procedimiento de preparacion de microorganismos y

k
REGISTRO DE LA
PROPIEDAD INDUSTRIAL
19
k
ES 2 013 055
kNúmero de solicitud: 8900663
kInt. Cl. : A01N 25/00
11 N.◦ de publicación:
21
4
51
ESPAÑA
A01N 63/00
A01N 65/00
k
12
PATENTE DE INVENCION
k
73 Titular/es: Eszakmagyarországi Vegyimüvek
k
72 Inventor/es: Nagy, József;
22 Fecha de presentación: 23.02.89
3792 Sajóbábony, HU
45 Fecha de anuncio de la concesión: 16.04.90
k
45 Fecha de publicación del folleto de patente:
16.04.90
k
k
k
Nagy, István; Kecskes, Mihály;
Balogh, Károly; Mile, Erzsébet;
Tarpai, Gyula; Séllet, Katalı́n;
Fodor, Károly y Tóth, Erzsébet
74 Agente: Gil Vega, Victor
k
54 Tı́tulo: Procedimiento de preparación de microorganismos y macroorganismos portadores de
k
antı́dotos, útiles para reducir el efecto nocivo de tiolcarbamatos y cloroacetanilidas
sobre las plantas cultivadas.
57 Resumen
Procedimiento de preparación de microorganismos
y macroorganismos portadores de antı́dotos, útiles
para reducir el efecto nocivo de tiolcarbamatos y
cloroacetanilidas sobre las plantas cultivadas.
El procedimiento se caracteriza porque comprende
el tratamiento de microorganismos o macroorganismos nativos o manipulados genéticamente que
viven en la tierra o en la superficie de ella con
los compuestos de fórmulas generales (I) a (VII)
y el uso de los organismos vivos ası́ convertidos
en portadores de antı́dotos para el tratamiento de
tierras de cultivo en estado fresco o después de
su conservación mediante liofilización o aplicación
a un vehı́culo en su estado original o después
de su elaboración mediante trituración, pulverización, extracción o secado, antes o simultaneamente o después del tratamiento con los herbicidas, en cualquier momento hasta la germinación
de la planta cultivada, en virtud de lo cual se incrementa la selectividad de los tiolcarbamatos de
fórmula general (I) y de las cloroacetanilidas de
fórmula general (VIII) frente a las plantas cultivadas, preferiblemente contra el maı́z.
Venta de fascı́culos: Registro de la Propiedad Industrial. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
A6
2 013 055
DESCRIPCION
5
Esta invención se relaciona con un procedimiento de preparación y uso de microorganismos y macroorganismos portadores de antı́dotos, útiles para reducir el efecto nocivo sobre las plantas cultivadas
de los tiolcarbamatos de fórmula general (I),
R1
10
\
O
k
N - C - S R3
(I)
/
R2
en la que:
15
R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C1−6 o cicloalquilo C3−6 , o bien R1
y R2 , junto con el átomo de nitrógeno al que están ligados, forman un grupo hexametilenimino;
R3 significa un grupo alquilo C1−5 ,
20
o de las cloroacetanilidas de fórmula general (VIII),
25
30
35
en la que:
R4 y R5 son iguales o diferentes y representan hidrógeno o un grupo alquilo C1−5 ;
40
R6 significa un grupo alquilo C1−5 , alquenilo C2−5 , (alcoxilo C1−3 )-(alquilo C1−3 ) o un grupo pirazolil -(alquilo C1−3 ).
45
Es comuúnmente sabido, por la práctica de la protección de plantas, que los tiolcarbamatos de
fórmula general (I), particularmente el EPTC [S-etil-N,N-di(n-propil)tiolcarbamato], el butilato [Setil-N,N-di(isobutil)tiolcarbamato], el vernolato [S-propil-N,N-di(n-propil)-tiolcarbamato], el etiolato
(S-etil-N,N-dietiltiolcarbamato), el cicloato (S-etil-N-etil-N-ciclohexiltiolcarbamato) y el molinato (Setil-N,N-hexametilentiolcarbamato), ası́ como las cloroacetanilidas de fórmula general (VIII), particularmente alaclor (2-cloro-2’,6’-dietil-N-metoximetilacetanilida), el acetoclor (2-cloro-2’-etil-6’-metil-Netoximetilacetanilida) y el propaclor (2-cloro-N-isopropilacetanilida), son herbicidas muy eficaces.
50
55
60
Sin embargo, un inconveniente común de ambas clases de tales agentes herbicidas consiste en su selectividad relativamente baja contra determinadas plantas cultivadas, principalmente el maı́z.
Cuando se emplean en las habituales dosis herbicidamente activas, principalmente el EPTC, el nernolato y el acetoclor pueden incitar importantes sı́ntomas fitotóxicos. Hace unos veinticinco años, Hoffmann
reconoció que existen compuestos, tales como derivados anhı́dridos del ácido 1,8-naftálico, que son capaces de disminuir el efecto fitotóxico. Desde entonces, se han iniciado unas investigaciones ampliamente
desarrolladas, orientadas a hallar compuestos sintéticos que se opongan al efecto nocivo sobre plantas
cultivadas causado por dichos herbicidas.
La acción antı́dota de algunas clases de compuestos ha sido expuesta en varias memorias de patentes
húngaras seguidamente indicadas:
2
2 013 055
N◦ 165.736: Acción antı́dota contra tiolcarbamatos de los derivados dicloroacetamidas, por ejemplo
N,N-dialil -2,2-dicloroacetamida (código núm. R-25 788);
5
N◦ 168.977: Oxazolidina y antı́dotos de tipo tiazolidino, particularmente útiles contra los tiolcarbamatos;
N◦ 170.214: Sulfóxido de tiazolidina y antı́dotos de tipo sulfona, útiles contra los tiolcarbamatos y
cloroacetanilidas;
10
N◦ 173.775: Antı́dotos de tipo sulfuro, útiles contra tiolcarbamatos;
N◦ 176.876: Derivados oxazolidinas útiles como antı́dotos de los tiolcarbamatos;
15
N◦ 179.643: Compuestos N-benzoilsulfonilcarbamatos, útiles como antı́dotos contra los tiolcarbamatos;
N◦ 180.069: Compuestos N-benzoilsulfoniltiolcarbamatos útiles como antı́dotos contra los tiolcarbamatos; y
20
25
30
35
40
N◦ 180.068: Derivados 2,3-dibromopropionamidas, útiles como antı́dotos contra los tiolcarbamatos;
Nos. 174.487, 176.784, 180.422, 181.621, 183.997, 185.400 y 188.135: Antı́dotos de tipo acetamida
sustituı́da, útiles contra tiolcarbamatos y cloroacetanilidas.
