de decidualización
La decidualización es un proceso que experimenta el estroma
endometrial durante la fase secretora media, inmediatamente después del
cierre de la ventana de implantación (King, 2000). Se trata de un proceso
esencial para controlar la invasión del trofoblasto y la formación de la placenta
de forma coordinada. Defectos en este proceso están relacionados con
complicaciones del embarazo, incluyendo aborto, preeclampsia, restricción del
crecimiento fetal y parto prematuro. A diferencia de los roedores, en humanos
la reacción decidual ocurre independientemente de la presencia de un
blastocisto en la cavidad uterina.
Dicho proceso comprende cambios morfogénicos, bioquímicos y
modificaciones vasculares iniciadas por la presencia de progesterona (P)
seguido de un pico de estrógeno (E2) (Ramathal y cols., 2010). Estudios previos
han establecido que la P juega un papel central en regular la decidualización
(Lydon, 1995), el papel del E2 en este proceso parece más secundario. Un
estudio mostró que la administración de P de forma aislada a ratones
ovariectomizados induce la respuesta decidual, indicando que no es necesaria
la presencia de E2 para regular este proceso (Paria y cols., 1998). No obstante
otros estudios han demostrado que la administración de un antagonista del
receptor de E2, severamente dificulta la formación del tejido decidual en ratón,
concluyendo que el E2 actuando vía su receptor regula este proceso (Curtis y
Korach., 2000).
Morfológicamente, las células experimentan una transformación desde
una estructura fibroblástica alargada a células redondeadas y de mayor tamaño
con modificaciones ultraestructurales específicas (Fig. 6). Estos cambios son
22
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
acompañados con la secreción de proteínas específicas de forma local, tales
como prolactina, IGFBP-1 (proteína-1 de unión al factor de crecimiento similar
a insulina), relaxina y factor de tejido celular (Goldsmith y cols., 1993; Daly y
cols., 1983; Giudice y cols., 1992; Lockwood y cols., 2009), además de moléculas
de matriz extracelular como laminina, colágeno tipo IV, fibronectina y
proteoglicano heparin sulfato (Dunn y cols., 2003; Tabanelli y cols., 1992; Irwin
y cols., 1991) (Fig. 7). El inicio de este proceso tiene lugar en las células
estromales que rodean las terminaciones de las arterias espirales.
Figura 6. Esquema de la transformación decidual de los fibroblastos
endometriales. La célula del estroma endometrial fibroblástica experimenta un
cambio morfológico y un incremento en la secreción de citoquinas y hormonas tales
como IGFBP-1 y PRL, por acción de progesterona (P) y estradiol (E2).
La mayor parte del conocimiento sobre los mecanismos de regulación
de la decidualización humana ha sido generado a partir de los sistemas modelo
in vitro. La exposición de los cultivos de células estromales endometriales ESC
(Endometrial Stromal Cells) a progesterona durante 7-9 días, sola o en
combinación con E2, induce el aumento de expresión de marcadores deciduales
(Simón y cols., 1994; Irwin y cols., 1989; Gellersen y Brosens., 2003), así como
una cambio morfológico observable. Esta respuesta es mediada por un aumento
gradual de los niveles intracelulares de AMPc, el cual también es empleado
23
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
como estimulo no-hormonal de la decidualización (Tang y cols., 1993; Brar y
cols., 1997).
Estudios de microarrays con ESC decidualizadas han mostrado una
regulación de muchos genes asociados fundamentalmente con la matriz
extracelular y la integridad del tejido, lo que sugiere que estos cambios son
característicos de este proceso (Popovici y cols., 2000; Brar y cols., 2001). La
regulación génica es solo una parte de la compleja regulación que permite a las
células responder a estos estímulos, tanto a nivel intracelular y como
extracelular. Existen trabajos recientes que usan las tecnologías proteómicas
para entender la decidualización mediante modelos in vitro (Oh y cols., 2008).
En estos trabajos, se detectaron seis picos mediante chips de proteínas H4 y
CM10 con una expresión diferencial entre células ESC no decidualizadas y
decidualizadas inducidas con 8-Br-cAMP (Oh y cols., 2008). Trabajos como el
citado anteriormente no resultaron muy informativos para mejorar el
conocimiento de este proceso biológico. Por ello, un análisis proteómico más
amplio es necesario para entender los mecanismos implicados en el proceso de
decidualización.
1.5. Anexina A2, RhoA y el citoesqueleto de actina
1.5.1. Anexina A2
Las anexinas son una familia de proteínas caracterizadas por su
capacidad para unirse a las membranas biológicas en presencia del ión calcio.
Las anexinas humanas pertenecen a la subfamilia A de las anexinas de los
vertebrados, habiéndose identificado hasta el momento 12 miembros. Se
24
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
designan con el símbolo ANX seguido de un subfijo que indica el número de
anexina, designada de la A1 a la A11 y luego la A13, pues no hay anexina A12
(Morgan y cols., 1999). Desde el punto de vista estructural se caracterizan por
un núcleo formado por cuatro dominios repetitivos homólogos de 68-69
aminoácidos cada uno altamente conservados, precedido de una secuencia
amino-terminal única (Gerke y Moss, 2002) (Fig. 7). Las diversas funciones de
los miembros de la familia vienen conferidas por las divergencias en la
secuencia del núcleo central y por el dominio amino-terminal único.
Las anexinas se han implicado en un amplio espectro de procesos
celulares y moleculares, que incluyen la transducción de señales a través de la
tirosina quinasa, el mantenimiento de la integridad del citoesqueleto y la matriz
extracelular, procesos de exocitosis y endocitosis, el crecimiento y la
diferenciación tisulares, la inflamación y la coagulación sanguínea (Gerke y
Moss, 2002). Aunque in vitro se les han asignado una gran variedad de
funciones, todavía se desconoce cuál es el papel fisiológico concreto de cada
anexina.
Anexina A2 (ANXA2), proteína de unión a fosfolípidos dependiente de
calcio, ha sido asociada con los filamentos de actina, participando en el
mantenimiento de la dinámica de las interacciones membrana-membrana y
membrana-citoesqueleto (Hayes y cols., 2006). ANXA2, reclutada en los sitios
de unión de actina a la membrana celular, es capaz de unirse a actina globular
(G-actina) o filamentosa (F-actina) inhibiendo la elongación de los filamentos a
nivel de los extremos terminales (Filipenko y Waisman, 2001; Rescher y Gerke,
2004). Por lo tanto, esta proteína ha sido ligada a procesos donde se produce un
remodelado de la actina a nivel de las membranas celulares, tal y como ocurre
durante el recrutamiento de ciertos receptores de membrana o durante la
25
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
formación de los tallos de actina en los macropinosomas móviles (Merrifield y
cols., 2001; Oliferenko y cols., 1999). Estas funciones se encuentran
probablemente ligadas a la organización dinámica de los microdominios de
membrana ricos en colesterol donde ANXA2 puede ser recrutada mediante
interacción directa con fosfatidilinosil (4,5)-bifosfato (Hayes y cols., 2006;
Rescher y cols., 2004).
Figura 7. Anexina A2. (A) Estructura tridimensional de la proteína anexina A2. (B)
Esquema de la estructura primaria formada por un extremo N-terminal donde se
localizan los sitios de fosforilación y de unión a otras proteínas, y su extremo C-terminal
que es altamente conservado en las diferentes anexinas. (C) Tabla donde se recogen las
diferentes anexinas que constituyen la familia.
Un estudio reciente ha demostrado que ANXA2 es fosforilada a partir de
la acción tirosin quinasa del receptor de la insulina y se haya ligado a un
reordenamiento en la actina, implicados en cambios que se producen a nivel de
adhesión celular (Rescher y cols., 2008). ANXA2 mediante la regulación del
citoesqueleto de actina, también se encuentra implicada en la regulación de la
26
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
migración celular (Hansen y cols., 2002). Existen estudios que han sugerido que
esta proteína afecta a la motilidad celular, mediante el trabajo con líneas
celulares de carcinoma (Balch y Dedman., 1997; Barwe y cols., 2005). Otros
estudios sugieren que la ANXA2 superficial regula la migración a través de
interacciones con proteínas de la matriz extracelular tipo tenascina C (Chung y
cols., 1996; Matsuda y cols., 1999). Además, se observó que al inhibir ANXA2 en
células epiteliales Caco-2 se producen reducciones significativas en la
migración celular asociados con una disminución en la formación de filamentos
de actina en la base de estas células (Babbin y cols., 2007).
1.5.2. RhoA
Las proteínas Rho son miembros de una gran familia de pequeñas
proteínas de unión al GTP que comparten aproximadamente el 30% de
homología en la secuencia con la proteína Ras. Las proteínas GTPasas pueden
encontrarse en dos conformaciones: unidas a GTP o a GDP, el estado unido a
GTP es el activo y el capaz de realizar una función determinada o de señalizar
hacia una ruta concreta. La proteína tiene capacidad GTPásica, es decir, de
hidrolizar el GTP a GDP, quedando en este caso en estado inactivo. La unión a
cada tipo de guanínnucleótido o la actividad GTPásica están modulados por
otras proteínas reguladoras (Fig. 8), que se pueden clasificar en GEFs (guanine-
nucleotide-exchange-factors), que promueven el intercambio de GDP por GTP,
estabilizan la forma unida a este último y activan, por tanto, a la GTPasa; GAPs
(GTPase-activating proteins), que estimulan la actividad GTPásica intrínseca de
la proteína, de forma que ésta hidroliza su GTP a GDP y queda inactiva; y GDIs
(guaninenucleotide-dissociation-inhibitors), que al impedir la separación de la
proteína de la molécula de GDP, estabilizan su forma inactiva. Las GTPasas tipo
Ras se anclan en la membrana mediante un grupo farnesilo o isoprenilo que se
27
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
añade posttraduccionalmente por enzimas prenil- o farnesil-transferasas. Las
proteínas GDIs, además de estabilizar la forma unida a GDP de la GTPasa, son
capaces de extraerla de la membrana en la que se encuentra anclada mediante
unión con el grupo isoprenoide C-terminal, con lo que la GTPasa, separada de
su lugar de acción, queda inactivada (LaMarche y Hall, 1994; Feig, 1994; Chant
y Stowers, 1995; Gooser y cols., 1997).
Figura 8. Modelo de regulación de Rho GTPasas. Las proteínas RhoA actúan como
transductores de señales, respondiendo a una gran variedad de estímulos externos a
través de la activación de diferentes receptores de membrana. Están regulados por
GEFs (factor intercambiador de guanin nucleótidos) y GAP (proteínas activadoras de la
actividad GTPasa). RhoA unido a GDP constituye la forma inactiva, mientras que, Rho
unido a GTP constituye la conformación activa que es capaz de unirse a diversos
efectores celulares, regulando así variadas funciones celulares.
28
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Existen moléculas que actúan a través de diferentes receptores, tales
como NgR1, LINGO1, p75, TROY provocando la estimulación de RhoA. RhoA
activa a ROCK (quinasa RhoA) la cuál estimula a quinasa LIM, que activa a su
vez a cofilina, la efectora que actúa reorganizando el citoesqueleto de actina
(Kiss y cols., 1997). Los miembros de la familia Rho y sus efectores se han
descrito controlando procesos tan variados como la proliferación, migración,
adhesión, motilidad celular, los cambios morfológicos, la apoptosis, el
transporte de vesículas o el transporte núcleo-citoplasma (Boguski y
McCormick, 1993; Hall, 1990; Ridley y Hall, 1992). Estas funciones
desarrolladas en las células se encuentran primariamente relacionadas con la
regulación de la organización del citoesqueleto. Estudios han demostrado una
participación indirecta, a través de factores asociados, en la fosforilación de la
miosina y en respuesta al estrés celular, tales como la formación de adhesiones
focales y fibras de estrés de actina (Fujita y cols., 1992). También se ha
demostrado la existencia de una relación directa con elongación de la cadena de
miosina, reorganización de los filamentos de actina y la determinación de la
forma celular (Zhang y cols., 1998).
Existen trabajos donde se describe que las Rho GTPasas se encuentran
implicadas en cascadas de señalización locales que regulan los primeros pasos
del proceso de implantación a nivel de la adhesión (Heneweer y cols., 2002) y la
migración celular del trofoblasto (Shiokawa y cols., 2002). Además las Rho
GTPasas regulan la invasión del embrión humano sobre el estroma endometrial
(Grewal y cols., 2008) a través de la modulación de la dinámica de la actina,
miosina y los microtúbulos (Ettiene-Manneville y Hall, 2002). Resulta muy
interesante destacar la existencia de trabajos donde se relaciona la ruta de
acción de RhoA/ROCK con la expresión de ANXA2, ambos regulando cambios
que tienen lugar a nivel del citoesqueleto de actina que se asocia con el control
29
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
de la adhesión celular (Rescher y cols., 2008; Babbin y cols., 2007; Babiychuk y
cols., 2002).
1.5.3. El citoesqueleto de actina
El citoesqueleto es una red tridimensional de filamentos que contribuye
a la integridad de la célula. Define la forma y arquitectura celular, permite el
movimiento y transporte intracelular, media procesos de endocitosis y
exocitosis, participa activamente en la mitosis y en los procesos de modulación
de receptores de superficie, favorece la organización funcional por
compartimentos, participa en los procesos de interacciones intercelulares y
regula procesos de adhesión, migración y motilidad celular (Small y cols., 1999;
Badley y cols., 1980; Wehrle-Haller y Imhof, 2003; Moustakas y cols., 1998).
El citoesqueleto está compuesto por 3 tipos principales de estructuras:
microtúbulos, filamentos intermedios y microfilamentos (Fig. 9).
Microtúbulos
Los microtúbulos son estructuras tubulares de 25 nm de diámetro que se
originan en los centros organizadores de microtúbulos y que se extienden a lo
largo de todo el citoplasma. Se hallan en las células eucariotas y están formados
por la polimerización de un dímero de dos proteínas globulares, la alfa y la beta
tubulina. Cada microtúbulo está compuesto de 13 protofilamentos formados
por los dímeros de tubulina. Se pueden polimerizar y despolimerizar según las
necesidades de la célula. Intervienen en diversos procesos celulares que
involucran desplazamiento de vesículas de secreción, movimiento de
orgánulos, transporte intracelular de sustancias, así como en la división celular
30
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
(mitosis y meiosis), ya que forman el huso mitótico. Además, constituyen la
estructura interna de los cilios y los flagelos. Los microtúbulos son más flexibles
pero más duros que la actina.
Filamentos intermedios
Son filamentos que tienen entre 8 a 11 nm y están constituidos por
diferentes proteínas, dependiendo del tipo celular donde se encuentren:
citoqueratina, vimentina, neurofilamentos, desmina y la proteína fibrilar acídica
de la glia. Son los componentes del citoesqueleto más estables, ya que dan
soporte a los orgánulos a través de sus fuertes enlaces, y heterogéneos. Su
función principal es la organización de la estructura tridimensional interna de
la célula, por ejemplo, forman parte de la envuelta nuclear y de los sarcómeros.
También participan en algunas uniones intercelulares, formando los
desmosomas.
Figura 9.
Inmunofluorescencia mostrando la ubicación y disposición de los
elementos que constituyen el citoesqueleto de una célula eucariota. (A)
Microtúbulos. (B) Filamentos de queratina. (C) Microfilamentos de actina.
31
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Microfilamentos
Los microfilamentos tienen un diámetro de unos 5 ó 7 nanómetros y
están formadas por polímeros de actina que junto con un gran número de
proteínas asociadas y proteínas de unión a la actina constituyen el
citoesqueleto de actina. La actina puede presentarse en dos formas, por un lado
la actina no polimerizada en forma globular (G-actina) que se encuentra
asociada a la profilina para evitar su polimerización. Esta forma representa
aproximadamente la mitad de la actina de la célula y es utilizada para la
polimerización de microfilamentos cuando es necesario. Y por otro lado, la
actina polimerizada en forma filamentosa (F- actina), se trata de una doble
hélice dextrógira de dos hebras de actina no polimerizada. Esta actina se puede
encontrar asociada a otras proteínas, tal como estructurales, que permiten la
unión de los filamentos de actina; o a proteínas reguladoras, siendo la más
importante la miosina que permite la contracción muscular al permitir que la
actina se desplace sobre ella.
Los monómeros de G-actina se polimerizan en un proceso dependiente
de ATP, para formar el polímero de F-actina. Los microfilamentos son
estructuras altamente dinámicas, cuyo ensamblaje está regulado a múltiples
niveles, incluida la organización monomérica de la actina dentro del polímero y
la superorganización de los polímeros de actina en una red de filamentos. Un
gran número de proteínas de unión a la actina regulan el ensamblaje y
controlan la formación de los filamentos y el entrecruzamiento de la red de
actina. Las funciones de estas proteínas son moduladas por moléculas
señalizadoras como el calcio o los fosfoinosítidos fosforilados (Schmit y Hall,
1998; Janmey, 1994; Martín, 1998).
32
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Los filamentos de actina poseen gran importancia en todos los procesos
de migración y adhesión celular (Badley y cols., 1980; Wehrle-Haller y Imhof,
2003). También juegan un papel importante en la división celular, pues forman
el anillo de contracción que permite el estrangulamiento celular durante la
citoquinesis (Schmidt, 1980). Otra función importante tiene lugar en el tejido
muscular, donde los filamentos de actina se hayan asociados a proteínas
motoras denominadas "miosinas", provocando la contracción del músculo en
un proceso mediado por calcio (Strzelecka-Golaszewska y cols., 1984).
Las funciones del citoesqueleto de actina están moduladas por vías de
señalización que responden a estímulos que inciden sobre la membrana
plasmática (Schmit y Hall, 1998). En este sentido, el estudio de las moléculas
que son componentes de las vías de señalización celular tales como la
superfamilia de proteínas Ras, dentro de las cuales se incluye la familia de
proteínas Rho, resulta de particular interés. Las Rho-GTPasas participan en la
regulación de la organización del citoesqueleto de actina, están envueltas en
vías de señalización que activan cascadas de quinasas que regulan la expresión
génica y controlan la progresión del ciclo celular y la proliferación celular
(Khorravi-Far y cols., 1998; Nobes y cols., 1995). Por otro lado también resulta
interesante, estudiar proteínas como anexina A2 que también participan en la
modulación de la dinámica el citoesqueleto de actina, mediante el anclaje de los
filamentos entre sí o a la membrana plásmatica (Merrifield y cols., 2001;
Oliferenko y cols., 1999).
El citoesqueleto de actina, y su remodelación tiene un papel fundamental
en muchos procesos que tienen lugar en el endometrio. Como hemos citado
anteriormente, el endometrio es un órgano activo y dinámico, que desarrolla
temporalmente un estado en el que se permite la adhesión del cigoto o
33
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
blastocisto, para posibilitar la implantación. En este proceso se producen toda
una serie de cambios que se materializan a nivel morfológico y molecular. Las
células endometriales epiteliales experimentan cambios estructurales que
modifican su membrana celular, desencadenados por la reestructuración del
citoesqueleto (Thie y cols., 1995; Martin y cols., 2002). Existen muchas
evidencias que indican la relevancia de la interacción de los elementos del
citoesqueleto y la membrana plasmática en el desarrollo del estado de
receptividad (Hitt y Luna, 1994; Murphy, 1995; Thie y cols., 1997). Estos
estudios han empleado agentes despolimerizantes de actina, como citocalasina
D, determinando que una reorganización del citoesqueleto es necesaria para
generar una despolarización en las células epiteliales endometriales, y por
tanto, para permitir la adhesividad del trofoblasto (Thie y cols., 1997). La
reorganización del citoesqueleto de actina también resulta clave para que tenga
lugar el proceso de decidualización que sufren las células estromales
endometriales. La manipulación de la dinámica de la actina mediante el empleo
de drogas tales como jasplaquinolida o latrunculina B, alteran de forma
llamativa este proceso (Ihnatovych y cols., 2009). Estudios de este tipo
corroboran la importancia de una remodelación activa del citoesqueleto de
actina para inducir la decidualización.
1.6. Proteómica del endometrio
Recientemente, se han producido grandes avances en la genómica del
endometrio mediante el uso de la tecnología de microarrays y la bioinformática,
que proporciona una amplia cantidad de información sobre la expresión génica
(Horcajadas y cols., 2007). Pero la expresión génica es solo un aspecto de la
compleja regulación que permite a las células responder a señales
34
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
intracelulares y extracelulares. La próteomica es considerada como el siguiente
paso en el estudio de los sistemas biológicos.
La proteómica estudia y caracteriza todo el conjunto de proteínas
expresadas desde el transcriptoma. El termino proteómica fue acuñado en 1997
como una analogía con la genómica, el estudio de los genes (James, 1997). La
palabra "proteoma" es la fusión de "proteína" y "genoma", y fue acuñada por
Marc Wilkins (Wilkins y cols., 1994). El proteoma es la dotación completa de
proteínas producidas por un organismo o sistema. La descripción del proteoma
permite tener una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas, en un
momento dado y bajo determinadas condiciones concretas de tiempo y
ambiente. El estudio y comparación del proteoma en diferentes situaciones
biológicas, permite identificar aquellas proteínas cuya presencia, ausencia o
alteración se correlaciona con determinados estados fisiológicos y/o
patológicos. Unos de los objetivos clave es emplear esta estrategia con el fin de
identificar nuevos marcadores para el diagnóstico de estados fisiológicos o
patológicos, y en la identificación de nuevos fármacos.
La proteómica es una ciencia relativamente reciente ya que para su
consolidación definitiva, ha sido necesario el desarrollo de la espectrometría de
masas como método de identificación de proteínas gracias a los métodos de
ionización suaves como la electronebulización (ESI) y la desorción/ionización
mediante láser asistida por matriz (MALDI). También fue fundamental el
crecimiento exponencial en el número de entradas correspondientes a genes
y/o proteínas en las bases de datos (Siuzdak, 1994). Esto, combinado con el
empleo de potentes métodos de fraccionamiento y separación de péptidos y
proteínas como el electroforesis de poliacrilamida de dos dimensiones (2D-
PAGE) (Weiss y Görg, 2009) y la cromatografía líquida de alta resolución HPLC
35
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
(Berkowitz, 1989), ha permitido consolidar la proteómica, desde mediados de
los años 90 del siglo pasado, como ciencia para el análisis masivo de proteínas.
Podemos distinguir tres disciplinas que constituyen la proteómica:
metodologías de separación, técnicas analíticas de espectrometría de masas y la
bioinformática (Fig. 10).
Figura 10. Estrategias de análisis proteómico. Los extractos proteícos obtenidos a
partir de muestras biológicas, pueden ser separados mediante electroforesis (2D-DIGE)
o cromatografía líquida (HPLC) y analizados mediante espectrometría de masas:
MALDI-TOF/TOF o ESI-Trampa iónica. Alternativamente también se puede llevar a
cabo un análisis proteómico parcial mediante array de proteínas. Finalmente todos los
datos fruto de estos análisis se interpretan con el uso de herramientas bioinfórmaticas.
36
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
1.6.1. Metodologías de separación
Las proteínas celulares deben extraerse de las muestras (tejido, células,
fluidos biológicos, etc.), previo a la aplicación de cualquier metodología
separativa.
El
proceso
de
extracción
contempla
aspectos
como
la
homogenización de células y tejidos; la solubilización de las proteínas mediante
detergentes como 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato
(CHAPS), Tween y dodecilsulfato sódico (SDS) y agentes reductores como
ditiotreitol (DTT); la desnaturalización de las proteínas mediante urea/tiourea,
compuestos que rompen los enlaces responsables de las estructuras secundaria
y terciaria, y la adición de enzimas que degraden los ácidos nucleicos coextraídos (DNAsas y RNAsas).
Las compleja mezcla de proteínas, o la de sus correspondientes péptidos,
debe ser separada en sus componentes para que éstos puedan ser identificados
y caracterizados. Para este fin se emplean fundamentalmente dos abordajes:
electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) y la cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC).
Electroforesis bidimensional: 2D-DIGE
Mediante la electroforesis bidimensional (2-DE) es posible separar
extractos proteicos complejos en sus componentes en función de su punto
isoeléctrico (pI) y su masa molecular (Görg y cols., 2004). A pesar de las
limitaciones de la técnica, fundamentalmente en lo que respecta a la
solubilización de proteínas integrales de membrana y la exclusión de proteínas
con valores extremos de pI y masa molecular, esta metodología posibilita la
37
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
separación de miles de proteínas partiendo de mezclas proteínas (Görg y cols.,
2004).
Debido a la escasa reproducibilidad de la técnica 2-DE que dificulta su
adaptación al trabajo cuantitativo, esta técnica se ha perfeccionado mediante el
marcaje con agentes fluorescentes de las proteínas que van a ser separadas.
