Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton

Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
LINIVERSIDADDE ALICANTE
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTo
DEFrsrolocÍa
VARIABILIDAD FUNCIONAL
DE
Los rsLorESPANcnnÁrrcosDEnarón
TESISPRESENTADA
POR:
BERNARDO OLIVERA ALONSO
PARA OPTARAL GRADO DE DOCTOR
ALICANTE.1997
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
4'ffi8)
{ffi
S;lil{ll$
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
El trabajo rcalizado en estatesis ha sido parcialmentefinanciado por los siguientes
proyectos :
GeneralitatValenciana :
cv-3rr7-95
Ministerio de Sanidad:
FIS 9410014-01
FIS 9611994-01
Unión Europea:
ERBSCl-CT920833
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
D. BERNAT soRIA ESCoMs, catedráticode Fisiología delDepartamenrode
Fisiologíade la UniversidaddeAlicante.
CERTIFICA:
Queel presentetrabajode investigaciónsobre"VARIABILIDAD
FUNCIONALDE LOS ISLOTESPANCREATICOSDE RATON*,
presentadopor D. BernardoOlivera Alonso, paraoptaral gradode
Doctor,ha sido realizadobajo su direcciónen la FacultaddeMedicinade
la Uníversidadde Alicante y puedepresentarse
parasu defensa.
Paraqueasíconstey surtalos efectosoportunos,firmo el presentecertificadoen
Alicantea veinticincode agostode mil novecientos
noventay siete.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
¡\
lf
IL
Ik*c
Fdo.:BernatSoriaEscoms
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ABREVIATURAS
a
Ordenada
en el origende la rectaderegresión
simple.
ACh
Acetilcolina.
ADP
Adenosin-5'-difosfato.
AMP
Adenosin-5'-monosfato.
Arg
AminoácidoL-Arginina.
A-IRI
Contenido
de insulinainmunorreactiva
en ácido,pglislote.
Ain-IRI
contenidoinicialde insulinainmunorreactiva
en ácido
(EX-lRI+A-IRI),pglislote.
ATP
Adenosin-5'-triosfato.
T32ATP
Adenosin-5'-triosfato
conisótopo32pen fosfatoy.
b
Pendiente
de la rectaderegresión
simple.
BSA
Albúminaséricabovina.
c.p.m.
por minuto.
Cuentas
Ca2+
Ion calcio.
lCa2+li
Concentración
intracelularde ion calcio
cAMP
Adenosin-3'-5'-monosfato
cíclico.
COz
Dióxido de carbono.
CoA
CoenzimaA.
C.V.
Coeficientede variación.
DHU
Dehidrouramilo.
DS
Desviaciónstanda¡dde los datosde la muestra.
ES
Error standardde la media.
EX-IRI
Secreción
de insulinainmunorreactiva,
pglislote/30
minutos.
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%FEx
Porcentaje
de la secreciónde insulinarespectodel contenidode
insulinadel islote.(100EX-IRI/A-IRI).
.
G
Glucosa.
GIP
Polipéptido
inhibidorgásrrico.
oC
Gradoscentígrados.
GTP
Guanosin,5'-trifosfato.
h
Unidaddetiempo:hora.
HCI
Acidoclorhídrico.
HEPES
-piperazinii]-etansulfonico.
Acido2'[4-Q-hidróxietil)-l
12sl
Isóropo125del yodo.
IBMX
Isobutilmetilxantina.
IGF-I
Factorde crecimiento
semejante
a la insulin4tipo I.
IRI
Insulinainmunorreactiva.
K+
Ion potasio.
Karp
Canales
depotasiodependientes
deATp.
KCI
Cloruropotásico.
KDa
Unidaddepesomolecular:
kilodalton.
Km
Constantecinética enzimática.
KRB
Soluciónde K¡ebs-Ringer-Bicarbonato.
Lys
AminoácidoL-Lisina.
M
Unidadde concentración:
molar.
MgCl2
Cloruromagnésico.
pl
Unidadde volumen:microliÍo.
pM
Unidadde concentración:
micromolar.
pm
Unidadde longitud:micrometro.
ml
Unidadde volumen:mililitro.
mM
Unidaddeconcentración:
milimolar.
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mm
Unidadde longitud:milímetro.
mRNA
Acidoribonucléico
mensajero.
ms
Unidaddetiempo:milisegundo.
n
Númerode datosde la muestra.
NaCI
Clorurosódico.
NAD(P)H
Nicotinamida
adenina
dinucleótido
reducido+ Nicotinamida
adeninadinucleótidofosfatoreducido(NADH + NADPH).
NADH
Nicotinamida
adenina
dinucleótido
reducido.
NaH2POa
Dihidrógenoortofosfatosódico.
NaHCO3
Bicarbonato
sódico.
ng
Unidadde masa:nanogramo.
NIDDM
Diabetes
mellitusno insulinodependiente.
nm
Unidadde loneitud:nanometro.
nM
Unidadde concentración:
nanomolar.
02
Oxígenomolecular.
p
Probabilidadde erroral considerardiferenteslas mediasde dos
muestras,
comparándolas
por la pruebade la t de student.
32Pi
Fosfatoinorgánicodel isótopo32 del fósforo.
PCl, PC2,PC3
Convertasas
de proproteína
(proinsulina).
pg
Unidaddemasa:picogramo.
PP
Polipéptidopancreático.
r.p.m.
Revoluciones
por minuto.
12
Coeficientede determinación
de la rectade regresiónsimple.
RIA
Radioinmunoensayo.
Rx
Valor dereferenciade la variableindependiente.
sx
Desviaciónstandardde la variableindependiente.
sy
Desviaciónstandardde la variabledependiente.
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sy/x
Desviación standardde la variable dependienterespectode la
variable independiente.
TPA
l2-O-tefradecanoilforbol l3-acetato.
Tyr
Aminoácido L-Tirosina.
VIP
Polipéptidointestinalvasoactivo.
W-IRI
Contenido de insulina inmunoreactiva en agua, pg/islote.
win-IRI
contenido inicial de insulinainmunoreactivaen asua
(EX-rRr
+ W-rRI).
xi
Datosde la muestratomadacomovariableindependiente.
yc
Valorde la variabledependiente
por la rectade
calculado
regresión
simple.
yi
Datosde la muestratomadacomovariabledependiente.
Yt
Valor de la variabledependiente
calculado,paracorregirla media
y la desvíaciónstandard,
mediantela pendientede la rectade
regresiónsimpley el valor dereferenciade la variable
independiente. y,=y¡+(R*- x¡)b
Zn2+
Ion cinc.
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ÍNrrcn
l.
INTRoDUccIóN
Basesmorfológicas de la fisiología del Islote de Langerhans.
2
Descripcióndel islotede Langerhans.
2
Circulacióninhaislote.
5
Identificaciónmorfológica.
6
Acoplamiento estímulo - secreción.
7
Síntesisy almacenamiento
de insulina.
7
Endopeptidasas.
ll
Secreciónde insulina.
l4
Iniciadoresy potenciadores
de Ia secreciónde insulina.
l6
Metabolismo
denutrientes.
17
Calciointracelula¡.
l7
Fosforilaciónde proteínas.
l8
ProteínquinasaA.
l9
ProteínquinasaC.
19
Proteínquinasasdependientes
de Ca2+-Calmodulina.
20
Exocitosis.
22
1.3.
Esquema general del control de la secrecién de insulina.
24
1.4.
Ileterogeneidad
25
y Variabilidad
del islote de Langerhans.
t.4.1.
Heterogeneidad
celularen célulasaisladas.
25
1.4.2.
Variabilidadmorfológicadel islotede Langerhans.
29
1.4.3.
Heterogeneidad
células-islote.
30
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)
OBJETIVOS
2.1,.
Objetivo general.
33
)',
Objetivos específicos.
33
2.2.1.
Estudio de la variabilidadfuncional de los islote s pancreáticos.
33
2.2.2
Efecto de la metodología utilizada.
34
2.2.3.
Estudio de la variabilidaddebidaa los depósitosde insulina.
35
3.
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.
Material.
39
3.1.1.
Animalesde experimen
tación.
39
3.1.2.
Reactivos.
39
3.1.3.
Aparataje.
40
3.t.4.
Software.
4l
3.1.5.
Soluciones,
42
Métodos.
43
3.2.r.
Obtenciónde islotesde Langerhans.
43
3.2.2.
Incubaciónde los islotes.
44
3.2.3.
Tamañodel islote.
44
3.2.4.
Contenidode insulinadel islote.
44
3.2.5.
Radioinmunoanálisis
de insulina.
45
3.2.6.
Análisisestadístico.
46
3.2.
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4.
RESULTADOS
50
4.1.
En el páncreas de ratón no existen islotessilentes.
5l
4.2.
La respuestade los islotes únicos depende de Ia concentración
de glucosa.
4.3.
54
Relación de la secreciónde insulina, inducida por glucosa,
y del contenido de insulina con el tamaño del islote.
59
4.3.1
Secreción.
59
4.3.2.
Contenido.
63
4.3.3.
y contenidoconglucosa3 mM y 22 mM.
Secreción
7l
4.4.
Determinación mediante RIA inespecíficode las distintas
insulinas inmunorreactivas contenidas en el islote.
4.5.
La albúmina @sA) no es necesariaen el medio de incubacién
para estimular la secreciónde insulina con glucosa.
4.6.
gg
El contenido de IRf total se puede determinar en presencia
de BSA, sin ácido.
4.7,
g5
gg
La albúmina @SA) en el medio de incubación aumenta el
contenido de insulina inmunorreactiva en ácido (A-RD,
pero no el contenido de insulina inmunorreactiva en agua.
4.8.
92
La secreciónde insulina, inducida por K+ 50 mM o por
glucosay potenciada por IBMX, se relacionan con la insulina
inmunorreactiva en agua.
4.9-
La adrenalina inhibe la secreciónde insulina y actúa sobre la
insulina inmunorreactiva en agua.
4.10.
92
97
La glucosa induce la síntesisde insulina inmunorreactiva
en agua (W-RI).
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103
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5.
DISCUSIÓN
5.1.
El funcionamiento integrado del islote resuelvela
heterogeneidadde las células B aisladas.
108
5.1.I
No existenislotessilentes.
108
5.1.2.
Los islotesresponden
a la glucosaen formaconcentración
dependiente.
109
5.1.3.
El tamañodel isloteesun factorde variabilidad.
109
Insulinas inmunorreactivas contenidasen el islote.
lll
5.2.
5.2.1.
5.2.2.
5.3.
La incubaciónde los islotesen presenciade albúminaaumentael
contenidototal de insulinainmunorreactiva
en ácido(A-IRI).
lll
El islotecontienedosfracciones
de insulinainmunorreactiva.
tt4
Los secretagogosinducen la tiberación de insulina y
modifican la insulina inmunorreactiva en agua.
6.
CONCLUSIONES
BIBILIOGRAFIA
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12l
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INTRODUCCION
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1. INTRODUCCION
1.1. Bases morfológicas de la fisiología del Islote de
Langerhans
1.1.1Descripcióndel Islote de Langerhans
Los islotes de Langerhansson racimos de tejido endocrino distribuidos por el páncreas
exocrino en todos los vertebradossuperioresy teleósteos.Cada islote es una mezcla compleja de
células y puede funcionar separadamente,como un microórgano, o también concertado como
páncreasendocrino.En los mamíferos,los islotesde Langerhansconstituyenúnicamenteun l% del
parénquima pancreático.El número de células y el tamaño del islote de Langerhansvaría desdeunas
pocascélulasy <40 ¡"rmde diámetrohasta 5000 célulasy 400 pm de di¡ámetro.Los islotesde tamaño
<160 pm de di¿irnetrocomprendenel 75Yode los islotes,pero sólo suponenunl5Yo del volumen, y
los islotes>250 ¡rm comprendenun 15% de los islotesy ocupanun 60Yodel volumen (Bonner-Weir,
I 99 l).
Hay cuatrotiposprincipalesde célulasendocrinas
en los islotesde mamíferos:
célulasno-B
célulasB
productoras
de insulina
I célulasA
productoras
de glucagón
f célulasD
productoras
desomatostatina
I
depolipéptidopancreático
I célulasPP productoras
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Células B: son poliédricas (pirámides truncadas), están muy granuladas, con griinulos
secretoresde unos 250 - 300 nm de diámetro. Hay dos tipos de gránulos en la célula B:
- gránulos maduros, presentan un núcleo denso a los electrones y una amplia membrana
envolventeque deja un halo en su interior.
- gránulos inmaduros, presentanpoco o ningrln halo, de contenido moderadamentedenso a
los electronesy recubrimientode clatrina.
Los gránulosinmadurosson el principal, sino el único, lugar de conversiónde proinsulina
a insulina. Otros cambios,como la pérdida de la cubiertade clatrina, acidificación del contenidode
los gránulos, y cristalización de insulina se produce en la maduración de los griínulos ricos en
proinsulinaa gránulosricos en insulina. La proporciónde células B en los islotesvaría de especiea
especie.En los islotesde ratonesnormaleshay aproximadamente
un 80% de célulasB.
CélulasA: son más pequeñasy columnaresque las B. Estánmuy granuladas,con gránulos
de unos 200 - 250 nm de diámetro.
Células D: son más pequeñasque las células A y B. Están muy granuladas,y suelen
presentarforma dendrítica.Los gránulostienenun tamañode unos 200 -250 nm de diámetro.
La figura l.l muestrala imagende un islote de Langerhansdonde se observanlas distintas
célulasendocrinasque lo forman, teñidasde distinto color. Las célulasB aparecende color verde, las
célulasA se presentande color azul y las célulasD de color rojo.
Las célulasno endocrinas
incluyencélulasendoteliales,
célulasnerviosasy fibroblastos.
El isloteestárecubiertopor una cápsulaformadapor una capade fibroblastosy fibras de
coláseno.
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Figura 1.1. I:magendel islote de Langerhans. üstribución celularen islote
pancreáticode ratón. Las cáulas B aparecende color verdg las élulas A son
las de color azul y las célulasD de color rcjo. Tonado dB: RL. Sorensony
T.C. Brelje. Deptnent
of Cell Biologt md Newoanamty. University of
Mirmesota (h@:/r\n'w. rcv o.dHlri)
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1.1.2.Circulación intraislote
El islotede Langerhans
de rataestáformadopor un núcleode célulasB envueltas
en un
manto,de un grosorde unaa trescélulas,de célulasno-B.