En las memorias de patentes húngaras núms. 176.669, 176.796, 178.892 y 178.895 se han descrito derivados
dicarboxı́licos de diferentes estructuras quı́micas que contrarrestan a tiolcarbamatos y/o cloroacetanilidas; el efecto antı́dotó de los derivados del ácido naftalincarboxı́lico ha sido publicado en las memorias
de patente húngaras núms. 178.883, 179.092 y 179.093.
En una publicación de J. E. Casida y colaboradores titulada “Herbicidas de sulfóxidos tiocarbamatos”,
del año 1974, se ha descrito un resultado en cuanto a incremento de selectividad de los tiolcarbamatos.
La indicación principal de esta publicación consiste en que el sulfóxido de EPTC, que es un producto
de descomposición de EPTC, muestra una útil acción herbicida, pero sin resultar perjudicial para el
maı́z. Sin embargo, el reconocimiento de estos autores se extendı́a sólo al uso del sulfóxido de EPTC de
por sı́, que no puede emplearse en la protección práctica de las plantas debido a sus otras propiedades
desventajosas (por ejemplo, no puede emplearse en todos los tipos de tierras).
A pesar de los resultados de investigaciones descritas en un elevado número de memorias de patente, no
se ha conseguido hallar un compuesto capaz de proporcionar una protección general contra los nocivos
efectos de varios herbicidas, hecho sustentado también por la circunstancia de que las investigaciones
dirigidas a clarificar la acción antı́dota no pudieron crear un punto de vista uniforme que decidiese los
procesos bioquı́micos que intervenı́an en el caso de la adición de antı́dotos, o que definiese la influencia
de estos antı́dotos sobre los procesos inducidos por los herbicidas en las plantas cultivadas.
En el curso de nuestras investigaciones dirigidas a disminuir el efecto deteriorativo de plantas cultivadas
de los herbicidas de tipo tiolcarbamato de fórmula general (I) y cloroacetanilidas de fórmula general
(VIII), se ha descubierto que los compuestos de fórmulas generales (II) a (VII).
45
(Las fórmulas pasan a la página siguiente)
50
55
60
3
2 013 055
R1
\
/
5
R2
15
(II)
O
k
N - C - S - R3
/
k k
O O
R2
R1
10
N - C - S - R3
k k
O O
R1
\
(III)
\
/
R2
N - C - S - glutationa
k
O
(IV)
20
R1
\
/
25
R2
R1
30
R2
35
40
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
NH - C - CH2 - COOH
k
O
(VI)
\
/
R2
(V)
\
/
R1
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
NH2
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
O - C - CH2 - COOH
k
O
(VII)
45
donde en los compuestos de fórmulas generales (I) a (VIII):
50
R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C1−6 ó cicloalquilo C3−6 , o bien R1
y R2, junto con él átomo de nitrógeno, forman un grupo hexametilenimino;
R3 significa un grupo alquilo C1−5 ;
R4 y R5 son iguales o diferentes y representan hidrógeno o un grupo alquilo C1−5 ; y
55
60
R6 representa un grupo alquilo C1−5 , alquenilo C2−5 , (alcoxi C1−3 )-(alquilo C1−3 ) o pirazolil-(alquilo
C1−3 ).
formados en la tierra o en microorganismos o macroorganismos pretratados con tiolcarbamatos de
fórmula general (I), o sus derivados acilados o esterificados, pueden usarse satisfactoriamente para proteger contra la fitotoxicidad de los herbicidas de ambas clases cuando se aplican los compuestos de fórmulas
generales (I) a (VII) a la tierra antes o durante o después del tratamiento con los agentes herbicidamente
4
2 013 055
activos.
5
10
15
20
Ası́, la presente invención se relaciona con la totalidad de los procedimientos en los que se tratan con
compuestos de fórmulas generales (I) a (VII) y preferiblemente con EPTC, microorganismos o macroorganismos nativos o manipulados genéticamente que viven en la tierra o en su superficie, o sus cultivos
orgánicos o celulares o componentes celulares.
En el curso del procedimiento de tratamiento, los productos de descomposición formados a partir
de los compuestos de fórmulas generales (I) a (VII), que pueden ser preferiblemente cualquiera de los
compuestos de fórmulas generales (II) a (VII) o su mezcla o un derivado acilado o esterificado de ellos,
muestran una acción antı́dota de herbicidas y se asocian a los microorganismos o macroorganismos, con
lo que se obtienen como resultado final organismos vivos portadores de antı́doto.
La presente invención se relaciona también con el uso de los microorganismos y macroorganismos portadores de antı́dotos, obtenidos mediante uso de los procedimientos antes citados, para disminuir el efecto
nocivo sobre plantas cultivadas producido por tiolcarbamatos de fórmula (I) y cloroacetanilidas de fórmula
(VIII).
Estos microorganismos y macroorganismos se usan en estado fresco o tras su conservación por liofilización
o mediante su aplicación a un vehı́culo, en su forma original o después de su elaboración por trituración,
pulverización, extracción, secado, etc., antes, durante (en forma de combinación manufacturada o mezcla
de tanque) o después del tratamiento con los herbicidas, en cualquier momento hasta la germinación de
la planta cultivada, para el tratamiento de tierras de cultivo, con lo que se incrementa la selectividad de
los compuestos herbicidas de fórmulas generales (I) y (VIII) contra plantas cultivadas, preferiblemente el
maı́z.
La invención se ilustra con detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
25
Ejemplo 1
Investigación de la tierra, pretratada con EPIC, herbicida de fórmula general (I), como vehı́culo de
los productos metabólicos antı́dotos de origen microbiano.