Esta metodología, llamada 2D-DIGE (electroforesis diferencial bidimensional en
gel) permite el análisis cuantitativo de varios extractos en un mismo gel (Unlü y
cols., 1997). Para ello, los extractos a comparar son marcados con diversos
agentes fluorescentes, mezclados y separados mediante 2-DE (Fig. 11). La
utilización de las frecuencias de excitación apropiadas permite la obtención de
las correspondientes imágenes, que son procesadas mediante un software
específico capaz de revelar diferencias correspondientes a expresión diferencial
con una determinada significación estadística. El marcaje con agentes
fluorescentes posee una linealidad analítica de 5 órdenes de magnitud y su
límite de detección se sitúa por debajo del nanogramo de proteína, además,
resulta totalmente compatible con el posterior análisis mediante MS.
38
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 11. Esquema de la aplicación de la tecnología 2D-DIGE. Los extractos
proteicos se marcan con los diferentes fluoróforos: Cy3, Cy2 y Cy5, se mezclan y se
someten a la separación por electroforesis bidimensional (2-DE). Tras ello, las
imágenes de los geles son escaneadas y se hace un análisis usando un software
informático.
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) posibilita la
separación de proteínas y péptidos en función de su afinidad por una fase
estacionaria contenida en una conducción capilar cuando se fuerza el paso de
una fase móvil a través del sistema. Para la separación de péptidos o proteínas
mediante HPLC se emplean diversas fases estacionarias (por ejemplo inversa,
de intercambio iónico y de afinidad). El acoplamiento de distintos sistemas de
separación de péptidos o proteínas en lo que se denominan sistemas de
cromatografía multidimensional proporciona una metodología especialmente
poderosa; en concreto, la cromatografía bidimensional basada en la
39
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
combinación del intercambio iónico y fase inversa a mostrado una inigualable
capacidad de separación de mezclas complejas de péptidos de forma
completamente automática y con gran resolución (Josic y Clifton, 2007).
1.6.2. Técnicas analíticas: espectrometría de masas
Las manchas de proteínas separadas mediante electroforesis o las
proteínas en solución separadas mediante cromatografía líquida, son sometidas
a un análisis posterior mediante espectrometría de masas (MS) y la
identificación de las correspondientes proteínas mediante búsqueda en las
bases de datos. El análisis de proteínas mediante espectrometría de masas ha
sido posible gracias al desarrollo de varios métodos de ionización suaves para
convertir biomoléculas grandes, polares y no volátiles en iones en fase gaseosa.
Los espectrómetros de masa están formados por una fuente de ionización, un
analizador de masas y un detector que mide la relación masa/carga de los iones
en fase gaseosa. La mayor parte de los dispositivos se basan en el acoplamiento
de la ionización tipo desorción/ionización mediante láser asistida por matriz
(MALDI) a un analizador de tiempo de vuelo (TOF) en tándem o en la ionización
mediante electronebulización (ESI) acoplada a trampas iónicas lineales o
cuadrupolares (Aebersold y Mann, 2003).
El abordaje más empleado consiste en la conversión de los péptidos en
iones en fase gaseosa mediante técnicas de ionización suave: MALDI o ESI, y a
continuación se lleva a cabo el análisis de los iones según su relación
masa/carga en un analizador de masas: tipo TOF o trampa iónica. Tras ello, se
emplean algoritmos específicos para identificar las proteínas de las que
provienen los péptidos analizados mediante MS a través de la búsqueda en
bases de datos de proteínas (Henzel y cols., 1993). Se usa la posibilidad de
40
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
fragmentar los iones peptídicos seleccionados mediante descomposición
metaestable o mediante disociación inducida por colisión (CID) llevado a cabo
por un espectrómetro de masas en tándem combinando dos analizadores
diferentes (MS/MS). Dado que esta fragmentación es específica de cada
secuencia peptídica, los datos provenientes de MS/MS no sólo mejoran
notablemente la búsqueda en las bases de datos, sino que también permiten la
secuenciación de novo y la caracterización de modificaciones posttraduccionales.
1.6.3. Bioinformática
Estas nuevas disciplinas se caracterizan por la ingente cantidad de
información que producen, por ello, la bioinformática hace que los datos
obtenidos por la proteómica puedan ser analizados e interpretados
(Quackenbush, 2006b). La bioinformática trata de un instrumento en continua
evolución, con creación de buscadores, bancos de datos y métodos de búsqueda
cada vez más avanzados en la identificación de proteínas de cualquier origen.
Los
datos
obtenidos
se
combinan
a
través
de
herramientas
bioinformáticas para la búsqueda de proteínas no redundantes en las bases de
datos. Existe una amplia variedad de plataformas informáticas que usan los
datos de espectrometría de masas para identificar proteínas a partir de la
secuencia primaria que se encuentra en las bases de datos.
41
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Algunas de estas herramientas bioinformáticas son:
Mass Search (ETH) (cbrg.inf.eth.ch);
PeptideSearch (EMBO) (www.mann.embl-heidelberg.de);
Mascot (Matrix Science) www.matrixscience.com ;
PepFrag, ProFound (Rock) (prowl.rockefeller.edu);
Mowse (Hum. Gen. Res. Cent.) (www.seqnet.dl.ac.uk);
SEQUEST (UW, Seattle) (fields.scripps.edu/sequest).
Para llevar a cabo una búsqueda en las bases de datos se escogen los
parámetros más relevantes como el tipo de enzima proteasa utilizada o el error
que permitimos para dicha búsqueda. La base de datos identifica a las
proteínas, ya sea empleando las masa de péptidos intactos registrados en la
correspondiente huella peptídica de masa, o la de sus fragmentos, medidas
mediante MS en tándem (MS/MS). Se otorga una puntación a la búsqueda y se
determina con que fiabilidad se ha determinado la proteína en cuestión
(puntuaciones mayores a 80 se suelen considerar significativas (P ≤ 0.05)).
1.6.4. Arrays de proteínas
Los arrays de proteínas constituyen una estrategia novedosa en
proteómica, que no se pueden clasificar ni en técnicas separativas ni analíticas.
Se fundamentan en la unión específica de las proteínas a diferentes sustratos.
Los arrays de proteínas consisten una matriz plana, que puede ser de distintos
materiales, en los que los anticuerpos, péptidos, proteínas o complejos
extractos proteicos pueden inmovilizarse en diferentes puntos para capturar la
presencia de proteínas específicas (Habb y cols., 2001). Mediante el escaneado
de estas matrices de puntos, donde cada punto corresponde a una unión
específica (por ejemplo, antígeno-anticuerpo) podemos analizar diferencias
42
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
cuantitativas en abundancia de cada proteína. Una de las ventajas
fundamentales de esta tecnología es su capacidad para medir cientos de
proteínas simultáneamente usando pequeños volúmenes tanto de las muestras
clínicas o biológicas a analizar, como de los anticuerpos.
Los arrays de proteínas representan plataformas proteómicas guiadas, que
disponen de ciertas ventajas sobre tecnologías de proteómica no guiadas,
basadas en separaciones electroforéticas bidimensionales y de espectrometría
de masas. Tales ventajas son principalmente la alta rentabilidad y
reproducibilidad, así como la alta precisión y sensibilidad de las mediciones.
Sin embargo, el número de mediciones simultáneas que pueden realizarse a
nivel práctico depende de la disponibilidad de anticuerpos con alta afinidad y
especificidad disponibles para la caracterización de cada una de las proteínas
diana a medir (Kingsmore, 2006).
Mediante esta aproximación analizamos un conjunto definido de proteínas
expresadas en nuestra muestra biológica, es decir, se hace un estudio
proteómico a nivel parcial. Podemos trabajar con arrays que contengan
proteínas relacionadas funcionalmente. Ello resulta de gran utilidad por
ejemplo, para poder evaluar una ruta biológica concreta o analizar el conjunto
de proteínas que son secretadas (secretómica parcial). Este abordaje permite
diseños experimentales que responden a hipótesis específicas, así como, la
interpretación biológica de los resultados obtenidos.
43
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Figura 12. Aplicación de las tecnologías proteómicas en el proceso de
implantación embrionaria. El estudio del proteoma a partir de diferentes muestras
biológicas (biopsia o fluido endometrial, blastocistos o medio de cultivo de blastocistos)
nos permite mejorar el entendimiento de procesos complejos, como la implantación
embrionaria. Además las proteínas identificadas con expresión diferencial pueden ser
usadas como marcadores de la adquisición de la receptividad endometrial, la viabilidad
embrionaria, así como, para identificar causas de enfermedad o posibles interceptivos.
Todo este conjunto de estrategias proteómicas se pueden aplicar en el
estudio del proceso de implantación, estudiando tanto el tejido endometrial
como el embrión, así como para el análisis del líquido presente en la cavidad
uterina (Fig. 12). Se han llevado a cabo un par de intentos iníciales para
identificar
biomarcadores
del
proceso
de
receptividad
endometrial,
comparando el endometrio proliferativo con el secretor (De Souza y cols., 2005;
44
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
Parmar y cols., 2009). Los distintos trabajos realizados sobre el proteoma
endometrial se han basado en el análisis de muestras recolectadas en diferentes
momentos del ciclo menstrual, han usado técnicas proteómicas distintas y con
tamaños muéstrales reducidos, estas razones hacen que no sean cruciales para
sacar conclusiones. No obstante, con el conocimiento aportado, se deduce que
la aplicación de la proteómica parece ser un buen método para obtener
biomarcadores de receptividad endometrial que permitan caracterizar dicho
proceso y obtener un método objetivo para la evaluación de la receptividad
uterina, así como, usar esta información para identificar posibles causas de
infertilidad o usar estos marcadores como interceptivos del proceso de
implantación.
45
_______________________________________________________________________________1. INTRODUCCIÓN
46
_____________________________________________________________________________________2. HIPÓTESIS
2. HIPÓTESIS
47
_____________________________________________________________________________________2. HIPÓTESIS
48
_____________________________________________________________________________________2. HIPÓTESIS
2. HIPÓTESIS
Durante el periodo de receptividad endometrial se producen una serie
de cambios a nivel morfológico y molecular, conducentes a la transformación a
un fenotipo capaz de permitir la adhesión del embrión al endometrio materno.
La hipótesis de partida de la presente tesis doctoral es que el
proteoma, es decir el conjunto de proteínas presentes en el endometrio,
es un nuevo campo cuyo conocimiento y caracterización puede ser
utilizado para mejorar el entendimiento de este proceso.
49
_____________________________________________________________________________________2. HIPÓTESIS
50
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
3. OBJETIVOS
51
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
52
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos generales
•
Comparar el proteoma del endometrio humano en la fase receptiva
respecto a la pre-receptiva, identificando y cuantificando el repertorio
•
de proteínas diferencialmente expresadas.
•
secretadas durante el proceso de decidualización in vitro.
Determinar el patrón de proteínas expresadas intracelularmente y
Investigar la implicación de anexina A2, actuando a través de RhoA,
sobre la receptividad endometrial humana.
3.2. Objetivos específicos
a) Estudiar comparativamente el proteoma del endometrio receptivo
respecto al pre-receptivo mediante la técnica separativa DIGE e
identificando las proteínas mediante MALDI/TOF.
b) Usar un modelo de endometrio refractario para caracterizar la
importancia funcional de dos proteínas clave: estatmina 1 y anexina
A2, en la receptividad endometrial.
c) Estudiar el proteoma de células estromales decidualizadas in vitro
mediante DIGE y MALDI/TOF.
d) Estudiar el secretoma a partir del medio condicionado de células
estromales decidualizadas in vitro mediante un array de proteínas.
e) Generar el interactoma de la decidualización humana, integrando los
datos proteómicos y secretómicos, junto con la información genómica
pública disponible.
53
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
f) Localizar la proteína anexina A2 y RhoA en el endometrio humano
durante el ciclo menstrual.
g) Estudiar la expresión a nivel de proteína de anexina A2, RhoA total y
la RhoA activo en el endometrio humano durante el ciclo menstrual.
h) Demostrar la funcionalidad de anexina A2 y RhoA sobre la fase de
adhesión de la implantación embrionaria.
i) Estudiar el papel de anexina A2 sobre la expansión del trofoblasto.
j) Determinar la función de anexina A2 sobre la capacidad de
migración/proliferación de las células epiteliales endometriales.
k) Estudiar la posible relación entre anexina A2 y RhoA.
l) Analizar el papel de anexina A2 y RhoA en la remodelación del
citoesqueleto de actina.
54
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4. MATERIAL Y MÉTODOS
55
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
56
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1. Muestras biológicas
4.1.1. Criterios de inclusión
El material biológico de origen humano empleado en este estudio esta
formado por un total de 79 biopsias endometriales de mujeres diferentes, en
distintos días del ciclo menstrual.
Las mujeres reclutadas para los estudios eran de raza caucásica, sanas, con
edad comprendida entre 18 y 39 años y con un índice de masa corporal normal
(IMC) de entre 19–25 kg/m². Se trataron de mujeres fértiles, asumiéndose
como fertilidad probada el haber tenido embarazos previamente. Estas mujeres
no presentaban ninguna patología endometrial y presentaban ciclos
menstruales regulares entre 25 y 33 días. Ninguna de estas mujeres recibió
tratamiento hormonal en los tres meses precedentes a la realización de la
biopsia.
•
Muestras para proteómica de la receptividad endometrial.
Las mujeres que participaron en el primer estudio fueron voluntarias,
reclutadas específicamente y compensadas económicamente. A partir del día
10 del ciclo menstrual se realizó el control ecográfico. Con folículos de 16 mm
se inició la determinación de LH en suero o en orina diaria. Se asumió un pico
de LH según los valores que se obtuvieron durante las distintas
determinaciones y se consideró el día del pico como día 0. A partir de entonces
57
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
se tomó la biopsia, 2 y 7 días después, siendo considerado ese día como LH+2 o
LH+7, respectivamente. Para la medición de la LH urinaria se empleó un kit
comercial predictor de la ovulación (Donacheck ovulación, Novalab Ibérica,
S.A.L, Coslada, Madrid, España), y para la medición de la LH sérica se utilizó
otro kit comercial (LH reactiva abbot laboratorios axsym system).
Se seleccionó un set de muestras para ser analizadas comparativamente
mediante técnicas proteómicas. Las biopsias endometriales se obtuvieron a
partir de ocho mujeres durante su mismo ciclo menstrual, en fase pre-receptiva
(LH+2) y en fase receptiva (LH+7), resultando una n de 16 muestras. Este
diseño permitió reducir la variabilidad interpaciente.
Adicionalmente, otras ocho muestras endometriales (4 muestras LH+2 y 4
muestras LH+7) se recogieron a partir de ocho donantes diferentes para
confirmar los resultados de la aplicación de las técnicas proteómicas fuera del
set de muestras de estudio descrito anteriormente.
Para llevar a cabo el estudio funcional de algunas de las proteínas
desreguladas en receptividad endometrial, se seleccionaron tres mujeres con
endometrio refractario inducido por la inserción de un dispositivo intrauterino
(DIU). Tres biopsias endometriales se tomaron a la misma paciente en fase
receptiva LH+7 antes de la inserción del DIU, en su presencia y tres meses
después de su retirada (Horcajadas y cols., 2006). La n total fue de 9 muestras.
58
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
•
Muestras para próteomica de la decidualización
Para el segundo objetivo, basado en el análisis proteómico de células
estromales endometriales (ESC, Endometrial stromal cells) inducidas al proceso
de decidualización in vitro, se emplearon un total de 16 biopsias endometriales.
Las muestras fueron tomadas a partir de donantes en el día de la extracción
ovocitaria (día 15 del ciclo menstrual).
•
Muestras para el estudio de Anexina A2 y RhoA en implantación
Para el tercer objetivo sobre el papel de ANXA2 y RhoA en la implantación
embrionaria, se usaron células epiteliales endometriales humanas (hEEC,
Endometrial epithelial cells) obtenidas a partir de 30 biopsias endometriales.
Las muestras procedían de donantes en el día de la extracción ovocitaria (día
15 del ciclo menstrual).
Adicionalmente, se emplearon 12 muestras endometriales recogidas a lo
largo del ciclo menstrual y se incluyeron en parafina. Dichas muestras se
distribuyeron en cuatro grupos (n=3 en cada grupo) según la fase del ciclo
menstrual: proliferativa (P)(días 1-14); secretora temprana (STE)(días 15-18);
secretora media (SM)(días 19-22); y secretora tardía (STA)(días 23-28); de
acuerdo a los criterios de Noyes (Noyes y cols., 1975).
Consentimiento informado
Antes de la recogida de cualquier tipo de muestra, se obtuvo el
consentimiento escrito de la paciente previa aprobación por el comité ético del
Instituto Valenciano de la Infertilidad (IVI). Anexo II.
59
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1.2. Obtención de las muestras
Todas las biopsias endometriales se tomaron del fundus uterino usando
una pipelle de Cornier (Genetics, Namont-Achel, Belgium) en condiciones de
esterilidad. El procedimiento tuvo una duración estimada de 5-10 segundos.
Las muestras se lavaron con tampón salino (PBS) para eliminar restos de moco
y sangre.
Las biopsias usadas en el estudio de la proteómica de la receptividad
endometrial se congelaron directamente a -80°c para su posterior análisis.
Mientras que, las muestras empleadas en el estudio de la proteómica de la
decidualización y el estudio de ANXA2 y RhoA se sometieron al protocolo de
separación de la fracción estromal y epitelial.
Para los posteriores análisis histológicos un pequeño fragmento (1/4
parte) de la biopsia endometrial se separó y se incluyó en parafina.
4.1.3. Separación fracción epitelial y estromal
Todo el procedimiento celular se llevó a cabo en condiciones de
esterilidad para evitar cualquier tipo de contaminación por agentes externos.
Por lo tanto, se procedió a la recogida y procesamiento de la muestra con
material esterilizado y en campana de flujo laminar, dentro de zonas de cultivo
celular asépticas.
La disgregación mecánica se realizó con bisturís, limpiando el moco y
sangre de la muestra, y troceándola cuidadosamente hasta alcanzar fragmentos
menores 1 mm. Tras la disgregación mecánica se llevó a cabo la disgregación
60
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
enzimática con la enzima colagenasa tipo IA (Sigma-Aldrich, Madrid, España)
diluida en medio de cultivo DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s médium (Sigma-
Aldrich, Madrid, España)) a concentración 10 mg/mL, y a continuación se dejó
la muestra a 4°C durante 24 horas. La colagenasa hidroliza el colágeno en su
conformación de triple hélice liberando fragmentos pequeños de tejidos y
células aisladas. Transcurrido este tiempo se separaron las dos fracciones
celulares en base a su coeficiente de sedimentación. Las células disgregadas se
colocaron en posición vertical durante 10 minutos, apareciendo un pellet que
se separó del sobrenadante y se pasó a un nuevo tubo, este procedimiento se
repitió dos veces más. Las células de mayor tamaño sedimentan más rápido al
fondo del tubo y se corresponden con glándulas y fragmentos epiteliales,
mientras que las células estromales se encuentran en la fracción superior.
Las suspensiones celulares correspondientes al estroma se filtraron a
través de filtros de 30 µm de poro (Partec, Celltrics), se centrifugaron a 2000
rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en medio DMEM/F12 (Dulbecco's
Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) suplementado con 10% de suero
bovino fetal (FBS) (Gibco, Barcelona, España) y 0,1% de antibióticos (fungizona
y gentamicina).
Por otro lado, las células de la fracción inferior fueron resuspendidas en
DMEM y sometidas a dos incubaciones de 15 minutos en flasks de 25 cm2
(Falcon, Becton-Dickinson) donde se recogió el sobrenadante. Estas
incubaciones permiten eliminar aquellas células estromales que puedan quedar
en la fracción epitelial. Finalmente las células fueron centrifugadas a 2000 rpm
durante 5 minutos y se resuspendieron en medio compuesto por 75% de
DMEM y 25% de MCDB-105 (Sigma, Madrid, Spain) complementado con 10%
de FBS, 220 µL de insulina y 0,1% de antibióticos (fungizona y gentamicina).
61
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1.4. Decidualización in vitro
Una vez las células estromales endometriales (ESC) se obtuvieron, a
continuación se cultivaron en placas de 24 pocillos (BD Becton and Dickinson)
usando el medio DMEM/F12 suplementado con 10% de FBS y 0,1% de
antibióticos (fungizona y gentamicina). Una vez alcanzada una confluencia del
80-90% se reemplazó con el mismo medio suplementado con 2% de FBS, 5
ug/mL de acido ascórbico y 10 ug/mL de transferrina. La decidualización in
vitro se indujo añadiendo progesterona (1 μmol/L) y 17β-estradiol (30 nmol/L)
durante 12 días. El medio de crecimiento con hormonas se renovó cada tres
días. Las ESC control fueron cultivadas en paralelo sin el tratamiento hormonal.
Se recogió el medio condicionado cada tres días (días 0, 3, 6, 9 y 12),
mientras que las células fueron recolectadas en día 9 de cultivo, tanto las ESC
control como las deciduales. El medio condicionado se analizó por ELISA para
comprobar los niveles de los diferentes biomarcadores que son secretados
cuando la decidualización tiene lugar: IGFBP-1 (Raybiotech) y prolactina ((PRL)
Abbott Axsym System). Tanto el aumento de la secreción de estas moléculas
como el cambio morfológico que experimentaban las células, permitía
comprobar que la decidualización se había producido con éxito.
Las células ESC control y decidualizadas en día 9 de cultivo se
sometieron al análisis proteómico mediante separación electroforética 2D-DIGE
e identificación de las proteínas con expresión diferencial por espectrometría
de masas MALDI-TOF. El medio condicionado procedente de células ESC
control y decidualizadas en día 9 de cultivo se analizó mediante un array de
proteínas (Fig. 13).
62
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 13. Diseño experimental empleado en el estudio de proteómica de la
decidualización. Las células endometriales estromales (ESC) se obtuvieron a partir de
biopsia y se cultivaron in vitro en presencia/ausencia de progesterona (P) y estradiol
(E2) durante 12 días. Las células se analizaron mediante 2D-DIGE y MALDI-TOF/TOF y
el medio condicionado se analizó mediante array de proteínas.
4.2. Líneas celulares
En el tercer objetivo donde se analizó el papel de ANXA2 y RhoA en el
endometrio se emplearon dos líneas celulares procedentes de la Colección
Americana de cultivos tipo (ATCC; Rockville, MD) (Tabla 2).
63
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Línea celular
Numero
Origen
Morfología
HEC-1-A
HTB-112
Carcinoma endometrial humano
Epitelial
JEG-3
HTB-36
Células derivada de trofoblasto
Epitelial
Tabla 2. Resumen de las líneas celulares empleadas en nuestros análisis.
Las células HEC-1-A fueron crecidas en medio McCoy 5A y las células
JEG-3 en EMEM (Eagle's minimal essential medium), ambos suplementados con
10% de FBS y 0,1% de antibióticos (fungizona y gentamicina).
Para todos los experimentos, las células HEC-1-A y JEG-3 se usaron
entre los pases de cultivo 2 y 8, sembradas en placas de cultivo (BD Becton and
Dickinson).
4.3. Estudio proteómico
4.3.1. Preparación de las muestras
Las proteínas se extrajeron a partir de las biopsias endometriales o bien
a partir de las células ESC decidualizadas y control, en tampón de lisis (7 M
urea,
2
M
tiourea,
4%
CHAPS
(acido
3-
((3
Cholamidopropyl)
dimethylammonio)-1-propanesulfonic) y 30 mM Tris-pH 8.5) con un contenido
de 50mM DTT y empleando el kit comercial 2D Grinding (GE Healthcare,
Chalfont St Giles, UK). La suspensión se agitó durante 40 min a temperatura
ambiente y se centrifugó a 16000 g durante 15 min. Para eliminar las posibles
64
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
sustancias interferentes la muestra se limpió y precipitó usando el kit comercial
2D Clean Up (GE Healthcare), y las proteínas se resuspendieron en tampón de
lisis. La concentración de proteínas se determinó usando el ensayo de proteína
RD/DC (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, USA).
4.3.2. Separación por 2D-DIGE
Las proteínas se marcaron siguiendo las recomendaciones de la casa
comercial GE Healthcare. Para el estudio de proteómica de la receptividad
endometrial se cogieron 50 µg de extracto proteico de la fase pre-receptiva y 50
µg de la fase receptiva, mientras que para el estudio de proteómica del proceso
de la decidualización se cogieron 50 µg del extracto proteico de células ESC
control y 50 µg de células ESC decidualizadas. Los extractos se marcaron con
400 pmol de los fluoróforos Cy3 ó Cy5 en hielo y en oscuridad durante 30 min.
En ambos estudios se introdujo un estándar interno, que contenía cantidades
iguales de cada lisado celular marcado con el fluoróforo Cy2 y se introdujo en
todos los experimentos. La reacción de marcaje se paró con 1 µL de lisina
10mM en hielo durante 10 min en oscuridad.