Los microcapilares
formanla infraestructura
de un islote.La arteriolaentraen el islote de
por unade lasdiscontinuidades
Langerhans
delmantode célulasno-B,y llegadirectamente
al núcleo
de célulasB, desdedondese ramifica en capilaresfenestrados,
que siguenun camino tortuoso,
primero a travésdel núcleo de célulasB y despuésa fravésdel manto de célulasno-g. Los
microcapilares
eferentes
confluyenen vénulascolectoras.
El tipo de microvascularización
varíasegún
el tamañodel islote.En los islotesgrandes,los vasoseferentes
confluyenen el espaciosubcapsular,
en los pequeños
seextienden
por el tejidoexocrinounos50 - 100pm antesde confluiren lasvénulas
(Bonner-Weir,
colectoras
1991).LascélulasB, de rata,presentan
doscaraslibreshacialos capilares,
y entreunasocho a diez célulasforman una rosetaalrededordel capilar,dandolugar a la forma
tubulardel capilar(Bonner-Weir,
1988).En el casode los islotesde ratón(FiguraI .1) la distribución
celularesdistintay lascélulasB formangruposcelularesquese intercalanentrecélulasno-B.
Hay bastantesevidenciasde que las células B poseenuna polarizaciónmorfológica
funcional.En célulasB desgranuladas
experimentalmente,
los gránulosremanentes
estánpolarizados
haciala capilaridadcentral.
En la uniónde treso máscélulasB existencanalículos
con microvilli interdigitados.
Los
desmosomas,
que actuancomo unión mecánica,se encuentranprincipalmenteen esta zona. Esta
superficieestáespecializada
en funcionessensoras
o secretoras.
Dos líneasde evidenciasugierenuna
funciónsensora:
- los microvilli estrínenriquecidos,
variasveces,en un transportador
de glucosaencontrado
en hígadoy célulasB (Orci et al.,1989\,
- la exclusiónde figurasde exocitosisen la regióncanalicular(Bonner-Weir,1989).
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1.1.3.Identificación morfológica
Mediante autorradiografia de alta resolución, Orci siguió la vía de transformación de
proteínas formadas de nuevo, desde el retículo endoplásmicorugoso hacia los gránulos de las
vesículassecretoras(Orci et a1.,1985).
A los l5 minutos,después
de su síntesis,
la mayorpartede las moléculasde proinsulinaes
recuperada
en el complejode Golgi, y se muevendesdelas cisternasde Golgi c¡s a las trans, donde
sonempaquetadas
en vesículas
recubiertas
de clatrina(Orci et al.,1988).Durante,y pocodespués
de
su separación
del complejode Golgi,estasvesículas
parecenestaruniformemente
llenasde material
proteico,de moderadadensidada los electrones.
En esteestadíose inicia la transformación
de la
proinsulina(Orci et al., 1984)(Orci et al., 1985)(Orci et al., 1988).Esta iniciacióndepende,
probablemente,
de la presenciade, primero, componentes
de membranaque creancondiciones
intravesiculares
parala conversión
proteolíticay, segundo,de enzimasque hidrolicenlas proteínas
precursoras
sintetizadas;
la proteínamásimportante,la insulina,cristalizacomo complejo de Zn2+y
ocupael núcleode la vesículasecretora
(Howell,1984).
En cuantoal requerimientoenergético,el ATP no parecenecesarioparala formacióndel
gránulo,aunquesí, parael transportede la proinsulinaal retículoendoplásmico
rugosoo al complejo
de Golgi (Howell, 1972;citadopor Howell y Tyhurst,1982),y tambiénparael procesode conversión
deproinsulina
eninsulina(Rhodeset al.,1987).
Una horadespuésde la síntesisde su precursor,la insulinaes el principalproductode las
vesículasquehanperdidola cubiertade clatrina(orci et al., 1985)(orci et al.,l9g7).
Las célulasB, de adulto,tienenuna cantidadrelativamentegrandede insulinaalmacenada
(50 pglcélula) (Pipeleerset al., 1987).Dean (Dean, 1973; citadopor Howell y Tyhurst, 1982)
medianteestudiosmorfométricosde granulos(en ratones),observóun promediode unos 13000
gnínulos/célulaB, que corresponden
a un 1006del volumen celular,lo cual estáde acuerdocon la
observación
de quela cantidadrelativade insulinaesun 10oádel contenido
proteicodel islote.
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Inhibiendo la secreción de insulina, inducida por glucosa, con adrenalina, sin afectar a la
biosíntesis de insulina, se observa un aumento de 120%oen el número de gránulos (hasta
28000/célula)en 45 minutos (Dean, 1976; citado por Howell y Tyhurst, 1982). La biogénesisde
gránulos que esto implica es considerable,pues la velocidad máxima de secreciónque se alcanza
normalmente es un 100/odel contenido de insulina/hora;así que, para mantener el cpntenido de
insulina, se requierela generaciónde unos 1300gránulos/célulalhora.
Se ha calculadoque hay unas
200000 moléculas/gránulo(Howell, 1974; citado por Howell y Tyhurst, 1982), por lo que una
secreciónactiva deberíaliberar unas2-6 108 moléculas/horade hormona.
En una minoría de células B del islote, las vesículassecretorascontienenprincipalmente
proinsulina, como si no se produjera la conversiónen estascélulas antes del almacenamientoy/o
secreción.
El pH del gránulo es importante para iniciar la conversiónproteolítica de la proinsulina.Se
han identificado dos endopeptidasasresponsablesde la conversión (Davidson et al., l98B). El pH de
los gránulos de insulina aislados es del orden de 5.0 - 5.5; las vesículas de Golgi- trans tienen pH
neutro; los gránulos inmaduros tienen pH intermedio entre los anteriores(Hutton, 1982).
1.2.Acoplamiento estímulo- secreción
1.2.1.Síntesisy almacenamiento
de insulina
Cualquierincrementoen la secreciónde insulina es nípidamentecompensadopor un
incrementocorrespondiente
en la bioslntesisde proinsulina,d e forma que las reservasde las células
B sonrellenadascontinuamente.
Portanto,la regulaciónde la bioslntesisde proinsulinaesun aspecto
muy importantede la funciónde la célulaB.
En células B de islotes pancreáticosnormales, la biosíntesis de proinsulina es
específicamenteregulada por muchos factores,de los que la glucosa es el más relevante
fisiológicamente.
A corto plazo(<2b),la biosíntesis
de proinsulinainducidapor glucosaesreguladaa
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nivel de traducción.Paralargosperiodosde estimulación(>6h) hay un gradoadicionalde control a
nivel de transcripción,
asícomoun aumentode la estabilidad
del mRNA de preproinsulina,
quepuede
contribuiral control de la biosíntesisde proinsulina;pero estecontrol sólo tendríaimportanciaen
condiciones fisiológicas inusuales, como realimentacióndespués de ayuno prolongado o
hiperglucemia
en NIDDM. Portanto,en condiciones
fisiológicas
normales,
el control fino, minutoa
minuto,de la biosíntesis
de proinsulinaes principalmente
mediadoa nivel de traducción(Skellyel
al.,1996).
Dos principalescambiosconformacionales
culminanen la formacióndel núcleo del
gránulo,la homohexamerización
de proinsulinay Ia condensación
de insulina,sensiblesal Zn2+y
ocurren en la salida del retículo endoplásmicoy en la llegada a los gránulos inmaduros,
respectivamente
(Huangy Arvan,1995).
Los cristalesde insulinasonmásestables
a pH próximoal puntoisoeléctrico
(5.5- 6.0)y
en presenciadeZn2+. Prácticamente,
latotalidad delZn2+se encuentraen el núcleodel gránulo,
unido covalentemente
a moléculasde insulina,a travésdel grupo histidinaB10, en forma de
hexámero(dosátomosde Zn2+por cadaseismoléculasde insulina)(Hill er at., l99l) (Bryarúet al.,
1993)(Bently ef al., 1992).Estáclaro que la proinsulinatambiénpuedeunir Zn2+ de forma similar,
pero la moléculaZn2+-Proinsulina
es relativamente
soluble,por lo que la condensación
en los
gránulossóloocunedespués
de la conversión
deproinsulina
en insulina(Howell y Tyhurst,l9g2).
La figura 1.2 representa
la estructuradel hexámerode insulinacoordinadocon Zn2+,de
formacilíndricade dirímetro50 A y altura35 A, a partirde los datosde Hill (Hill et al.,l99t).Los
monómerosde insulinase asociande forma antiparalelapara formar dímeros(representados
en un
mismo color) en cuya estabilidadintervienenlos restosglutamato813. En presenciade Zn2+ tres
dímerosse asocianpara formar hex¿irneros.
Dos átomosde Zn2+ se colocanen el eje axial del
cilindro, a una distanciade 15.9A entresl, y los seisenlacesde coordinaciónde cadaZn2+ se unen
con tres restosHistidinaBl0, uno de cadadímero,haciael centro del cilindro y tres moléculasde
aguaorientadas
haciael exterior.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Figura 1.2. Representacióndel hexámero de insulina (vistas axial y
transversal). El hexámeroesta formado por tres dímeros de insulina
coordinadoscon dos átomosde Zn2+ que estabilizanla estructura.Realizado
segin datosde Hill et al., 1991.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
de insulinase inicia en el retículode Golgi trans.La
La formaciónde gránulossecretores
maduraciónse caracterizapor la pérdidade la cubiertade clatrina de la membranadel gránuloy
cambiosen la morfologíadel nrlcleodel griánulo.La conversiónproteolíticade proinsulinaa insulina
se produceen la maduracióny se inicia por cambiosen la composicióniónicadel gránuloinmaduro.
físicascomunesque las permiten
Las protelnascontenidasen los gránulospuedentenerpropiedades
coagregarseo interaccionarcon la membranadel retículo de Golgi-tra¡es.Muchas tienen puntos
al pH del gránulo,y puedenfijar Caz+.
ácidos,quecolresponden
isoeléctricos
relativamente
de ATP, que
Los gránulossecretores
tienenen sumembranauna bombade H+ dependiente
de la proinsulina,por lo que el
acidificael granulohastael pH óptimo de las enzimasconvertidoras
aumentode ATP, provocadopor el aumentode la concenfraciónde glucosa,activarála maduración
de los grrínulosinmaduros(Rhodeset a1.,1987).
de glucosaconducea mejorar la
La exposiciónde los islotes a altas concentraciones
por glucosa.La insulinareciénsintetizadaimplica la
secreciónde insulinaestimuladaposteriormente
al estímuloinicial (Hoenig et al., 1986)
creacióno el aumentode tm pool de insulinacomorespuesta
(Hutchinsy Menell, 1985).
de los gránulosse reciclanhaciael
Despuésde la exocitosis,la mayoríade las membranas
retículode Golgi-traraparaincorporarse
a lasnuevasveslculas.(Hutton,1994)
es el mecanismoclave
La eliminaciónendoproteolítica
de paresde aminoácidosbrásicos
específicodemoléculasprecursoras
de hormonas.En la conversiónde proinsulina
del procesamiento
PCI (o PC3)y PC2.Ambassiguenun patrónde incrementode
esüánimplicadasdosendopeptidasas,
densidad gradual en la vía secretorq siendo superior en los glifurulossecretoresinmadwos. La
proinsulinase detectaprincipalmenteen el aparatode Golgi y en los ganulos secretoresinmaduros
recubiertos,localizadosen el área de Golgi. PCI y PC2 se localizan en los gránulosricos en
proinsulina.La coexpresiónde PCl, PC2y proinsulinaindicaque estasproteasas
están activamente
de forma secuencial,
en la conversiónde proinsulinaen insulina.(Malide
implicadas,probablemente
et al.,1995)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
t0
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
dos insulinasdiferentes,InsulinaI e insulinaII, de genesno
En ratay ratónse encuentran
diferenciaen la proporciónrelativa.En ratala razónes 2: I y en
alélicos,y ambosanimalespresentan
Io
ratón 1:2.En ratala razónesmayor en la insulinareciénsintetizadaqueen la insulinaalmacenada,
que indicauna cinéticade conversiónmiáslentade la proinsulinaII que de la proinsulinaI (Linde et
Leahy (Leahy, 1993)la ha determinadoen
at., 1989).Respectoa la proporciónproinsulina/insulina,
extractosde páncreasde ratamedianteHPLC, encontrandoun valor de aproximadamentell.5%.
de ratón;el péptido
La figura 1.3presentala estructuraprimariade las dospreproinsulinas
señalestáformadopor los 24 primerosaminoácidos,que se eliminanpara formar la moléculade
al péptidoB y los 21 últimos aminoácidos
proinsulina;los aminoácidosdel 25 al 54 corresponden
al péptidoA de la insulina;los aminoácidosintermediosentreB y A constituyenel
corresponden
y posee
I se diferenciade la II en los aminoácidossubrayados,
péptidoconectorC. La preproinsulina
73 y 74.
menosquela II debidoa unadelecciónde los aminoácidos
dosaminoácidos
1.2.1.1.
Endopeptidasas
estructu¡almenterelacionadascon la subtilisina
Hay una familia de endopeptidasas,
La proteasakex2 de Sacharomyces
de las proprotelnas.
del procesamiento
bacteriana,responsables
cerevisiae es la mejor caracteizada,y se ha identificado un grupo de homólogos de Kex2 en
y Furina(PACE) y
PC2y PC3 (o PCI) en célulasnerviosasy endocrinas,
mamíferosdenominadas:
PACE-4de mayorubicuidad.