30
35
40
45
Se pretrató una tierra de cultivo, de un valor pH-C1K de 5,7, una pesantez de 46 AK y un contenido
del 0,03% de sales totales, 1,9% de humus, 14,8 ppm de NO3 +NO2 , 735 ppm de P2 O5 , 853 ppm de K2 O,
246 ppm de Mg, 60 ppm de Na, 2,1 ppm de Zn, 3,2 ppm de Cu y 151 ppm de Mn, con una dosis de 8 l/ha
de Witox 72 EC que contenı́a un 72% de agente activo como formulación del herbicida EPTC, o con una
dosis de 8 l/ha de Alirox 80 EC que contenı́a un 72% de EPTC y un 8% de AD-67 [N-(2,2-dicloroacetil)
-1-oxa-4-azabioclo[4,5]decano] como antı́doto.
Se pesaron 600 g de esta tierra en frascos de cultivo y se sembraron en ellos 10 granos de varias especies
de maı́z hı́brido, ası́ como 20 granos de sorgo en calidad de mala hierba.
El undécimo dı́a siguiente a la siembra, tras un cultivo de las plantas bajo lámparas de luz diurna
HgMIF 400/D, con un perı́odo de iluminación de 16 horas, y con un riesgo diario hasta la saturación
acuosa de la tierra, se midió la masa verde de las plantas, ası́ como la longitud de los tallos de maı́z y se
evaluó el exterior de éste mediante la siguiente escala de calidad:
4: fuerte deformación, torsión
3: deformación media, torsión
2: suave fitotoxicidad
50
1: planta intacta y sana.
55
Seguidamente, el 14◦ dı́a siguiente a la primera siembra, se sembraron de nuevo las plantas en los
frascos de cultivo y se trató la tierra con una dosis de 8 ó 20 l/ha, respectivamente, de Witox 72 EC que
contenı́a un 72% de EPTC.
En el 11◦ dı́a siguiente a la segunda siembra, se midieron la masa verde de las plantas y la longitud
de tallos del maı́z.
60
Puede afirmarse por los datos de la Tabla I que las diversas especies de maı́z hı́brido, sembradas en
la tierra pretratada con EPTC o con EPTC contrarrestado por AD-67, respectivamente, toleraron bien
las dosis de 8 l/ha y 20 l/ha de EPTC, mientras que el sorgo sembrado a manera de mala hierba resultó
5
2 013 055
destruı́do.
TABLA I
5
Desarrollo de la longitud de tallos, masa verde y exterior de maı́ces hı́bridos, ası́ como cambio en la
masa verde de sorgo bajo el efecto de los tratamientos con EPTC
Control no tratado
10
Dosis de EPTC
8 l/ha
20 l/ha
21
19
8
19
–
19
0,56
0,5
0,49
0,59
–
0,63
2,0
2,0
1,2
2,0
2,0
0,15
0,14
0
0
–
0
15
Longitud de tallos de maı́z
(cm/planta)
1a
¯ siembra
2a
¯ siembra
Masa verde de maı́z
(g/planta)
1a
¯ siembra
2a
¯ siembra
Calidad (maı́z)
1a
¯ siembra
2a
¯ siembra
Masa verde de sorgo
(g/frasco)
1a
¯ siembra
2a
¯ siembra
20
25
30
35
40
Ejemplo 2
Se efectuó un experimiento en frascos de cultivo de laboratorio para investigar la acción sinergética y
antagónica ejercida por diferentes herbicidas de tipo tiolcarbamato y bacterias portadoras de antı́dotos
(suspensión bacteriana NI-86/21 EPTC 250) entre sı́.
1. Materiales, equipos y métodos
45
1.1 Preparación de la suspensión bacteriana NI-86/21
Se inoculó un cultivo de especie pura de bacterias NI-86/21 descomponedoras del EPTC, aisladas de
la tierra, en 5 ml de medio nutriente inclinado que contenı́a los siguientes componentes:
50
55
60
Extracto de carne
Levadura
Peptona
ClNa
Agar
Agua destilada
pH
1g
2g
5g
5g
20 g
1000 ml
7,4
En lo que seguidamente se expone, se empleó un cultivo de una edad superior a 3-4 dı́as pero inferior
a 120 dı́as.
Posteriormente, las bacterias propagadas en el tubo de vidrio fueron llevadas a un volumen de 10 ml
de agua destilada y esterilizada. De este modo, la suspensión contenı́a aproximadamente 109 bacterias
6
2 013 055
por cada milı́litro.
Se vertieron fracciones de 200 ml de solución salina de nutriente fisiológico en frascos de Erlenmeyer
de 500 ml. La composición de esta solución salina nutriente, calculada para 1000 ml, era la siguiente:
5
No3 NH4
PO4 H2 K
PO4 HK2
ClNa
SO4 Mg.2H2 O
Cl2 Ca.2H2 O
SO4 Cu.5H2 O
SO4 Fe.7H2 O
Cl2 Zn
10
15
20
25
40
Una muestra del cultivo del microorganismo NI-86/21 ha sido depositada en la institución denominada
“National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, de M-1502 Budapest”, con fecha 14
de Julio de 1.988.
Experimento en frasco de cultivo
Se usaron frascos de plástico forrados con lámina de cloruro de polivinilo, de una superficie de 0,8
dm2 , que eran adecuados para recibir 800 g de tierra cada uno de ellos. Primeramente se introdujeron
en cada uno de tales frascos 400 g de una tierra de cultivo secada con aire, con un contenido de humus
del 1,95%, un valor pH de 5,7 y una pesantez (de acuerdo con Arany) de 46. En cada uno de ellos se
sembraron 10 granos de maı́z hı́brido Pioneer 3707, 20 granos de sorgo cultivado de tipo “Alföldi 1” y
0,5 g de mijo rojo. Cada siembra fué cubierta con 100 g de tierra y luego se aplicaron EPTC, vernolato
y molinato como ingredientes activos en una dosis de 6 l/ha, y butilato como ingrediente activo en una
dosis de 24 l/ha, como composiciones manufacturadas de EMV (Laboratorios Quı́micos del Norte de
Hungrı́a). La superficie de tierra tratada fué cubierta con otros 100 g de tierra y luego se aplicaron 10
ml de biopreparado NI-86/21 EPTC 250 en cada frasco, en la superficie de la tierra, de acuerdo con la
lista de tratamientos que seguidamente se expone.