Los extractos proteicos pre-receptivo y receptivo, así como los extractos
proteicos control y decidual se combinaron por parejas, junto con el estándar
interno de cada estudio y se corrieron en un gel individual (150 µg de proteína
total). La tabla 2 muestra como se combinaron en parejas las diferentes
muestras correspondientes a los dos estudios. Los extractos proteicos se
diluyeron en tampón de rehidratación (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS) y se
redujeron con 50 mM de ditioltreitol (DTT), y se aplicaron en unas tiras
comerciales IPGs (gradiente de pH inmovilizado) de 24 cm con un rango de pH
3-11 no lineal (NL) para correr la primera dimensión. Estas tiras habían sido
65
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
previamente rehidratadas con tampón de rehidratación conteniendo 100 mM
de disulfido de hidroxietilo (DeStreak, GE Healthcare), tal como fue descrito por
Cortón y cols (2004).
Tabla 3. Diseño experimental para los análisis DIGE realizados en el estudio de la
receptividad endometrial y en decidualización. En el primer estudio, se hicieron dos
experimentos DIGE (GI y GII), usando 5 y 3 pares de muestras, respectivamente,
empleando en cada caso el estándar interno correspondiente. En el segundo
experimento, se analizaron 11 pares de muestras en un único experimento (GI) y con
un estándar interno común. Las muestras en todos los casos fueron combinadas por
parejas dentro de cada gel, realizando un marcaje tal como describe la tabla.
66
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
La primera dimensión se corrió a 0.05 mA˚/IPGs en el IPGphor
Isoelectric Focusing System (GE Healthcare) siguiendo un incremento de voltaje
en cuatro pasos: 300 V durante 3 h, gradiente lineal de 1000 V en 4 h, gradiente
lineal a 8000 V en 2 h y finalmente a 8000 V hasta estabilizarse. Después de la
primera dimensión, las tiras fueron equilibradas en tampón de equilibrado con
SDS (75 mM Tris pH 8.8, 6 M urea, 30% (v/v) glicerol, 2% (w/v) sodio dodecil
sulfato (SDS), y trazas de azul bromofenol) conteniendo 1% (w/v) de DTT
durante 15 min y tras ello, las tiras se sumergieron en tampón de equilibrado
con SDS conteniendo 4% (w/v) de yodoacetamida durante 15 min adicionales.
A continuación las proteínas se separaron por electroforesis SDS-PAGE en geles
de poliacrilamida del 10-12% usando el sistema Ettan Dalt Six device (GE
Healthcare) a 25°C.
4.3.3. Adquisición de imágenes y análisis
Después de la separación en la segunda dimensión mediante
electroforesis SDS-PAGE, los geles se escanearon con un escáner tipo Typhoon
9400 (GE Healthcare) a 100 mm de resolución usando filtros apropiados para
las longitudes de onda de los fluoróforos Cy2, Cy3 and Cy5. La cuantificación
relativa de las proteínas entre las muestras LH+2 y LH+7, así como entre las
muestras control y decidual se llevó a cabo usando el software DeCyder versión
6.5 y el módulo estadístico multivariable de análisis de datos (Extended Data
Analysis (EDA)) versión 1.0 (GE Healthcare) en un solo paso. En primer lugar,
se empleó el modulo DIA (Differential In-gel Analysis) para co-detectar las tres
imágenes de un gel (estándar interno marcado en azul, y las dos muestras,
marcadas en verde y rojo) para medir la relación exacta entre los volúmenes de
la mancha Cy3 y Cy5 referido al volumen de Cy2 en cada gel. Se eliminó
automáticamente el ruido de fondo, se normalizó y cuantificó siguiendo el
67
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
manual del software con DeCyder Differential Analysis version 6.5 (GE
Healthcare, 2005). A continuación, las imágenes procesadas de forma individual
con el módulo DIA se compararon entre los geles con el módulo de análisis
biológico de variación (Biological Variation Analysis (BVA)), utilizando el
estándar interno para la coincidencia de gel a gel. BVA reveló las diferencias
entre los grupos experimentales en todos los geles. Cada diferencia se calculó
como el ratio medio de cada mancha. Se aplicó un test t-Student para comparar
los ratios medios para cada mancha entre las muestras LH+2 y LH+7, y entre las
muestras control y decidual. Se consideró significativo un P-valor menor o igual
a 0.05. La agrupación de los grupos experimentales se realizó mediante Análisis
de Componentes Principales (PCA) empleando un algoritmo incluido en el
módulo de EDA del software DeCyder versión 6.5.
4.3.4. Digestión con tripsina
Aquellas manchas de proteínas que mostraron unos niveles de
expresión significativamente alterados entre los dos grupos (LH+2 y LH+7, así
como entre control y decidual) al ser analizadas con el software DeCyder y EDA,
se seleccionaron para escindir del gel. Los geles se tiñeron con plata y las
manchas de proteínas se compararon visualmente contra las imágenes DIGE,
manualmente escindidas de los geles y transferidas a microplacas de
polipropileno de 96 pocillos con agua ultrapura (Bruker Daltonik, Bremen,
Germany). Las muestras se digirieron automáticamente usando una estación de
digestión de proteínas Proteineer DP (Bruker Daltonik) según el protocolo de
Shevchenko y cols (2006) con pequeñas modificaciones. El fragmento del gel se
redujo con 15 µl de 10 nM DTT (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) en 50 mM
bicarbonato amónico (99.5% pureza; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) y
sometido a alquilación con 15 µl de una solución de yodoacetamida 55 mM
68
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
(Sigma Chemical) en 50 mM de bicarbonato amónico.
Los fragmentos se
lavaron con una solución 50 mM de bicarbonato amónico y acetonitrilo (en
gradiente; Merck, Darmstadt, Germany) y se secaron bajo una corriente de
nitrógeno. Posteriormente se añadieron 10 µl de tripsina porcina modificada
(Promega, Madison, WI, USA) a una concentración final de 8 ng/ml en 50 mM
de bicarbonato amónico y la digestión se realizó a 37°C durante 8 h.
Finalmente, para la extracción de los péptidos se añadieron 6 µl de 0.5% de
ácido trifluoroacético (TFA) (99.5% pureza; Sigma Chemical), y las soluciones
de digestión resultantes se transfirieron por centrifugación al fondo de las
microplacas de polipropileno de 96 pocillos (Greiner Bio-One, Frickenhausen,
Germany).
4.3.5. Espectrometría de masas
Las muestras para ser sometidas a un análisis MALDI-TOF/TOF
(desorción/ionización mediante láser asistida por matriz- tiempo de vuelo) se
prepararon mezclando volúmenes equivalentes de la solución de digestión y
una solución matriz compuesta de 0.5 g/l de ácido α-ciano-4 hydroxicinámico
(Bruker Daltonik) en 50% de acetonitrilo acuoso y 0.25% TFA. Esta mezcla se
depositó en la sonda MALDI de 600 mm AnchorChip (Bruker Daltonik)
(Schurenberg y cols., 2000) y se dejó secar a temperatura ambiente. Las
muestras se analizaron automáticamente en un espectrómetro de masas tipo
Ultraflex MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonik) (Suckau y cols., 2003) con un
análisis automatizado de bucle usando una calibración de masa interna,
controlado por el software flexControl 2.2 (Bruker Daltonik). En primer lugar,
se calculó la media de 300 espectros individuales en el modo de ion positivo
reflector a una frecuencia de láser de 50 Hz y en un rango de masas desde 800 a
4000 Da, para obtener el espectro MALDI-MS.
69
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
La calibración interna del espectro MALDI-MS se realizó usando los
iones fruto de la autolisis de la tripsina con un valor de masa/carga conocido
(m/z ¼ 842.510 y m/z ¼ 2211.105). En segundo lugar, aquellos iones
precursores que presentaron una señal de ruido de fondo de 20 en el espectro
de masas MALDI-MS se sometieron a un análisis de fragmentación de los iones
en tándem (MS/MS). Los precursores se aceleraron a 8 kV, mientras que los
fragmentos iónicos generados por la descomposición inducida por láser se
aceleraron a 19 kV, y sus masas se analizaron tras pasar el ion reflector en un
promedio de 1000 espectros. Para las calibraciones MALDI-MS/MS se usaron
iones tipo Y, obtenidos a partir de los protones de la mezcla de péptidos del
espectro de fragmentación iónico (calibración peptídica estándar, Bruker
Daltonik) que cubre la región 800–3200 m/z. El análisis automatizado de los
datos de masas se realizó empleando el software flexAnalysis versión 2.2
(Bruker Daltonik). Los espectros MALDI-MS y MS/MS se revisaron
manualmente en detalle, se readquirieron y recalibraron usando el protocolo
arriba mencionado.
4.3.6. Bases de datos
Los datos obtenidos a partir de MALDI-MS y MS/MS se combinaron a
través de la herramienta BioTools versión 3.0 (Bruker Daltonik) para la
búsqueda de proteínas no redundantes en las bases de datos (NCBInr
20080229, _6.5 _ 106 entries, National Center for Biotechnology Information,
Bethesda US) usando el software Mascot versión 2.2.1 (Matrix Science, London,
UK; http://www.matrixscience.com) (Perkins y cols., 1999). Los parámetros de
búsqueda mas relevantes fueron: enzima tipo tripsina; modificaciones,
carbamidometil (C); permisión de un error; tolerancia de péptido +20 ppm;
70
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
MS/MS tolerancia +0.5 Da. Puntaciones de proteínas mayores a 80 se
consideraron significativas (P ≤ 0.05).
4.4. Análisis de secretómica: Array de proteínas
Se llevó a cabo un análisis secretómico parcial usando un sistema de
Arrays de proteínas llamado Human Cytokine Antibody Array G Series 2000
(Raybiotech). Este sistema está compuesto por un set de tres arrays VI, VII y
VIII, los cuales contienen 174 citoquinas humanas que pueden ser comparadas
simultáneamente entre dos condiciones y en un experimento único (Dominguez
y cols., 2008; Dominguez y cols., 2010). Se comparó el medio condicionado de 7
conjuntos de células ESC control y decidualizadas recogido en día 9 de cultivo,
usando estos arrays de proteínas.
Los portaobjetos de arrays de proteínas se bloquearon durante 30 min a
temperatura ambiente antes de la incubación con el medio condicionado. A
continuación, los diferentes arrays VI, VII y VIII se incubaron 2 horas a
temperatura ambiente con 100 µL del medio de células ESC control, 100 µL del
medio de células ESC deciduales y 100 µL de medio que había estado sin células
(medio de cultivo DMEN/F12 con 2% SBF). Tras la incubación de las muestras y
el lavado, se aplicó a cada membrana una solución que contenía anticuerpos
anti-citoquinas conjugados con biotina durante 2 horas. A continuación se
lavaron los portaobjetos y se incubaron con una dilución de colorante
fluorescente conjugado con estreptavidina durante 2 horas a temperatura
ambiente y en oscuridad. Los portaobjetos se lavaron y las gotas de agua
restantes se eliminaron mediante centrifugación a 1000 rpm durante 3 min.
Tras ello los portaobjetos se dejaron secar al aire durante al menos 20 min.
Finalmente los arrays se escanearon en un escáner tipo Axon 4100A (Molecular
71
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Devices, Sunnyvale, CA, USA) y los datos se extrajeron con el software GenePix
Pro versión 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Para el análisis de cada punto del array (spot) fue usado el software
GenePix Pro versión 6.0 y para calcular la intensidad de los spots se
consideraron los datos en bruto. Se restó el ruido de fondo a la intensidad
media de los spots y los datos obtenidos se transformaron a escala logarítmica.
Antes de la normalización por cuartiles, los datos se representaron mediante un
diagrama de cajas para comprobar la distribución de los datos y poder eliminar
aquellos datos anormales. Se unificaron los datos de aquellas proteínas que
presentaron réplicas en el array. El software R-estadístico se usó como
herramienta para estos propósitos y los análisis posteriores. Comparando el
medio condicionado control con el decidual con test paramétricos y no
paramétricos, se obtuvo el patrón de expresión de proteínas. Se usaron dos
criterios para definir que proteínas tenían una abundancia alterada en las
diferentes muestras: un valor absoluto de tasa de cambio de 1.5 o mayor y un pvalor ≤ 0.05.
4.5. Bioinfórmatica: “interactoma” de la decidualización
Se desarrolló un análisis bioinformático para integrar los patrones del
proteoma y el secretoma de la decidualización, junto con la información
presente en las bases de datos públicas. Mediante el uso de la aplicación Snow
(http://snow.bioinfo.cipf.es) (Minguez
y cols., 2009) presente
en la
herramienta de análisis Babelomics (http://www.babelomics.org) (Medina y
cols., 2010), se creó una red de interacciones entre las proteínas
diferencialmente reguladas intra- y extracelularmente.
72
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Aunque los receptores de progesterona y estradiol (PGR, ESR1 y ESR2)
no se detectaron como diferencialmente expresados, se incluyeron en el
conjunto proteínas que interactúan, ya que representan la entrada principal de
las señales hormonales que desencadenan el proceso de decidualización. La
base de datos de interacciones de proteínas humanas disponible en Snow se usó
para construir la red de interacciones. Se incluyeron aquellas interacciones
físicas proteína-proteína detectadas por al menos dos métodos experimentales
distintos, y se permitió la incorporación de una proteína de unión (es decir, no
presente en los datos experimentales).
El interactoma de la decidualización se complementó incluyendo la
información disponible de aquellos factores de transcripción (FT) que regulan
la expresión de los genes que codifican a todas las proteínas presentes en la red.
Los datos de los factores de transcripción se obtuvieron de la base de datos
Jaspar (Portales-Casamar y cols., 2010), la cual se encuentra incluida en
Babelomics. Adicionalmente, todos los datos fruto del estudio de la
transcriptómica del proceso de decidualización (Aghajanova y cols., 2010) se
recopilaron y cruzaron con los datos proteómicos para identificar los genes
cuya expresión diferencial se observó tanto a nivel génico como proteíco.
Todas las proteínas que constituyeron la red resultante se revisaron
manualmente y se clasificaron en diferentes categorías funcionales, que
describían del mejor modo la diversidad de funciones en nuestro conjunto de
datos. Finalmente, la red se visualizó usando el software Cytoscape (Fig.14)
(Shannon y cols., 2003).
73
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 14. Obtención de la red de decidualización. A partir de los datos proteómicos
(intracelular y extracelular) se generó el interactoma empleando el software Cytoscape.
Se incorporaron los factores de transcripción que regulan todo este conjunto de
proteínas identificados a través de la base de datos Jaspar. Finalmente, los datos de
microarrays publicados se cruzaron con los proteómicos dando como resultado un
conjunto de genes en los cuales hay intersección.
74
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.6 Tratamientos para Anexina A2 y RhoA
4.6.1 Inhibición de Annexin A2
Se aplicaron dos tratamientos que implicaban la alteración de ANXA2 a
dos niveles:
Silenciamiento de la expresión génica
Se
silenció
ANXA2
empleando
un
oligonucleótido
ARNi
con
especificidad para ANXA2 (CGGCCUGAGCGUCCAGAAATT) con una modificación
en su extremo 3´ que adiciona el fluoróforo AlexaFluor488 (Quiagen CA, USA).
El kit de la casa comercial Qiagen también proporcionó un RNA dúplex como
control negativo.
Los experimentos de transfección se llevaron a cabo cuando las
monocapas de células HEC-1-A y EEC estuvieron al 50-70% de confluencia. Las
células HEC-1-A se transfectaron con 25nM de ARNi para ANXA2 o ARNi como
control negativo, mientras que las células EEC se transfectaron con 100nM de
ARNi para ANXA2 o ARNi como control negativo. La transfección se realizó
usando el agente de transfección Hiperfect (Qiagen CA, USA). Se diluyó el ARNi
en 100 µL de medio de cultivo sin suero, donde se añadió 3 µL de Hiperfect en el
caso de las células HEC-1-A y 4.5 µL en el caso de las células hEEC. Esta mezcla
se vorteó y se dejo incubando durante 10 min a temperatura ambiente, para
permitir la formación de los complejos de transfección. Finalmente la mezcla se
añadió en pequeñas gotas a las células (100 µL por pocillo de placa de 24). Se
movió orbitalmente con suavidad la placa para que los complejos de
transfección se distribuyeran homogéneamente. Se incubaron las células con
75
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
los complejos de transfección durante 24 horas a 37°c, transcurrido este tiempo
se comprobó el silenciamiento mediante RT-PCR y Western Blot.
Alteración a nivel de la actividad
Se empleó la droga Witaferina A (WA) para inhibir la actividad de
ANXA2. WA es un componente químico de tipo esteroide que se obtiene a partir
de una planta llamada Withania somnífera (Lavie y cols., 1965). Para nuestro
trabajo empleamos WA ofrecida por la compañía Santa Cruz Biotechnology (CA,
USA). Se ha reportado que esta droga produce una disrupción en la
organización de la F-actina a nivel fisiológico y su acción es dependiente de la
expresión de ANXA2 (Falsey y cols., 2006). Las células HEC-1-A y hEEC crecidas
en placas de 24 pocillos a una confluencia del 70-80% se trataron con 5µM de
Witaferina A durante 24 h a 37°C, y en paralelo se cultivaron células sin el
tratamiento como control.
4.6.2 Activación/inactivación de RhoA
Con el fin de activar/inactivar el estado de la proteína RhoA se empleó
un set de vectores de expresión pcDNA3-GFP-RhoA proporcionados por la casa
comercial Cell Biolabs (CA, USA) que incorporaban una copia normal de RhoA
como control, y dos mutaciones diferentes, la mutación T19N que produce la
inactivación de RhoA y la mutación Q63L que produce la activación de RhoA.
Las células HEC-1-A se cultivaron hasta un 50-70% de confluencia y un día
antes de la transfección se incubaron en medio de cultivo sin antibióticos. Tras
ello, se transfectaron con 0.8 µg de pcDNA3-GFP-RhoA (Wild-Type), pcDNA3GFP-RhoA T19N (mutante dominante negativo) o pcDNA3-GFP-RhoA Q63L
(mutante constitutivamente activo) usando como agente de transfección
76
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Barcelona, Spain). Siguiendo las indicaciones
del fabricante, se adicionaron 2 µL de Lipofectamine para una cantidad de 0.8 µg
de DNA en 100 µL de medio de cultivo sin antibióticos y se dejaron incubar 15
min para permitir la formación de los complejos de transfección. Finalmente la
mezcla se añadió en pequeñas gotas a las células (100 µL por pocillo de placa de
24). Se movió orbitalmente con suavidad la placa para que los complejos de
transfección se distribuyeran homogéneamente. El medio se cambió después de
4-6 horas y transcurridas 24 horas se comprobó la activación/inactivación de
RhoA mediante un ensayo pull-down y un análisis G-LISA.
La inactivación de la actividad de RhoA también se llevó a cabo
empleando la Toxina B de Clostridium difficile (Cytoskeleton CO, USA). La
Toxina B es una toxina bacteriana que glicosila irreversiblemente a todos los
miembros de la familia Rho GTPasa, provocando su inactivación funcional
(Genth y cols., 2008). Las células HEC-1-A se trataron con la Toxina B a
500ng/mL durante 1h a 37°C para inactivar la actividad de RhoA.
4.7 Ensayo de adhesión en cocultivo
4.7.1 Obtención de los embriones de ratón
Dichos estudios se llevaron a cabo usando el protocolo aprobado por el
Comité de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia, en
concordancia con las indicaciones para el uso y cuidado de los animales de
laboratorio del Instituto Nacional de Salud U.S. La cepa de ratones B6C3F1 se
proporcionó por los laboratorios de Charles River (Barcelona, Spain).
77
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Se indujo la ovulación de 40 ratonas con una edad comprendida entre 6-
8 semanas mediante la administración de 10 UI de PMSG (gonadotropina de
suero de yegua preñada) (Sigma-Aldrich, Irvine, U.K.), 48 horas después se
siguió con la administración de 10 UI de hCG (gonadotropina coriónica
humana) (Sigma-Aldrich). Las hembras se distribuyeron de dos en dos con un
macho semental durante la noche y a la mañana siguiente se examinó la
presencia de tapón vaginal (día 1 de embarazo). En día 2 de embarazo, las
ratonas se sacrificaron mediante dislocación cervical, y los embriones se
extrajeron del oviducto con PBS con ayuda de una aguja de calibre 30
conectada a una jeringa de 2 ml. Los embriones se cultivaron durante 3 días en
medio de cultivo CCM-30 (Vitrolife, Lubeck, Germany). Se incluyeron en el
estudio sólo aquellos embriones que se habían expandido y con morfología
normal (n=400-450 embriones de ratón empleados en total en los diferentes
experimentos). Se descartaron aquellos embriones degenerados o con defectos
en el fenómeno de expansión. La zona pelúcida en ningún caso se eliminó
artificialmente.
4.7.2 Cultivo de los esferoides JEG-3
El uso de embriones humanos está muy restringido debido a los
inconvenientes éticos y al alto número de embriones que son necesarios para
llevar a cabo los ensayos de adhesión. Como aproximación de un modelo de
adhesión embrionaria in vitro y debido a los inconvenientes anteriores, se
emplean esferoides generados por la línea celular trofoblástica JEG-3, que
muestra una morfología y comportamiento similar a un embrión humano.
La línea celular de coriocarcinoma humano JEG-3 fue cultivada en
suspensión celular dentro de flasks Erlenmeyer de 25 ml de medio EMEM
78
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
suplementado con 10% de FBS y 0,1% de antibiótico, a una concentración de
6x105 células/ml en agitación como se describió previamente (Nancy y cols.,
1993). El medio se cambió transcurridas 48 h, y los esferoides se recogieron
tras 72h después del inicio del cultivo.
4.7.3 Ensayo de adhesión
Mediante un ensayo mecánico se midió la adhesión de los embriones de
ratón y los esferoides JEG-3 a las monocapas de células epiteliales
endometriales (Shiotani y cols., 1993). Tanto los embriones de ratón como los
esferoides JEG-3 se cocultivaron sobre monocapas de células HEC-1-A y hEEC
crecidas hasta confluencia (Fig. 15). Transcurridas 24 horas de incubación
(37°C, 5% CO2), se ejerció un movimiento circular sobre las placas de cocultivo
de 3 cm de diámetro a una velocidad de rotación de uno por segundo durante
aproximadamente 10 segundos. Los embriones que se hallaban flotando en el
medio se clasificaron como no adheridos, mientras que aquellos que se
mantenían unidos a la monocapa celular se clasificaron como adheridos. Los
embriones se examinaron con ayuda de un microscopio invertido (Nikon
Diaphot 300; Nikon Corporation, Tokyo, Japan). Se añadieron de 6 a 8
embriones o esferoides JEG-3 en cada pocillo de placas de 24, donde se
cultivaron las monocapas confluentes de células HEC-1-A and hEEC. En cada
condición dentro de cada experimento teníamos una n de 10-15 embriones de
ratón o esferoides JEG-3. Cada experimento de adhesión se repitió tres veces.
4.8 Ensayo de expansión de trofoblasto
Las células HEC-1-A y hEEC se transfectaron con ARNi para ANXA2 o se
trataron con WA, como hemos descrito en el apartado 4.6.1. Posteriormente se
79
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
co-cultivaron en medio fresco con blastocistos de ratón hasta que tuviera lugar
la adhesión embrionaria. En aquellos casos donde se habían adherido
embriones a las células HEC-1-A y hEEC, se dejaron transcurrir 48 h y se evaluó
el área de expansión de 4 trofoblastos sobre células control y 4 trofoblatos
sobre células inhibidas para ANXA2. Las imágenes de la expansión se tomaron
inmediatamente después de la adhesión y 48 horas después (Fig. 15). El área de
expansión medida en pixels, se expresó como valores medios ± SEM de
conjuntos de medidas tomadas por triplicado en tres experimentos
independientes.
4.9 Ensayo migración/proliferación celular: “Cierre del surco”
Las células HEC-1-A y hEEC se cultivaron en placas de 24 pocillos
crecidas a 70-80% de confluencia y tratadas con inhibidores de ANXA2 (ARNi y
Witaferina A) 24 horas antes del ensayo de “cierre del surco”. En cada
monocapa se generó un surco o herida con una punta de pipeta estéril de 200
µL, tras ello se lavó la monocapa con PBS y se incubó con medio fresco. Las
placas se marcaron en la parte trasera con ayuda de un rotulador para
asegurarnos que las medidas del cierre del surco eran tomadas en los mismos
puntos. La anchura del surco se midió inmediatamente tras su realización y
transcurridas 24 h mediante un microscopio de contraste de fase (Fig. 15). El
cierre del surco se calculó y expresó como el porcentaje respecto a la anchura
inicial. Los datos son una representación de la media ± SEM de diez medidas
tomadas a partir de tres experimentos independientes.
80
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 15. Representación de los ensayos de adhesión, expansión del trofoblasto
y migración/proliferación celular. El ensayo de adhesión se realizó usando
blastocistos de ratón y esferoides JEG-3 sobre monocapas de células epiteliales HEC-1-A
y hEEC. La expansión del trofoblasto se evaluó en aquellos embriones de ratón que se
habían adherido, como el area generada una vez transcurrieron 48 h. El ensayo de
migración/proliferación celular se realizó midiendo el porcentaje de cierre de surco
tras 24 horas de su realización.