La biosíntesisde PC3 esestimuladapor glucosade formaparalelaa la de proinsulina,la de
PC2no esestimuladapor glucosa.La biosíntesisde PC3y proinsulinaesestimuladapor encimade 4
mM de glucosa,y alcanzael máximo(7 a l0 veces)con glucosal0 mM; es rápida,comienzaen 20
el máximoa los 60 minutos,y no se afecÍapor ActinomicinaD, lo que indica
minutos, alcanzando
que la regulaciónes a nivel de traducción.La señalintracelularparala síntesisde PC3 y proinsulina,
estimuladapor glucosa,parecesimilar y requiereel metabolismode glucosa.PC3 se considerala
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
ll
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
PreproinsulinaI de ratón
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PreproinsulinaII de ratón
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ll0
Figura 1.3.Estructuraprimaria de las preproinsulinasde ratón. Tomado
de ExPASy Molecular Biologt Server. Geneva university Hospüat and
Universityof Geneva.(http://expasy.hcuge.ch)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
clavede la conversiónde proinsulina,e inicia el procesopreferencialmente
endopeptidasa
(Alarconet al.,1993).
son
Muchasproteínassecr€toraseucarióticas,incluidas hormonasy neurotransmisores,
por proteolisislimitada.El
inactivasque sonprocesadas
comomoléculasbiológicamente
sintetizadas
corteproteolíticose produceen el extremoC-terminalde una secuenciade dos aminoácidosbasicos
se produceen todaslas células
(generalmente
Arg-Arg o Lys-Arg). Esteproceso,muy conservado,
eucarióticasdesdelevadurasa humanos,siendo común a proteínasque siguen la vía secretora
constitutiva(albúmina,receptorde insulina,etc.) o la vía secretoraregulada(insulina,etc.). En la
Arg3l-Atg32 y Lys64-Arg65,catalizado
proinsulinael corteproteolíticoseproduceen lassecuencias
Ademásde la secuenciade
tipo I (PCl, PC3)y tipo II (PC2)respectivamente.
por dosendoproteasas,
aminoácidosbásicos,también intervienenen el reconocimientode la secuencialos aminoácidos
de la proinsulina.
próximos,asícomola estructurasecundaria
requierenCa2+, tipo I (l-2 mM) y tipo II (50-30 pM) y tienenpH
Ambasendoproteasas
óptimo 5.5, pero el tipo II tiene rangomás ancho,siendomás activaque el tipo I a pH próximo al
de la molécula
conffolanel procesamiento
neutro.Esto sugiereque el Ca2+ y el pH intragr¿ínulo
precursora.
Es raro encontr¿rlas moléculasintermediarias32,33-splity 65,66-splítdebido a Ia gran
que eliminanípidamentelos aminoácidos
H en los granulossecretores,
cantidadde carboxipeptidasa
(Rhodeset al., 1992)
en el corteendoproteolítico.
básicosC-terminalexpuestos
a glucosay hay pocaevidencia
PCI y PC2 son coliberadascon la insulinaen Ia respuesta
dirigidasa la vía regulada.
de secreciónen la vía constitutiva,lo que indica que son eficientemente
(Hutton,1994)
la
A corto plazo(<2h) la estimulacióndel islote con glucosaincrementaespeclficamente
biosíntesisde proinsulinay sus enzimasconvertidorasPC3 y PC2 a nivel de traducción.A largo
plazo (>6h) la glucosamantieneniveles los de mRNA de PC2 y PC3 paralelosal mRNA de
PC2 y PC3 son 2.9,3.0 y
preproinsulina.
Despuésde 48 h los nivelesde mRNA de preproinsulina,
con glucosaque en ausenciade glucosa.La expresióngénicade
5.3 vecessuperior,respectivamente,
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
PC2,PC3 y preprcinsulinaserealizacon glucosa>5.5 mM. La estabilidadde mRNA es PC2 (9 h),
PC3 (5 h) y preproinsulina(24 h) y no se afectapor la glucosa.La transcripciónde preproinsulina,
PC2 y PC3 comienzaa inducirse I h despuésde exponersea 16.7 mM de glucosa.El cAMP
PC2,ni PC3.
por forskolinano tieneefectosobrelos nivelesde mRNA de preproinsulina,
aumentado
(Schuppiny Rhodes,1996)
L.2.2.Secreciénde insulina
de otrashormonas
En condicionesfisiológicas,la secreciónde insulina,y probablemente
por la concentración
de nutrientes
pero no exclusivamente,
pancreáticas,
esreguladaprincipalmente,
la glucemia.Estosnutrientesejercenun efectodirectoe inmediatosobrela
circulantes,especialmente
slntesisde proinsulinay la secreciónde insulina,aunqueambosprocesosno estiinligadosuno a otro,
por ciertosagentesinsulinotrópicos.
El controlinmediato
y puedenser reguladosindependientemente
sólo un aspectode la regulaciónde la
de la secreciónde insulinapor nutrientescirculantesrepresenta
colinérgicos,
Otrosagentes,como neuroüansmisores
en la célulaB pancreática.
actividadsecreüora
tambiénparticipanen el control directoe inmediatode
u hormonasgastrointestinales,
catecolaminas
la secreciónde insulinq mientrasque varios factores,incluyendonutrientescirculantes,pueden
en
ejerceruna modulaciónretrasadapero sostenidade la secreciónhormonal,como los encontrados
lactanciao vejez(Malaisse,1991).
especiales
oomoayuno,embarazo,
situaciones
I-a regulaciónde la slntesisde proinsulinay de la secreciónde insulinase distinguepor su
de la glucosa.El nivel de glucosanecesarioparala biosíntesisde insulinaesmenorque
dependencia
parala secr€ción(Pipeleerset al.,1973;citadopor Malaisse,l99l).
aisladossegreganuna
A concenfacionesfisiológicasde glucosa,los islotespáncreáticos
pero no es
pequeñaporción de insulina"y esta secreciónpuede amplificarsepor secretagogos,
eliminada,en condicionesqueinhibenla secreciónreguladadesdelos gránulosmaduros.La facilidad
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
relacionadoscon la
para estimularla secrecióny el perfil bioquímicode los péptidossegregados,
proinsulina,indicaqueestasecreciónseoriginadesdelos granulosinmadurosLa estequiometríade la secreciónde péptido C e insulina, marcados,es l:l
a altas
fisiológicaso bajas,el péptido C es
de glucosa.Sin embargo,a concentraciones
concentraciones
liberadocon un excesomolar de insulina,como si las vesículasexocitósicasque conllevanesta
post-Golgi,en el que el lumen estuvieracompuestode
secreciónprocedierande un compartimento
se puedenexplicarpor un modelode
y péptidoC soluble.Estasobservaciones
insulinacondensada
tráfico reguladode proteínassecretoras,en el que la exocitosisdirecta de gránulosjóvenes es
de glucosa,y la apariciónde vesículassecretorasdesdelos
estimuladapor altas concentraciones
de glucosa.Así, el destinode la insulinade
gránulosinmadurosseproducea bajasconcentraciones
y constitutivas(Arvan et al., l99l).
reguladas
los gránulosmadurospresentacaracterísticas
La insulinaliberadaen la exocitosisseguinicoordinadacon Zn2+, cuandoes vertida al
medioextracelula¿hastaque algunmecanismorompala unión Zn2+-insulina,y, aunqueseasoluble,
la compactaciónde las seis moléculasde insulinadel complejode coordinacióndeberíasuponer
impedimentoestéricoparaunirsea su receptoren las célulasdiana@ersony Yallow, 1966; citado
por Ciszaky Smith, 1994) o, como nosotrossuponemos,para ser reconocidopor el anticuerpo
antiinsulinadel RIA. En la prácticaexperimental,se necesitaque la albúminaestépresenteen el
mediode incubación(Ferreret al.,1984)paxaquelos islotesproduzcansecreciónde insulina,perose
que,en la sangre,el Znb setransportaunidoprincipalmente
desconoce
comoactua.Si consideramos
a la albrimina(Massuokay SalÍnan, 1994)(Tibaduizay BobilyU 1996)(Kiilerich y Christiansen,
1986),éstapuedeactuarcomo quelanteendógenoparacaptarel Zn2+ del hexámero,dejandolibre la
ínsulina como monómero.El ZnZ+ libre, en concentraciónsuperior a 0.05 mM, puede alterar la
actividadeléctricade la célula B (Ferreret aI., 1984),pero su concentraciónen sangrees del ordende
nM (Tibaduizay Bobilya, 1996)y la inhibiciónde la secreciónproducidapor Znz+podrÍadebersea
la satu¡aciónde la albúminaque captaríamenosZn2+ delhexámero.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
de la secreciénde insulina
t.2.2.l.Iniciadoresy potenciadores
El principal determinantede la secreción de insulina es el nivel de glucemia; hormonas y
neu¡otransmiso¡esactuan modulando la acción secretorade la glucosa. Los secretagogosde insulina
se dividen en dos grupos: iniciadoresy potenciadores.
Iniciadores, son sustanciascapacesde estimular la secreción de insulina por sí mismos, e
incluyen nutrientes (como la glucosa) que son metabolizados por la célula B; sustancias que
estimulan el metabolismo de nutrientes endógenos;y drogas como las sulfonilureas. La célula B es
excitableeléctricamente,yestaactividadelécttc4y el aumentode [Cz2\iasociado, es la clavepara
el inicio de la secreción(Soria.,1989)(Valdeolmilloset al., 1989)(Boleaet al., 1997)$Aartín et al.,
1997).La glucosay las sulfonilureasinhibenlos canalesK-etp de la membranaplasmáticade la
comúnparalos iniciadoresde la secreciónde insulinaes la capacidadpara
célulaB. El denominador
la célulaB (Valdeolmillosel al.,1992).
bloquearlos canalesK-etp y despolarizar
como ACh, que
Potenciadores,hormonascomoglucagón,GIP, VIP y neurotransmisores
son capacesde potenciarla secreciónde insulina,en presenciade glucosa,pero no la inician sin
glucosa(Srlnchez-Andrés
JV et al., 1988).
galanina,
La secreciónse puedeinhibir por sustanciascomo diazóxido,somatostatina,
peptide)y agonistasadrenérgicos.
Los inhibidorespuedenactuara
CGRP (calcitoninagene-related
nivel del metabolismo,de la membranaplasmáticao de la misma exocitosis(Ashcroft y Ashcroft,
l99r).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
t6
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.2.2.2.Metabolismode nutrientes
El canal de K-¡1p es responsabledel potencialde membranade la célula B, y su
de potencial,que
inhibicióndespolarizala membrana,Io cual abrelos canalesde C*+ dependientes
y
conducea un aumentode la [Cu2+]¡ que causala secreciónde insulina(Martín, Sánchez-Andrés
Soria,1995)(Nadalet a1.,1994).
En el citosol, la glucosa se transformaen piruvato, que puede ser oxidado en la
mitocondria,pasandopor acetil-CoAy el ciclo del ácidocítrico, aCO2y agua.El NADH producido
se oxidaen la cadenarespiratoriaacopladaa la síntesisdeATP, en la fosforilaciónoxidativa.
y se acumula
El aumentode la relaciónATP/ADP inhibe la piruvato deshidrogenasa,
piruvatoqueesreducidoa lactato,el cuales liberadoal medioextracelular.
Los ácidosgrrisosse convíertenen acil-CoA,que es introducidoen la mitocondria,donde
se transformaen acetil-CoA,que sigue vía ciclo del ácido cítrico y fosforilaciónoxidativa para
sintetizarATP.
previatransaminación,
setransfornanen 2-cetoácidos,quedariínlugar a
Los aminoácidos,
del ciclo del ácidocÍtricoparaser oxidadosy aumentarla síntesisde
precursores
o a intermediarios
ATP (Martín y Soria, 1995).Bolea (Bolea et al.,1997) ha mostradoque cuandolas célulasB son
y glucosase explicamas adecuadamente
la
fisiológicasde aminoácidos
a concentraciones
expuestas
de la secreciónde insulina.
homeostasis
1.2.2.3.Calciointracelular
del aumentode la
por exocitosis,comoconsecuencia
La secreciónde insulinase produce.
en diferentesespeciescomohumanos(Martfn y Soria, 7996),rata
[Cu2+]i lo cual se ha comprobado
(Martín,Reig y Soria,1995)y ratón(Nadalet al.,1994).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
semueveny sefusionanconla membranaplasmática,descargando
Los gránulossecr€tores
de
Hay evidenciade quela fosforilaciónde proteínas,dependiente
su contenidoal medioextracelular.
perolos mecanisrnos
no sonbien
moleculares
Ca2+,estáimplicadaen la iniciaciónde la exocitosis,
conocidos.
también puede involucrar la
El efecto potenciadorde hormonasy neurotrasmisores
activaciónde la fosforilaciónde proteínas,actuandosobrelasproteínquinasasA y C.
puedeestarimplicadoen ciertos
La liberaciónde C&+ de los reservoriosintracelulares
sin embargo,un importantemecanismopara la potenciaciÓnde la secreción
efectospotenciadores;
pareceestaren una sensibilizacióndel sistemasecretoral Ca2+ (Ashcroft y Ashcroft, 1991). En
realidadel Ca2+ debe aumentarcerca del sensorque disparala maquinariaexocitótica,en este
que los nutrientescomo la
sentidoMartín, Ribas y Soria (1997) han demostradorecientemente
mientas que el carbacollo aumentaen la
glucosaaumentanla [Ca2+]¡en la regiónsubmembrana,
zonacentralde lascélulasB.
1.2.2.4.Fosforilaciónde proteínas
que aumentanel cAMP o activanel intercambiode
Las hormonasy neurotransmisores
inositol fosfatidos,producenpocao ningunaestimulaciónde la secreciónde insulinaen ausenciade
glucosau otro iniciador.
puedeser centralen
de Ca2+-Calmodulina
La activaciónde proteínquinasasdependientes
la iniciaciónde la secreciónde insulina,mientrasque a las protelnquinasasA y C se les asignaun
papel moduladoren el efecto potenciadorde hormonasy neurotransmisores(Ashcroft y Ashcroft,
r99l).
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1.2.2.4.1.Proteín quinasaA.- El aumentode cAMP, por glucagóny otrashormonas,que
potenciala respuestasecretorade la glucosa,se acompañade una rápidafosforilaciónde sustratos
de la proteínquinasaA (Christiey Ashcroft,1985),apoyandoel papelmoduladorde ésta
específicos
en la regulaciónde secreciónde insulina.
premarcados
Sehan estudiadolos sustratosde proteínquinasaA en islotesde Langerhans,
"on
32Pi,y estimulados
con forskolina(activadorde adenilatociclasa)(Christiey Ashcroft, 1985),y
expuestosa cAMP, en presenciaAe¡.¡321aff (Jonesel al., 1988),
tambiénen islotespermeabilizados
rapidoscambiosen la fosforilaciónde péptidoscitosólicosy de membrana.
demostrando
La glucosaelevapor sí mismael cAMP de la célulaB, pero es improbableque esteefecto
al mecanismoiniciadorde Ia glucosa,ya que si se aplicacAMP, con
contribuyasignificativamente
de glucosa,no seestimulaIa secreciónde insulina(Christiey Ashcroft,I984); y si
bajaconcentración
seínhibela proteÍnquinasaA conun análogodel cAMP, la glucosasigueestimulandola secreciónde
et al.,1990).
insulina(Persaud
paralaactividad
de la protelnquinasa
ProtefnquinasaC.- El Ca2+esnecesario
1.2.2.4.2.