45
50
55
g
g
g
g
g
mg
mg
mg
mg
El ingrediente activo de EPTC fue dosificado en esta solución de tal manera que se obtuviese una
concentración de 250 ppm. Luego se mezclaron porciones de 2 ml de esta suspensiı́on bacteriana en los
frascos, que seguidamente se agitaron en un equipo destinado a ello durante 24 horas, para obtener las
bacterias portadoras de antı́doto.
Se examinó además la selectividad de los herbicidas (EPTC, butilato, vernolato, molinato) utilizados
en los experimentos, por sı́ mismos y en combinaciones formadas con 10 ml de suspensión bacteriana
portadora de antı́doto NI-86/21 EPTC 250 de acuerdo con los tratamientos.
30
35
0,5
0,4
1,6
0,1
0,2
0,5
0,5
0,5
0,5
Lista de tratamientos:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Control no tratado
EPTC 6 l/ha
EPTC 6 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 10 ml
Butilato 24 l/ha
Butilato 24 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 10 ml
Vernolato 6 l/ha
Vernolato 6 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 10 ml
Molinato 6 l/ha
Molinato 6 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 10 ml
Resultados del experimento en frascos de cultivo
60
Los resultados del experimento en frascos de cultivo se muestran en las Tablas II, III y IV.
7
2 013 055
5
10
Puede verse por la Tabla II que la longitud de tallos del maı́z de control sin tratar ascendı́a a 22 cm.
Al usar EPTC; vernolato o molinato en una dosis de 6 l/ha o butilato en una dosis de 24 l/ha, como
tales, las longitudes de los tallos resultaban notablemente disminuı́das (a 9, 11, 13 ó 12 cm, respectivamente). Por el contrario, cuando se añadı́an 10 ml de biopreparado NI-86/21 EPTC 250 a cada uno
de los herbicidas antes mencionados, se eliminaba entonces el efecto disminuidor de la longitud de tallos
del EPTC, butilatpo y vernolato (21, 23 y 21 cm, respectivamente), en tanto que la fitotoxicidad del
molinato permanecı́a inalterada (17 cm).
Los datos señalados en la Tabla III relativos al cambio en la masa verde del maı́z muestran un cuadro
similar al de la longitud de tallos.
El maı́z resultó completamente protegido contra el efecto nocivo del EPTC, butilato y vernolato herbicidamente activos mediante uso de la suspensión NI-86/21 EPTC 250 en una dosis de 10 ml/frasco de
cultivo.
15
Este hecho está perfectamente ilustrado por la Tabla IV, según la cual la excelente acción antı́dota
de este biopreparado puede quedar explicada sobre la base del exterior del maı́z.
20
El mijo rojo y el sorgo sembrados a manera de malas hierbas quedaron destruı́dos por todos los
tratamientos; es decir, estas plantas no fueron protegidas por el biopreparado NI-86/21 EPTC.
TABLA II
25
Disminución del efecto fitotóxico inducido en el tallo de maı́z por los herbicidas EPTC, butilato,
vernolato y molinato, merced al biopreparado NI-86/EPTC
Herbicida
Dosis l/ha
Longitud de tallo del maı́z (cm/planta)
30
35
EPTC
Butilato
Vernolato
Molinato
6
24
6
6
–
Biopreparado NI-86/21 EPTC 250
9
12
11
13
21
23
21
17
40
La longitud de tallo del maı́z de control sin tratar fué de 22 cm.
TABLA III
45
Acción sobre la masa verde de maı́z por los herbicidas EPTC, butilato, vernolato y molinato y sus
combinaciones con el biopreparado NI-86/21 EPTC 250, respectivamente
Herbicida
Dosis l/ha
Masa verde de maı́z (10−2 (g/planta)
50
55
EPTC
Butilato
Vernolato
Molinato
6
24
6
6
–
Biopreparado NI-86/21 EPTC 250
51
60
54
57
86
83
88
64
60
La masa verde del maı́z de control sin tratar ascendió a 82x10−2 g/planta.
8
2 013 055
TABLA IV
Acción sobre el exterior del maı́z por los herbicidas EPTC, butilato, vernolato y molinato y sus
combinaciones con el biopreparado NI-86/21 EPTC 250, respectivamente
5
Herbicida
Dosis l/ha
10
EPTC
Butilato
Vernolato
Molinato
15
6
24
6
6
Exterior del maı́z (%)
–
Biopreparado NI-86/21 EPTC 250
55
61
63
58
100
100
100
61
El exterior del maı́z de control sin tratar fué considerado como el 100%
20
Escala de calidad
25
30
100%:
99 a 87%:
86 a 75%:
75 a 51%:
50%:
maı́z intacto con desarrollo normal
suave fitotoxicidad, deformación del tallo
deformación media del tallo, torsión
fuerte deformación del tallo, destrucción
maı́z destruı́do, permanece en la cápsula del tallo
Ejemplo 3
Se investigó la acción selectiva sobre el EPTC de varias cantidades de la suspensión bacteriana NI86/21 EPTC 250 portadora de antı́dotos, preparada como se describe en el Ejemplo 2.
35
40
En este experimento, se usaron frascos de cultivo de plástico forrados con lámina de cloruro de polivinilo, con una superficie de 0,8 dm2 , que fueron útiles para recibir 800 g de tierra secada con aire, cada
uno de ellos. Primeramente, se introdujeron 400 g de tierra en cada uno de los frascos.
La tierra de cultivo superior tenı́a una pesantez media, un contenido de humus del 1,95% y un valor
pH de 5,7. Se sembraron en cada frasco 10 granos de maı́z hı́brido Pioneer 3707 como planta de ensayo,
ası́ como 20 granos de sorgo y 0,5 g de mijo. Se cubrió el sembrado con 100 g de tierra en cada frasco,
tras lo cual se efectuaron como sigue los tratamientos con tiolcarbamatos y con biopreparados NI-86/21
EPTC 250, respectivamente.