4.10 Análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa
4.10.1 Aislamiento de ARN
La extracción de ARN total de las muestras se realizó usando el agente
Trizol LS (Invitrogen, Barcelona, Spain) de acuerdo con el protocolo
recomendado por el fabricante (protocolo de Chomczynski y Sacchi., 1987).
Después del Trizol LS se añadió 0,2 volúmenes de cloroformo por cada volumen
de Trizol LS utilizado en origen. Se agitó vigorosamente con ayuda de un vórtex
durante 15 segundos y se dejó reposar 2-3 min a temperatura ambiente. Tras
81
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
una centrifugación a 12000 r.p.m durante 15 min a 4°C se transfirió la fase
acuosa a otro tubo y se le adicionó 0,5 volúmenes de isopropanol por cada
volumen de Trizol LS empleado al inicio. Se dejó precipitar 10 min a
temperatura ambiente o durante toda la noche a -20°C y tras otra
centrifugación a 12000 r.p.m durante 15 min a 4°C se obtuvo un precipitado de
ARN. Este pellet se lavó con etanol al 70% (v/v) en agua DEPC y se volvió a
centrifugar por última vez a 7500 r.p.m durante 5 min a 4°C. Finalmente se
resuspendió en 15 µL de agua-DEPC.
Terminada la fase de extracción de ARN de cada una de las muestras, se
procedió a cuantificar la concentración de ARN total midiendo por
espectrofotometría.
4.10.2 Retrotranscripción
Se procedió a retrotranscribir el ARN obtenido a ADN complementario
(ADNc) para poder analizarlo por RT-PCR. Para ello se cogió 1 µg de ARN total,
y se utilizó el kit Advantage RT-for-PCR (Clontech CA, USA) según las
instrucciones del fabricante. A cada muestra se le añadió 1 µL de oligo-18-dT y
agua-DEPC hasta un volumen final de 13,5 µL y se calentó a 70°C durante 2 min
para desnaturalizar las cadenas de ARN y evitar la formación de estructuras
secundarias de las mismas. Después de esos 2 min se añadió a cada tubo 6,5 µL
de la mezcla de reacción que contenía: 4 µL de tampón de reacción 5X, 1 µL de
dNTP mix (10mM cada uno), 0,5 µL de inhibidor recombinante de ARNasa y 1
µL de la transcriptasa reversa MMLV (Moloney- Murine Leucemia Virus).
Completados los 20 µL de volumen final se procedió a llevar a cabo la reacción
de retro-transcripción (RT). Las muestras se incubaron durante 1 hora a 42°C y
82
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
al final 5 min a 94°C para detener la reacción y destruir la actividad ADNasa. El
producto final se diluyó hasta un volumen total de 100 µL con agua-DEPC y se
almacenó a 4°C hasta su análisis por PCR.
4.10.3 RT-PCR
La RT-PCR en tiempo real (real time PCR) es una variante de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente
cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido
desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, un molde de ADN, en nuestro caso
ADN complementario fruto de la retrotranscripción, un par de cebadores
específicos (Tabla 3), Cl2Mg, y SYBR Green para RT-PCR (Roche) que contiene
Taq ADN Polimerasa FastStart y un fluoróforo SYBR Green I específico de DNA
de doble cadena para la detección del producto de reacción.
Se utilizó un termociclador Light Cycler 480 (Roche), que alberga
sensores para medir fluorescencia que tras excitar el fluoróforo a la longitud de
onda apropiada, permita medir la tasa de generación del productos de PCR.
Para contrarestar la variabilidad que se introduce en la cuantificación y
que conlleva a un error en la estima se han desarrollado numerosos sistemas de
estandarización. La forma más común, se orienta a la cuantificación relativa del
gen de estudio respecto de otro, denominado “normalizador”(house-keeping),
que se selecciona debido a su expresión casi constante. Nosotros hemos
utilizado GAPDH como gen normalizador. Este gen está involucrado en
funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una
expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la
83
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen
normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer
en términos absolutos su nivel de expresión.
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de
hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda
determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.
Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar
rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades
fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
El proceso de PCR consistió en una serie de cambios de temperatura
que se repiten 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee tres etapas:
desnaturalización en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos
nucleicos de doble cadena; anidamiento, a una temperatura variable (en
nuestro caso 59 °C), que permite el alineamiento de los cebadores al ADN
molde; extensión, a 72 °C, que facilita la polimerización por parte de la ADN
polimerasa.
Los transcritos se cuantificaron usando su correspondiente curva
estándar, usando GAPDH como control interno. Cada experimento se realizó
tres veces con cada muestra por triplicado.
Se usaron los siguientes cebadores específicos para cada gen están
especificados en la tabla 4:
84
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Gen
ANXA2
RhoA
GAPDH
Forward
Reverse
TGTGCAAGCTCAGCTTGGA
AGGTGTCTTCAATAGGCCCAA
GCTTGCTCATAGTCTTCAGCA
GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
TCCTTCTTATTCCCAACCAGGA
GAAGATGGTGATGGGATTTC
Tabla 4. Tabla donde se representan los cebadores específicos usados para los
genes utilizados en nuestros estudios.
4.11 Análisis de proteínas
4.11.1 Extracción de proteínas
La extracción de proteínas se hizo directamente partiendo de un
fragmento de biopsia de endometrio total y a partir de células epiteliales
endometriales (hEEC o HEC-1-A). En ambos casos, biopsia o células se lavaron
con PBS frío y tras su disgregación mecánica se adicionó el tampón de lisis
entre 20-100 µl según la cantidad de células (aproximadamente 50 µl por cada
800.000 células). El tampón de lisis estaba formado por: 50 mM Tris-HCl pH
8.0, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA 360, 0.5% Na-DOC, 0.1% SDS and 0.5M EDTA.
Se dejó actuar durante 20 min en hielo. Transcurrido este tiempo las muestras
se centrifugaron a 12000 r.p.m a 4°C durante 15 min. Se tomó el sobrenadante
celular donde se hallaba resuspendido el extracto proteico.
4.11.2 Cuantificación
La cuantificación se llevó a cabo usando el método Bradford. Este
método se basó en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (BioRad, UK)
a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas, una azul y
85
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
otra naranja. Las proteínas se unieron a la forma azul para formar un complejo
proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
Con ayuda de un espectrofotómetro se midió la absorbancia a 280 nm, longitud
de onda a la que absorben las proteínas. Para determinar la concentración de
proteína total presente en la muestra se preparó una curva de calibrado
empleando una proteína patrón, llamada seroalbúmina bovina.
4.11.3 Western blot
En primer lugar, entre 20-60 µg de cada extracto proteico se mezcló
con tampón Laemmli (Bio-Rad, UK) con 8% de β-mercaptoetanol y se
desnaturalizó a 95°C durante 5 min. La electroforesis que se utilizó es conocida
como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con
dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por
agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras secundaria y
terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH
+ SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este
modo, la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la
electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño. Los
extractos proteicos se separaron por electroforesis discontinua (gel
apilamiento de poliacrilamida al 4% y gel resolutivo de poliacrilamida al 1012%) durante 1 h a 180V.
A continuación, las proteínas se transfirieron desde el gel de
poliacrilamida a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF)
(Amersham Biosciences, NJ, USA) para que las proteínas sean accesibles a la
detección por anticuerpos. Esta transferencia se realizó por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia húmeda), usando el tampón de transferencia
86
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Tris/Glicina (Bio-Rad, UK). Las condiciones de transferencia fueron 160 V
durante 4 h a 4°C con agitación.
Tras el paso de transferencia, se procedió a bloquear la membrana con
leche desnatada en polvo al 5% en PBS y 0,1% de detergente Tween para
saturar todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados
para evitar la unión no específica de anticuerpos. Posteriormente, las
membranas se incubaron a 4°C durante la noche con diferentes anticuerpos
primarios a concentración adecuada: 4 mg/ml de Anti-Estatmina 1 monoclonal
de conejo (Abcam, Cambridge, UK), 1 mg/ml de Anti-Anexina A2 policlonal de
cabra (Affinity BioReagents, Golden, CO), 2,5 μg/ml Anti-Transgelina
monoclonal de ratón, 2 μg/ml Anti-α-Actinina monoclonal de ratón (Abcam,
Cambridge, UK), 2 μg/ml Anti-Transglutaminasa 2 monoclonal de ratón
(Abcam, Cambridge, UK), 0.25 μg/ml Anti-Catepsina B monoclonal de ratón
(Abcam, Cambridge, UK), 1/1000 Anti-RhoA monoclonal de ratón (Santa Cruz
Biotechnology), 1/1000 Anti-Annexin II policlonal de conejo (Abcam,
Cambridge, UK) y 1/2000 GAPDH monoclonal de ratón (Abcam, Cambridge,
UK) diluidos en leche desnatada en polvo al 3% en PBS. Luego las membranas
se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios
anti-ratón, anti-conejo y anti-cabra conjugados con peroxidasa de rábano (HRP)
(Santa Cruz, CA, USA) a una dilución de 1:2000 en leche desnatada en polvo al
3%. Los complejos antígeno-anticuerpo se revelaron con el sistema de análisis
ECL Plus reagent (Amersham Biosciences, CT, USA), fotografiadas usando el
aparato Fujifilm LAS-3000 y el subsecuente análisis de las bandas se realizó por
densitometría con el programa Fujifilm Multi Gauge versión 3.0.
87
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.12 Inmunohistoquímica e inmunosfluorescencia
Pequeños fragmentos de biopsias endometriales fijados en formol al 4%
y embebidos en parafina se seccionaron y se montaron en portaobjetos de
cristal recubiertos con Vectabond TM (Vector Lab, Burlingame, CA, USA). Tras la
desparafinización y rehidratación con etanol, las secciones se lavaron tres veces
con PBS durante 5 min. La immunohistoquímica sobre las secciones
endometriales se realizó usando el kit LSAB Peroxidase (DAKO, CA, USA). Para la
unión no especifica de anticuerpos se bloqueó con albumina de suero bovino
(BSA) al 5%. Las secciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente
con los anticuerpos: 6 mg/ml Anti-Anexina A2 policlonal de cabra (Affinity
BioReagents, Golden, CO, USA), 4 mg/ml Anti-Estatmin 1 monoclonal de conejo
(Abcam, Cambridge, UK), 1/100 Anti-Anexina II policlonal de conejo (Abcam,
Cambridge, UK) y 1/100 Anti-RhoA monoclonal de ratón (Santa Cruz
Biotechnology, CA, USA) diluidos en PBS con 3% de BSA. Los controles
negativos de la técnica se incubaron únicamente en PBS con 3% de BSA y en
ausencia de anticuerpos. También se incluyeron controles de tejido para las
proteínas Anexina A2 (piel como control positivo y testículo como control
negativo) y para Estatmina 1 (testículo como control positivo e hígado como
control negativo). Los anticuerpos secundarios utilizados se aportaron por el
kit LSAB Peroxidase (DAKO, CA, USA) y eran válidos para ratón, conejo y cabra,
especies donde estaban obtenidos nuestros anticuerpos primarios. El marcaje
se obtuvo con el cromógeno 3,3´-diaminobenzidina (DAB) aplicado durante 30
segundos. Tras ello, se aplicó una contratinción con hematoxilina durante 10 s y
se lavó con agua destilada. Finalmente los portaobjetos se montaron con un
cubreobjetos con ayuda de pegamento entellan (Merck, Darmstadt Germany) y
se visualizaron al microscopio.
88
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
Las células epiteliales endometriales, HEC-1-A y hECC, se cultivaron en
placas de plástico hasta una confluencia del 30-40%. A continuación, se fijaron
con bajas concentraciones de paraformaldehido al 2–3% para minimizar los
efectos del enmascaramiento de antígeno y se bloquearon con BSA al 5% en
PBS durante 1 h. Seguidamente se incubaron durante 1 h a temperatura
ambiente con anticuerpos primarios: 1/100 anti-Anexina II humana policlonal
de conejo (Abcam, Cambridge, UK) y 1/100 anti-RhoA humano monoclonal de
ratón (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) diluidos al 3% de BSA en PBS.
Después, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios: 1/1000 de
anti-conejo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Barcelona, Spain), 1/1000 anti-ratón
Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Barcelona, Spain) y 0.1 µg/mL de Faloidina-
tetrametilrodamina B isotiocianato conjugado, obtenido a partir de Amanita
Phalloides (Sigma Aldrich, USA). Esta incubación duró 30 min y se llevó a cabo a
temperatura ambiente y en oscuridad. Las imágenes de fluorescencia se
tomaron con un microscopio confocal Nikon microscope equipado con un
objetivo de apertura numérica 100× 1.45 y con un disco rotatorio confocal
Yokogawa (PerkinElmer).
Se usaron tres preparaciones diferentes de células o tejidos para
analizar y valorar las señales por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.
4.13 Análisis ELISA
El medio condicionado de las células control y decidualizadas se evaluó
usando kits comerciales de ELISA para IGFBP-1, MPIF-1, IL-6, MCP-3
(Raybiotech), y IL1R-II (Hycult biotech), siguiendo las indicaciones del
fabricante. Este ensayo se basa en la presencia de un anticuerpo específico para
89
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
la proteína que queremos detectar, adherido a una placa de 96 pocillos. Tanto el
estándar como las muestras se pipetearon en el interior de los pocillos y la
proteína a identificar presente en la muestra se unió a los pocillos, gracias a la
presencia de los anticuerpos inmovilizados en el plástico. Los pocillos se
lavaron y se añadió un anticuerpo biotinilado que reaccionaba frente a la
proteína a identificar. Tras el lavado de los anticuerpos no unidos, se añadió
estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP). Finalmente los
pocillos se incubaron con una solución de sustrato 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina
(TMB) y se desarrolló color de forma proporcional a la cantidad de la proteína a
identificar presente en la muestra. La reacción se detuvo con un tampón de
parada produciéndose un viraje del color azul a amarillo, y dicha intensidad de
color se midió a 450 nm. Cada muestra se analizó por duplicado y los valores se
calcularon en pg/mL, determinados a partir de las curvas estándar
proporcionadas por el kit.
4.14 Ensayo para medir la actividad de RhoA
Se usaron dos metodologías a la hora de medir la cantidad de RhoA
activo, es decir, RhoA unido a GTP.
4.14.1 Ensayo Pull-down de RhoA-GTP
Se utilizó un kit donde se realizaba un ensayo pull-down (Cytoskeleton,
CO, USA) para la detección de RhoA activo, siguiendo las indicaciones del
fabricante. El ensayo pull-down es un método usado in vitro para determinar la
interacción física entre dos proteínas. En este ensayo se empleó un dominio de
unión a RhoA (RBD) presente en rhotekin, que es una proteína efectora de
RhoA. Se ha demostrado que esta proteína a través del dominio RBD se une
90
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
específicamente a RhoA, cuando este se encuentra en estado activo unido a
GTP. La proteína Rhotekin-RBD además contiene una secuencia de 7-89
aminoácidos de Glutation S-transferasa (GST) expresada como fusión en
Escherichia coli. El resultado es una proteína recombinante etiquetada con GST
en el extremo N-terminal y unida a bolas de sefarosa glutation coloreadas.
El protocolo se inició a partir de un extracto de 300-800 µg de proteína
al que se le adicionaron 50 µg de bolas rhotekin-RBD y se dejó incubar durante
1 h a 4°C en rotación. Tras centrifugar a 5000 g durante 1 min a 4°C, el pellet se
lavó con 500 µL de tampón de lavado y finalmente se resupendió con 20 µL de
tampón Laemmli. Tras ello, la cantidad de RhoA-GTP activo unido con las bolas
rhoketin-RBD se determinó mediante western blot.
4.14.2 Ensayo para la detección de RhoA activo por G-LISATM
Se utilizó un kit donde se realizaba un ensayo G-LISA (Cytoskeleton, CO,
USA) para la detección de RhoA activo siguiendo las indicaciones del fabricante.
Este ensayo usaba proteína de unión a Rho-GTP adherida a los pocillos de una
placa de 96, de este modo las moléculas de RhoA activo presente en el extracto
proteico permanecieron adheridas, mientras que las moléculas de RhoA
inactivo unido a GDP se eliminaron en los pasos de lavado.
El protocolo consistió en incubar 25 µg de extracto proteico junto con
tampón de unión aportado por el kit (50 µL totales), en los pocillos de la placa
G-LISA. Cada muestra se incubó por duplicado durante 30 min a 4°C en
agitación. Transcurrido este tiempo, se incubó con 200 µL de tampón para
presentación de antígenos durante 2 min a temperatura ambiente. A
continuación, se detectó la cantidad de RhoA activo unido añadiendo 50 µL de
91
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
anticuerpo primario anti-RhoA a temperatura ambiente durante 45 min.
Después de los lavados, se añadió 50 µL de anticuerpo secundario marcado con
peroxidasa de rábano (HRP) a temperatura ambiente durante 45 min.
Finalmente, se añadió sustrato de detección de HRP durante 15 min a 37°C, tras
ello se detuvo la reacción con solución de parada y se midió la absorbancia a
490 nm.
4.15 Ensayo para medir F-actin/G-actin in vivo
Mediante el kit para el ensayo G-actin/F-actin in vivo (Cytoskeleton, CO,
USA) se midió la cantidad de actina monomérica globular libre (G-actina)
respecto a la cantidad de actina filamentosa (F-actina). Las células se
homogeneizaron en tampón de estabilización de F-actina, incubadas a 37°C
durante 10 min. Tras ello, los lisados celulares se clarificaron para eliminar
restos celulares mediante centrifugación a baja velocidad (2000 rpm). El
sobrenadante celular se centrifugó a 100.000 g con el fin de separar la G-actina
globular soluble de la F-actina filamentosa insoluble. En el sobrenadante
resultante se encontraba presente la G-actina, mientras que en el pellet
permaneció la actina insoluble. El pellet se resuspendió con agua mili-Q y
1/100 de agente despolimerizante de F-actina, y se dejó a actuar en hielo
durante 1 h. Finalmente ambas fracciones: actina globular y filamentosa se
analizaron por Western Blot usando el anticuerpo anti-actina a una dilución
1/500 (Cytoskeleton, CO, USA). La cuantificación por densitometría determinó
el ratio entre la actina globular hallada libre en el citosol en comparación con la
actina filamentosa incorporada en el citosqueleto, todo ello normalizado con la
cantidad total de actina.
92
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.16 Estadística
Los datos se calcularon como valores medios ± error estándar de la
media (Media ± SEM) con un valor n que denotó el número de experimentos
realizados. Los datos se analizaron usando test de la t-student (t-test) o el test
de Mann-Whitney (U-test), según los datos presentasen una distribución
paramétrica o no paramétrica, para analizar las diferencias globales entre los
grupos comparados. La significancia estadística se definió con un p-valor ≤
0.05. (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001).
93
______________________________________________________________________4. MATERIAL Y MÉTODOS
94
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5. RESULTADOS
95
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
96
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. Proteómica de la receptividad endometrial
5.1.1.
Análisis proteómico del endometrio receptivo
comparado con pre-receptivo mediante DIGE e identificación
por MALDI-MS.
Se evaluó la expresión de proteínas entre el endometrio en fase pre-
receptiva (LH+2) y receptiva (LH+7) mediante proteómica basada en la
tecnología DIGE. Para ello se llevaron a cabo dos experimentos DIGE
independientes basados en conjuntos de muestras diferentes. El primer
experimento incluyó 10 muestras 5 LH+2 y
5 LH+7 (procedentes de 5
donantes), mientras que el segundo incluyó 6 muestras adicionales, 3 LH+2 y 3
LH+7 (procedentes de 3 donantes). Se marcaron los extractos de proteínas con
los fluoróforos Cy3 o Cy5 alternados para evitar el posible sesgo de marcaje
debido a las propiedades de fluorescencia de los geles en diferentes longitudes
de onda. Cada uno de los 8 geles se corrió con cada pareja de muestras
marcadas Cy3/Cy5 y junto con el estándar interno marcado con Cy2. Después
de la electroforesis bidimensional (2-DE), se obtuvieron las imágenes
individuales de cada gel para los tres canales: Cy3, Cy5 y Cy2.
En el primer experimento DIGE, se seleccionaron tres de los cinco geles,
ya que tenían una mayor calidad para evitar la disminución de la potencia
estadística. Uno de estos geles se eliminó porque presentaba una baja
resolución en la región alcalina y cuando se incluyó en el análisis con el
programa informático DeCyder el número de spots presentes en los geles
97
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
reconocidos por el programa descendía desde 1800 a 600. El otro gel se
descartó porque el análisis de componentes principales (PCA) resultó atípico, lo
cual se correspondía con una muestra con alto nivel de contaminación
sanguínea. En el segundo caso sin embargo, si se incluyeron los tres geles que
constituían el experimento.
La detección de los spots se llevó a cabo con el módulo DIA del
programa informático DeCyderTM permitiendo una detección de 2.500 spots en
cada gel (Fig. 16).
Se analizó la expresión diferencial de estas proteínas en las dos
condiciones: endometrio pre-receptivo y receptivo. Aquellas proteínas que
presentaban una expresión diferencial significativa (p≤0.05) se escindieron a
partir de los geles teñidos con plata y se sometieron a digestión con tripsina.
Para la identificación de estas proteínas se usó el sistema MALDI-TOF/TOF, del
cual se obtuvo la huella peptídica o la huella de framentación peptídica, seguido
de una búsqueda en la base de datos Mascot (Tabla 5).
98
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 16 Geles 2D-DIGE. Extractos proteicos de muestras endometriales LH+2, LH+7
y el estándar interno se marcaron con los fluoróforos Cy3, Cy5 y Cy2, se mezclaron y se
separaron mediante electroforesis bidimensional. Para la primera dimensión, se usaron
tiras de acrilamida de 24 cm y con un rango de pH de 3-11 NL y para la segunda
dimensión se empleó un gel SDS-PAGE de acrilamida al 10%. Los geles se escanearon
obteniéndose imágenes para las proteínas (A) LH+7 (Cy3, verde) y (B) LH+2 (Cy5, rojo).
(C) Superposición de los dos fluoróforos Cy3 y Cy5. (D) Tinción de plata del gel anterior
tras el escaneado de fluorescencia.
99
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Tabla 5. Proteínas que presentan cambios significativos entre el estado receptivo
(LH+7) y pre-receptivo (LH+2), identificadas por MALDI-TOF/TOF. aNúmero de
spot, que coincide con el que aperece en el gel de plata de la figura 16D (spots del 1-18).
bP-valor
obtenido al aplicar el test de la t. cTasa de cambio (LH+7/LH+2) calculado a
partir del análisis DeCyder. dCódigo de acceso de la proteína a partir de la base de datos
SwissProt. ePuntuación Mascot. fPeso molecular (MW) y punto isoeléctrico (pI) teórico,
gnúmero
de péptidos analizados,
hcobertura
de secuencia para el candidato de
secuencia proporcionado por Mascot. iFunción biológica proporcionada por SwissProt.
kFosforilación
demostrada mediante MALDI-TOF/TOF.
100
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Comparando a nivel proteómico el endometrio pre-receptivo con el
receptivo se identificaron un total de 35 spots con niveles de expresión
diferencial significativo, de los cuales se identificaron 32 proteínas
diferenciales: 12 reguladas al alza y 23 reguladas a la baja. Los conjuntos de
proteínas encontrados como diferencialmente expresados en los dos
experimentos realizados fueron diferentes probablemente debido a la
variabilidad
entre experimentos y entre pacientes, a excepción de dos
proteínas que se encontraron desreguladas en ambos casos: anexina A2 (spots
7, 16 y 33, regulada al alza en el endometrio receptivo) y estatmina 1 (spots 2, 3
y 20, regulado a la baja en el endometrio receptivo).
Además, se encontró una isoforma adicional de la proteína estatmina
con una fosforilación en la serina 25 también regulada a la baja en el
endometrio receptivo. La figura 17 muestra en detalle el espectro de
fragmentación MALDI-TOF/TOF de esta proteína fosforilada obtenido a partir
del ión parental procedente del spot 7 que tenía una masa de 1468,7 (m/z).
101
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 17 Espectro MALDI-TOF/TOF obtenido a partir del ión precursor con m/z
= 1468,70. El ión precursor de m/z = 1468,70 se seleccionó a partir del espectro de
masa correspondiente al spot número 7 para llevar a cabo un análisis de los fragmentos
peptídicos. Se muestra la secuencia de las principales series de fragmentación, y (serie
C-terminal) y b (serie N-terminal). Los fragmentos iónicos con una pérdida neutral de
H3 PO4 (-98 unidades de masa atómica) producidos a partir de la fosforilación de serina
son marcados por “-P”, y los fragmentos internos identificados son marcados con su
secuencia aminoácidica. Otras pérdidas adicionales también se han indicado. Para
mayor claridad, la región de intensidad comprendida entre 50-950 m/z se aumentó
ocho veces.