C, pero el principal reguladorde la proteín quinasaC es el diacilglicerol(DAG), liberadopor la
fosfolipasaC sobreel fosfatidilinositolbifosfato,quemodulala sensibilidadde la proteínquinasaC
al C&+ (Nishizuka,I 988).
El l2-O-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA), que activa la proteín quinasa C
sustituyendoel efecto del DAG, es un intensopotenciadorde secreciónde insulina, acompañándose
de un aumentode la fosforilación de proteínasdel islote (Hughes y Ashcroft, 1988)(Howell et al.,
r990).
El clomifeno, inhibidor de protefn quinasaC, bloqueael efectodel TPA sobrela secreción
de insulinay la fosforilaciónde proteínasen el islote(Hughesy Ashcroft,1988).
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Se han descritovarias
de Ca2+-Calmodulina.l.Z.Z.4.3.Proteínquinasasdependientes
de Ca2+'Calmodulinaproteínquinasasdependientes
La quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK) puede estar involucrada en la
(Oberwettery Boyd, 1987).
de gránulossecretores
translocación
La proteín quinasa P53 fosforila una proteína endógenade 53 KDa., se activa a
concentraciónpM de CaZ+ en presenciade calmodulina,y se inhibe por antagonistasde la
del citoesqueleto(Harrison
calmodulina.Seha sugeridoquela proteínquinasaP53esun componente
et at., 1984)(Harrison y Ashcroft, 1982),y pareceposibleun papel mediadoren la interacciÓn
del péptidofosforilado por lo que
La actividadquinasano ha podidosep¿rarse
gní,nulo-citoesqueleto.
es posible que se autofosforile.La proteín quinasaP53 tiene caracterlsticassemejantesa la
calmodulinaquinasaII, y sepiensaquepodríanserla mismaquinasa(Colbranet al.,1989).
El dehidrouramilo(DtIu), un análogo establedel aloxano,inhibe la quinasaP53, en
extractosde islotes,pero no la proteínquinasaA, y causauna menor inhibición sobrela proteín
quinasaC (Flarrisonet al.,1986).
de la secreciónde insulinaa la glucos4 y
En islotesintactos,el DHU alterala respuesta
bloqueael efectode la forskolinay del TPA, por lo que se sugiereun papelcentralparala proteín
quinasaP53en la iniciaciónde la secreciónde insulina.
ProtelnquinasaII (CaM-quinasaII): los inhibidoresde estaquinasareducenla secreción
por lo
exocitósicaa la despolarización,
de insulinaestimuladapor nutrientes,asf como la respuesta
que se suponeque esta enzima debe actuaren la exocitosis,probablementefosforilando protelnas
implicadasen el procesode Ia secreciónde insulina.No seconoceel sustratode Ia fosforilación,pero
puede estar ¡elacionadofi.¡ncionalmentecon las sinapsinas(las sinapsinasson especlficasde las
neuronas),regulandola unión entregranulossecretoresy citoesqueleto,como sucedeen las neuronas
(Ámm¿¡lá
et a1.,1993).
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20
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Hay dos mecanismospor los que la activaciónde proteínquinasaspuedenpotenciarla
secreciónde insulinaestimuladapor glucosa:
L- la activaciónde proteín quinasaspuedeconducira un aumentode la [Caz+]¡ por la
entradade C&+ ex$acelulara través de Ia membranacitoplasmática,o por la salida desdelos
reservoriosintracelulares
al citosol(Hugheset a|.,7989).
II.- la activaciónde proteínquinasaspuedesensibilizarel mecanismosecretoral nivel de
Ca2+ intracelular,precisandomenor lCu2+li para activar la secreciónde insulina (Huglteset al.,
1987).
Estádescritoel efecto activador,en los islotes,delCa2+,mediadopor calmodulina,sobre
la adenilatociclasa,que aumentael cAMP potenciandola secreciónde insulina,pero no la inicia, y
quereduceel nivel de cAMP reduciendola secreciónde insulina(Christiey
sobrela fosfodiesterasa,
Ashcroft,1985).
Los potenciadores
de la secreciónactuana variosniveles:
- puedenestimularla actividadeléctricade la célulaB (Henquinet al., 1988),
- alteranlas concentraciones
de segundosmensajeros
como Ca2+, diacilglicerolo cAMP
(Hugheset al.,1990) (Malaissey Malaisse-Lagae,
1984)(Christiey Ashcroft,1985),
- sensibilizanla maquinariasecretoraa los nivelesde Ca2+ (Hugheset at.,1987),
Los secretagogos
secundarios
comprenden
dosgruposprincipales:
I.- los queelevanel cAMP paraactivarla proteínquinasaA
II.- los que estimulanla vía del fosfatidilinositoly elevanlalCa2+lipara
activar la proteÍnquinasaC.
Las célulasB purificadascontienenreceptoresde glucagón.El glucagónactiva la enzima
adenilatociclasa,con la intervenciónde GTP y Ns (proteínareguladorade la unión al receptor),
aumentandoel cAMP. El cAMP puede favorecerel catabolismode nutrientesendógenos,que
ejercerlanun efecto semejanteal de los nutrientessobre la biosíntesisde proinsulina o la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
21
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
de K+ (Malaissee/ al.,1974;citadopor Malaissel99l) (Carpinelliy Malaisse,1980;
conductividad
ciüadoporMalaissel99l).
Ciertos estudioshan reveladoque las célulasdel islote contienenun glucofosfolípido,
que actuacomo
similar al de las célulassensiblesa insulina,precursorde un fosfooligosacarido
inhibe la biosíntesisde proinsulinay la
segundomensajerode la insulina.Este fosfooligosacárido
secreciónde insulina en islotes pancreáticosintactos(Albor et al., 1989). La existenciade un
Algunos
feedbackinhibitorio directo por la insulina,sobresu propia secreción,aún se desconoce.
estudiossugierenque las célulasB cmecende receptoresde insulinade alta afinidad,y sólo poseen
receptoresde IGF-I (insulin-like growth factor type I). Aunque la insulina en alta concentración
de IGF-I, su efecto no es sospechoso
podríaactuar,de forma limitada,por unión a los receptores
de
a partir del
producir activaciónde la fosfolipasaC, que catalicela síntesisdel fosfooligosacárido
glucofosfolípidosensiblea la insulina.Tampocoseha visto queel IGF-I ejerzaefecto sobresecreción
antiinsulina,paraneutralizarel efectode la
de insulina,inclusoen presenciade excesode anticuerpos
(Malaisse,1988).
insulinasegregada
1.2.2.5.Exocitosis
En el mecanismode la exocitosisse distinguendospasosprincipales,la migraciónde los
gninulos secretores,unidos al citoesqueleto,
hacia la membranay la fusión de la vesículacon la
membranacitosólica.
Translocación de gránulos.- La célula B tiene un citoesqueletomuy desarrollado;la
probablemente
por
miosinapuedeprovocarel movimientode los gnfurulosligadosal citoesqueleto,
interaccióncon microfilamentosde actina (Howell, 1984).En célulasB se encuenfiael enzima
de microtubulos,que se suponeimplicadaen el transporte
Kinesinq que es una ATPasadependiente
intracelularde vesículasy organulos@alczonet al., 1992).La activaciónde protelnquinasasA y C,
o la inhíbición de proteín fosfatasas,aumentanla secreciónde insulína, como respuestaa la
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
22
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
de lascélulasB aisladas,lo queindicaque la modulaciónde la exocitosispor proteín
despolarización
quinasaso por proteínfosfatasas,
en un estadíodistalal aumentode la [Ca2+¡¡,es importanteparala
secreción
de insulina(Ámmálaet al.,1994)(Martín,Reigy Soria,1995).
peroel
Papel del GTP.- Muchascélulasno excitablesno requierengu2+ paralasecreción,
de Ca2+,y parece
GTP tieneun papelesencial.El GTP inducela secreciónde insulina,independiente
intervenirunaproteínaG. en el procesode exocitosis(Martín,Salinaset al.,1996) (Gomperts,1990)
(Melanconet al., 1987).
de canales
de Ca2+,la exocitosis
a la apertura
se inicia
Subsecuente
Fusiónde vesículas.con una latencia<l00ms. La entrada de C*+ que precedea la exocitosisestá desigualmente
En esta
distribuidaen la célulay se concentraen la regióncon alta densidadde gránulossecretores.
concentraciones
zona,la[Cu2+]i es 5-10 vecessuperiorqueen el restode la célula,alcanzando
¡.rM.
en la partede
Los regishosde canalúnico confirmanquelos canalesde CaZ+ tipo L estanagrupados
(Bokvistet a1.,1995)
la célulaquecontienelos gránulossecretores.
H C&+ puede iniciar la fosforilaciónde una proteínade membrana,cuyo estadode
se puedananclara la membranaplasmátic4por
fosforilacióndeterminaque las vesículassecretoras
interaccióncon proteínasde la membranavesicular.La sintaxina-1,proteínaimplicadaen la fdación
tambiénseencuentraen las célulasB de los
de vesículassinápticasa las zonasactivaspresinápticas,
de la regiónH3
islotesde ratón(Martín,Moya et al., 1995).Seha comprobadoquepartesespecíficas
proteína-proteína
en las interacciones
durante la
de la sintaxina-l estánimplicadasespecíficamente
secreciónde insulinainducidapor [Ca2+]i(MaxtÍn,Salinaset al.,1996).
La fusión se inicia cuandose abreel canaliónico, formandoun poro de fusión, que se
dilata al fusionarselos lípidos de las membranasvesiculary citosólica,y se excretael contenidode
un procesode endocitosisparamantenerla superficie
los gránulosal medioextracelular,esperiíndose
(Almers,1990).
vesiculares
de lasmembranas
de la célulay recuperarlos componentes
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
23
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.3. Esquemageneral del contrdl de Ia secreciónde insulina
En resumen, puede concluirse, como representala figura 1.4, que la célula B responde a
tres clasesde estimulantes fisiológicos: metabolitos, hormonas y neurofansmisores. La iniciación de
la secreciónde insulinapor glucosaimplica metabolismodel azúcary aumentodel [Ca2+]1vía
inhibición de canalesK-Atp. La activaciónde protefn quinasasdependientesde Calmodulína
clave del sistemaliberacióny descargaexocitósicade
conducea la fosforilaciónde componentes
los segundos
mensajeros
que intervienen
insulina.Comorespuestaa hormonasy neurohansmisores,
en el intercambiode inositolfosflítidosy en la activaciónde la adenilatociclasageneranseñalesque
de fosforilaciónadicionalinvolucradosen la activación
modulanla vía iniciadora.Los mecanismos
la vía iniciadoraa los nivelesde
de proteínquinasaA y proteínquinasaC funcionansensibilizando
c&+ . Yt C&+ tambiénejerceunaaccióndirectasobrela maquinariaexocitótica.
Señales
Sistems
Receptor
Sustratos
ll
Y{/
Neurotransmisores
Metabolismo
Pl-lnúercambío
desno!$zación
Factoresde
Acoplamiento
Proteín
Quinasas
Fosforilación
de Protefnas
r<-E
Hormonas
ü
Adenilato Giclasa
V
J
r
ü
[.n¡/rPl
++.t
@@@
+&__f,"-**'{
I
i'"i"¡*¡ó"
Membranacelular
Componentes
Secretores
C¡toesqueleüo
Gránulos
+
Secreción
I rNsrrL'NA
I
Figura 1.4. Esquemageneral del control de la secreciónde insulina.
Modí/icadode Ashuofi y Ashcrofi, I 99I (pdgínaI 35).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.4. Heterogeneidady Variabilidad del islote de Langerhans
En el Diccionario de la Lengua Española de la Real Academia Española se definen los
conceptosVariabilidad y Heterogeneidadcomo:
Variabilidad. Calidad de variable.
Variable. Instable, inconstantey mudable. Magnitud que puede tener un valor cualquiera
de los comprendidos en un conjunto.
Heterogeneidad. Calidad de heterogéneo.Mezcla de partes de diversa naturaleza en un
todo.
Los términos va¡iabilidad y heterogeneidada veces se utilizan erróneamentecomo
sinónimos.Los islotesquemanifiestansecreciónde insulinade formadosis-dependiente
de glucosa,
cuandoresponden
todos,sonvariablesen funciónde la dosisde glucosaa que seexponen,pero si los
islotesrespondena la glucosaen distintaproporción,es decir,formandopoblacionesque se pueden
describirentérminosestadísticos,
sonheterogéneos.
1.4.1.Heterogeneidad celular en células aisladas (Pipeleers,
1994)
Existennumerosos
estudiosquemuestranquelascélulasB aisladassecomportande forma
heterogéneqesdecir,agrupadas
enpoblacionescondistintocomportamiento.
A partir del estudio de Van De Winkel y Pipeleers,(1983), que mosfiaron la
heterogeneidad
celularen términosde respuesta
metabólicaa nutrientes,medianteautofluorescencia
de NADPH, se han sucedidofabajos en los que se ha mostradoque las célulasB aisladasson
heterogéneas
en la secreciónde insulinaestudiadapor el ensayode placahemolítica(RFIPA:reverse
hemolyticplaqueassay)(Salomony Meda"1986)(Soriaet al.,l99l); efectosobreel canalde Ka.¡p y
respuesta
subsecuente
de [Ca2+]¡(Valdeolmilloset a1.,1992);etc..En un estudio,que no recibido
confirmaciónpor partede otros autores,Hiriart y Matteson,(1988),sugirieronque las célulasB de
ratasonheterogéneas
en términosde canalesiónicos.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La determinación
fluorimética de la [Ca2+]i indicaque las célulasB difierenmuchoen su
respuestaa Ia glucosa"wt 70oAde célulasB aumentanla [Ca2+7ipor efecto de la glucosay 30%
no responde.El aumentode cAMP por teofilinao por glucagóntransformalas célulasB que
resüante
presentan
aumentosen la [Ca2+]i y en la
aumentando
su [Ca2+]¡y lasqueresponden,
no responden,
El carbacoly el TPA, que activanla proteínquinasaC, no aumentanel
amplitudde las oscilaciones.
cAMP, pero aumentanel númerode célulasque elevanla [Ca2+]¡y la amplitudde las oscilaciones.