45
Tratamientos:
50
0
1
2
3
4
5
control sin tratar
EPTC 6 l/ha
EPTC 6 l/ha + NI-86/21
EPTC 6 l/ha + NI-86/21
EPTC 6 l/ha + NI-86/21
EPTC 6 l/ha + NI-86/21
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
250
250
250
250
1000 l/ha
5000 l/ha
10000 l/ha
20000 l/ha
55
La superficie de tierra tratada fué repetidamente cubierta con 100 g de tierra cada vez.
60
El experimento se evaluó el 10◦ dı́a siguiente al tratamiento, cuando se midieron la longitud de tallo
y masa verde del maı́z, ası́ como la masa verde del sorgo y el mijo.
Las ventajas de las combinaciones que contienen EPTC junto con NI-86/21 ETPC 250 se resumen en
la Tabla V.
9
2 013 055
TABLA V
Acción del biopreparado NI-86-/21 EPTC sobre la fitotoxicidad del EPTC en un cultivo de maı́z (datos
indicados como porcentajes del control sin tratar)
5
Tratamiento
10
15
1
2
3
20
4
5
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
EPTC
Maı́z
Sorgo
Mijo
Masa verde
%
Longitud de tallo
%
Masa verde
%
Masa verde
%
74
117
41
115
0
0
0
0
113
112
0
0
95
113
0
0
118
113
0
0
6 l/ha
6 l/ha + NI-86/21
250 1000 l/ha
6 l/ha + NI-86/21
250 5000 l/ha
6 l/ha + NI-86/21
250 10000 l/ha
6 l/ha + NI-86/21
250 20000 l/ha
25
Ejemplo 4
30
35
Se efectuó un experimento en frasco de cultivo para comparar la acción antı́dota de las formas liofilizadas de bacteria NI-86/21 con la de la bacteria portadora de antı́doto NI-86/21 ETPC 250 contra el
EPTC, el butilato, el vernolato y el acetoclor, respectivamente.
1. Material, equipos y método
1.1 Preparación de las muestras liofilizadas de NI-86/21 y NI-86/21 EPTC 250
40
45
Se inoculó un cultivo puro de la especie NI-86/21 en un medio nutriente inclinado (para su composición, véase el Ejemplo 2) en 5 tubos de vidrio. Después de cultivar las bacterias a temperatura ambiente
durante 3 dı́as, se pasó la masa bacteriana a porciones de 5 ml de solución fisiológica (véase el ejemplo 2
para su composición). Se diseminó 0,1 ml de la suspensión bacteriana ası́ preparada en cada uno de 100
platillos de Petri sobre placas de nutriente. Después de una incubación a 25◦ C durante 4 dı́as, las colonias
de bacterias se suspendieron en porciones de 3 ml de solución fisiológica, que luego se introdujeron por
decenas en 10 frascos de Erlenmeyer de 100 ml de volumen para obtener 10 x 30 ml de suspensión bacteriana. De estas cantidades, 3 x 30 ml se trataron 3 x 8 ul de EPTC y luego las muestras ası́ obtenidas
se mantuvieron a -10◦ C hasta la liofilización efectuada el 5◦ dı́a siguiente a aquélla operación.
La liofilización se llevó a cabo en un dispositivo Labor MIM a -40◦C sin uso de coloide protector.
50
55
60
En su empleo, los productos liofilizados NI-86/21 y NI-86/21 ETPC fueron resuspendidos en porciones
de 60 ml de agua del grifo en un frasco y usados inmediatamente después junto con los tratamientos por
hebicidas previos al brote o a la siembra.
1.2 Experimento en frascos de cultivo
Unos frascos de plástico forrados con hoja de cloruro de polivinilo, con una superficie de 0,8 dm2 ,
que permitı́an recibir 800 g de tierra cada uno de ellos, fueron los utilizados para este experimento. Primeramente, se introdujeron en cada uno de estos frascos 400 g de tierra de cultivo superior, secada con
aire; esta tierra contenı́a un 1,95% de humus y presentaba un valor pH de 5,7 y una presantez de 46 (de
acuerdo con Arany).
Sobre esta tierra se sembraron 10 granos de maı́z Pioneer 3901 y 20 granos de sorgo HIBAR en cada
10
2 013 055
frasco. El sembrado se cubrió en cada uno de éstos con 100 g de tierra y luego se aplicaron EPTC en
una dosis de 6 l/ha, butilato en una dosis de 12 l/ha, vernolato en una dosis de 6 l/ha y acetoclor en una
dosis de 3 l/ha, respectivamente.
5
Sobre la superficie de tierra ası́ tratada, se aplicaron separdamente dosis de 0,05 x 103 , 0,5 x 103 , 1,0 x
103 y 2,5 x 103 , l/ga, respectivamente, de la suspensión obtenida del material liofilizado de la suspensión
bacteriana NI-86/21 EPTC 250, y finalmente la superficie de tierra tratada fué repetidamente cubierta
con 100 g de tierra cada vez.
10
Tratamientos:
EPTC 6 l/ha + NI-86/21 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
15
EPTC 6 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
Butilato 12 l/ha
Butilato 12 l/ha + NI-86/21 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
20
Butilato 12 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
Vernolato 6 l/ha
25
Vernolato 6 l/ha + NI-86/21 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
Vernolato 6 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
Acetoclor 2 l/ha
30
Acetoclor 2 l/ha + NI-86/21 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
Acetoclor 2 l/ha + NI-86/21 EPTC 250 0,05-0,5-1,0-2,5x103 l/ha
35
40
Cada tratamiento se efectuó con cinco repeticiones.
Las plantas se cultivaron hasta el 10 dı́a siguiente a la siembra o el tratamiento bajo lámparas de luz
diuran HgMIF/400 W, empleando una intensidad lumı́nica de 15 KLX, con un perı́odo de iluminación de
16 horas. El agua fué diariamente respuesta desede arriba hasta la capacidad de admisión de la misma.