102
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.1.2.
Validación del análisis proteómico del endometrio
receptivo comparado con pre-receptivo mediante DIGE e
identificación por MALDI-MS.
Con el fin de validar los resultados obtenidos al aplicar las técnicas
proteómicas se analizó la expresión de estatmina 1 y anexina A2 mediante
Western blot en 6 de las 12 muestras usadas en el experimento DIGE (tres
donantes). La validación en las tecnologías “ómicas” resulta fundamental, ya
que el estudio de las proteínas a gran escala puede incorporar muchos errores y
se requiere del uso de técnicas tradicionales para verificar los resultados.
Las bandas que se visualizan como resultado del Western blot
presentan una regulación similar a lo obtenido en el análisis DIGE (Figura 18A).
Es decir, vemos como estatmina 1 tiene mayor expresión en el endometrio en
estado pre-receptivo tal como ocurría en el análisis DIGE, en el cual tenía una
tasa de disminución de -2.6 respecto al endometrio receptivo. En
contraposición, anexina A2 presenta su mayor expresión en el endometrio en
estado receptivo, coincidiendo con su tasa de aumento de 2.8 respecto a esta
fase.
Además se analizaron 8 biopsias de ciclo natural adicionales obtenidas a
partir de diferentes mujeres (4 biopsias en fase pre-receptiva y 4 en receptiva)
y se comprobó por Western blot que la regulación al alza y a la baja de estas
proteínas también se daba fuera del conjunto de muestras usadas en el DIGE
(Figura 18B). La proteína GAPDH se usó como control para normalizar la
abundancia de proteínas en todos los experimentos Western blot realizados.
103
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 18 Validación mediante Western blot de estatmina 1 y anexina A2 en el
endometrio humano pre-receptivo y receptivo. (A) Estatmina 1 y anexina A2 se
analizaron por Western blot en 6 de las 12 muestras endometriales empleadas en el
estudio DIGE (tres donantes). (B) Estatmina 1 y anexina A2 se analizaron por Western
blot en ocho muestras endometriales obtenidas a partir de ocho donantes diferentes,
para testar la significación biológica fuera del set de muestras analizadas por
proteómica.
104
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.1.3. Inmunolocalización de estatmina 1 y anexina A2 en el
endometrio pre-receptivo y receptivo.
Estatmina 1 y anexina A2 son las dos proteínas reguladas de forma
consistente en los dos experimentos DIGE realizados entre endometrio prereceptivo y receptivo. Se trata de dos proteínas importantes en la
reorganización del citoesqueleto, y por ello nos planteamos localizarlas en el
endometrio humano en fase pre-receptiva (LH+2) y receptiva (LH+7) (Fig. 19).
Figura. 19 Inmunohistoquímica de estatmina 1 y anexina A2 en el endometrio
humano pre-receptivo y receptivo. El marcaje de estatmina en el endometrio pre-
receptivo (LH+2) mostró una elevada intensidad, mientras que resultó prácticamente
ausente en el endometrio receptivo (LH+7). El testículo se usó como control positivo
(C+), y el hígado se usó como control negativo (C-). Anexina A2 presentó un marcaje
muy leve en el endometrio pre-receptivo (LH+2) comparado con el fuerte marcaje
observado en el endometrio receptivo (LH+7). La epidermis se empleó como control
positivo (C+), mientras el testículo fue el tejido control negativo (C-). Se analizaron 3
muestras de cada condición (n total= 24 muestras).
105
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Anexina A2 presentaba un marcaje muy débil en el endometrio pre-
receptivo, únicamente presente en algunas células estromales y en la parte
apical de las glándulas endometriales, sin embargo el marcaje fue muy intenso
en el endometrio receptivo con mayor intensidad en las glándulas
endometriales. Estatmina 1 presentó un patrón de inmunoreactividad opuesto,
se localizó mayoritariamente en las células estromales y en la superficie apical
de las glándulas endometriales con una intensidad mucho mayor en el
endometrio en fase pre-receptiva comparado con el endometrio en fase
receptiva.
5.1.4. Modelo de endometrio humano refractario para testar
la relevancia funcional de estatmina 1 y anexina A2.
Para evaluar la posible relevancia funcional de estatmina 1 y anexina A2
en la receptividad endometrial, se utilizó un modelo de endometrio refractario
inducido por la inserción de un dispositivo intrauterino (DIU). Con este fin se
analizaron por inmunohistoquímica tres muestras procedentes de tres
pacientes diferentes (n=9) obtenidas en la fase receptiva del endometrio
(LH+7) en un ciclo previo a la inserción del DIU, en presencia del DIU, y tres
meses después de su retirada (Fig. 20).
Antes de la inserción del DIU, estatmina 1 mostraba el mismo patrón
descrito en el endometrio receptivo, con una débil señal únicamente en las
glándulas endometriales. Aunque, cuando se introdujo el DIU, el marcaje se
observó mucho más intenso a nivel del estroma y las glándulas endometriales,
semejante a lo que ocurría en el endometrio en fase pre-receptiva. Tres meses
después de la retirada del DIU el endometrio recuperó el patrón de
inmunoreactividad característico del endometrio en fase receptiva.
106
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Nuestros resultados para anexina A2 demostraron que se expresaba
intensamente en las glándulas endometriales y en las células estromales antes
de la inserción del DIU, lo que coincide con los resultados anteriores. Cuando se
insertó el DIU en el útero, el marcaje a nivel glandular fue significativamente
reducido y desapareció completamente de las células estromales. Tres meses
después de la retirada, anexina A2 aun presentaba un patrón de expresión
débil, semejante a cuando había un DIU presente. Esto demuestra que
transcurrido este tiempo el fenotipo endometrial aun no se había recuperado
totalmente.
Figura. 20 Inmunohistoquímica de estatmina 1 y anexina A2 en el endometrio
humano refractario inducido por la inserción de un DIU. Se evaluó el patrón de
expresión de estas moléculas en biopsias de endometrio tomadas en día LH+7 (n total=
9 muestras): antes de la inserción del DIU (n=3), en presencia de este dispositivo (n=3)
y transcurridos tres meses de su retirada (n=3). Con ello se evaluó la desregulación de
estas proteínas en presencia del DIU y la posible implicación funcional en la
receptividad endometrial.
107
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Este modelo de endometrio refractario inducido por la inserción de un
DIU, nos mostró una desregulación clara en el patrón de marcaje
inmunoreactivo de ambas proteínas, indicando una implicación funcional en la
receptividad endometrial.
5.2. Proteómica del proceso de decidualización
5.2.1. Evaluación de la decidualización in vitro
Transcurridos 9 días de cultivo in vitro en presencia de progesterona y
estradiol se estudió la morfología de las células endometriales estromales
(ESC), y se vio que mostraban un fenotipo claramente decidual con mayor
tamaño respecto a las células control y con forma redondeada (Fig. 21A-B).
Además se corroboró mediante ELISA que las células decidualizadas secretaban
marcadores característicos de este proceso: prolactina con unos niveles de
60.27 ± 23.71 ng/ml e IGFBP-1 con unos niveles de 98.38 ± 48.07 ng/ml (Fig.
21C-D). Se comprobó que este aumento observado en las células decidualizadas
era estadísticamente significativo respecto al control. Para los análisis
proteómicos solo se seleccionaron aquellas parejas de células control y
decidualizadas (n=16) que mostraron un incremento significativo en los niveles
de prolactina e IGFBP-1 (P<0.005).
108
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 21 Decidualización in vitro. (A) Morfología de células ESC sin tratamiento
hormonal. (B) Morfología de células ESC decidualizadas cultivadas con progesterona y
17β-estradiol durante 9 días. Secreciones de prolactina (PRL) (C) e IGFBP-1 (D) de
células ESC control (barra negra) y decidualizadas (barra gris) en cultivo durante 0, 3,
6, 9 y 12 días. Estas proteínas se midieron por ELISA (n= 20 experimentos de
decidualización in vitro), cada condición se midió por duplicado y los valores se
expresaron en ng/mL (media±SEM). * p-valor < 0.05 **p-valor< 0.005.
109
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.2.2. Análisis proteómico de las células decidualizadas
respecto a las células control.
La electroforesis bidimensional 2D-DIGE llevada a cabo a lo largo de un
rango de pH de 3 a 11 no lineal, permitió la discriminación de 2500 spots con
ayuda
del
programa
diferencialmente
informático
expresadas
se
DeCyderTM.
escindieron
y
Aquellas
analizaron
proteínas
mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF y finalmente se identificaron usando
la herramienta de búsqueda Mascot (Fig. 22).
Se obtuvo un listado de 60 proteínas con una abundancia diferencial
significativa (p≤ 0.05) entre
células ESC decidualizadas comparadas con
control: 36 reguladas a la alza y 24 reguladas a la baja (Tabla 6). Entre las
diferentes proteínas identificadas encontramos algunas relacionadas con el
citoesqueleto (actinina alfa, gelsolina y queratina 7), homeostasis del estado de
oxidación de la célula (superóxido dismutasa y peroxiredoxina 4), implicadas
en metabolismo (isomerasa triosafosfato 1 y lipasa monoglicerido) y
relacionadas con la plegamiento/degradación de las proteínas (catepsina B y
proteína disulfito isomerasa).
En algunos casos, la misma proteína se identificó en dos spots diferentes
(por ejemplo, caldesmon, spot 13 y 14), lo que sugiere la posibilidad de que se
produzcan modificaciones posttraduccionales. En otros casos, se identificaron
dos proteínas co-migrando en un mismo spot (por ejemplo, en el spot 2
aparecen la proteínas isomerasa disulfito y el inhibidor de ribonucleasa).
110
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 22 Experimento DIGE con células ESC decidualizadas comparadas con las
control. El extracto de proteínas de células control, decidualizadas y el estándar
interno se marcaron con los fluoróforos Cy3, Cy5 y Cy2, respectivamente, se mezclaron
y se separaron por electroforesis bidimensional. Para la primera dimensión se usaron
tiras de poliacrilamida de 24 cm para un rango de pH de 3 a 11 NL (De izquierda a
derecha) y para la segunda dimensión se usaron geles SDS-PAGE de poliacrilamida al
10%. (A-B) Los geles se escanearon y se obtuvieron imágenes con la superposición de
los fluoróforos Cy3 y Cy5. (C-D) Estos mismos geles se marcaron con plata y se
escanearon. Se identificaron 53 manchas de proteínas (rodeadas en rojo)
significativamente desreguladas entre las muestras control y decidualizadas (pvalor≤0.05).
111
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Tabla. 6 Listado de proteínas identificadas por MALDI-TOF/TOF con cambios
significativos entre células ESC control y decidualizadas in vitro. aNúmero de spot,
que se corresponde con la numeración que aparece en los geles de plata de la figura 22
C-D (spots 1-53). bTasa de cambio (células ESC decidalizadas/control) calculada a partir
del análisis con el programa DeCyder. cP-valor obtenido al aplicar el test de la t. dCódigo
112
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
de acceso de la proteína a partir de la base de datos SwissProt. ePuntuación Mascot.
fValor
Mascot esperado. gPeso molecular (MW) y hpunto isoeléctrico (pI) teórico.
iNúmero
de péptidos analizados y jcobertura de secuencia para el candidato de
secuencia proporcionado por Mascot.
5.2.3. Validación de la tecnología proteómica mediante
Western blot.
Se seleccionaron dos proteínas reguladas a la alza: catepsina B y
transglutaminasa 2 y dos proteínas reguladas a la baja: transgelina y actinina
alfa 1, con el fin de validar los resultados obtenidos tras la aplicación de las
técnicas proteómicas. Estas proteínas se analizaron por la técnica Western blot
en 4 conjuntos de células ESC decidualizadas y control de los 6 usados en los
análisis DIGE. Los resultados obtenidos demostraban una regulación similar a
la que se había reportado en el análisis proteómico. Catepsina B y
transglutaminasa se encontraba regulada a la alza en las células ESC
decidualizadas (tasa de cambio de 1.4 y 1.7, respectivamente), mientras que
actinina alfa y transgelina se hallaron significativamente reducidas en las
células decidualizadas comparadas con las control (tasa de cambio de -4.5 y
-6.1, respectivamente) (Fig. 23A).
Se usaron 4 conjuntos de células ESC decidualizadas frente a control
que no habían sido analizadas por técnicas proteómicas, con el fin de extender
los resultados obtenidos a la población general. Los resultados coincidieron con
lo previamente reportado (Fig. 23B). La proteína GAPDH se usó como control
para normalizar la cantidad de proteína total en los experimentos de validación
realizados.
113
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 23 Validación de los experimentos DIGE para las proteínas actinina alfa,
transgelina, cathepsina B y transglutaminasa mediante Western blot. (A)
Extractos de proteínas (control = C y decidualizadas = D) obtenidas a partir de las
muestras endometriales usadas en los experimentos DIGE (n= 4 experimentos de
decidualización in vitro usados en el DIGE). (B) Experimentos de validación realizados
en un nuevo conjunto de muestras que no habían sido analizados previamente por
DIGE (n= 4 experimentos de decidualización in vitro no usados en el DIGE). GAPDH se
usó como control para normalizar la abundancia de proteína en todos los experimentos
realizados.
5.2.4. Análisis secretómico de las células decidualizadas
respecto a las células control.
Siete medios condicionados procedentes de células ESC control y
decidualizadas se colectaron en día 9 de cultivo y se analizaron
comparativamente mediante un array de proteínas (Fig. 24). La tabla 7 muestra
las proteínas secretadas diferencialmente, la tasa de cambio y los valores de
significatividad en forma de p-valor.
114
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Tabla. 7 Lista de proteínas secretadas diferencialmente debido al efecto del
proceso de decidualización. aNombre de la proteína, tal y como aparece en el array.
bTasa
de cambio (decidual/control). cP-valor obtenido al aplicar el test de la t.
cDescripción
de la proteína.
Tal y como era de esperar, se identificaron marcadores típicos del
proceso de decidualización: prolactina e IGFBP-1 con un aumento significativo
en el medio de células decidualizadas respecto al medio de células control
(p≤0.05). Sin embargo, también destacan la aparición de otros marcadores con
un aumento de secreción en el momento de decidualización, identificados por
primera vez en este proceso tal como MPIF-1, receptor beta IL-10, receptor IL21, PECAM-1, receptor tipo 2 IL-1, CD-80 receptor de leptina (tasa de cambio >
2, p-valor < 0.05). Únicamente dos proteínas, IL-6 y MCP-3 se encontraron
significativamente disminuidas en el medio decidual en comparación con el
medio de las células control (p-valor < 0.05).
115
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 24 Arrays de proteínas que muestran la abundancia proteica entre el
medio condicionado control y decidual. Array de membrana VIII de Raybiotech
incubado con medio condicionado de células ESC control (A) y decidualizadas (B). Las
proteínas incluidas en el array están proporcionadas por duplicado. La intensidad de
fluorescencia de cada punto se correlaciona con la abundancia de proteína en el medio
de cultivo analizado. Observamos la expresión diferencial de ciertas proteínas como IL-
21R, ICAM-2, CD80 y MPIF-1, reguladas a la alza en el medio condicionado decidual
respecto al control (flechas y círculos).
5.2.5. Validación del análisis secretómico mediante ELISA
Se llevó a cabo la validación para dos proteínas con aumento de
secreción (MPIF-1 y ILR1-RI) y disminuidas en el medio decidual (MCP-3 y IL-
6) respecto al medio de células control, mediante la técnica ELISA. Los
experimentos se llevaron a cabo en 4 conjuntos de medio condicionado frente a
116
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
control recolectados en día 9 de cultivo, los cuales ya habían sido usados
previamente en el estudio secretómico. Los resultados de estos análisis
demostraron una regulación similar al resultado del array de proteínas (Fig.
25A). Por un lado, MPIF-1 y ILR1-RI se encontraron significativamente
reguladas a la alza en el medio decidualizado comparado con el medio de ESC
control. Por otro lado, MCP-3 e IL-6 se hallaron significativamente reguladas la
baja en el medio decidualizado comparado con el medio de ESC control, tal y
como esperábamos.
Figura. 25 Validación de algunas proteínas obtenidas en el patrón secretómico,
tales como, MPIF-1, IL1 RII, MCP-3 y IL-6. (A) Se analizaron estas cuatro moléculas en
medio condionado procedente de 4 experimentos de decidualización in vitro ya usados
en el análisis secretómico. (B) Para validar los resultados fuera de población de estudio,
se analizaron 5 conjuntos de muestras adicionales control y decidual no usados en los
arrays de proteínas. Las proteínas se midieron por ELISA en el medio condicionado
(control=C y decidual=D) y los resultados en pg/mL se expresaron como media ± SEM.
* p-valor < 0.05, ** p-valor < 0.01
117
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Esta validación también se llevo a cabo analizando cinco muestras
adicionales de medio decidual respecto al control, que no habían sido usados en
el análisis secretómico para verificar si estos resultados se daban fuera de la
población de estudio. El análisis por ELISA corroboró los resultados obtenidos
por los arrays de proteínas (Fig. 25B). Estos resultados se evaluaron con el test
U de Mann-Whitney y mostraron que las diferencias observadas eran
estadísticamente significativas.
5.2.6. Generación del interactoma de la decidualización
Fruto del análisis proteómico llevado a cabo, se identificaron un total de
47 proteínas intracelulares y 18 extracelulares, diferencialmente expresadas en
ESC decidualizadas comparadas con control. De esas 65 proteínas, 44 se
unieron en una gran red proteica altamente interconectada gracias al empleo
de la herramienta informática Snow. Se permitió que el programa informático
añadiese una proteína adicional que uniese parejas de proteínas. La red final
contuvo 132 proteínas (44 proteínas nativas y 88 añadidas por el programa
Snow) y 378 interacciones (Fig. 26). También se incluyó en la red un total de 33
factores de transcripción (FT) que regulaban la expresión de las 65 proteínas,
hallados con ayuda de la base de datos Jaspar. Curiosamente, la base de datos
Fantom (Ravasi y cols., 2010) clasificó a cinco de esos FT (GATA2, GATA3,
SOX10, SPIB, TFAP2A) como “específicos”, lo que implica que estos factores de
transcripción se expresan de forma específica de tejido. Por otro lado, la base
de datos determinó que seis FT (USF1, ARID3A, ETS1, BRCA1, NFIC, YY1) se
clasificaran como “facilitadores”, o reguladores expresados constitutivamente.
118
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Los 734 genes diferencialmente expresados en el proceso de
decidualización publicados en el trabajo de Aghajanova y cols., (2010) se
cruzaron con nuestros datos proteómicos, con el fin de identificar los genes
cuya expresión diferencial se observase tanto a nivel génico como proteico.
Estos genes incluían proteínas nativas (Caldesmon 1, superoxido dismutasa,
actinina alfa 4, transgelina, calponina), factores de transcripción (NR4A y
BRCA1) y coincidieron con proteínas que constituían nodos adicionales (IGFBP-
1, NFKB1, laminina A/C, vimentina, vinculina, quinasa dependiente de ciclina 1,
serpina inhibidor de peptidasa E).
En la generación del interactoma de la decidualización resultó
interesante incorporar el papel que ejercían las hormonas progesterona y
estradiol, actúando a través de sus receptores PR, ES1 y ES2. Por ello, se
incorporaron estos receptores y se estudiaron las interacciones con las
diferentes proteínas que constituían la red. Destacaba la interacción con
diferentes factores de transcripción, que a la vez regulaban la expresión de una
gran cantidad de proteínas implicadas en este proceso.
Finalmente todas las proteínas y FT que componían la red se revisaron
manualmente y se clasificaron en 19 categorías funcionales que revelaron
aspectos interesantes de la biología de este proceso. Gran proporción de las
proteínas intracelulares se relacionaron con la organización del citoesqueleto,
con la composición de la matriz extracelular, implicadas en rutas de
transducción de señales, en procesos de adhesión celular, en el metabolismo del
ADN/ARN y en la degradación de proteínas, entre otros procesos.
119
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
120
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 26 Interactoma de la decidualización. Red de interacciones entre las
proteínas identificadas reguladas diferencialmente a nivel intracelular y extracelular en
nuestro análisis proteómico, junto con la información presente en las bases de datos
públicas. (Triángulo) Proteínas reguladas a la alza en nuestros análisis proteómicos.
(Cuadrado) Proteínas reguladas a la alza en nuestros análisis proteómicos. (Círculo)
Factores de transcripción. (Rombo) Proteínas de conexión añadidas para la
construcción de la red de interacciones. (Línea rosa) Interacciones directas entre
proteínas desreguladas encontradas en nuestros análisis proteómicos. (Línea azul)
Interacciones indirectas entre proteínas desreguladas y las conectoras. (Línea blanca)
Interacciones entre las proteínas y los factores de transcripción. (Línea roja)
Interacciones entre todas las proteínas y los receptores hormonales (PGR, ESR1 y
ESR2). Las proteínas se clasificaron en 19 categorías funcionales, indicadas por
diferentes colores en la leyenda. Aquellas proteínas que se encuentran remarcadas,
corresponden a genes cuya expresión diferencial se ha detectado tanto a nivel de
expresión génica como a nivel de proteína.
5.3. Análisis de anexina A2 y RhoA en la receptividad endometrial
5.3.1. Análisis de anexina A2 en el endometrio humano a lo
largo del ciclo menstrual.
En el análisis proteómico de la receptividad endometrial se encontró
anexina A2 (ANXA2) con un aumento de expresión significativo en el
endometrio en estado receptivo comparado con el estado pre-receptivo. Hasta
entonces solo habíamos descrito la expresión de esta molécula en fase pre-
receptiva y receptiva. Para conocer más acerca de la regulación y la localización
de esta molécula en el endometrio, se estudió a lo largo de todo el ciclo
menstrual por inmunohistoquímica y Western blot. Se comparó su expresión en
121
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
fase proliferativa (P), secretora temprana (STE), secretora media (SM) y
secretora tardía (STA) (Fig. 27).
Figura. 27 Análisis de la distribución de ANXA2 a la largo del ciclo menstrual en el
endometrio humano mediante inmunohistoquímica. El patrón de ANXA2 se
observó en el endometrio proliferativo (A), secretor temprano (B), secretor medio (C) y
secretor tardío (D). Se analizaron cinco muestras de cada fase del ciclo menstrual. (E) El
anticuerpo policlonal para ANXA2 no se adicionó y este tejido se usó como control
negativo. (F) No se observó señal en el testículo humano (usado como control
negativo). (G) Un intenso marcaje se detectó en la capa de epidermis (tejido control
positivo). Dentro del tejido podemos observar EP (epitelio) luminal y glandular, así
como las células del estroma (ES).
122
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
ANXA2 presentó una señal muy débil en el endometrio proliferativo y secretor
temprano, restringido solo a algunas células estromales y a la parte más apical
del epitelio luminal. El marcaje, sin embargo, fue muy intenso en el endometrio
en fase secretora media tanto a nivel de células estromales como epiteliales,
con prominencia en el epitelio glándular y luminal. Este marcaje se mantuvo
también intenso al visualizar en endometrio en fase secretora tardía (Fig. 27AD).
No se observó señal en el control negativo de endometrio, y tampoco al
visualizar una sección de testículo usado como tejido control negativo. Mientras
que se detectó una fuerte señal en la capa epidérmica de una sección de piel,
usada como tejido control positivo (Fig. 27G).
El análisis de ANXA2 mediante Western blot a lo largo del ciclo
menstrual corroboró el incremento de expresión que habíamos observado,
tanto en el endometrio secretor medio como en el tardío, en comparación con la
baja expresión vista en el proliferativo y el secretor temprano (Figura 28A). Se
realizó una densitometría de las bandas comprobando que este aumento era
significativo (Fig. 28B).
123
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 28 Análisis de ANXA2 a lo largo del ciclo menstrual en el endometrio
humano mediante Western blot. (A) Los extractos proteicos obtenidos a partir de
biopsia de endometrio en fase proliferativa (P), secretora temprana (STE), media (SM)
o tardía (STA) se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE y se inmunodetectaron
mediante la unión del anticuerpo anti-ANXA2. Se realizaron 3 experimentos Western
blot con muestras distribuidas a lo largo del ciclo. (B) Se realizó un análisis
densitométrico de ANXA2 en fase del endometrio proliferativa comparada con secretor
temprana, media y tardía, para los 3 experimentos de Western blot diferentes. La
abundancia se expresó en unidades relativas y normalizadas respecto GAPDH.
5.3.2. Efecto de la inhibición de ANXA2 endometrial sobre la
adhesividad.