La capacidadde cAMP o de los activadoresde la proteínquinasaC paraaumentarla [Ca2+]¡en las
con la capacidad
de secreciónde insulinaestimuladapor glucosa.
directamente
célulasB correlaciona
Las célulasB aisladasy purificadasno segreganinsulinaen forma dosis dependientede glucosa
(Wang et al., 1993).En célulasB, la secreciónde insulina,inducidapor glucosa,es altamente
de la presenciade péptidosqueactivanla Adenilatociclasacelular.
dependiente
La citometríade flujo permite separ¿rcélulas B segrin el estadoredox metabólico,
determinandola fluorescenciacelular de NAD(P)H, despuésde 15 minutos de incubaciónen un
mediocon glucosa.El Yode célulasB con elevadonivel de NAD@)H aumentacon la concentración
de glucosadel mediode incubación;el cambiode glucosade I mM a 5 mM aumentael númerode
y de 5 mM a 20 mM en un 30olo.
célulasB con alto nivel de NAD(P)H enun25%o,
de célulasB aisladaspermitecontarlas célulasque se activanen la
La autorradiog¡afia
de glucosa:I mM (5yo),3 mM (27%o\,5mM
concentración
slntesisde protelnasa una determinada
(507o)y a l0 mM (707")(Schuitet a1.,1988).
tlpicas como baja respuestaa bajos niveles de glucosa,estimulaciónde
Características
varias veces a altos niveles de glucosa y variación dosis dependiente,en el rango intermedio de
con diferente sensibilidada la
concentaciónde glucosa,sugierenla existenciade subpoblaciones
glucosa.Susproporcionesrelativasdeterminaránla forma de las curvas,¿tsícomo la amplitud de la
respuestaa la glucosa.
Estudiossobrela poblacióntotal de célulasB indicanque la amplitudde la secreciónde
insulina,inducidapor glucosa,dependede la interacciónsinérgicaentreel nutrientey los niveles
celularesde cAMP.
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26
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
el 50%o
Con glucosa7.5 mM responden
aproximadamente
de las célulasB, aumentando
los
y se puedensepararde las que no responden(baja respuesta)
nivelesde NAD(P)H (alta respuesta),
para compamrambassubpoblaciones
metabólicas,funcionalesy morfológicas.
en sus propiedades
Realizandouna segundaincubaciónde 60 minutosa 7.5 mM de glucosa,para medir la actividad
biosintética,en el grupo de alta respuestatodaslas células son activas,mientrasque en el de baja
presentanpoca actividadbiosintética.Medianteperifusiónde 2-4 horas,el grupo de alta
respuesta
respuesta
muestrala primera fase de secrecióna partir de 4.2 mM, y un nivel de secrecióndosis
dependiente
de glucosa2 vecessuperioral del grupo de baja respuesta.
El grupo de baja respuesta
presentala primerafasede secreciónde insulinaa partir de 8.3 mM. Por tanto, la dependencia
de
dosis de glucosaen la actividadbiosintéticay secretorase deberíaa un paso en su metabolismo
celular.En poblacionesde célulasB de rata normales,el aumentode la concentraciónde glucosa
reduce,perono llegaa eliminar,elYode célulasB inactivas.
Las célulasdel grupode altarespuesta
aumentanla utilizacióny oxidaciónde glucosa"2-4
veces,másquelas del grupode bajarespuesta.
En ambassubpoblaciones,
la biosíntesisproteicaestá
muy correlacionada
con la utilizacióny oxidaciónde glucosa.Las cinéticasmásaltasde degradación
de glucosaen el grupo de alta respuestano son afribuiblesa un aumentoen el fiansportede glucos4
pero sí a un aumentode la fosforilaciónde la glucosa.La subpoblaciónde alta respuestapresenta
mayoractividadde enzimaglucoquinas4asl comomayornivel de mRNA de glucoquinasa,
mientras
que el nivel de mRNA del tansportadorde glucosaGLUT2es similaral del grupode bajarespuesta.
Estosdatosindicanque la diferenciaintercelularen la fosforilaciónde glucosa,y no en el transporte
de glucosa,contribuyea la heterogeneidad
de las célulasB en la sensibilidada la glucosa.Pero la
fosforilaciónde la glucosano esel únicopuntoclaveen lasfi¡ncionesdependientes
de glucosa.
La subpoblaciónde alta respuestacontienela mayor partede la hormonarecién sntetizada
en los gránulossecretoresclaros, con una densidadtres vecessuperior a la de baja respuesta.Los
gránulos claros, ricos en proinsulina, están heterogéneamente
distribuidos en las células B
pancreáticas,
con una mayordensidaden las célulassensiblesa concentración
de glucosamás baja,
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
por lo que podríantomarsecomomarcadormorfológicoparalas célulasB que sintetizany segregan
másbajos.
hormonaa nivelesfisiológicamente
.
durantel0 días,a glucosa6 mM
Si seafslancélulasB, de rata,y seexponencrónicamente,
de glucosa,se observaque en
posteriora distintasconcenkaciones
o 20 mM, y seanalizala respuesta
el grupode 6 mM existendiferenciasen la sensibilidada cambiosde glucosa,a I mM <20oAde las
al cambiara l0 mM las célulasactivas
o biosintéticamente,
célulasson activasmetabólicamente
lleganal 50%.En el grupode glucosa20 mM, a I mM >600Ade las célulasya sonactivas,y a 5 mM
metabólicaentrecélulasB está
Io soncasitodaslas células.Estosdatosindicanquela heterogeneidad
sujetaa variación.La glucosaactuacomo reguladorfisiológicode Ia proporciónde célulasB con
metabólicay biosintéticaes válido
diferentesensibilidada la glucosa.El patrónde heterogeneidad
tantoparacélulasaisladasde islotesgrandescomode islotespequeños.
puedevariarsegúnlas condicionesin vivo a que se sometela
El patrónde heterogeneidad
poblaciónde célulasB en el animalantesde su aislamiento.Despuésde dos díasde tratamientocon
queproducendesgranulación
de Ia célulaB y mejoransu unión,hay
glibenclamída,
a concentraciones
mayorproporciónde célulasB que ya son activasen ausenciade glucosa.Esta alteraciónse asocia
haciamayorescinéticasde síntesisde insulina.
de la curva dosis-respuesta
con un desplazamiento
Estosdatosindicanquelas condicionesin vivo influyenen el patrónde heterogeneidad.
Comoen todoslos estudiosin vitro, no sepuedeexcluirque el procesode aislamientono
in vivo,por lo quela célulaB serfamejorexaminarlain situ. La población
altereciertascaracterlsticas
funcional en su localizaciónin situ. Estudiosde
de células B tambiénpresentaheterogeneidad
de glucosa"en
perfusiónen páncreas
de rataindicanque la secreciónde insulinaesdosisdependiente
un mngo de concentraciónsimilar al de las células B purificadas.El páncreasintacto también
presentao/oincrementadode forma dosis dependientede glucosa en su actividad bíosintética,con
todaslas célulasB marcadasa slucosa10mM.
En ratasadultas,la estimulaciónprolongadacon glucosano conduceal mismo grado de
celularo en el estadode
en todaslas célulasB, sugiriendodiferenciasen la respuesta
desgranulación
inicial. En animalesno fatados, la intensidadde la inmunotinciónde insulinavarla
desgranulación
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
28
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
considerablemente
entre células B; la mayoría de las células son débilmentepositivas para
proinsulina,perounaspocaspresentan
intensapositividad.Estavariabilidaden la tinción de hormona
seobservatambiénen laspreparaciones
de célulasde islotes;la intensidadmásfuerteen las célulasB
que estánestructuralmente
acopladasa las célulasque contienensomatostatina
indica diferencias
topográficas
en Ia fi¡ncionalidadde lascélulasB.
Un análisisin vivoseríanecesarioparacomprobarla hipótesisde que la heterogeneidad
entrecélulasB juegaun papelimportanteen la fisiologlay patologladel páncreasendocrino.
1.4.2.Variabilidad morfológica del islote de Langerhans
Los islotesde un páncreas
no sontodosiguales(Bonner-Weir,
1991).Los íslotesdifieren
en su composicióncelular.Hay una distribuciónregionalde célulasA y de célulasPP,basadaen la
derivaciónembriológica.La porción dorsal o esplénicadel páncreas(cola, cuerpoy parte de Ia
cabeza)es rica en glucagóny pobreen PP, mientrasque la parteduodenalo ventral del páncreas
(mayorpartede la cabeza)espobreen glucagóny rica en PP. Estasdiferenciasregionalespuedendar
lugar a un funcionamientodiferentedel islote de Langerhans.Datos fisiológicos de islotes y de
perfusiónde páncreasindicanque los islotesesplénicosliberanmás insulinaque los duodenalesen
respuestaa la glucosa.Además,los islotespresentandiferenterelaciónvascularrespectodel tejido
exocrino,segúnel tamañodel islote.Estasdiferenciasmorfológicaspuedenafectara la funcionalidad
del islote.
Experimentosque utilizan hormonasexógenas,sobre islotes aisladoso en piincreas
perfundidos,indicanque las hormonasde los islotesson capacesde influir sobreotas célulasdel
islote por un mecanismode feedback.Asl, la insulinapuedeinhibír tanto a las célulasA como a las
puedeinhibir a las célulasA y B y el glucagónpuedeestimula¡a las célulasB5 y
D, la somatostatina
D. Esto ha conducidoa pensarque la secreciónhormonaldel islote puede estar reguladapor
interacciones
específicas
intraislote(Bonner-Weir,I 99I ).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Hay tresnivelesposiblesde interacciónintraislote:
I.- célula-célulavía uniones intercelulares(gapjunctions),
II.- via vascularidad,y
III.- paracrina,vía intersticial.
Existenotas diferencias,por ejemplo,las célulasB centralesde islotesgrandestienenel
antes
núcleomáspequeñoque las periféricas,o quelas de islotespequeflos.Tambiénse desgranulan
quelasperiféricascuandola rataseestimulain vivo conglucosao glibenclamida.
1.4.3.Heterogeneidad células-islotes
en la respuestaa la
El hecho de que las célulasB presentenmúltiplessubpoblaciones
glucosa,con diferentespropiedadesen la secreciónde insulina,ha conducidoa un modelo, en la
secreciónde insulina dependientede glucosa,del islote basadoen el reclutamientode célulasB
individuales.Sin embargo,la actividadsíncronay uniformedel Ca2+ y de la respuestaeléctrica,
indican que la conductade las célulasB en el islote es más uniforme. Por tanto permanecela
metabólicaen el isloteintactoesimportantefuncionalmente.
incertidumbresobresi la heterogeneidad
del NAD(P)H inducidapor glucosamanifiestaque en el islote el90Vo
La autofluorescencia
a la glucosacon elevadosnivelesde NAD(P)H, mientrasque en célulasB
de las célulasB responden
sigmoidalen la
En el islote las célulasB presentancomportamiento
aisladasse quedaen un 70o/o.
a la Km de la glucoquinasa.
a la glucosa"con inflexiónen 8 mM, semejante
cuwa dosisrespuesta
Estosresultadossugierenque la heterogeneidaden las célulasB puedeser funcionalmente
menosimportanteen los islotesde lo queseha predichomediantelos estudioscon célulasaisladas,y
de la célulaB a la glucosa.
comoenzimalimitanteen la respuesta
apoyael papelde la glucoquinasa
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posiblesparala diferenciaobservada
Hay dosexplicaciones
entrecélulasB e islotes:
1.- El daño proteolíticoproducido,en el aislamientode célulasB y de islotes,puede
degradarla respuestadel NAD(P)H de algunascélulassin afectarsu viabilidad.En islotesenteros,
todaslas célulasque no respondenestánen la periferia,y estascélulas podrfanestarafectadaspor
este tipo de daño. En contra de esta interpretaciónestá el hecho de que las célulasB aisladas
por ejemplolos receptores
mantienenintactossusreceptores
de membrana,
de glucagón,acetilcolin4
etc.;suscanalesiónicosestanintactos(Soriaer a1.,7991);etc..
2.- La comunicacióncelularen el islotepuedesuperarla heterogeneidad
de las célulasB
individuales.El contactocélula-célulapuedehacerque las célulasque menosrespondense activen
por las querespondenmás,peroestono se observaen célulasdisociadas,
donde célulasen contacto
no respondenmás uniformementeque las completamente
aisladas.En el islote, las células B no
presentanrespuesta
mrisÉpida que las vecinas,por lo que el mecanismoinvolucradodeberíaactuar
en tiempoinferior a algúnsegundo.
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3l
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OBJETIVOS
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
El objetivo general de este trabajo es estudiar la variabilidad funcional del islote de
Langerhans.Para ello se determinariin la secreciónde insulina y el contenido de insulina de un único
islote, y su relación con el tamaño del íslote, a distintas concentracionesde glucosa, y en presenciao
ausenciade inhibidores o de potenciadoresde la secreción.
El planteamientodel problema lo presentamosa los siguientesniveles:
L Determinación
de Ia secreciónde insulina.
II. Determinación
delcontenido
de insulinadel islote.
III. Relaciónentrela secrecióny el contenidode insulina.
IV. Medidadel tamañodel islotey surelaciónconIa secreción
y
contenidode insulina.
2.2. Objetivosespecíficos
Los objetivosespecíficos
seorganizanen tresgrandesgrupos:
2.2.1.Estudiode la variabitidadfuncionalde los islotespancreáticos
¿Existenislotessilentes?
La heterogeneidad
funcionalde las célulasB revelaque en todaslas célulasestudiadas,
procedentes
de distintosislotes,hay un porcentajede células que no respondea la glucosa,y esto
podrfaserdebidoa la presenciade islotessilentes,queno responden
a la glucosa,o tambiéna queen
un mismoislotehayaun porcentajede célulasconmenorsensibilidada la glucosa.
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¿Es concentración-dependientela respuestadel islote único a la glucosa?
La respuestade los islotes a la glucosa además de ser concentración-dependientepuede
tener distintos umbrales o distinta sensibilidad interindividuo.
¿La variabilidad en el tamaño de los islotes implica variabilidad en la secreción de
insulina?
a la glucosaliberandoinsulina,pero la sensibilidada la glucosao el
Los islotesresponden
control de Ia secreciónde insulina,puede estarreguladoa nivel celular o en conjunto como un
sincitio.
¿Cómo es la relación de la secreción de insulina, inducida por glucosa, y del contenido de
ínsulina con el tamaño del islote?