Se midieron las masas verdes de las plantas y la longitud de tallo del maı́z. El grado de torsión del maı́z
se evaluó usando la escala descrita en el Ejemplo 1.
2. Resultados y conclusiones
45
50
55
Los resultados se muestran en las Tablas VI a XIII. Puede establecerse por tales Tablas que el material
liofilizado preparado a partir de las bacterias NI-86/21 cultivadas en el medio que contiene 250 ppm de
EPTC muestra una notable acción antı́dota. El efecto fitotóxico inducido en el maı́z por una dosis de 6
l/ha de EPTC ó de 12 l/ha de butilato o de 6 l/ha de vernolato o de 3 l/ha de acetoclor, respectivamente,
se elimina mediante una dosis de 500, 1000 ó 2500 l/ha del material liofilizado de NI-86/21 EPTC 250
preparado de acuerdo con la presente invención. Sin un pretratamiento con EPTC, la bacteria NI-86/21
no ejerce ninguna acción antı́dota.
(La Tabla VI pasa a la página siguiente)
60
11
2 013 055
TABLA VI
Acción antı́dota de dosis crecientes de la suspensión bacteriana NI-86/21 contra un herbicida EPTC, en
dosis de 6 l/ha, en el maı́z.
5
Maı́z
10
15
20
Dosis de EPTC
l/ha
NI-86/21
103 l/ha
6
6
6
6
6
Control no Tratado
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
Longitud tallo
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
4,4
4,8
5,0
5,3
7,6
18,9
2,1
2,8
3,4
3,4
3,9
5,0
4
4
4
4
3
1
1,7
0,8
25
TABLA VII
30
Acción antı́dota de dosis crecientes del biopreparado NI-86/21 EPTC 250 contra una dosis de 6 l/ha de
herbicida EPTC en el maı́z.
Maı́z
35
40
45
50
Dosis de EPTC
l/ha
6
6
6
6
6
Control no tratado
SZD5%
NI-86/21
EPTC 250
103 l/ha
0
0,05
0,5
1,0
2,5
Longitud de tallos
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
4,4
5,9
18,6
20,9
22,5
18,9
2,1
3,1
5,1
5,7
5,8
5,0
4
3
1
1
1
1
1,7
0,8
55
60
12
2 013 055
TABLA VIII
Acción antı́dota de dosis crecientes de la suspensión bacteriana NI-86/21 contra una dosis de 12 l/ha de
herbicida butilato de maı́z
5
Maı́z
10
15
20
Dosis de butilato
l/ha
12
12
12
12
12
Control no tratado
NI-86/21
103 l/ha
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
Longitud de tallos
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
16,1
16,3
17,4
16,7
15,5
18,9
4,6
4,6
4,8
4,6
4,1
5,0
3
3
2
2
2
1
1,7
0,8
25
TABLA IX
30
Acción antı́dota de dosis crecientes del biopreparado NI-86/21 EPTC 250 contra una dosis de 12 l/ha
de herbicida butilato en el maı́z.
Maı́z
35
40
45
50
Dosis de butilato
l/ha
12
12
12
12
12
Control no tratado
SZD5%
NI-86/21
EPTC 250
103 l/ha
0
0,05
0,5
1,0
2,5
Longitud de tallos
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
16,1
16,0
18,1
18,6
18,7
18,9
5,6
5,0
5,1
5,0
5,0
5,0
3
2
2
1
1
1
1,7
0,8
55
60
13
2 013 055
TABLA X
Acción antı́dota de dosis crecientes de la suspensión bacteriana NI-86/21 contra una dosis de 6 l/ha de
herbicida vernolato en maı́z
5
Maı́z
10
15
20
Dosis de butilato
l/ha
NI-86/21
103 l/ha
6
6
6
6
6
Control no tratado
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
Longitud tallo
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
7,5
6,3
8,1
7,7
12,2
18,9
4,1
3,7
4,0
4,1
4,6
5,0
4
4
4
4
3
1
1,7
0,8
25
TABLA XI
30
Acción antı́dota de dosis crecientes del biopreparado NI-86/21 EPTC 250 contra una dosis de 6 l/ha de
herbicida vernolato en el maı́z.
Maı́z
35
40
45
50
Dosis de vernolato
l/ha
NI-86/21
EPTC 250
103 l/ha
6
6
6
6
6
Control no tratado
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
Longitud de tallos
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
7,5
8,8
16,6
18,7
19,0
18,9
4,1
4,3
4,6
5,1
5,0
5,0
4
4
3
2
1
1
1,7
0,8
55
60
14
2 013 055
TABLA XII
Acción antı́dota de dosis crecientes de la suspensión bacteriana NI-86/21 contra una dosis de 3 l/ha de
herbicida acetoclor en maı́z.
5
Maı́z
10
15
20
Dosis de acetoclor
l/ha
NI-86/21
103 l/ha
3
3
3
3
3
Control no tratado
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
Longitud tallo
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
16,0
16,4
16,6
17,3
17,9
18,9
3,9
4,1
4,8
4,8
4,7
5,0
3
3
2
2
2
1
1,7
0,8
25
TABLA XIII
30
Acción antı́dota de dosis crecientes del biopreparado NI-86/21 EPTC 250 contra una dosis de 3 l/ha de
herbicida acetoclor en el maı́z.
Maı́z
35
40
45
Dosis de acetoclor
l/ha
NI-86/21
EPTC 250
103 l/ha
3
3
3
3
3
Control no tratado
0
0,05
0,5
1,0
2,5
SZD5%
50
Longitud tallo
cm/planta
Masa verde
g/frasco
Valor de calidad
16,0
18,9
19,1
20,8
21,4
18,9
3,9
5,1
5,4
5,5
6,0
5,0
3
2
1
1
1
1
1,7
0,8
Ejemplo 5
55
60
Se realizó un experimento de laboratorio en frascos de cultivo para investigar la acción antı́dota del
EPTC en un cultivo de maı́z de los filtrados acuosos y acetónicos, ası́ como de las sustancias fibrosas
residuales obtenidas del tallo y raı́z de pequeñas plantas de maı́z pretratadas con EPTC.