Para estudiar la funcionalidad de ANXA2 sobre la adhesión embrionaria
al epitelio endometrial, se usó un modelo in vitro donde se analizaron los
efectos de inhibir ANXA2 mediante ARN de interferencia (ARNi) o aplicando un
tratamiento con la droga Witaferina A (WA). Este ensayo consistió en un
cocultivo de una monocapa confluente de la línea celular endometrial humana
HEC-1-A o las células epiteliales endometriales humanas (hEEC, human
Endometrial Epithelial Cells) primarias con blastocistos de ratón o esferoides
JEG-3 (línea celular derivada de trofoblasto humano).
124
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Se llevó a cabo una transfección transitioria en las células epiteliales
HEC-1-A y hEEC con una secuencia de ARN de interferencia específica para
ANXA2 humana (ARNi ANXA2) o con una secuencia aleatoria como control de
transfección (ARNi control). Transcurridas 24 horas después de la transfección,
se midieron los niveles de expresión del ARNm por RT-PCR y de proteína
mediante Western blot, comprobando que existía una reducción significativa
tanto de los niveles de ARNm como de proteína cuando las células eran tratadas
con ARNi ANXA2 comparadas con el control (Fig. 29).
Figura. 29 Efecto de la inhibición de ANXA2 mediante ARNi en las células HEC-1-A
y hEEC. (A) Las células se transfectaron con una secuencia control (ARNi control) o
ARNi específico para ANXA2 (ARNi ANXA2) y los niveles de ARNm se midieron por RT-
PCR. (B) Los niveles de proteína ANXA2 se midieron por Western blot. (C) Análisis
densitométrico de ARNi ANXA2 respecto al ARNi control en las células HEC-1-A y hEEC
procedentes de tres experimentos Western blot diferentes y expresada en unidades
relativas normalizadas con GAPDH.
125
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Las células tratadas con ARNi para ANXA2 experimentaban una
reducción significativa de la adhesión a blastocistos de ratón comparado con
los niveles de adhesión que mostraban las células control (Fig. 30A). Cuando
evaluamos la adhesión a esferoides JEG-3 también comprobamos el mismo
efecto de disminución respecto a las células control (Fig. 30B).
Figura. 30 Efecto de la inhibición de ANXA2 sobre la adhesión de las células HEC1-A y hEEC a los blastocistos de ratón y esferoides JEG-3. La adhesión de
blastocistos de ratón (A) y esferoides JEG-3 (D) sobre células tratadas HEC-1-A y hEEC
se expresó como porcentaje. Los valores se representan como la media ± SEM de tres
experimentos diferentes (n= 10-15 blastocistos de ratón o esferoides JEG-3 por
condición en cada experimento realizado) *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001.
En paralelo, realizamos un experimento donde tratamos las células
HEC-1-A y hEEC con la droga WA durante 24 horas. Se ha demostrado que esta
droga afecta a la funcionalidad de ANXA2 mediante su unión covalente,
provocando la alteración del citoesqueleto de actina (Falsey y cols., 2006).
Cuando las células se trataron con WA, el porcentaje de adhesión de
blastocistos de ratón disminuyó significativamente (Fig. 30A). Las células HEC-
126
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
1-A y hEEC tratadas con WA también experimentaron una reducción
significativa a la adhesión de esferoides JEG-3 comparado con las células
control (Fig. 30B).
Estos experimentos proporcionaron evidencias de que la alteración
funcional de ANXA2 usando dos aproximaciones diferentes induce un defecto
en la habilidad para adherirse los embriones de ratón o esferoides JEG-3 a las
células epiteliales.
5.3.3. Estudio del fenómeno de expansión del trofoblasto
cuando ANXA2 es inhibida.
Además de estudiar la inhibición de ANXA2 sobre la adhesión
embrionaria, decidimos extender nuestras observaciones para ver el efecto
sobre el fenómeno de expansión del trofoblasto. Las células HEC-1-A y hEEC se
transfectaron con ARNi ANXA2 o se incubaron con WA, como previamente se
ha descrito, y posteriormente se cocultivaron con blastocistos de ratón y
algunos de éstos acabaron adheridos sobre la monocapa celular. De aquellos
blastocistos adheridos, se hizo un seguimiento observando cómo tenía lugar la
expansión del trofoblasto. Se midió el área de expansión tras la adhesión y 48
horas después y se observó que las células con ANXA2 inhibida (transfectadas
con ARNi ANXA2 o tratadas con WA) mostraron una marcada disminución de la
expansión del trofoblasto comparado con las células control (Fig. 31A). Esta
disminución se analizó estadísticamente y se vió que era significativa respecto a
las células control (Fig. 31B).
127
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 31 Fenómeno de expansión del trofoblasto de ratón sobre las células
epiteliales tratadas para la inhibición de ANXA2. (A) Las células hEEC se
transfectaron con ARNi para ANXA2 o se trataron con WA, luego se cocultivaron con
blastocistos de ratón hasta que se produjera la adhesión embrionaria. Transcurridas 48
horas, se observó la expansión de los blastocistos de ratón sobre las células hEEC y se
rodeó usando una línea blanca. (B) El área de expansión del embrión se midió en
pixeles y los valores se representaron como la media ± SEM de tres experimentos
diferentes.
128
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.3.4. Análisis de la migración/proliferación de las células
epiteliales endometriales (hEEC) tras inhibir ANXA2.
El blastocisto se adhiere al epitelio endometrial y penetra a través de él,
ocasionando un daño en la superficie que será reconstituida mediante la
habilidad de las células epiteliales endometriales in vivo de migrar y/o
proliferar (Aplin., 2007) para cerrar de nuevo la superficie epitelial. Nosotros
realizamos un ensayo in vitro de “cierre del surco” para analizar la habilidad de
las células para sellar dicha superficie. Pasadas 24 horas después de la
inhibición funcional de ANXA2 mediante ARNi o WA, se realizaron surcos de
forma mecánica en las monocapas de células HEC-1-A y hEEC crecidas en
confluencia (Fig. 32A). Las anchuras de los surcos se midieron inmediatamente
y 24 horas después, y se determinó el porcentaje de cierre del surco (Fig. 32B).
La capacidad de cierre del surco en las células inhibidas con ARNi ANXA2 se
redujo significativamente en ambos tipos celulares (HEC-1-A y hEEC)
comparadas con las células control. El porcentaje de cierre del surco también
disminuyó notablemente en el caso de las células tratadas con WA al comparar
con las células control.
Por lo tanto, del experimento “cierre del surco” deducimos que la
capacidad de reconstitución/migración de las células epiteliales decrece
cuando ANXA2 es inhibida.
129
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 32 Migración/proliferación de las células endometriales al inhibir ANXA2.
(A) Se realizó un ensayo de “cierre de surco” sobre células control e inhibidas para
ANXA2 y se midió la anchura de la herida en el momento inicial y una vez transcurridas
24 h. (B) El porcentaje de cierre de la herida se determinó mediante el uso de un
software de análisis de imagen y los valores se representaron como la media ± SEM de
diez medidas tomadas a partir de tres experimentos diferentes. *P≤0.05, **P≤0.01
130
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.3.5. Efecto de la inhibición de ANXA2 sobre la proteína
RhoA.
Existen múltiples evidencias que sugieren que ANXA2 está ligada a la
vía de acción de RhoA regulando la adhesión celular (Rescher y cols., 2008;
Babbin y cols., 2007; Babiychuk y cols., 2002), por ello hemos evaluado los
efectos de inhibir ANXA2 sobre los niveles totales o de activación de RhoA (Fig.
33).
Figura. 33 La inhibición de ANXA2 mediante ARNi o tratamiento con WA sobre la
actividad de RhoA. (A) Los niveles de RhoA total en células HEC-1-A y hEEC control e
inhibidas para ANXA2 se evaluaron por Western blot. (B) Análisis densitométrico de las
bandas obtenidas a partir de tres experimentos diferentes y expresado como unidades
relativas normalizadas con GAPDH. (C) Los niveles de RhoA en forma activa (RhoAGTP) se analizaron por G-LISA. Se realizaron tres experimentos diferentes y los valores
se representaron como la media ± SEM del porcentaje de actividad de RhoA. *P≤0.05,
**P≤0.01, ***P≤0.001.
131
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Se analizaron los niveles totales de RhoA mediante Western blot en las
células HEC-1-A y hEEC tratadas con ARNi ANXA2 o WA (Fig. 33A). No se
encontró ningún cambio significativo en la banda de RhoA total al comparar
entre las células transfectadas con ARNi ANXA2 o tratadas con WA y las células
control (Fig. 33B).
También se examinó el estado de activación de RhoA en ambos tipos
celulares mediante un ensayo G-LISA. A diferencia del experimento anterior,
aquellas células transfectadas con ARNi ANXA2 o tratadas con WA presentaban
una reducción significativa en los niveles de RhoA activo comparadas con las
células control (Fig. 33C).
5.3.6. Efecto de la inactivación de RhoA sobre los niveles de
ANXA2.
En el siguiente experimento tratamos de comprobar que ocurría en los
niveles totales de la proteína ANXA2 cuando RhoA se inactivó (Fig. 34A). Para
inactivar esta molécula se llevó a cabo una transfección de las células HEC-1-A
con un mutante dominante negativo (RhoA T19N). Evaluando los niveles de
ANXA2 por Western blot, comprobamos que no se producían cambios
significativos al comparar las células control, las tranfectadas con plásmido
control (Wild-Type) y las transfectadas con RhoA T19N (Fig. 34B).
132
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 34 Efecto de la inactivación de RhoA sobre los niveles de ANXA2 de las
células HEC-1-A. (A) El extracto proteico de las células HEC-1-A control, transfectadas
con un plásmido control (Wild type) y un mutante dominante negativo RhoA (RhoA
T19N) se sometieron a un análisis Western blot para ANXA2 y GAPDH. (B) Análisis
densitométrico de ANXA2 en células transfectadas con el mutante RhoA T19N respecto
al control, realizado a partir de tres experimentos diferentes y expresado como
unidades relativas normalizada con GAPDH. *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001.
Se concluye pues que la inhibición de ANXA2 reduce significativamente
la actividad de RhoA, mientras que la inactivación de RhoA no produce efectos
en la expresión de ANXA2.
5.3.7. Análisis de RhoA en el endometrio humano a lo largo
del ciclo menstrual.
Hemos comprobado que la inhibición de ANXA2 ocasiona una
disminución en la actividad de RhoA, ello sugiere la posibilidad de que esta
molécula también se vea implicada en la capacidad de adhesión del embrión al
epitelio endometrial.
133
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
En primer lugar nos planteamos examinar la localización y regulación
de la proteína RhoA a lo largo del ciclo menstrual (Fig. 35), tal y como llevamos
a cabo anteriormente para ANXA2.
Figura. 35 Análisis de la distribución de RhoA total a lo largo del ciclo menstrual
en el endometrio humano mediante inmunohistoquímica. El patrón de RhoA total
se observó en el endometrio proliferativo (A), secretor temprano (B), secretor medio
(C) y secretor tardío (D). Se analizaron cinco muestras de cada fase del ciclo menstrual.
La intensidad de marcaje de la proteína RhoA total presentó un patrón
semejante en todas las fases del ciclo menstrual: proliferativo, secretor
temprano, medio y tardío (Fig. 35). Los niveles totales de proteína RhoA
134
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
también se evaluaron mediante Western blotting, comprobando que las bandas
no mostraban cambios diferenciales entre las diferentes fases del ciclo (Fig.
36A-B).
Figura. 36 Análisis de RhoA total y activo en el endometrio humano a lo largo del
ciclo menstrual. (A) El extracto proteico obtenido a partir de biopsia de endometrio en
fase proliferativa (P), secretora temprana (STE), media (SM) y tardía (STA) se sometió a
Western blot SDS-PAGE para RhoA total y GAPDH. (B) Análisis densitométrico realizado
a partir de tres experiementos diferentes y expresado como unidades relativas
normalizadas con GAPDH. (C) Actividad de RhoA obtenida a partir de análisis G-LISA en
el endometrio proliferativo, secretor temprano, medio y tardio. Se midió la absorbancia
a 490 nm. Los valores se representan como el porcentaje de actividad (media ± SEM) de
las diferentes fases dentro del estado secretor respecto a la fase proliferativa en tres
experimentos realizados.
135
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Por el contrario, cuando se analizaron los niveles de la forma activa de
RhoA mediante un ensayo G-LISA se observó un aumento significativo de los
niveles durante la fase secretora media comparada con la fase proliferativa, la
secretora temprana y la tardía (Fig. 36C). Esto constituye un fenotipo
compatible con la ventana de receptividad endometrial.
5.3.8. Efecto de la activación/inactivación de RhoA sobre la
adhesión embrionaria sobre las células HEC-1-A
En el experimento anterior vimos que en la fase secretora media,
cuando se abre la ventana de implantación, se produce un aumento de la
actividad de RhoA lo cual puede implicar una función sobre la adhesividad
embrionaria. Se analizó el efecto de activar e inactivar funcionalmente RhoA en
la línea celular de epitelio endometrial HEC-1-A mediante el uso de plásmidos.
Las células primarias hEEC no se transfectaron de forma adecuada con los
plásmidos utilizados, por tanto los siguientes estudios se desarrollaron usando
únicamente la nombrada línea celular. La transfección se llevó a cabo usando
plásmidos pcDNA3-GFP que contenían un mutante dominante negativo para
RhoA (RhoA T19N) o constitutivamente activo (Rhoa Q63L), también se
transfectó con el plásmido control (Wild type). La inactivación de RhoA también
se llevó a cabo tratando las células HEC-1-A con Toxina B obtenida a partir de
Clostridium difficile, la cual glicosila irreversiblemente a la proteína RhoA,
provocando una inactivación funcional de la molécula (Genth y cols., 2008).
Se realizó un ensayo pulldown para confirmar que se había producido
una correcta activación/inactivación de RhoA. Aquellas células transfectadas
con el plásmido constitutivamente activo RhoA Q63L presentaban un aumento
en los niveles de RhoA activo, mientras que las transfectadas con el mutante
136
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
dominante negativo RhoA T19N o la Toxina B presentaban menor nivel de
actividad. Los niveles totales de la proteína RhoA permanecieron sin variación
en todos los casos (Fig. 37A).
Los niveles de RhoA activo también se analizaron mediante un ensayo
G-LISA, donde se cuantificó el porcentaje de actividad de RhoA respecto al
control.
Este
ensayo
permitió
corroborar los
resultados
anteriores,
comprobando que el aumento o la disminución de RhoA activo en los diferentes
casos (RhoA Q63L, RhoA T19N y Toxina B) eran estadísticamente significativos
(Fig. 37B).
Figura. 37 Activación/inactivación de RhoA. (A) La forma de RhoA activa en las
células HEC-1-A control y tratadas con los plásmidos (Wild type, RhoA Q63L, RhoA
T19N) y con la toxina B se evaluó mediante un ensayo pull-down y los resultados se
observaron mediante Western blot. Los extractos proteicos obtenidos a partir de células
HEC-1-A se marcaron con GTPΥS o GDP para generar un control positivo y negativo. (B)
Los lisados celulares de células HEC-1-A control y tratados se sometieron a análisis
mediante ensayo G-LISA, midiendo la absorbancia a 490 nm. Los valores se
representaron como porcentaje de actividad (media ± SEM) respecto a las células
control en tres experimentos realizados.
137
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
La adhesión de blastocistos de ratón a las células HEC-1-A se redujo
significativamente cuando RhoA se inactivó con el mutante dominante negativo
RhoA T19N o mediante el tratamiento con Toxina B (Fig. 38A). Una observación
interesante fue que la adhesión embrionaria a las células HEC-1-A mejoraba
notablemente cuando eran transfectadas con el mutante constitutivamente
activo RhoA Q63L. También se observó una disminución dramática de la
adhesión de esferoides JEG-3 cuando se inactivaba RhoA en las células HEC-1-A
mediante transfección con RhoA T19N o tratándolas con toxina B, pero no se
consiguió mejorar la adhesión de éstos al transfectar las células con el mutante
constitutivamente activo RhoA Q63L (Fig. 38B). Estos resultados indican que el
estado de activación de RhoA se encuentra directamente implicado en la
adhesión embrionaria al epitelio endometrial.
Figura. 38 Efectos de la activación/inactivación de RhoA en la dhesión de
blastocistos de ratón o esferoides JEG-3 a células HEC-1-A. Se evaluó el porcentaje
de adhesión de embriones de ratón (A) y esferoides JEG-3 (B) a las células HEC-1-A
control. Los valores se representan como la media ± SEM de tres experimentos
diferentes (n= 10-15 blastocistos de ratón o esferoides JEG-3 por condición en cada
experimento realizado) *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001.
138
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
5.3.9. Papel de ANXA2 y RhoA regulando la adhesividad de
las células hEEC al embrión.
Nos planteamos examinar la posible relación entre ANXA2 y la actividad
de RhoA, investigando el efecto sobre la adhesión embrionaria de inhibir
ANXA2 combinado con la activación/inactivación de RhoA sobre las células
HEC-1-A (Fig. 39A). Se comprobó que la inhibición de ANXA2 (ARNi ANXA2)
junto con la inactivación de RhoA (RhoA T19N) disminuye significativamente la
adhesión de esferoides JEG-3 sobre las células HEC-1-A comparadas con las
células control, aunque no existían diferencias significativas al comparar la
aplicación de estos tratamientos de forma individual. Por lo tanto, la doble
inhibición/inactivación no potenciaba un defecto mayor sobre la adhesión
embrionaria a células epiteliales.
Sin embargo, cuando se inhibió ANXA2 (ARNi ANXA2) y se activó RhoA
(RhoA Q63L) el porcentaje de adhesión de esferoides JEG-3 sobre las células
HEC-1-A no descendió, sino que fue similar al de las células control. Ello
indicaba que la expresión de RhoA constitutivamente activo revertía
parcialmente los defectos en adhesión embrionaria provocados por la
inhibición de ANXA2.
Para tratar de entender la posible vinculación entre ANXA2 y RhoA en
las células endometriales epiteliales, llevamos a cabo un estudio de localización,
mediante inmunocitoquímica doble sobre células HEC-1-A (Fig. 39).
139
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura
39.
Efecto
de
la
inhibición
de
ANXA2
combinado
con
la
activación/inactivación de RhoA sobre la dhesión de esferoides JEG-3 a las
células HEC-1-A. (A) Análisis de la adhesión de esferoides JEG-3 sobre células HEC-1-A
transfectadas con ARNi ANXA2, plásmidos RhoA T19N, RhoA Q63L o una combinación
de ARNi ANXA2/ RhoA T19N y ARNi ANXA2/RhoA Q63L. (B) Las células epiteliales
HEC-1-A se sometieron a un marcaje doble para ANXA2 (rojo) y RhoA (verde) y se
visualizó una clara colocalización a la largo de la membrana (mezcla). La sección XZ
muestra la colocalización de las proteínas ANXA2 y RhoA a lo largo de la membrana
lateral y apical con más detalle.
140
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Se observó una señal intensa de ANXA2 fundamentalmente a nivel de la
membrana plasmática, donde mayoritariamente colocalizó con RhoA (Fig. 39B).
RhoA también presentaba señal en el compartimento citoplasmático,
coincidente con un patrón de localización que ya ha sido reportado en otros
tipos de células epiteliales (Yonemura y cols., 2006). Por lo tanto, se comprobó
que ambas proteínas tenían una distribución celular similares, presentando un
patrón claro de colocalización a nivel de la membrana plasmática de las células
epiteliales.
5.3.10. Regulación de la reorganización del citoesqueleto por
ANXA2 y RhoA.
Existen trabajos donde se detalla que tanto ANXA2 como RhoA son
proteínas implicadas en la regulación del citoesqueleto de actina en células
epiteliales (Hayes y cols., 2006; Heneweer y cols., 2003). Se ha demostrado que
ANXA2 y RhoA tienen una función en la restructuración dinámica de la F-actina,
proceso que resulta fundamental para la adhesión del trofoblasto y la
reconstitución de las células epiteliales (Thie y cols., 1997). Por tanto, se llevó a
cabo un análisis de la localización subcelular de ANXA2 y RhoA respecto a la
distribución de F-actina, que constituye una diana importante sobre la que
actúan estas moléculas. Después de la doble inmunocitoquímica de ANXA2/F-
actina y RhoA/F-actina, se observó de nuevo que la señal tanto de ANXA2 como
RhoA aparecía distribuida mayoritariamente a lo largo de la membrana
plasmática de las células epiteliales endometriales donde colocalizaba con la
red de filamentos de actina (Fig. 40A).
141
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
Figura. 40 Análisis del remodelado de F-actina que se produce cuando ANXA2 es
inhibida o RhoA es inactivada. (A) ANXA2 (verde) y RhoA (verde) se colocalizaron
con las fibras F-actina (rojo) en las células epiteliales. (B) La arquitectura de F-actina en
las células HEC-1-A control, inhibidas para ANXA2 e inactivadas para RhoA se visualizó
con un marcaje con rodamina-faloidina.
142
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
El siguiente objetivo, fue analizar los efectos de la inhibición de ANXA2
y de la inactivación de RhoA sobre la arquitectura de F-actina en las células
HEC-1-A, aplicando una tinción con Faloidina marcada con rodamina B. Se
comprobó que la inhibición de los niveles de ANXA2 y la inactivación de RhoA
inducen modificaciones significativas en la distribución de las fibras de F-actina
(Fig. 40B).
Las células control presentaban una morfología redondeada con una red
de filamentos de actina distribuidas a lo largo de la periferia celular. Por el
contrario, aquellas células con ANXA2 inhibida o con RhoA inactivo
presentaban agrupaciones de fibras extendidas por todo el compartimento
citoplásmico, con un fenotipo celular alargado. Los agregados de actina
presentaban tamaños variables y una distribución muy irregular a lo largo de
toda la superficie celular.
Este análisis de la arquitectura de actina después de la inhibición de
ANXA2 o la inactivación de RhoA, no sólo se llevo a cabo a nivel morfológico
sino que se completó con un ensayo a nivel bioquímico. Se estudió la
proporción de actina globular (G-actina) en forma monómerica, que se hallaba
libre en el citosol de la célula, comparado con la actina filamentosa (F-actina),
incorporada en las fibras que constituyen el citoesqueleto (Fig. 41A). Este
ensayo se llevó a cabo en células control, en células donde ANXA2 estaba
inhibida (mediante ARNi ANXA2 o WA) y en células con RhoA inactivado
(mediante RhoA T19N o Toxina B). La relación entre G/F-actina en el caso de
las células control fue 1:1, mientras que cuando la ANXA2 se inhibió la relación
se modificó notablemente con un aumento significativo del contenido de Gactina respecto a F-actina (una relación de 6:1 en el caso de células
143
__________________________________________________________________________________5. RESULTADOS
transfectadas con ARNi ANXA2 y de 3:1 en las células tratadas con WA) (Fig.
41B). Los resultados cuando RhoA se inactivó a nivel celular fueron similares,
con un incremeno significativo en la cantidad de G-actina comparada con la F-
actina (una relación de 3:1 en el caso de células transfectadas con Rhoa T19N y
de 4:1 en las células tratadas con Toxina B) (Figura 41B). Este experimento
corroboró que tanto la inhibición de ANXA2 como la inactivación de RhoA
provocan una despolimerización de los filamentos de actina y por tanto, un
incremento en la fracción de actina monómerica libre en el citosol. Ambos
estudios, a nivel morfologíco y bioquímico, demuestran que se produce una
significativa desorganización de las fibras de F-actina cuando se inhibe ANXA2
o se inactiva RhoA.
Figura. 41 Análisis bioquímico de la proporción de G/F-actina de las células HEC1-A cuando ANXA2 es inhibida o RhoA es inactivada. (A) La actina G (soluble),
actina F (filamentosa) y la fracción total de las células HEC-1-A inhibidas para ANXA2 e
inactivadas para RhoA se analizaron mediante un ensayo in vivo y los resultados se
observaron por Western blot. (B) Se realizó un análisis densitométrico a partir de tres
experimentos diferentes, y se expresó como ratio de G/F actina normalizados con la
proporción de actina total.
144
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
6. DISCUSIÓN
145
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
146
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
6. DISCUSIÓN
El conocimiento científico acerca del proceso de receptividad endometrial
resulta fundamental para entender los mecanismos moleculares que regulan el
proceso de implantación embrionaria y por tanto, la reproducción humana. La
expresión diferencial de genes en el sistema embrión-endometrio regula la
expresión de proteínas, preparando a las células del sistema para todos los
procesos asociados a la implantación del blastocisto en las fases de
colocalización, adhesión e invasión. El hallazgo de biomarcadores durante la
ventana de implantación endometrial permitiría el diseño de nuevos elementos
diagnósticos de utilidad clínica en la determinación de la receptividad
endometrial, así como la identificación de posibles dianas terapéuticas, en
procesos de infertilidad, endometriosis, preeclampsia o en carcinomas
endometriales. Por el contrario, este conocimiento también podría ser
empleado para diseñar interceptivos con el fin de prevenir la implantación
embrionaria (Simón y cols., 1992).