El tamañodel isloteesproporcionalal númerode célulasB, por lo quelos islotesde mayor
tantosi todaslas célulasrespondenpor
tamañodebenliberarmiís insulinaque los islotespequeños,
igual, como si el númerode célulasque respondendependede la concentraciónde glucosa. Si el
islote controlala secreciónde insulinacomouna unidad funcional.la secreciónde insulinadebería
del tamañodel islote.
serindependiente
2.2.2. Efecto de la metodología utilizada
¿Es necesaria la presencia de albúmina en el medio de incubación para Ia determinación
de la insulina inmunorreactiva?
La secreciónde insulinapor los islotesprocedede los gránulosmaduros,por lo que la
insulina estarácoordinadacon Zn2+ en forma de hexámero,y, según suponemos,no se podrá
determinarcon RIA, por impedimentoestéricopara unirse al anticuerpoantiinsulina, a no ser que
intervengaalgúnmecanismoquerompala uniónZn2+-Insulina,comopuedeser el medio ácido que
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protone los restos histidina a los que está ligado el Zn2+, dejando a éste separadode la insulina" o
también en presencia de un quelante de Zn2+. Considerando que el Zn2+ se transporta, en la sangre,
unido principalmente a la albúmina (Masuoka y Saltman, 1994) (Tibaduiza y Bobilya, 1996)
(Kiilerich y Christiansen, 1986), podría ser estamolécula la que capte Zn2+ dejando libre la insulina,
y esta podría ser la explicación por la que se necesita albúmina en el medio de incubación para
determinar la secreciónde insulina.
Debido a este efecto de la albúmina, el contenido total de insulina del islote se podría
determinar añadiendoácido o albúmina al agua,despuésde romper en ella el islote.
2.2.3.Estudiode la variabilidad debidaa los depósitosde insulina
¿Sepueden cuantificar, con RIA inespecífico,las distintas insulinas inmunorreactivas
contenídasen el islote?
se encuentraalmacenada
en gránulossecretores,
En la célulaB la insulinainmunorreactiva
como proinsulinaen los gránulosinmaduros,y como insulinaen los gránulosmaduros,en forma
cristalina,coordinadaconZn2+.
en2 ml de agua,la dilución
Si serompeel islote(volumen= lQ5-196pm3),por sonicación,
de los componentes
del islote serádel ordende 106-107veces,y se solubilizarrínla proinsulinay la
insulina.
paradeterminarel contenidototal de IRI, consiste
Seaceptaqueel métodode etanol-ácido,
en la solubilizacióno extacción de toda la IRI de los islotes,también se suponeque el etanol sirve
para solubilizarlípidosy que el ácido elimina interferencias
de otrasprotelnas.Esto podrla ser así
cuandose tratangrandescantidadesde islotes,respectode un pequeñovolumenpara solubilizarla
IRI total,perono cuandoel contenidodel islotesediluye 106vecesen agua.
Puestoque en los gninulosmadurosIa insulinase encuertracoordinadacon Zn2+,d,ebe
haberimpedimentoestéricopara la unión del anticuerpoantiinsulinadel RIA, y por tanto sólo se
podrádeterminar,rompiendoel isloteen agua,la proinsulinay tarnbiénla insulinaque se encuentre
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
35
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
libre como monómero.La accióndel ácido,añadidoposteriormente,serfaromper la unión Zn2+Insulina(Bryantet al.,1993) (Bentleyet al.,1992),quedandolibre, comomonómero,todala insulina
contenidaen el islote para ser determinadapor RlA. Perose sabe,y lo hemoscomprobado,que el
mediomuy ácidoproducewra interferenciaquese interpretacomopositivaen el R[A, es decir,a más
ácidose detectanmenosc.p.m.quese transformancomomayorconcentración
de insulina,y por ello
hay quediluir la muestraparaaumentarel pH y disminuirla interferencia.
De estaforma se podrádeterminarIa insulinainmunorreactiva
en agua(W-IRI), que será
proporcionalal contenidode proinsulinadel islote,y el contenidototal en ácido(A-IRI), al mismopH
queen el métodode etanol-ácido,
constituidopor insulina+proinsulina
inmunorreactivas.
¿Lasecreciónde insulina,potenciadapor IBMX o la inducidapor K+ se relacionancon el
contenidode insulina inmunorreactivaen agua?
La metilxantina(IBMX) es un inhibidorde la fosfodiesterasa,
quetransformael cAMP en
AMP de formairreversible,por lo cual su presenciaen el mediode incubaciónaumentalos nivelesde
cAMP en la célulaB.
El cAMP activala protelnquinasaA, que prireceinterveniren el procesode migraciónde
los gránulosmadutos,en relaciónal citoesqueleto,
hacia la membranaplasmática,favoreciendola
probabilidadde exocitosis(Christie y Ashcroft, 1985)(Christiey Ashcroft, 1984)@ersaudet al.,
1990)(Ámmálá et al., 1994) (Howell, 1984).Por lo tanto la secreciónde insulina,inducidapor
glucosay potenciadapor IBMX, disminuiráel contenidode granulosmaduros,y con ellos el de
insulina,que se repondnía partir delpool de proinsulinarápidamente,
el cual deberádisminuiren la
mismacantidadhastaquese sinteticenuevaproinsulina.
El K+ 50 mM, en el medio de incubación,promuevela entradade Ca2+a la célula B e
inicia el procesode exocitosisque libera insulina, de los griínulosmaduros,que se repondrá
rápidamentea partir delpool de proinsulina,el cual deberásintetizarse
en la mismacantidadque la
secretada.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
36
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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¿Induce la glucosa la síntesis de insulina inmunorreactiva en agua?
La glucosa activa tanto la síntesiscomo la secreciónde insulina, manteniendo las reservas
celulares de insulina, para responder fisiológicamente, en cualquier momento, al estímulo de la
glucemia. La célula B necesitaATP, y por tanto glucosa,para la síntesisde proinsulina, a nivel de
traducción, y de insulina" en el proceso de maduración (Howell, 1972; citado por Howell y Tyhurst,
1982) (Rhodes et al., 1987) (Schuit et al., 1991). En las condicionesexperimentales,el islote sólo
cuenta con las reservascelulmes de aminoácidospara la síntesisde proinsulina, o con los procedentes
de la captación-degradaciónde la albúmina del medio de incubación.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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3. MATERIAL Y METODOS
3.1. MATERIAL
3.1.1.Animales de experimentación
que aquí se tratanfueronratonesOF-l, de
Los animalesempleadosen los experimentos
27-50 grunas de peso y aproximadamente
de 3 mesesde edad,criadosen el estabulariode la
Facultad de Medicina. Los progenitoresoriginales fueron suministradospor Panlab S.A. de
Barcelona.Fueronalimentadoscon la dieta estándarpara ratón AO4 de Panlab S.A. y hastael
momentode su sacrificiotuvieronlibre accesoal alimentoy al agua.
3.1.2.Reactivos
Reactivos generales:
Las salesempleadas
paraprepararlas solucionesy la glucosa-anhiüaprocedende Panreac
(Barcelona,
España).
La albúminaséricabovina (BSA) fracción V, Adrenalinay Diazóxido,de Sigma (St,
Louis,MO, USA).
Laenzimadigestiva,colagenasa
tipo A, deBoehringerMannheim(Mannheim,Germany).
Agua estérily apirógena,
de laboratoriosGrifols,S.A. @arcelona,España).
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
El kit para radioinmunoanálisisde insulina (DIPESA, Madrid,
España).
Compuestopor:
ng/ml : 0.0, 0.2, 0.6,2.0,4.0, 8.0, 16.0.
Estándaresde insulinade rata,de concentraciones
125¡en el residuoTyr-A19.
Insulinamarcada
"on
Tubos de ensayode l2x75mm revestidoscon anticuerpoantiinsulina.
3.1.3.Aparataje
General
BalanzadeprecisiónMl50 SX (CobosS.A.,Barcelona,
España).
pH-metromicroph2001(CrisonInstruments,
Alella,España).
LupaOlympus3260.(OlympusOpticalCO.(EUROPA)GMBH,Hamburgo,
Alemania).
Fuentede luz fría KL 1500(Schott.Glaswerke,
Germany).
Wiesbaden,
Aislamiento de islotes
Centrífugade mesa(Selecta,Barcelona,España).
Baño termostatizado:termostato electrónicoAtom 131 (Atom S.A., Barcelona, España).
Incubación de islotes
Bañotermostatizado:
electrónico
termostato
Atom131(AtomS.A.,Barcelona,
España).
Sonicación
SonicDismembrator
Model300(ArtekSystems
Corporation,
Fermingdale,
N.Y.,USA)
A 30% de potenciamáxima.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Centrífuga
GS-6R(Beckman
Corp.,PaloAlto,calif.,USA).
Medida
del tamaño del islote
Cámarade vídeo Sony AVC-D7CE CCD.
Microscopio Olympus BH2-RFCA (Instrumentoscientíficos S.A., Valencia).
Ordenador486. Tarjetavideo ScreenMachine (Fast Electronic,Alemania).
Software N eurograph(Microptic, Barcelona).
RIA de insulina
Magnetoagitador
SBSA-06 (Lab-lineInstruments
inc.,MelrosePark,ILL, USA).
Contadorde centelleoBeckmanGamma5500(BeckmanInstruments
Inc.,Palo Alto, CA,
USA).
3.1.4,Soffware
MicrosoftWindows3.1(MicrosoftCorp.,USA).
Sigmaplot
2.0 (JandelCorp.,SanRafael,CA, USA).
Excel5.0(MicrosoftCorp.,USA).
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
3.1.5.Soluciones
Buffer para la extracción de islotes por digestión con colagenasa
SoluciónA
NaCl
KCI
I 1 5 . 0m M
5.0mM
NaHCO3
10.0mM
NaH2PO4
1.2mM
MgC12
1 . 2m M
HEPESácido
CaCl2
BSA
Glucosa
25.0mM
2.5mM
30.0g/l
5.0mM
La solución, mantenida sobre hielo, se gaseade forma continua con carbógeno (O 95o/o+
2
Co2s%).
Buffer de incubación. Solución Krebs-Ringer-Bicarbonato-Albúmina
(KRB-BSA)
Solución B
NaCl
NaHCO3
120.0mM
25.0mM
KCI
5.0mM
CaCl2
2.5mM
MgC12
l.l mM
BSA
7.5e/l
Lasolución
segasea
deformacontinua
(O 295%+ CO25%).
concarbógeno
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
3.2.MÉTODOS
3.2.1.Obtención de islotesde Langerhans
Los islotesde Langerhansse aislaronpor digestióndel páncreasde ratón con colagenasa.
Protocolo: Los animales se sacrifican mediante luxación cervical; a continuación se
practica una laparotomíamedia completa,abatiendola pared abdominal lateralmentemediante dos
seccioneshorizontales,inmediatamentepor debajo de los rebordescostales inferiores. Se tracciona
del hígado y se frja a la pared costal mediante una gasa. Se desplazanlos intestinos a partir del
yeyuno hacia la derechadel animal, de forma que quedanexpuestosel páncreas,la vesículabiliar y la
porción proximal del conducto biliar común. Se tracciona del duodeno con el fin de localizar la
porción distal del conductobiliar común; se liga el colédocoen su unión al duodeno;a unosdos o tres
milímetrospor debajode la vesículabiliar se introduce,en el conducto biliar, una aguja de insulina de
punta rom4 previamentedoblada en ángulo recto; a continuaciónse pasa una ligadura que frja la
aguja en su posición. Se inyectacon unajeringa 8 ml de la soluciónA, suplementadacon la cantidad
necesariade colagenas4segúnactividad específica.De estemodo, se logra una buenadistensióndel
tejido pancreático,que facilita su extracción, ademásde permitir un buen acceso de la colagenasa a
todo el páncreas.Se extrae el piincreasde la cavidad abdominal por disección y se fansfiere a un tubo
de ensayo de 15 ml, que se incuba en un baño termostatizado, a 37"C durante 10 minutos. La
digestión se detiene mediante la adición de Solución A, fría. A partir de este momento comienza la
primera fase de lavado; el digerido se agita suavementecon una pipeta, para disgregar y resuspender
el tejido, después se sedimenta mediante centrifugación (1200 rpm, durante 50 segundos), y por
ultimo se decantael líquido sobrante,dejando sólo el sedimentode tejido; se termina llenando el tubo
con solución A. Este proceso se repite otras dos veces,con el fin de eliminar la colagenasadel medio.
Del dígerido se recuperÍu:llos islotes, uno a uno, mediante succión con pipeta automática, con la
finalidad de separarbien los islotes del resto de tejido exocrino. Posteriormentese preincuban en una
placa de petri, en Solución A, durante una hora, a temperaturaambiente,y en atmósfera de carbógeno
(95%deC,2+ 5% de CO2).
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3.2.2.Incubación
de losislotes
Se incuba cada islote, por separado,tomándolo del medio de preincubación,por succión
con pipeta automática(4 pl), y poniéndolo en tubo de ensayo con 200 ¡rl de Solución B, con la
glucosanecesariapara estimularla secreciónde insulina,a 37 oC durante30 minutos, en atmósferade
carbógeno.Al terminar la incubación se saca el islote del medio de incubación,por succión con
pipeta automática(4¡rl). Con estemedio de incubaciónse determinala insulina inmunorreactivaIEXIRI) segregadapor el islote.
3.2.3.Tamaño del islote
Se utiliza un sistemacompuestopor microscopio,cámara de video y ordenadorcon tarjeta
digitalizadoray softwareNeurograf.Se calibracon rejilla de 200 Fm para los objetivosde x4 y xl0.
Se coloca el islote en un pocillo portaobjetosdel microscopio,se utiliza el objetivo de x4 o
de xl0, y se enfoca y centra la imagen del islote en el monitor. Se dibujan, mediante el ratón del
ordenador,la siluetay los ejes mayor y menor del islote.Los datosde las coordenadasse almacenan
en el fichero conespondiente. El islote medido se pone en el tubo de ensayo con 2 ml de agua para
sonicarlo.El procesode medición se repite con cadaislote.
Los datos obtenidos se procesancon el programaNeurografo con una hoja de cálculo para
determinarlos tamañosde los ejesdel islote en pm y de la superficiede la siluetadel islote en um 2.