1. Materiales, equipos y método
1.1 Preparación de un maı́z portador de antı́doto
15
2 013 055
5
10
15
Se emplearon frascos de cultivo de plástico forrados con hoja de cloruro de polivinilo, de una superficie
de 4 dm2 cada uno, adecuados para recibir aproximadamente 6000 g de tierra secada con aire cada uno
de ellos. Primeramente se introdujeron en cada uno de los frascos 4000 g de tierra de cultivo superior,
con un contenido en humus del 1,95%, con un valor pH de 5,7 y una pesantez (de acuerdo con Arany) de
46. Sobre ella se sembraron 50 granos de maı́z Pioneer 3707 en cada frasco, cubriéndose con 1000 g de
tierra, también en cada frasco. Seguidamente, los frascos de cultivo designados por (E) se trataron con
una dosis de 6 l/ha de EPTC. La superficie de tierra tratada fué repetidamente cubierta con 1000 g de
tierra cada vez.
Las plantas de maı́z que recibieron el tratamiento (E) fueron cultivadas desde el momento del tratamiento hasta el 14◦ dı́a bajo lámparas de luz diurna HgMIF/400 W de una intensidad lumı́nica de 11
KLX, con un perı́odo de iluminación diario de 16 horas, a una temperatura de 26 ± 4◦C.
Las plantas fueron regadas diariamente desde arriba hasta el total de su capacidad acuosa. En el 14◦
dı́a, los tallos de las plantas fueron separadamente cortados en cada frasco y las raı́ces fueron liberadas
de la tierra.
1.2 Separación de los materiales filtrados y sustancias fibrosas del maı́z
20
25
1.2.1 Elaboración del tallo de maı́z pretratado con EPTC (E)
Después del corte, se trituraron inmediatamente 55 g del tallo (Ha) del maı́z pretratado con EPTC
(E), en 500 ml de agua en una máquina Turmix. El material triturado fué dividido en dos partes, 250
ml fueron filtrados a través de un filtro de vidrio de laboratorio y se obtuvo de este modo un material
filtrado acuoso (Sz), que fué designado por el código E-Ha-Vi-Sz.
El material fibroso que permanecı́a en el filtro fué agitado con 50 ml de acetona en un embudo agitador
y la fase acetónica fué extraı́da. Esta fase acetónica se designó por el código E-Ha-Ac-Sz.
30
El restante material triturado acuoso de 250 ml se filtró a través de un filtro de vacı́o y la sustancia
fibrosa que permaneció en el filtro fué agitada como muestra separada, designada por el código E-Ha-ViR.
1.2.2. Elaboración de la raı́z de maı́z pretratada con EPTC
35
La elaboración se efectuó análogamente a la descrita antes, con la excepción de que se trataron 28
g de raı́ces trituradas con un cuchillo con 400 g de agua del grifo en una máquina Turmix. De 200 ml
de material triturado se obtuvo el material triturado acuoso y luego el acetónico; la sustancia fibrosa se
obtuvo de la otra parte de un volumen de 200 ml.
40
Estas fracciones fueron designadas por los siguientes códigos:
E-Gyö-Vi-Sz
45
E-Gyö-Vi-R
E-Gyö-Ac-Sz
50
1.3 Investigación en frasco de cultivo de la acción contrarrestadora de EPTC de los materiales filtrados y de las fibras obtenidos del maı́z
1. Disposición del experimento
55
60
Se emplearon frascos de plástico forrados con hoja de cloruro de polivinilo, de una superficie de 0,8
dm2 cada uno, adecuados para recibir, cada uno de ellos, 800 g de tierra. Primeramente, se introdujeron
en cada uno de estos frascos 400 g de tierra de cultivo superior dotada de las propiedades descritas bajo
1.1. Sobre ella se sembraron 10 granos de maı́z Pioneer 3707 en cada frasco, se cubrió el sembrado con
100 g de tierra en cada frasco y luego se aplicó EPTC con una dosis de 6 l/ha. La superficie de tierra
tratada y los frascos sin tratar fueron repetidamente cubiertos con 100 g de tierra cada vez y luego se
aplicaron 100 ml de los filtrados acuosos, 100 g del material fibroso y 5 ml de los filtrados acetónicos,
cada vez y respectivamente.
16
2 013 055
Las plantas se cultivaron bajo las condiciones descritas bajo 1.1 desde la siembra hast el 7◦ dı́a y
luego se evaluaron la longitud de tallos y el peso de la masa verde del maı́z, ası́ como el exterior de éste,
usando la escala de calidad descrita en el Ejemplo 1.
TABLA XIV
5
Acción de los filtrados (Sz) acuosos (Vi) y acetónicos (Ac), ası́ como de las sustancias fibrosas residuales
(R) obtenidas del tallo (Ha) de maı́z pretratado (E) con una dosis de 6 l/ha de EPTC, sobre la
selectividad del herbicida EPTC (6 l/ha) en el maı́z.
10
Tratamiento
15
20
25
30
35
Control no tratado
EPTC
EPTC + (E-Ha-Vi-Sz)
EPTC + (E-Ha-Vi-R)
EPTC + (E-Ha-Ac-Sz)
E-Ha-Vi-Sz
E-Ha-Vi-R
E-Ha-Ac-Sz
Maı́z
Longitud de tallo
cm/planta
Masa verde
10−2 g/planta
Valor de calidad
19
9
19
19
20
20
20
18
72
56
62
72
70
72
79
68
2,0
1,2
1,8
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
Es evidente que por los datos de la Tabla XIV que el efecto fitotóxico de una dosis de 6 l/ha del
herbicida EPTC fué completamente eliminado por los extractos del material fibroso residual obtenido de
los tallos de pequeñas plantas de maı́z pretratadas con una dosis de 6 l/ha de EPTC. Como resultado
de la acción antı́dota de estos biopreparados, la longitud de tallo y el exterior de la planta cultivada
permanecieron intactos y sanos, similares a los del control no tratado.
TABLA XV
40
Acción de los filtrados (Sz) acuosos (Vi) y acetónicos (Ac), ası́ como de las sustancias fibrosas residuales
(R) obtenidas de la raı́z (Gyö) de maı́z pretratado (E) con una dosis de 6 l/ha de EPTC, sobre la
selectividad del herbicida EPTC (6 l/ha) en el maı́z.