•
La proteómica aplicada a la receptividad endometrial
La primera parte de la tesis consistió en estudiar en profundidad la
implicación activa del endometrio en la reproducción humana, mediante la
adquisión del estado de receptividad, imprescindible para la implantación
embrionaria y el desarrollo de la gestación.
El endometrio es un órgano activo y dinámico cuya función principal es
hacer posible la implantación del embrión y el desarrollo fetal y su existencia
147
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
constituye la condición sine qua non para la continuidad de la especie en
mamíferos.
La mejora de nuestro conocimiento en otras áreas de la reproducción
humana contrasta con el bajo desarrollo de la investigación en el endometrio.
En la actualidad, aun se sigue empleando para el dataje endometrial criterios
diagnósticos exclusivamente morfológicos que se crearon hace más de 50 años
por Noyes (Noyes y cols., 1950) y desconocemos la etiología de la
endometriosis que se descubrió hace 146 años (Von Rokitasnski, 1860). El
enorme desarrollo de la biología molecular ha permitido profundizar en el
estudio de los procesos biológicos, tanto fisiológicos como patológicos.
Clásicamente, los estudios llevados a cabo analizaban la expresión de un único
gen y/o proteína, o un conjunto muy reducido de éstos en los distintos tejidos.
Con la secuenciación del genoma humano y el desarrollo de nuevas tecnologías
se ha entrado de lleno en la era genómica. En esta era han surgido las
denominadas ciencias “ómicas” (genómica, transcriptómica, proteómica y
metabolómica), que han supuesto una auténtica revolución en la biología
molecular clásica. Mediante la transcriptómica, se ha conseguido establecer que
genes son esenciales en el desarrollo del estatus receptivo del endometrio (Kao
y cols., 2002; Carson y cols., 2002; Borthwick y cols., 2003; Riesewijk y cols.,
2003; Mirkin y cols., 2005; Horcajadas y cols., 2004; Horcajadas y cols., 2007).
A diferencia del genoma, el proteoma es altamente complejo, dinámico y
variable, dependiente no sólo del grado de desarrollo de la célula, tejido u
organismo implicado, sino también de su interacción con el ambiente que lo
rodea. A pesar de algunos retos técnicos que imponen ciertas limitaciones a la
aplicación de las tecnologías proteómicas al estudio de la receptividad
endometrial, este abordaje puede proporcionar un tipo de información sin
148
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
precedentes. Por todo ello, se hizo necesaria la investigación proteómica del
endometrio humano mediante la utilización de las nuevas tecnologías
existentes, que nos puedan dar nuevas posibilidades para mejorar nuestra
capacidad diagnóstica y terapéutica.
Desde esta nueva perspectiva “ómica”, se llevó a cabo un intento inicial
con el fin de identificar biomarcadores del proceso de receptividad endometrial
comparando el endometrio proliferativo con el secretor mediante tecnología
proteómica (De Souza y cols., 2005). Este grupo llevó a cabo una primera
aproximación para estudiar el repertorio proteico usando técnicas de marcaje
isotópico (ICAT), purificación por afinidad y cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas en línea (LC-MS). Solo cinco proteínas mostraban
alteración clara en sus niveles de expresión entre el endometrio proliferativo y
secretor, siendo el proto-oncogen FRAT1 y el precursor de la subunidad zeta 1
del receptor del glutamato NMDA las proteínas de mayor interés.
Unos años después, Parmar y cols publicaron un estudio prospectivo
identificando proteínas con expresión diferencial a lo largo del ciclo menstrual
(Parmar y cols., 2009). Compararon el endometrio en fase proliferativa con la
fase secretora media mediante 2D-DIGE (electroforesis bidimensional
diferencial en gel). El posterior análisis mediante espectrometría de masas
reveló una sobreexpresión de calreticulina, la cadena beta de fibrinógeno,
isoenzima adenilato ciclasa 5 y la transferrina en el endometrio proliferativo; y
anexina A5, antitripsina alfa 1, creatinin quinasa y peroxidoxina 6 en la fase
media secretora si se compara con la otra fase.
Estos trabajos obtuvieron un repertorio proteíco muy restringido y
ninguna de estas proteínas han sido identificadas en nuestro estudio,
149
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
probablemente sea debido a la diferente naturaleza de las muestras utilizadas
para el análisis (endometrio proliferativo y secretor usado por estos grupos
versus LH+2 y LH+7 usado en nuestro estudio) y debido a las diferentes
técnicas proteómicas empleadas.
Nuestro estudio de proteómica de la receptividad endometrial se basó
en la separación y cuantificación de proteínas mediante la técnica DIGE, la
identificación de aquellas proteínas diferencialmente expresadas en el estado
de receptividad endometrial (LH+7) respecto al pre-receptivo (LH+2), seguido
de un análisis mediante espectrometría de masas tipo MALDI-MS y finalmente
una búsqueda en la base de datos Mascot.
El listado de proteínas diferencialmente expresadas se comparó con la
información
disponible
en
la
base
de
datos
de
endometrio
(www.endometrialdatabase.com), donde se encuentran recopilados los
patrones de expresión génica del endometrio receptivo comparado con el pre-
receptivo, aportado por diferentes grupos de investigación. Aunque algunas de
las proteínas identificadas en nuestro estudio reguladas a la alza o a la baja
coincidieron con los patrones de expresión génica, tales como estatmina 1,
anexina A2, oxidasa monoamina A, componente 1 del receptor de progesterona
asociado a membrana, colágeno alfa 1, anexina 4 y la proteína S100-A10
(Riesewijk y cols., 2003; Mirkin y cols., 2005), en otros estudios
transcriptómicos se obtuvieron muchos otros genes desregulados que no se
correlacionaron con las proteínas con expresión diferencial halladas en nuestro
trabajo. Se sabe que en ocasiones la identificación de una alteración a nivel de la
expresión génica no siempre se correlaciona con cambios a nivel de proteína
(Chen y cols., 2002) y ello es explicado en gran parte a la existencia de las
modificaciones post-transcripcionales.
150
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Ello demuestra que existen diferentes aproximaciones para estudiar la
complejidad
de
los
procesos
biológicos
que
aportan
información
complementaria, y resulta evidente que lo más efectivo es un análisis integral a
diferentes niveles, tanto expresión génica como proteica (Nie y cols., 2006). Un
análisis integrado a escala global de los datos transcriptómicos y proteómicos
podría proporcionar un gran conocimiento acerca de los mecanismos
subyacentes a los procesos biológicos complejos, tales como la receptividad
endometrial y la implantación embrionaria. Sin embargo, en la mayor parte de
procesos fisiológicos la relación entre la abundancia de una proteína y su nivel
de expresión de ARNm es complicada, debido a ello se requieren sofisticados
modelos estadísticos para captar esta relación.
Además, resulta llamativo que los estudios transcriptómicos en
receptividad endometrial den como resultado un conjunto muy elevado de
genes alterados comparado con el escaso número de proteínas alteradas que se
identifican en nuestro estudio proteómico. Por un lado, esto se podría explicar
debido a las limitaciones de la tecnología 2D-DIGE. En dichas técnicas, no se
pueden analizar proteínas fuera del rango de pH que hemos seleccionado (en
nuestro caso, pH entre 3 y 11), además se pierden aquellas proteínas de gran
tamaño o tamaño muy pequeño, y también se encuentra dificultad analizando
proteínas muy hidrofóbicas o aquellas que son menos abundantes. Por otro
lado, existen proteínas implicadas en receptividad que son secretadas al
exterior celular y por tanto, no se encuentran en una biopsia endometrial.
•
Proteínas relevantes en receptividad endometrial
En este trabajo resulta interesante destacar que se encontraron dos
proteínas, estatmina 1 y anexina A2, ambas relacionadas con el citoesqueleto,
que presentan una regulación opuesta de forma consistente entre el
151
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
endometrio pre-receptivo y receptivo. Además cuando se analizaron sobre un
endometrio en estado refractario inducido por la inserción de un DIU, se
observó una notable reversión del patrón de expresión de estas dos proteínas.
El hecho de que estas dos proteínas implicadas en el citoesqueleto se
encuentren desreguladas, no resulta sorprendente, ya que para la consecución
del fenotipo de receptividad endometrial se requiere un remodelado de la
organización epitelial que tiene lugar como resultado de una disrupción del
citoesqueleto.
La proteína estatmina 1, conocida como Oncoproteína 18 o p19, es una
fosfoproteína altamente conservada de 19 kDa que tiene cuatro residuos de
serina en su extremo N-terminal (Irwin y cols., 1989; Thie y cols., 1995) y actúa
como reguladora de la dinámica de los microtúbulos durante la progresión del
ciclo celular. La estatmina interactúa con dos moléculas de tubulina dimérica
para formar un complejo ternario muy apretado, llamado complejo T2S (Sobel,
1991). Cuando la estatmina secuestra a la tubulina en el complejo T2S, la
tubulina se hace no polimerizable y sin esta polimerización no se pueden
ensamblar los microtúbulos. A través de este mecanismo, la estatmina estimula
el desensamblaje de los microtúbulos (Larsson y cols., 1997), sin actuar
directamente en el extremo de los mismos.
La regulación de la estatmina es dependiente del ciclo celular y está
controlada por las proteínas quinasas en respuesta a señales específicas (Doye
y cols., 1992). La fosforilación de la estatmina 1 en alguno de sus cuatro
residuos de serina: Ser16, Ser25, Ser38 y Ser63, por la acción de diferentes
quinasas provoca una unión más débil a la tubulina. Ello incrementa la
concentración de tubulina disponible en el citoplasma para el ensamblaje de los
152
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
microtúbulos. Por tanto, impide su acción en la desestabilización de los
microtúbulos, y por contra, se promueve la polimerización.
Se ha descrito que los niveles de estatmina 1 se regulan específicamente
en el sitio de implantación del embrión, y se encuentran regulados a la baja
durante el proceso de decidualización en roedores (Tamura y cols., 2003;
Yoshie y cols., 2004). En la especie humana, estatmina 1 se asocia con procesos
de proliferación y/o diferenciación endometrial. Cuando las células estromales
se decidualizan, se observa una disminución en los niveles de estatmina 1 y
cuando se interfirie su expresión mediante ARNi se inhibe la decidualización
(Tamura y cols., 2006). Nuestros resultados indican que estatmina 1 se
encuentra regulada a la baja en el endometrio receptivo, lo cual apoya a la
hipótesis de que bajos niveles de esta molécula promueven o apoyan al proceso
de decidualización, y los altos niveles de estatmina 1 durante la fase prereceptiva podría estimular la proliferación de las células estromales, así como
se ha mostrado en otros tipos celulares (Rowlands et al., 1995). La reducción en
los niveles de estatmina 1 en el endometrio receptivo no resulta sorprendente
debido al alto contenido en células estromales y al masivo proceso de
decidualización que tiene lugar.
La fosforilación de estatmina 1 podría regular la cantidad de proteína
activa que se encuentra presente en el estroma, generándose un gradiente de
proteína fosforilada/desfosforilada. Concretamente, la fosforilación a nivel de la
Ser16 y Ser63 provoca una disminución de la actividad desestabilizadora de
microtúbulos, y la fosforilación en múltiples sitios de la estatmina 1 es
necesaria para que tenga lugar la progresión del ciclo celular (Rubin y Atweh,
2004). De hecho, en el análisis proteómico se detectó que una de las formas de
proteína estatmina 1 fosforilada en al menos la Ser25 se encontraba regulada a
153
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
la baja en el endometrio receptivo, sugiriendo que el sistema de funcionamiento
de esta molécula, implicada en cambios a nivel endometrial, es complejo y
requiere de más investigación para comprenderlo. Además, se comprobó que
el patrón de expresión de estatmina 1 en un endometrio refractario inducido
con un DIU se revierte completamente, observándose un marcaje muy elevado
en estroma, tal y como ocurre en la fase pre-receptiva. De acuerdo con el
mecanismo que hemos descrito anteriormente esta desregulación, podría estar
inhibiendo la decidualización, y por lo tanto, interferir en el proceso de invasión
del embrión.
Como hemos nombrado, hay estudios que sugieren que la estatmina
está implicada en la proliferación de células endometriales humanas
promoviendo la desestabilización de los microtúbulos y permitiendo la
formación de nuevas redes (Tamura y cols., 2006). Nuestra hipótesis es que
esta proteína está implicada en la proliferación de las células estromales
(regulada a la alza en la fase pre-receptiva) que son la capa funcional del
endometrio y por tanto, es clave en la preparación para la implantación
embrionaria. Se requiere un descenso en los niveles de esta molécula para que
tenga lugar el proceso de decidualización, como otros estudios han mostrado.
Anexina A2 es una proteína relacionada con el mantenimiento de la
dinámica del citoesqueleto (Hayes y cols., 2006). Extrapolando a la situación in
vivo, conocemos que una modulación activa del citoesqueleto de actina debe
producirse cuando el epitelio endometrial adquiere un estado de receptividad.
Así que, ANXA2 a través de su ruta biológica podría estar relacionada con los
mecanismos de señalización y efectores que específicamente controlan la
reordenación del
citoesqueleto
de
actina
en las
células
epiteliales
endometriales. Por este motivo, nos resultó muy interesante extender nuestra
154
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
investigación analizando el posible papel de anexina A2 durante la
implantación embrionaria. Posteriormente profundizaremos más sobre esta
molécula.
•
La proteómica aplicada al proceso de decidualización
En nuestro primer objetivo encontramos algunas proteínas, tales como
estatmina, que desarrollan su función principal a nivel de las células estromales
endometriales, y por tanto, posiblemente se encuentren implicadas en el
proceso de decidualización. Este proceso resulta crítico para que tenga lugar el
establecimiento y mantenimiento de un embarazo exitoso. Consiste en una
compleja transformación que requiere cambios morfológicos y funcionales en
la estructura y la fisiología celular. De ello se deduce que se trata de un proceso
donde están implicadas un número elevado de proteínas tanto a nivel
intracelular como secretadas. Por tanto, en esta segunda parte de la tesis nos
planteamos llevar a cabo el estudio del proceso de decidualización desde el
punto de vista proteómico. La información resultante es de gran utilidad para
conocer más acerca de la fisiología de este proceso, así como para detectar
anormalidades a nivel endometrial que podrían ser causantes de esterilidad o
de aborto.
Además, hasta la fecha, se habían desarrollado pocos estudios para estudiar
el proteoma de células decidualizadas in vitro. Encontramos un estudio donde
se indujo la decidualización de las células estromales endometriales y se
trataron con la proproteína convertasa 6 (PC6). Tras ello, se llevó a cabo un
análisis proteómico para ver la implicación de esta proteína sobre el proceso de
decidualización (Kilpatrick y cols., 2009). En otro estudio más reciente, se
estudiaban células estromales decidualizadas con AMPc, mediante DIGE e
155
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
identificación por espectrometría de masas. Pero resultó muy deficiente, ya que
de las 88 proteínas que se detectaron como diferencialmente expresadas,
finalmente solo se identificaron 18 (Paule y cols., 2010).
Nosotros analizamos el repertorio a nivel proteómico y secretómico de
células del estroma procedentes de biopsias endometriales que se
decidualizaron in vitro. El modelo de decidualización in vitro es una
herramienta ampliamente extendida y establecida para el estudio de este
proceso. Una vez aisladas y cultivadas las células estromales, podemos inducir
su decidualización mediante la aplicación de progesteronaβ y -estradiol, así
como también se puede inducir mediante la administración de monofosfato
cíclico de adenosina (cAMP), segundo mensajero de este proceso. En este
trabajo nos hemos decantado por la aplicación de la terapia hormonal, para
acercarnos de forma más estrecha a la situación fisiológica que tiene lugar in
vivo.
El análisis proteómico del proceso de decidualización fue similar al aplicado
en el caso del estudio de la receptividad endometrial, basado en la separación
de proteínas mediante la técnica DIGE, la identificación de aquellas proteínas
diferencialmente expresadas en las células decidualizadas respecto a las no
decidualizadas, seguido de un análisis mediante espectrometría de masas tipo
MALDI-MS y finalmente una búsqueda en la base de datos Mascot. En este
análisis se encontraron 60 proteínas diferencialmente expresadas, que incluían
marcadores ya conocidos como catepsina B (Afonso y cols., 1997) y nuevos
biomarcadores como transglutaminasa 2 y peroxiredoxina 4.
Por otro lado, se estudió el patrón de proteínas consumidas o secretadas en
el medio de cultivo mediante el uso de un array de citoquinas llamado Human
156
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Cytokine Antibody Array G Series 2000 (Raybiotech). Con esta estrategia
conseguimos un análisis secretómico parcial, ya que se estudiaron un conjunto
de las 174 citoquinas humanas incluidas en el array, mientras que aquellas
proteínas que no fueron incluidas no se detectaron. No obstante, el modelo de
array escogido para realizar este análisis recoge las proteínas más relevantes
secretadas en gran parte de proceso biológicos.
Fruto de estos análisis hemos identificado proteínas importantes
implicadas
en
el
proceso
de
decidualización,
tanto
expresadas
intracelularmente, como secretadas al espacio extracelular. Todo este conjunto
de proteínas se han categorizado funcionalmente y ello nos revela aspectos
muy interesantes de la biología de este proceso.
•
Proteínas relevantes a nivel intracelular
En primer lugar vimos que una gran proporción de proteínas reguladas
intracelularmente se encontraban relacionadas con la organización del
citoesqueleto. Dado la importancia de la reestructuración del citoesqueleto
durante la decidualización, no resulta sorprendente que el 28% de proteínas
encontradas en este trabajo estén relacionadas con el citoesqueleto, y por tanto,
sufren una estrecha regulación durante este proceso. Este hallazgo se
corroboró por un trabajo anterior, donde también se identificaron muchas
proteínas implicadas en la estructura celular y en la remodelación del
citoesqueleto (Paule y cols., 2010). Recientemente se ha demostrado que la
desestabilización del citoesqueleto acelera la decidualización, mientras que un
aumento en los niveles de fosforilación de la cadena ligera de miosina impide la
decidualización (Ihnatowch y cols., 2007). Algunas de ellas, como transgelina,
conocida como proteína 22 del músculo liso (SM22) (Nair y cols., 2006), no
157
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
habían sido descritas anteriormente en decidualización humana, y por lo tanto
constituye un biomarcador intracelular novedoso.
Además, se vió que la iniciación de la decidualización estaba
acompañada con un aumento significativo de actina (tanto actina beta como
gamma) y una disminución de actinina alfa. La regulación de componentes del
citoesqueleto parece clave para este fenómeno, además existen estudios que
demuestran que una disrupción de los filamentos de actina por acción de
drogas específicas como jasplaquinolida, alteran el curso de la decidualización
(Ihnatowch y cols., 2009).
En segundo lugar, vimos modificaciones importantes en moléculas
implicadas en la composición y degradación de la matriz extracelular, como la
disminución de las metaloproteasas (MMP2, MMP3 y MMP14) e incremento de
los inhibidores de proteasas como TIMP1. El balance entre estas proteínas
resulta fundamental para controlar la invasión del trofoblasto en las células
deciduales (Osteen y cols., 1994).
•
Proteínas secretadas/consumidas relevantes durante el
proceso de decidualización
Las células deciduales actúan como una fuente de factores de
crecimiento y citoquinas que ejercen control y apoyo sobre la invasión del
trofoblasto (Finn, 1997; Glasser y cols., 1991). En nuestro análisis de
secretómica parcial se encontraron 13 proteínas diferencialmente secretadas al
comparar el medio de células ESC decidualizadas con aquellas sin decidualizar
(11 reguladas a la alza y 2 a la baja). Además de marcadores bien conocidos
158
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
como IGFBP-1 y prolactina, se encontraron por primera vez otras proteínas
implicadas en este proceso como MPIF-1.
MPIF-1, proteína también conocida como CCL23 muestra actividad
quimiotáctica para monocitos, linfocitos T inactivos y neutrófilos, pero no para
linfocitos T cuando están activados. Esta quimioquina participa en la
señalización celular, quimiotaxis, respuesta inflamatoria e inmune (Patel y
cols., 1997). Se ha visto que en cultivo tridimensional en matrigel la proteína
MPIF-1 humana induce la migración de células endoteliales y la formación de
vasos sanguíneos a través de la unión al receptor CCR1 (Son y cols., 2006). La
neutralización de esta molécula con los anticuerpos anti-MPIF-1 y anti-CCR1,
produce un bloqueo de la invasión de las células HUVECs con MPIF-1 activada.
Estos resultados nos indican que MPIF-1 podría tener un papel en la
angiogénesis que tiene lugar en el tejido decidual.
Por otro lado, se encontraron moléculas como IL-6 y MCP-3 que estaban
reguladas a la baja en el medio de células ESC decidualizadas comparadas con el
medio de células control. Se ha descrito que la proteína interleuquina 6 (IL-6)
tiene un efecto en estimular la invasión del citotrofoblasto durante el primer
trimestre de embarazo, mientras que anti-IL-6 inhibe este efecto (Jovanovic y
Vicovac., 2009). MCP-3, también conocida como CCL7, es un factor
quimiotáctico que se une a diferentes receptores CCR1, CCR2 y CCR3. Existen
ensayos de migración que han utilizado la línea celular del trofoblasto que más
se asemeja el citotrofoblasto extravelloso (AC1M-88), y muestran que la
migración del trofoblasto no se produce en respuesta a MCP-3 (Hannan y cols.,
2006).
159
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
•
Integración de la información protéomica y secretómica del
proceso de decidualización
Concluyendo este segundo estudio, se generó por primera vez un
modelo de la decidualización humana usando herramientas bioinformáticas
complejas. Se combinaron nuestros datos proteómicos y secretómicos en una
gran red proteíca altamente interconectados, a la cúal denominamos
interactoma. Además se integró con la información transcriptómica del proceso
de decidualización, ya publicada en otros estudios (Aghajanova y cols., 2010).
Resultó llamativo que el número de genes cuya expresión diferencial fuese
observada tanto a nivel génico como proteico fue muy reducido, únicamente
cuatro: caldesmon 1, superoxido dismutasa, actinina alfa 4, transgelina,
calponina. Al igual que en nuestro primer trabajo, de nuevo se muestra la baja
correlación existente entre los análisis transcriptómicos y proteómicos, y que
no siempre variaciones a nivel de expresión génica se plasman a nivel proteíco.
Podría deberse a la existencia de modificaciones postranscripcionales, así como
las limitaciones de las tecnologías proteómicas. Por ello, resulta muy útil
estudiar procesos biológicos complejos como la decidualización desde
diferentes perspectivas: transcriptómica, proteómica y secretómica, e integrar
toda esta información, tal y como hemos desarrollado en este trabajo.
Este sistema se complementó con la incorporación de aquellos factores de
transcripción que controlaban la expresión de las diferentes proteínas que
contituyen el interactoma. Gracias a este modelo pudimos ver como
interaccionan entre sí los componentes intracelulares con los secretados,
además de observar como tiene lugar la regulación génica de todas estas
proteínas por la acción de los factores de transcripción.
160
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
También cabe destacar la importancia de las hormonas esteroideas para
desencadenar la cascada de señalización que induce el proceso de
decidualización. Por esta razón, los receptores hormonales de progesterona
(PGR) y estradiol (ESR1 y ESR2) se incorporan en el interactoma, con el fin de
observar como tenía lugar la interacción con el resto de moléculas de esta red
proteica.
Los resultados de este trabajo revelan que existen conjuntos amplios de
proteínas implicadas en este proceso biológico, y para la mejora del
entendimiento se incluyeron diferentes categorías. Se pudo observar que
principalmente estaban relacionadas con la regulación del citoesqueleto,
adhesión celular, plegamiento y degradación de proteínas, homeostasis del
estado oxido-reductor de la célula, metabolismo lipídico y transducción de
señales. Este interactoma constituye una herramienta valiosa para interpretar
este fenómeno biológico, así como para diagnosticar posibles patologías donde
la decidualización podría estar afectada, tales como la preeclampsia o el aborto
de repetición, y poder establecer terapias clínicas.
•
Proteínas relevantes en receptividad endometrial: Anexina
A2
Fruto del primer objetivo donde tratamos de desvelar que proteínas
estaban implicadas en la receptividad endometrial (Dominguez y cols., 2009),
identificamos a las proteínas: estamina 1 y anexina A2 (ANXA2) como
marcadores importantes del endometrio humano receptivo. Resulta interesante
comprobar que Fowler y cols., (2007) realizando un estudio proteómico en
mujeres con endometriosis, identificó ANXA2 entre un grupo de proteínas
disreguladas.
161
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Anexina A2 (ANXA2) es una proteína de unión a fosfolípidos
dependiente de calcio, que ha sido asociada con los filamentos de actina,
participando en el mantenimiento de la dinámica del citoesqueleto, así como
mediando las interacciones membrana-membrana y membrana-citoesqueleto
(Hayes y cols., 2006). También se ha descrito que la unión de ANXA2 a la
superficie de células endoteliales induce la expresión de moléculas de adhesión
(Wolberg and Roubey, 2005). Un trabajo reciente ha identificado a ANXA2
directamente implicada en la adhesión celular, a través de reordenamientos en
el citoesqueleto de actina (Rescher y cols., 2008).