3.2.4. Contenido de insulina del islote
El islote exhaído del medio de incubación se coloca en tubo de ensayo con 2 ml de agua
frí4 para detenerla síntesisy secreciónde insulina, y se rompe con ultrasonidos durante 20 segundos.
Se centrifuga durante l0 minutos a 4000 r.p.m., y se toman 400 pl del sobrenadantepara
determinar Ia insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI).
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44
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
A los 1600 pl restantesse añaden2400 ¡tl de HCI 0.75 M, se agita, con el agitador
y se centrifugadurantel0 minutosa4000 r.p.m.;se diluyen100 pl del sobrenadante,
magnético,
a
1/10en SoluciónB, paradeterminar
la insulinainmunorreactiva
en ácido(A-IRI).
3.2.5. Radioinmunoanálisis de insulina
La técnicade radioinmunoanálisis
(RIA) fue introducidaoriginalmentepor Yalow y
Bersonen 1960paramedirla insulinaplasmática;
actualmente
se empleaparadeterminar
cantidades
mínimasde éstay otrashormonas,
asícomode enzimasy drogas.
El RIA consiste en la medición de la concentración de una sustancia en una muestra
mediantela comparaciónde su reactividadinmunoquímicacon la de una serie de solucionesestandar
que contienenconcentraciones
conocidasde la sustanciaproblema.
Principio del método.-El anticuerpoantiinsulinaestáunido al tubo de ensayo.La insulina
de la muestray la insulinamarcadas6r 125¡ compitenen Ia unión al anticuerpoantiinsulina,de modo
que cuando mayor sea la cantidad de insulina en la muestra, menos insulina marcada se une al
anticuerpo.La solución con la insulina libre (no unida al anticuerpo)es desechadapor decantación,
mientraslos complejosanticue¡po-insulinaquedanadheridosal tubo. Finalmentese leen las c.p.m. en
un contador de centelleo gamma. Para determinar la concentraciónde insulina se construve una curya
est¿indary se calculan los valores de las muestrasproblema.
El uso de est¿índarescomerciales, y el hecho de que el anticuerpo viene adherido a los
tubos, aumenta la efectividad del método al eliminar posibles factores de variabilidad. Con este
método se impide la perdida de complejo anticuerpo-insulina durante la decantación, las
concentracionesde los estándaresson las exactas y la concentración de anticuerpo en cada tubo es
exactamentela misma.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Protocolo:
Las concentraciones
de insulina utilizadasen los estándaresson:
0.0 ng/ml, 0.2 ng/m1,0.6nglml, 2.0 nglml,4.0 nglml,8.0 nglml, 16.0nglml
1. Añadir a los tubos, con anticuerpo antiinsulina,200 pl de estandary muesga por
duplicado.
2. Añadir I ml de insulina marcada a todos los tubos con muestra, estándares.cuentas
totalesy NSB.
3. Agitar todos los tubospara homogeneizarlas soluciones.
4. Incubar todos los tubos durante 24 horas.
5. Decantartodoslos tubos,exceptolos tubosde cuentastotales.
6. Medir las c.p.m. de cadatubo en el contadorgamma.
7. Calcular la concentraciónde insulinaen cadamuestra.
La figura 3.1 representaun esquemadel método utilizado para determinar secrecióny
contenidode insulinade cadaisloteúnico.
3.2.6.Análisisestadístico
Correccióndel efectodel tamañode los islotessobrela IRI determinada.
La naturalezay la intensidadde las relacionesentrevariablespuedeestudiarse
por medio
del análisisde regresión
y correlación.
El análisisde regresiónes útil para averiguarla forma probablede la relaciónentre las
variablesY, guandose utiliza estemétodode análisis,el objetivofinal es por lo general predeciro
estimarel valor de unavariablequecoffesponde
a un valordeterminado
de otravariable.
Cuando dos variablesestán conelacionadas,
tanto la variable independientecomo la
variabledependiente
tienensu mediay desviación
estándar
de la muestra,peropara cadavalor de
variableindependiente
hay una subpoblación
de variabledependiente,
cuyamedia se encuentraen Ia
rectade regresióny unadesviaciónestándarafectadade la variableindependiente.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
6 60'
95o/o02
5o/oCO2
I Preincubación
2Incubación
3 Poner islote en agu¿t
4 Romperislote
-,t\
E ro'
r.p.m.
@+ooo
5 Centrifugar
,_ru
6 SepararInsulina en agua
Dluoión
l/10
A-IRI
7 Añadir ácido
8 Agitary diluir
Figura 3.1. Esquema del método utilizado para determinar secreción
contenidode insulina de cada islote único.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Si se quiere comparar una variable de dos muestras (secreción de insulina a dos
concentracionesdistintas de glucosa) y ambas son dependientesde otra variable (tamaño del islote,
contenido total de insulina del islote, etc.), tanto la media como la desviaciónestándarde ambas
muestrasestaÉn afectadaspor la variable independiente.Por lo tanto, si la media de la variable
independientedifiere en ambas muestras,puede sucederque la diferencia entre las medias de la
variable dependientede Ias dos muestrassea positiva, nula o negativa,cuando en realidad, al estar
afectadaspor la variable independiente,la diferencia en la variable dependientede ambas muestrases
Ia diferencia observada,según la recta de regresión calculada para cada muestra, para un valor dado
de la variableindependiente.
Hay distintas formas de corregir el efecto de la variable independiente:
1.- Cálculo de la razón entre la variable dependientey la variable independiente,que se
puedeexpresarcomo tanto por l, tanto por 100, o respectode un valor escogidosegúnel significado
físico de la variable independiente(contenidomedio de insulina de los islotesen todas la muestras);
pero esto sólo es válido cuando la ordenadaen el origen de la recta de regresión pase por el origen de
coordenadas,pues sino, también presentarádependenciade la variable independiente,esto es,
correlación inversa cuando Ia ordenada en el origen sea positiva y conelación directa cuando la
ordenadaen el origen seanegativa.
2.- Calcular el valor correspondientede la variable dependientede cada muestra, mediante
la recta de regresión, para un mismo valor de la variable independiente(contenido medio de insulina
de los islotes en todas la muestras).
La desviación estándar de la va¡iable dependiente, de cada muestra, se debe calcular
respectode la variable independientey puede hacersede dos formas:
6-Z¡¡ %
"¡21t
2.- Mediantelasvarianzas
de ambasvariables:
syfx:{[(n-l)/(n-2)](srz -62t*2¡¡%
I .- Mediantelos residuales: su7*: { [X(y¡-y
De estaformase disponede la mediade la variabledependiente
correspondiente
a cada
muestra,en las mismasunidades(sin calcularla razónentre la variableindependiente
y la variable
y referidoa un valor con significadofísico (contenidode insulinao tamañodel islote).
dependiente),
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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y también de la desviación estándar de los datos de cada muestra respecto de la variable
independiente,y no respectode la muestratotal.
Otra forma de corregir el efecto de la variable independiente es transformar los datos
respecto de un valor de referencia de la variable independiente R* (contenido medio de insulina de
todos los islotes)y girar la recta de regresiónde pendientem, respectode dicha referencia,a una recta
de pendientenula, mediantela ecuación:
Y1=/i+(R*- x¡)b
La media y la desviación estandarde estos datos transformados nos permite comparar las
mediasde las muestrassin estarinfluidaspor la variableindependiente.
Comparación de medias
Para el análisis estadísticose emplea el test de la t de Student, considerandocomo
diferenteslas muestrasentre las que existeuna diferenciaentremediascon p< 0.05.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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RESULTADOS
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4. RESULTADOS
4.1.En el páncreasde ratón no existenislotessilentes
Calcula¡ldo
de la técnicade RIA, utilizandode muestrael mediode
el límitede detección
incubación(KRB-BSA), como el valor medio+ 3DS, se obtieneun resultadode t6 pg; por tanto,
todoslos valoresde secreciónde insulinainmunoneactiva
(EX-IRI) inferioresa 16 pglislote/3O
procedentes
minutosseconsideran
de islotessilentes.
La figura 4.la muestrala secreciónde insulinainmunorreactiva
(EX-IRI) de 491 islotes,
y sólouno (13 pglislote/30
estudiados
a dístintas
concentraciones
deglucosa,
minutos)caepor debajo
del límite de detección,por lo que el 99.8%de los isloteshan producidosecreciónde insulina
inmunorreactiva
en un rangode 2l a2679pg cadaisloteen 30 minutos.
La figura 4.lb representa
una ampliaciónde la figura 4.1a en el rangode secreciónde
insulina inmunorreactiva(EX-IRI) de 0 a 300 pglislote/30minutos, para observar mejor el
comportamiento
de los islotesconmenorsecreciónde insulinainmunorreactiva.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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10 12
GlucosamM
Fig.-4.1a.Secreción
de insulina(EX-lRl)de 491 islotesúnicos,estudiados
a distintasconcentraciones
de glucosa.El límitede deteccióndel RIAes
16 pg.Sólounode los islotes(13pg/islote/3O
minutosa 6 mM G) cae por
debajodel límitede detección
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Ampfiaciónde la figura4,1a
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GlucosamM
Fig.-4.1b.Secrecíón
de insulína(EX-lRl)de 491 islotesúnicos,estudiados
a distintasconcentraciones
de glucosa.El límitede deteccióndel RIAes
minutosa 6 mM G) cae por
16 pg. Sólounode los islotes(13pg/islote/30
debajodel límitede detección
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.2. La respuesta de los islotes únicos depende de la concentración de
glucosa
La figura 4.2 muestrala secreciónmedia de insulina(EX-IRI), de los islotesúnicos,con su
error estándar(ES), para cada concentraciónde glucosa;en cada experimentoestán unidos por una
línea los puntoscorrespondientes
a un mismo ratón.
En Ia figura 4.3 se observala respuestamedia de los datosde Ia figura 4.2, como fracción
de la secreciónde insulina(YoFEX),esto es, la secreciónde insulina inmunorreactiva(EX-IRI) por
cada 100 unidadesde contenidode insulinainmunorreactivaen ácido (A-IRD.
En las dos figuras se observa variabilidad entre individuos, y se puede comprobar que la
correcciónrespectodel contenidodisminuyela variabilidadintra e interindividuos.
Paraobservarla secreción
de insulinade los islotesobtenidos
de un soloratón,en el rango
de concentraciónde glucosade 4 mM a 22 mM, a incrementosde 2 mM, con n:4 en cada
concentración
de glucosa,seha realizadola incubaciónde cadaislote por separado,
determinando
la
secreción
de insulinainmunorreactiva
(EX-IRI)y el contenidode insulinainmunorreactiva
en ácido
por el métodotradicionalde etanol-ácido
(A-IRI).
Como se observaen la figura 4.4, los islotespresentanuna gran variabilidaden la
secreciónde insulina,comorespuestaala glucosa;comprobando
que hay islotesque liberanmucha
más insulina,a concentración
media de glucosa,que otros a mayor concentraciónde glucosa.Sin
embargo,en todoslos casosla liberaciónde insulinaestáen relacióndirectacon la concentración
de
glucosa.El ajustede los datos,a un polinomio de orden dos, muestraque Ia relaciónsecreciónglucosaes semejante
a la curvasigmoidaldescritaen la literatura,a pesardel bajo númerode puntos
paracadaconcentración
deglucosa.
En la figura 4.5 serepresentao/o
de la fracciónde secreciónde insulina(%FEX) y, aunque
se sigue observandovariabilidad,el comportamientode la curva ajustadade orden dos es más
próximaa la clásicacurvasigmoidal,aumentando
la pendientedel tramoproporcional.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1000
900
800
700
o
o
f
c
600
--o
XAg
lr¡
o
500
a
400
o)
o-
300
200
100
0
8
101214
16182022
GlucosamM
Fig.-4.2. Secreciónmedia(MIES)de insulina(EX-lRl),por isloteúnico,
de glucosa.Lospuntoscorrespondientes
a distintasconcentraciones
a un mismoratónestánunidosporunalínea.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
2.00
Dosis-Respuesta
1.75
1.50
1.25
X
UJ
LL
s
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
8
101214
16
GlucosamM
de insulina(M+ES),de cadaislote,
Fig.-4.3. Fracción(%FEX)de secreción
puntosconespondientes
glucosa,
Los
de
a un
a distintasconcentraciones
indicanvariabilidad
mismoratónestánunidospor unalínea.Losresultados
entreindividuos.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1400
1200
a
o
5
c
=io
.i
(f)
1000
800
600
iri O
o
(t,
o)
o-
400
200
0
10
12
14
16
mM Glucosa
1400
1200
a
o
f
1000
c
800
xa
uJg
600
a
400
FO
o
o)
o-
200
0
2
4
6
I
101214
1618202224
mM Glucosa
Fig.-4.4.Secreción
de insulina(EX-lRl)porisloteúnicoa distintas
concentraciones
de glucosa.La gráficaA muestrala dispersión
de los datosy la B la mediade cadagrupocon su errorstandard.
Los islotesprocedende un únicoratón.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
57
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
2.00
1.75
1.50
1.25
X
LU
IL
s
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
10 12 14 16 18
mM Glucosa
2.00
1.75
1.50
1.25
X
TIJ
TL
s
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
2
4
6
I
',tO 12 14 16 18 20 22 24
mM Glucosa
de insulina(%FEX),porisloteúnico,a distintas
Fig.-4.5. Fracciónde secreción
concentraciones
de glucosa.La gráficaA muestrala dispersiónde los datosy
la B la mediade cadagrupocon su errorstandard.
Losislotesprocedende un únicoratón.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.3. Relación de la secreción de insulina, inducida por glucosa, y del
contenido de insulina con el tamaño del islote
Para observarsi existecorrelaciónentre el tamañodel islote y la secreciónde insulina o el
contenidode insulina,se ha realizadola medida de los diámetrosmayor y menor del islote, así como
el áreacomprendidapor la siluetadel islote visto al microscopio,ademásde la secreciónde insulina
inmunorreactiva(EX-IRI), y el contenidode insulina inmunorreactivaen agua (WJRI) y de insulina
inmunorreactivaen ácido (A-IRI) de cada islote.
4.3.1. Secreción
La figura 4.6a muestrala curvade regresiónde orden2 entreel diámetromedio y la
secreción
de insulinainmunoneactiva
(EX-IRI)(gráficoA), y enheel áreadel islotey la secreción
de
insulinainmunorreactiva
(EX-IRI) (gráficoB), a una concentración
de glucosa 14 mM, (n:20); se
observaque los islotesde mayor tamaño(>300 pm) se desvíandel comportamiento
lineal que
par€cen
presentar
losislotesmáspequeños.