Tratamiento
Maı́z
45
Longitud de tallo
cm/planta
Masa verde
10−2 g/planta
Valor de calidad
19
9
5
19
18
7
20
19
72
56
16
72
70
22
73
68
2,0
1,2
1,0
2,0
2,0
1,4
2,0
2,0
50
55
Control no tratado
EPTC
EPTC + (E-Gyö-Vi-Sz)
EPTC + (E-Gyö-Vi-R)
EPTC + (E-Gyö-Ac-Sz)
E-Gyö-Vi-Sz
E-Gyö-Vi-R
E-Gyö-Ac-Sz
60
Es absolutamente evidente por los datos de la Tabla XV que tanto el filtrado acetónico como el
17
2 013 055
material fibroso residual obtenidos de la raı́z de pequeñas plantas de maı́z pretratadas con una dosis de
6 l/ha de EPTC muestran una excelente acción antı́dota.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
18
2 013 055
REIVINDICACIONES
1. Procedimientos de preparación de microorganismos portadores de antı́dotos, útiles para disminuir
el efecto nocivo de los tiolcarbamatos sobre plantas cultivadas, de fórmula general (I):
5
R1
\
O
k
N - C - S R3
(I)
/
10
R2
en la que:
15
R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C1−6 o cicloalquilo C3−6 , o bien R1
y R2 , junto con el átomo de nitrógeno al que están ligados, forman un grupo hexametilenimino; y
R3 significa un grupo alquilo C1−5 ,
20
o de las cloroacetanilidas de fórmula general (VIII),
25
30
en la que:
35
R4 y R5 son iguales o diferentes y representan hidrógeno o un grupo alquilo C1−5 ;
R6 significa un grupo alquilo C1−5 , alquenilo C2−5 , (alcoxilo C1−3 )-(alquilo C1−3 ) o pirazolil -(alquilo
C1−3 ),
40
45
caracterizado porque comprende el tratamiento de microorganismos nativos o manipulados
genéticamente que viven en tierras de cultivo o son preparados bajo condiciones de laboratorio, propagados y trans- formados en una suspensión fisiológica en una proporción del 0,001 al 99% en masa, con
uno de los compuestos de fórmulas generales (I) a (VII):
50
(Las fórmulas pasan a la página siguiente)
55
60
19
2 013 055
R1
\
O
k
N - C - S R3
(I)
/
5
R2
R1
\
10
/
R2
15
N - C - S - R3
k k
O O
(II)
O
k
N - C - S - R3
/
k k
O O
R2
R1
\
(III)
20
R1
\
/
25
R2
R1
30
R2
R1
R2
R1
45
50
55
60
(V)
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
NH - C - CH2 - COOH
k
O
(VI)
\
/
R2
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
NH2
\
/
40
(IV)
\
/
35
N - C - S - glutationa
k
O
N - C - S - CH2 - CH - COOH
k
|
O
O - C - CH2 - COOH
k
O
(VII)
en las que R1 , R2 y R3 son iguales a como se definen anteriormente, o con sus derivados acilados o
esterificados, o con la mezcla del 0,0001 al 99% en masa de ellos entre si o con otros plaguicidas, reguladores, antı́dotos, fertilizantes u otras sustancias inorgánicas, nativas o sintéticas correspondientes a un
contenido en ingrediente activo de 5 a 50.000 g/ha ó de 0,002 a 5000 ppm, respectivamente; y luego, en
caso necesario, la preservación de los microorganismos, ası́ convertidos en portadores de antı́dotos, por
liofilización o por aplicación sobre un vehı́culo orgánico o inorgánico, y finalmente su elaboración optativa
por trituración, pulverización, extracción o de otra manera.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende el tratamiento de una especie bacteriana
registrada bajo el núm. NI-86/21 con los compuestos de fórmulas generales (I) a (VII) para obtener una
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suspensión bacteriana portadora de antı́doto.
3. Procedimiento de preparación de macroorganismos portadores de antı́dotos que son útiles para
disminuir el efecto nocivo de los tiolcarbamatos sobre plantas cultivadas de fórmula general (I):
5
R1
\
O
k
N - C - S R3
(I)
/
10
R2
en la que:
15
R1 y R2 son iguales o diferentes y representan un grupo alquilo C1−6 o cicloalquilo C3−6 , o bien R1
y R2 , junto con el átomo de nitrógeno al que están ligados, forman un grupo hexametilenimino; y
R3 significa un grupo alquilo C1−5 ,
20
o de las cloroacetanilidas de fórmula general (VIII):
25
30
en la que:
35
R4 y R5 son iguales o diferentes y representan hidrógeno o un grupo alquilo C1−5 ;y
R6 significa un grupo alquilo C1−5 , alquenilo C2−5 , (alcoxilo C1−3 )-(alquilo C1−3 ) o pirazolilo -(alquilo
C1−3 ).
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45
50
caracterizado porque comprende el tratamiento de una especie de macroorganismos nativos o manipulados genéticamente, preferiblemente de plantas de orden superior, que viven en tierras de cultivo o
son cultivadas bajo condiciones de laboratorio, en un medio fisiológico lı́quido o sólido, o su cultivo de
órganos, tejidos o células, con uno de los compuestos de fórmulas generales (I) a (VII), en las que R1 , R2
y R3 son tal como se definen anteriormente, o con sus derivados acilados o esterificados, o con mezclas del
0,0001 al 99% en masa de ellos entre sı́ o con otros plaguicidas, reguladores, antı́dotos, fertilizantes u otras
sustancias orgánicas o inorgánicas, nativas o sintéticas correspondientes a un contenido en ingrediente
activo de 5 a 50000 g/ha ó de 0,002 a 5000 ppm, respectivamente, la ulterior recolección de los macroorganismos, ası́ convertidos en portadores de antı́doto, dentro de los 30 dı́as siguientes al tratamiento, y en
caso necesario la preservación y/o elaboración de aquéllos mediante trituración, pulverización, extracción,
secado o de otra manera.
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