En nuestro estudio, los dos experimentos DIGE realizados revelaron la
importancia de la proteína ANXA2 en el endometrio. En el modelo de
endometrio refractario inducido por la presencia de un DIU, se vió como la
expresión de ANXA2 disminuía dramáticamente tanto a nivel de las células
epiteliales como estromales, sugiriendo una falta de ANXA2 cuando el
endometrio era refractario.
Diferentes estudios han comprobado que durante el proceso de
implantación para la formación de uniones estables entre las células epiteliales
endometriales y las trofoblásticas se requiere una reordenación del
citoesqueleto (Thie y cols., 1997), la desestabilización de la polaridad apicobasal (Simón y cols., 2000) y la redistribución de diferentes moléculas en el
epitelio luminal (Linderberg, 1991). Nosotros postulamos que la regulación a la
alza de ANXA2 en el endometrio que adquiere el estado de receptividad, podría
ser importante para modular los cambios que tienen lugar a nivel epitelial para
preparar el polo apical para la adhesión celular.
162
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Por ello, nuestro último objetivo pretendió averiguar el posible papel de
ANXA2, así como, su interacción con otras moléculas en la consecución de la
receptividad y en las primeras etapas de la implantación embrionaria.
•
Estudio in vitro de la funcionalidad de ANXA2 sobre la
implantación embrionaria
Para comenzar el análisis molecular sobre la funcionalidad de ANXA2 en el
endometrio
receptivo,
se
extendieron
los
estudios
previos
de
inmunolocalización a lo largo de todo el ciclo menstrual. Se pudo corroborar
que ANXA2 se expresaba predominantemente en el endometrio secretor medio
y tardío con una señal muy intensa a nivel del epitelio endometrial, donde
podría estar ejerciendo su principal función. También se observó una
importante expresión en las células estromales, donde ANXA2 podría estar
implicada en la regulación del proceso de decidualización, el cual ha sido
reportado que depende de la reorganización del citoesqueleto de actina
(Ihnatovych y cols., 2009).
Para testar la relevancia funcional durante la primera fase del proceso de
implantación embrionaria, se usó un modelo de adhesión in vitro: se
cocultivaron blastocistos de ratón y esferoides humanos JEG-3 (son derivados
de una línea celular de trofoblasto) sobre monocopas de células epiteliales
HEC-1-A y células primarias hEEC. Este sistema ha sido ampliamente utilizado y
aceptado para mimetizar el proceso de adhesión embrionaria que tiene lugar in
vivo (Nancy y cols., 1993). Por un lado, tenemos un modelo interespecie donde
cocultivamos embriones de ratón con células epiteliales endometriales
humanas. Esta aproximación permite el uso de embriones vivos, que se usan
una vez hayan salido de su zona pelúcida y por tanto, una vez estén preparados
163
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
para la adhesión. Por otro lado, usamos un modelo intraespecie, donde el
cocultivo se hace con esferoides JEG-3 humanos, y de nuevo, sobre células
epiteliales endometriales humanas. En este caso, los esferoides JEG-3 muestran
una morfología y un comportamiento muy similar a los embriones humanos y
por ello pueden ser usados como una aproximación in vitro. El mejor sistema
sería el cocultivo de embriones humanos sobre células epiteliales primarias,
pero su uso se encuentra restringido debido a los aspectos éticos que supone el
uso de embriones humanos, así como, debido al alto número de embriones
necesarios para este tipo de ensayo.
Para averiguar el papel de ANXA2 en este proceso, procedimos a inhibirla
específicamente con el uso de ARN de interferencia, demostrando que afecta
negativamente y de forma significativa a la adhesividad embrionaria. Los
resultados también se verificaron usando tratamiento con witaferina A (WA),
una droga que induce una inactivación funcional sobre ANXA2 (Falsey y cols.,
2006). Por lo tanto, la inactivación funcional de ANXA2 tanto a nivel
transcripcional como por alteración estructural, induce un defecto en la
adhesividad embrionaria al epitelio endometrial en cultivo.
Una vez el blastocisto se adhiere a las células epiteliales, el trofoectodermo
empieza a expandirse (Van Blerkom y Chavez., 1981) y comienza la invasión a
través de las células estromales. Nuestros resultados demuestran que la
expansión del trofoblasto se ve reducida cuando ANXA2 se encuentra inhibida
en las células epiteliales endometriales. Este hecho podría reflejar una
interacción defectuosa y una falta de flexibilidad entre el trofoblasto y las
células epiteliales maternas debido a la incapacidad de reestructuración del
citoesqueleto.
164
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
El blastocisto, una vez adherido, penetra a través de la superficie epitelial, a
continuación las células del epitelio endometrial inician un proceso de cierre
para sellar dicha superficie (Aplin, 2007). Mediante un ensayo de cierre de
surco, pudimos comprobar cómo la capacidad de migración/proliferación de
las células epiteliales en cultivo disminuye significativamente cuando ANXA2 es
inhibida. Este fenómeno podría ser atribuido a la formación deficiente de
estructuras intracelulares que son requeridas para que se produzca el
movimiento celular, típicamente adhesiones focales y fibras de estrés de actina
que son reguladas por la proteína ANXA2 (Hayes y cols., 2006).
ANXA2 funciona mediante el ensamblaje con la membrana lipídica y/o
reclutando factores para iniciar los eventos de remodelado de actina, tales
como miembros de la familia de RhoA (Rescher y cols., 2008). Comenzamos a
realizar experimentos para analizar la relación funcional entre estas proteínas
en nuestro sistema, demostrando que la inhibición de ANXA2 no afecta a los
niveles totales de RhoA, pero significativamente sí se encuentra reducida la
actividad de RhoA. También comprobamos que la proteína RhoA se encuentra
implicada en la adhesión embrionaria sobre la línea de células epiteliales
(Heneweer y cols., 2002; Heneweer y cols., 2005). Nuestros resultados revelan
que se requiere RhoA activo para que se produzca una adhesión embrionaria de
forma adecuada. La proteína RhoA podría estar actuando como una especie de
interruptor de encendido/apagado, con lo cual podría ser un buen candidato
para promover las propiedades adhesivas del trofoblasto a la superficie celular
de las células epiteliales del endometrio.
Nos planteamos ver el efecto sobre la adhesión embrionaria de la
combinación de tratamientos, es decir, la inhibición de ANXA2 combinado con
activación/inactivación de RhoA. Este análisis demostró que la inducción de
165
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
RhoA de forma constitutivamente activa revierte parcialmente los efectos de la
inhibición de ANXA2 sobre la adhesividad endometrial. Mientras que, la
inactivación de RhoA no afecta a los niveles de ANXA2. Esto sugiere que ANXA2
actúa en una posición upstream en la ruta biológica induciendo a la forma activa
de RhoA.
La posible relación existente entre estas dos proteínas se reforzó
observando una llamativa co-localización de ANXA2 y RhoA a lo largo de la
membrana plasmática de las células epiteliales en cultivo. Esta evidencia
resulta consistente con la hipótesis de que exista una posible ruta biológica
donde ANXA2 y RhoA ejecuten su acción sobre el reordenamiento del
citoesqueleto de actina. Esta idea también se apoya en previos estudios, donde
se describía que ANXA2 funciona mediante el reclutamiento de otras proteínas
como tirosina fosfatasa SHP-2 y Rac-1 (Burkar y cols., 2003; Hanse y cols.,
2002).
También se sabe que ANXA2 y RhoA se asocian con organización de las
fibras de F-actina mediante un conjunto de mecanismos diferentes (Gerke y
Moss, 2002; Filipenko y Waisman, 2001). Mediante estudios de localización por
inmunocitoquímica, observamos que gran proporción de ANXA2 y RhoA
colocalizan con la red de F-actina. Además, vimos que los efectos funcionales de
inhibir ANXA2 e inactivar RhoA se asociaban con alteraciones significativas en
la organización de F-actina y en su consecuente despolimerización. Estos
resultados tienen un paralelismo con otro trabajo donde se trataron células
endometriales epiteliales con citocalasina D, una droga de origen fúngico que se
une a las fibras de actina, produciéndose una alta tasa de despolimerización
(Thie y cols., 1997).
166
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
También se testó el efecto de la inhibición de ANXA2 o la inactivación de
RhoA sobre la arquitectura de F-actina mediante un ensayo bioquímico, donde
observamos que un gran aumento en la proporción de actina globular libre por
el citoplasma. Estos resultados sugieren que ambos, ANXA2 y RhoA, tienen un
papel funcional en la determinación de la organización de las fibras de actina
mediante una interacción directa con la actina polimerizada y monomérica de
las células epiteliales endometriales. Podría ocurrir que la proteína ANXA2 por
sí misma remodele estas fibras o, alternativamente, que medie la activación de
otras proteínas estructurales como RhoA, la cual directamente module este
proceso (Fig. 42).
167
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Figura. 42 Modelo hipotético de actuación de ANXA2 y RhoA en el endometrio en
estado pre-recetivo y receptivo. En el estado no receptivo, encontramos una baja
concentración de ANXA2, los niveles de la proteína RhoA activa se mantienen bajas,
porduciendo una desestabilización de las fibras de actina, ello conlleva una baja
adhesividad del epitelio endometrial. En el endometrio receptivo, la concentración de
ANXA2 aumenta, produciéndose un incremento en la proporción de RhoA activo, lo cual
promueve la reorganización del citoesqueleto de actina e incrementa la adhesividad.
168
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
Perspectiva en investigación y en clínica
•
En definitiva, la aplicación de las herramientas proteómicas tanto para
estudiar la receptividad endometrial como la decidualización, nos aporta gran
información acerca de proteínas relevantes que gobiernan estos procesos
biológicos.
En el caso de la receptividad endometrial, podríamos usar estos
biomarcadores como herramienta diagnóstica para la determinación de cuando
un endometrio se halla en fase receptiva. Con ello se incorporaría un sistema de
detección objetivo del estatus de receptividad endometrial. También podría
servir para comprender procesos patológicos de infertilidad, observando cómo
este patrón proteico identificado se encuentra alterado. Por otro lado,
estudiando en profundidad algunos de estos biomarcadores podríamos
identificar posibles dianas para inducir la intercepción.
En el caso de la decidualización, conocer el interactoma que gobierna este
proceso nos permite conocer más acerca de este fenómeno biológico. Así como,
podría
servirnos
para
diagnosticar
patologías
donde
este
proceso
decidualización podría estar afectado, tales como preeclampsia o casos de
aborto de repetición, y poder establecer terapias clínicas.
Se requeriría una investigación molecular más extensa sobre cada una de
las moléculas identificadas para desenmascarar su posible papel en estos
procesos biológicos, y con ello poder testar nuestras hipótesis.
Siguiendo esta idea nos hemos centrado en estudiar a nivel molecular y
celular el posible papel de ANXA2 sobre la implantación embrionaria. Nuestros
169
_____________________________________________________________________________________6. DISCUSIÓN
resultados demuestran que ANXA2 tiene una función importante, actuando
upstream de la activación de RhoA, regulando el remodelado de la F-actina,
siendo un proceso clave para la adhesividad del epitelio endometrial al embrión
durante la implantación.
Basándonos en los resultados presentes, sugerimos que la ruta biológica
donde actúan ANXA2/RhoA es una diana potencial a explorar con perspectivas
a una posible aplicación translacional en medicina reproductiva. Con ello se
podrían mejorar las tasas de implantación embrionaria en tratamientos
fecundación in vitro, así como desarrollar estrategias para interferir este
proceso, generando un nuevo fármaco anticonceptivo no-hormonal.
170
_______________________________________________________________________________7. CONCLUSIONES
7. CONCLUSIONES
171
_______________________________________________________________________________7. CONCLUSIONES
172
_______________________________________________________________________________7. CONCLUSIONES
7. CONCLUSIONES
1. El proteoma del endometrio receptivo está constituido por 32
proteínas expresadas diferencialmente.
2. Hemos demostrado que estatmina 1 y anexina A2 tienen una
relevancia funcional en la receptividad, ya que su patrón de
expresión se revierte en un endometrio refractario.
3. El proteoma y el secretoma integrado junto con la información
génetica, nos permite obtener el interactoma de la decidualización.
El modelo de interactoma puede ser usado como herramienta para
diagnósticar e interpretar este fenómeno biológico tanto en
situación de normalidad como en patologías.
4. ANXA2 presenta una mayor expresión en la fase secretora media
y tardía, fundamentalmente a nivel del epitelio luminal.
5. La inhibición funcional de ANXA2 a nivel de expresión de mRNA
o sobre su actividad reduce la tasa de adhesión embrionaria, afecta
a
la
expansión
del
trofoblasto
e
imposibilita
la
migración/proliferación de las células epiteliales endometriales.
6. ANXA2 regula upstream la activación de RhoA, cuya actividad
aumenta en la fase secretora media. ANXA2 y RhoA regulan la
reorganización de las fibras de F-actina en el citoesqueleto,
afectando a la proporción
de actina polimerizada y
monomérica, modificando así el fenotipo celular receptivo.
173
_______________________________________________________________________________7. CONCLUSIONES
174
_________________________________________________________________________________8. BIBLIOGRAFÍA
8. BIBLIOGRAFÍA
175
_________________________________________________________________________________8. BIBLIOGRAFÍA
176
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198
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
9. ANEXOS
199
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
200
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
9. ANEXOS
Anexo I. Consentimiento informado.
HOJA DE INFORMACIÓN AL PACIENTE
TÍTULO DEL ESTUDIO: Proteómica de la receptividad endometrial
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Dr. Carlos Simón Vallés, Médico Ginecólogo y
Director Científico.
CENTRO: Fundación IVI (FIVI) - Instituto Universitario IVI (IUIVI)
INTRODUCCION
Nos dirigimos a usted para informarle sobre un estudio de investigación en el
que se le invita a participar. El estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de
Investigación Clínica correspondiente.
Nuestra intención es tan solo que usted reciba la información correcta y
suficiente para que pueda evaluar y juzgar si quiere o no participar en este
estudio. Para ello lea esta hoja informativa con atención y nosotros le
aclararemos las dudas que le puedan surgir después de la explicación. Además,
puede consultar con las personas que considere oportuno.
PARTICIPACIÓN VOLUNTARIA
Debe saber que su participación en este estudio es voluntaria y que puede
decidir no participar o cambiar su decisión y retirar el consentimiento en
201
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
cualquier momento, sin que por ello se altere la relación con su médico ni se
produzca perjuicio alguno en su tratamiento.
DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO:
A pesar de los avances en el conocimiento del endometrio (la mucosa que
recubre el interior del útero o matriz) no existe hoy en día una prueba que nos
diagnostique de forma objetiva si un endometrio se encuentra receptivo para
anidar el embrión.
Para ello hemos diseñado el estudio denominado “PROTEÓMICA DE LA
RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL”, mediante el cual vamos a determinar el perfil
proteico del endometrio receptivo, aplicando a las muestras la nueva tecnología
Proteómica.
BENEFICIOS Y RIESGOS DERIVADOS DE SU PARTICIPACIÓN EN EL ESTUDIO
De esta manera, conociendo las proteínas que se expresan diferencialmente
cuando el endometrio es receptivo al embrión, se pretende diseñar un predictor
que permita evaluar, de forma objetiva y poco invasiva, el estado receptivo de
un endometrio (PRE, predictor de receptividad endometrial) a partir de una
muestra de secreción uterina.
Solicitamos su permiso para obtener la muestra y así poder analizar dicho
material biológico en esta investigación.
Dicha muestra será procesada de forma anónima sin identificarla con usted,
únicamente el día del ciclo menstrual en el momento de la recogida de la
muestra.
202
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
La toma de la biopsia puede ser molesta y posiblemente Vd no podrá
beneficiarse de esta investigación por encontrase en fase experimental.
Se entiende que en cualquier momento usted tiene derecho a cambiar de
opinión y no participar en este estudio.
CONFIDENCIALIDAD
El tratamiento, la comunicación y la cesión de los datos de carácter personal de
todos los sujetos participantes se ajustará a lo dispuesto en la Ley Orgánica
15/1999, de 13 de diciembre de protección de datos de carácter personal. De
acuerdo a lo que establece la legislación mencionada, usted puede ejercer los
derechos de acceso, modificación, oposición y cancelación de datos, para lo cual
deberá dirigirse a su médico del estudio.
Los datos recogidos para el estudio estarán identificados mediante un código y
solo su médico del estudio/colaboradores podrán relacionar dichos datos con
usted y con su historia clínica. Por lo tanto, su identidad no será revelada a
persona alguna salvo excepciones, en caso de urgencia médica o requerimiento
legal.
Sólo se transmitirán a terceros y a otros países los datos recogidos para el
estudio que en ningún caso contendrán información que le pueda identificar
directamente, como nombre y apellidos, iniciales, dirección, nº de la seguridad
social, etc. En el caso de que se produzca esta cesión, será para los mismos fines
del estudio descrito y garantizando la confidencialidad como mínimo con el
nivel de protección de la legislación vigente en nuestro país.
El acceso a su información personal quedará restringido al médico del
estudio/colaboradores,
autoridades
sanitarias
203
(Agencia
Española
del
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
Medicamento y Productos Sanitarios), al Comité Ético de Investigación Clínica y
personal autorizado por el promotor, cuando lo precisen para comprobar los
datos y procedimientos del estudio, pero siempre manteniendo la
confidencialidad de los mismos de acuerdo a la legislación vigente.
COMPENSACIÓN ECONÓMICA
El promotor del estudio es el responsable de gestionar la financiación del
mismo. Para la realización del estudio el promotor del mismo ha firmado un
contrato con el centro donde se va a realizar y con el médico del estudio.
OTRA INFORMACIÓN RELEVANTE
Si usted decide retirar el consentimiento para participar en este estudio, ningún
dato nuevo será añadido a la base de datos y, puede exigir la destrucción de
todas las muestras identificables previamente retenidas para evitar la
realización de nuevos análisis.
También debe saber que puede ser excluido del estudio si el promotor los
investigadores del estudio lo consideran oportuno, ya sea por motivos de
seguridad, por cualquier acontecimiento adverso que se produzca por la
medicación en estudio o porque consideren que no está cumpliendo con los
procedimientos establecidos. En cualquiera de los casos, usted recibirá una
explicación adecuada del motivo que ha ocasionado su retirada del estudio
Al firmar la hoja de consentimiento adjunta, se compromete a cumplir con los
procedimientos del estudio que se le han expuesto.
204
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
CONSENTIMIENTOS INFORMADOS
Código del Estudio:
Yo ..........................................................................................................................
He leído la hoja de información que se me ha entregado.
He podido hacer preguntas sobre el estudio.
He recibido suficiente información sobre el estudio.
He hablado con el Dr. Carlos Simón.
Comprendo que mi participación es voluntaria.
Comprendo que puedo retirarme del estudio:
1º Cuando quiera.
2º Sin tener que dar explicaciones.
3º Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos.
- Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio y doy mi
consentimiento para el acceso y utilización de mis datos en las condiciones
detalladas en la hoja de información.
- Accedo a que las muestras de sangre o tejidos obtenidas para el estudio
puedan ser utilizadas en el futuro para nuevos análisis relacionados con la
enfermedad o fármacos del estudio no previstos en el protocolo actual
(quedando excluidos los análisis genéticos, siempre y cuando no formen parte
de los objetivos del estudio):
Firma de la paciente:
SI
NO
Firma del investigador:
Nombre:
Nombre: Dr. Carlos Simón
Fecha:
Fecha:
205
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
206
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
Anexo II. Publicaciones derivadas de la presente tesis doctoral.
Revista internacionales
Domınguez F, Garrido-Gomez T, Lopez JA, Camafeita E, Quinonero A, Pellicer A,
Simon C. Proteomic analysis of the human receptive versus non-receptive
endometrium using differential in-gel electrophoresis and MALDI-MS unveils
stathmin 1 and annexin A2 as differentially regulated. Human Reproduction
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Garrido-Gómez T, Dominguez T, Lopez JA, Camafeita E, Quiñonero A, Martinez-
Conejero JA, Pellicer A, Conesa A, Simón C. Modeling human endometrial
decidualization from the interaction between proteome and secretome. J Clin
Endocrinol Metab 2011; 96: 706-16.
Berlanga O, Bradshaw HB, Vilella-Mitjana F, Garrido-Gómez T, Simón C. How
endometrial secretomics can help in predicting implantation. Placenta 2011; 32:
275-281.
Garrido-Gómez T, Dominguez F, Quiñonero A, Estella C, Vilella F, Pellicer A,
Simon C. Annexin A2 is critical for endometrial adhesiveness and embryo
attachment in humans by activation of RhoA through F-actin regulation. FASEB
journal. Pendiente de publicar.
207
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
Capítulos de libro
Tamara Garrido-Gómez, Francisco Dominguez, Carlos Simón. Proteomics of
embryonic implantation. Volumen: Fertility Control - Today and in the Future.
Handbook of Experimental Pharmacology book series. Editorial: Springer. 2010;
198:67-78. Review
Carlos Simón, Tamara Garrido. Establecimiento de la gestación: Gametogénesis,
fecundación, desarrollo embrionario e implantación. Tratado de Ginecología,
Obstetricia y Medicina de la Reproducción de la Sociedad Española de
Ginecología y Obstetricia. Tratado SEGO. Editorial Médica Panamericana. 2010;
Pendiente de publicar.
Francisco Domínguez, Tamara Garrido, Carlos Simón. Proteomics analysis of the
endometrium and embryo. Can we improve IVF outcome?. Volumen: Human
Assisted Reproductive Technology- Future trends in Laboratory and Clinical
Practice. Editorial: Gardner, Rizk & Falcone 2010; 289-300.
T Garrido-Gomez, F Dominguez, M Ruiz, F Vilella, C Simon. The analysis of
endometrial receptivity. Laboratory volume VII Implantation. 2011. Pendiente de
publicar.
Congresos
Tamara Garrido, Francisco Dominguez, Juan antonio López, Emilio Camafeita,
Enrique Calvo, Carlos Simon. Proteómica de la receptividad endometrial. VI
Jornadas de Jóvenes Investigadores. Granada, España, Febrero 2008. Tipo de
participación: Póster.
208
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
Tamara Garrido, Francisco Domínguez, Juan A López, Emilio Camafeita, Enrique
Calvo, Marco Melo, Carlos Simón. Proteomic analysis of Pre-Receptive vs
Receptive Human Endometrium. 24th Annual meeting of European Society of
Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Barcelona. Julio 2008. Tipo de
participación: Póster.
Tamara Garrido-Gómez, Francisco Dominguez, Alicia Quiñonero, Juan A. Lopez,
Emilio Camafeita, Antonio Pellicer, Carlos Simón. Proteomic analysis of the
human receptive vs nonreceptive endometrium unveiled a functional relevance
of stathmin 1 and annexin A2. 3rd International IVI Congress. Madrid, España,
Mayo 2009. Tipo de participación: Poster.
Emilio Camafeita, Tamara Garrido-Gómez, Francisco Dominguez, Alicia
Quiñonero, Antonio Pellicer, Juan A. Lopez, Carlos Simón. Proteomic analysis of
the human receptive vs non-receptive endometrium unveiled a functional
relevance os Stathmin 1 and Annexin A2. Congreso Nacional de Proteómica.
Pamplona, 2009. Tipo de participación: Poster.
Tamara Garrido-Gómez. Embryo proteomics: a new tool for screening. ART:
experimental bases for improving outcomes for the benefit of patients. Estambul,
Turquia, Febrero 2010. Tipo de participación: Charla oral
Tamara Garrido-Gomez, Francisco Dominguez, Alicia Quinonero, Jose A
Martinez-Conejero, Juan A Lopez, Emilio Camafeita, Antonio Pellicer, Carlos
Simon. Proteomic and Secretomic of Human Endometrial Stromal Cells in
Decidualization Process. Society for Gynecologic Investigation (SGI). Orlando.
Marzo 2010. Tipo de participación: Poster.
209
________________________________________________________________________________________9. ANEXOS
Tamara
Garrido, Francisco Dominguez, Alicia Quiñonero, Carlos Simón.
Annexin A2 is critical for endometrial receptívity and embryo attachment in
women, regulating F-actin and membrane-cytoskeletal interactions. 6th
International Conference of Annexins. Barcelona. Agosto 2011. Tipo de
participación: Charla oral y póster.
Tamara Garrido-Gómez, Francisco Dominguez, Alicia Quiñonero, Carlos Estella,
Felipe Vilella, Carlos Simón. Annexin A2 is critical for endometrial adhesiveness
and embryo attachment in humans by activation of RhoA through F-actin
regulation. Society for Gynecologic Investigation (SGI). San Diego, Marzo 2012.
Tipo de participación: Charla oral
210
211