La figura 4.6b muestrala rectade regresiónsimpledel mismoexperimento
de la figura
4.6a,excluyendo
losdosislotesdemayortamaño,(n=I 8),mostrando
lossiguientes
estadísticos:
Diámetro
Media: 163¡rm
DS:42 pm
Rango(90 - 232)
Area
Media: 22602pmz
D S : 1 1 2 1 p5 m 2
Rango(6550- 41410)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
59
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4000
3500
a
3000
5
-
2500
o
-'F
2000
TO
xq
t u g 1500
o
(t,
o)
o-
1000
500
0
-500
50
100
150
200 250 300 350 400
450 500
Diámetromedio(pm)
4000
3500
a
3000
5
2500
o
.c
2000
TO
.i
Í)
u¡g 1500
o
a
o)
o-
1000
500
0
0.0e+0 3.0e+4 6.0e+4 9.0e+4 1.2e+5 1.5e+5 1.8e+5
Area(pm')
Fig.-4.6a.Secreción
de insulina(EX-lRl),porisloteúnico,índucidaporglucosa14 mM,
en relacióncon el tamañodel islote.GráfieaA respectodel diámetromediodel isfote;
gráficaB respectodel áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
3000
2500
a
o 2000
=
c
1500
=c)
.L
CO
.x. \iri O
o
(r,
ct)
o-
1000
500
0
100
120
140
160
180
200
220
240
Diámetromed¡o(pm)
2500
a
o
2000
:l
C
tr
o
(a 1500
o
o
U)
o)
o-
1000
500
0
0
5000100001500020000250003000035000400004500
Area(Um')
Fig.-4.6b.Secreción
de insulina(EX-lRl),por isloteúnico,inducidaporglucosa14 mM,
en relacióncon eltamañodel islote.GráficaA respectodel diámetromediodel íslote;
gráficaB respectodel áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
6l
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
s
s@
@
c
e
@
o
s
B
I
200 pm
Figura 4.7. Tamañoy forma de los islotesutilizadosen el experimentode la
figura4.6.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
62
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
EX-IRI
minutos
Media: 1290pglislote/30
minutos
DS : 760pglislote/30
Rango(136-2680)
C.Y.=58.9%o
Se observaque hay relacióndirectaentretamañoy secreciónde insulina,con los siguientes
parámetros:
Diámetro
r2:0.8494, a:- | 42l, b=16.586,sy7x:3I 3, C.Y.=243%
Area
12:0.8302,a:- I 06,b=0.062,sy/*:323, C.Y.:25.0%
Como se comprueba en los resultados,la desviación estándarde la muesffa de la secreción
cuando se corrige el
de insulina inmunorreactiva(EX-IRI) (DS=760) se reduce considerablemente
efectodel tamaño(srlx:3 13).
La figura 4.7 presentael tamañoy la forma de los islotesutilizadosen el experimentode la
figura 4.6.
4.3.2.Contenido
Puestoque en los gránulosmadurosla insulinase encuentracoordinadacon ZnT+, debe
haber impedimentoestéricopara la unión del anticuerpoantiinsulinadel RIA, y por tanto sólo se
podní determinar,rompiendoel isloteen agua,la proinsulinay tambiénla insulinaque se encuentre
libre como monómero.La accióndel ácido,añadidoposteriormente,seríaromper la unión Zn2+Insulina(Bryantet al.,1993) @entleyet al., 1992),quedandolibre, comomonómero,toda la insulina
por RIA.
contenidaen el isloteparaserdeterminada
La figura 4.8a muestrala curva de regresiónde orden 2 entre el diámetromedio y Ia
insulina inmunorreactivaen ácido (A-IRI) (gnifico A) y entre el área del islote y la insulina
inmunorreactiva
en ácido (A-IRI) (gráficoB), de los islotes(n:43) en preincubacióncon glucosa5
mM mantenidossobrehielo. Se observaque los islotesde mayortamafio(>300 pm) se desvíandel
comportamiento
linealqueparecenpresentarlos islotesmenores.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La figura 4.8b muestrala recta de regresiónsimple del mismo experimentode Ia figura
4.8a, excluyendolos dos islotesde mayor tamaño,(n=41), mostrandolos siguientesestadísticos:
Diámetro
M e d i a : 1 9 7p m
DS=40pm
Rango(125-295)
Area
Media: 31020pm2
DS = 12488pm2
Rango(12103- 67342)
A-IRI
Media: 38184pg/islote
DS = 12460pglislote
Rango(16220- 70130)
c.Y.:32.6%
Seobservaquehay relacióndirectaentretamañoy contenidode insulinainmunorreactiva
parámetros:
en ácido,conlos siguientes
Diámetro
r2:0.8412,r-18673,b:28'7.963,so¡*=4812,
C.Y.=12.6%
Area
12:0.83
83, 19846, b:0.9 I 35, s"7*:5075,C.V.:13.3%
Como se compruebaen los resultados,la desviaciónestándarde la muestrade insulina
inmunorreactivaen ácido (A-IRI) (DS:12460) se reduceconsiderablemente
cuandose corrige el
efectodel tamaño(sr7"=4812).
La figura 4.9a muestrala curva de regresiónde orden 2 entre el diiámetromedio y la
insulinainmunorreactiva
en agua (W-IRI) (gráficoA), y entre el áreadel islote y Ia insulina
en agua(W-IRI) (gráficoB), de los islotes(n:43) en preincubacióncon glucosa5
inmunorreactiva
queel de la figura 4.8).Seobservaquelos islotes
mM mantenidos
sobrehielo(mismoexperimento
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
64
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
de mayor tamaño (>300 pm) se desvían del comportamiento lineal que parecen presentar los demás
islotesmenores.
La figura 4.9b muestrala rectade regresiónsimpledel mismoexperimento
de la figura
4.9a,excluyendo
losdosislotesdemayortamaño,(n=41),mostrando
los siguientes
estadísticos:
Diámetro
Media= l97.pm
D S: 4 0 p m
Rango(125 -295)
Area
Media:31020 pm2
DS: 12488¡rm2
(12103- 67342)
Rango
W-IRI
Media: 3591pglislote
DS = 894pglislote
Rango(1'712- 499'7)
c.v.149%
Se observa que hay relación directa entre tamaño y contenido de insulina inmunorreactiva
en agua, con los siguientesparámetros:
Diámetro
12:0.7270, a: -203,b: 19.2| 6, syIx: 462,C.V.: l2.g%
Area
P=0.6857,a:1751,b=0.0593,
sr¡"=507,C.V.:14.1%
Como se compruebaen los resultados,la desviaciónestándarde la muestrade insulina
inmunorreactiva
en agua(W-IRD (DS=894)se reduceconsiderablemente
cuandose corrigeel efecto
del tamaño(srn:462).
La figura 4.10presentael tamañoy la formade los islotesutilizadosen el experimentode
lasfiguras4.8y 4.9.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.2e+5
1.0e+5
8.0e+4
.9
7o
+ E 6.0e+4
<b,
o-
4.0e+4
2.Oe+4
f=0.8912
0.0e+0
100
200
300
400
500
600
700
800
Diámetromedio(pm)
1.2e+5
1.0e+5
8.0e+4
o
trE
6.0e+4
{6
o-
4.Oe+4
2.0e+4
0.0e+0
0e+0 5e+4 1e+5 2e+5 2e+5 3e+5 3e+5 4e+5 4e+5
Area (pm')
en ácido(A-lRl),de isloteúnico,
de insulinainmunoneactiva
Fig.-4.8a.Contenido
en relacióncon eltamañodel islote.GráficaA respectodel diámetromediodel
islote;gráficaB respectodel áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
66
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
80000
70000
60000
o
&o
-a
<E
o-
50000
40000
30000
20000
f =0.8412
10000
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
medio(pm)
Diámetro
80000
70000
60000
, € 5oooo
TE
< ts, 4oooo
30000
20000
10000
1000020000 3000040000 5000060000 70000 80000
Area(pm')
Fig.-a.8b.Contenido
de insulinainmunorreactiva
en ácido(A-lRl),de isloteúnico,
en relacióncon el tamañodel islote.GráficaA respectodel diámetromediodel
islote;gráficaB respectodel áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
8000
7000
6000
o
5000
Éo
-a
> o ) 4000
o-
3000
2000
1000
100
9000
200
300
400
500
600
700
800
Diámetromedio(pm)
8000
7000
o 6000
úo
-U'
>o)
o-
5000
4000
3000
2000
1000
0e+0 5e+4 1e+5 2e+5 2e+5 3e+5 3e+5 4e+5 4e+5
Area (pm')
Fig.-4.9a.Contenido
de insulinainmunoreactiva
en agua(W-lRl),de isloteúníco,
en relacióncon el tamañodel islote.GráficaA respectodel diámetromediodel
islote;gráficaB respectodel área planadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
68
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
6000
5500
5000
4500
o
úo
-a
>(=
>o)
o-
4000
o
3500
3000
2500
2000
1500
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
Diámetromedio(pm)
6000
5500
5000
4500
o
4000
Éo
a@
>=
> o ) 3500
o-
3000
2500
2000
1500
0
1000020000 3000040000 5000060000 70000 80000
Area (pmt)
en agua(W-lRl),de isloteúnico,
de insulinainmunorreactiva
Fig.-4.9b.Contenído
en relacióncon el tamañodel islote.GráficaA respectodel diámetromediodel
islote;gráficaB respectodel áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
E8@
sG6
OiSS
w
/'
r$
$e)
€9$$
/']
$ \t
-r,
i@
\_1._/
200 pm
s
E
E
,{\
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v
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g)
s.,
v>
o
O
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s
I
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8$a
T
E
v7
8@
/-l-\
K.\J
m
\_-./
s&
Figura 4.10. Tamañoy forma de los islotesutilizadosen el experimentode las
4.8y 4.9.
fi.guras
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.3.3.Secrecióny contenido con glucosa3 mM y 22 mM.
Para comprobar si hay diferencia entre los islotes de un mismo ratón, a distinta
concentraciónde glucosa,en secrecióno contenidode insulina, se ha realizadola incubaciónde 40
islotes únicos, en dos grupos, 20 islotes con glucosa 3 mM y 20 islotes con glucosa 22 mM, y
determinado Ia secreción de insulina inmunorreactiva (EX-IRI), el contenido de insulina
inmunorreactivaen agua (W-IRI) y el contenidototal de insulina inmunorreactivaen ácido (A-IRI),
ademásdel diámetromedio v ¿ireadel islote.obteniendolos siguientesresultados:
Diámetro
3 mM G
Media: 226pm
DS:65 pm
Rango(149- 398)
22 m]!¡{G
Media:213 pm
DS:54 pm
Rango(122- 320)
Area
3 mM G
Media= 40700pm2
DS = 24855pmz
Rango(16388- 108964)
22 mMlG
Media:35121pm2
D S : 1 7 1 3p1m 2
Rango(10692-73571)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
7l
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
EX-IRI
3mMG
minutos
Media= 203pg/islote/30
minutos
DS : 105pglislote/30
22 m]üdG
Media: 513pg/islote/30
minutos
DS: 154pglislote/30
minutos
W-IRI
3mMG
Media: 5326pg/islote
DS = 1236pglislote
22mMG
Media: 5210pglislote
DS = I052 pglislote
A-IRI
3mMG
Media:64467 pglislote
DS -- 22196pglislote
22mMG
Media: 61166pglislote
DS : 16856pglislote
Se observaque el tamañomedio de los isloteses ligeramenteinferior en el grupo22 mM
G, lo que explicael valor ligeramenteinferior de W-IRI y A-IRI a 22 mM G, pero sin diferencia
significativa.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La figura 4.11 describela relación directa que hay entre tamaño del islote y secreciónde
insulina (EX-IRI), aumentandola pendientede la regresióna concentraciónmás alta de glucosa.Se
compruebaque islotesgrandes,con glucosa3 mM, liberanmás IRI que islotespequeñoscon glucosa
22mM.
Regresiónlineal simple: diámetromedio vs EX-IRI
3mMG
P:0.1 591,a:- l 15,b:1.408
22mMG
P=0.8264,a:-37,b=2.585
Regresión
linealsimple:áreavs EX-IRI
3mMG
r¿:0.7674, a:52, tl-,0.003
697
22 mNlG
r2:0.2886.
a:233.b:0.007983
Se observaque, respectodel áreadel islote, la pendientede la recta es ligeramentesuperior
al doble y la ordenadaen el origen mayor con glucosa 22 mM, pero respecto del diámeho la
pendienteno llega a ser el doble aunque,la ordenadaen el origen sigue siendomayor con glucosa22
mM.
La figura 4.12 muestra que hay relación directa entre tamaño del islote y contenido de
insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI).
Regresión
linealsimple:diámetromediovs W-IRI
3mMG
P:0.85OZ,a:1378, b=17.496
22 mMG
?:o.gz9t, r | 444,b: l7 .683
Regresiónlinealsimple:¿íreavs W-IRI
3mMG
P =0.8337,a:3479, b:0.0454
22mMG
P :O .l g lZ, 13292, o-*0.0546
No se observadiferenciaente ambosgruposde concenfaciónde glucosa.Respectodel
diámetrolas dos rectasde regresiónson paralelasy practicamentecoincidentes,
si bien la del grupo
22 mM superaal de 3 mM, en unos 100pg, paraun diámetrode unos200 ¡rm.Respectodel áreadel
islotelasdosrectasderegresión
linealsecortana un valorpróximoa los 20000pm 2.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
73
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
900
800
a
o
J
_F
.c
T o(9
700
600
500
.i
t J g 400
o
a
=
o)
o-
300
200
O
u
100
3mMG:f=0.7581
22 mM G : f=0. AZG4
0
100
150
200
25A
300
350
400
450
Diámetromedio(pm)
900
800
a
700
o
+,
:f,
c 600
500
:io
>ta
lJg
400
-9
a
(')
a-
300
200
O
n
100
3 mM G: f=0.7614
22 mM G : f=0.788G
0
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.0e+5 1.2e+S
Area (umt)
Fig.-4.1l. Secreción
(EX-lRl),
de insulina
porglucosa
de isloteúnico,inducida
3 mM y 22 mM,en relacióncon el tamañodel islote.
GráficaA: diámetromediodel islote;gráficaB: áreaplanaderisrote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
74
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
l
9000
8000
7000
_p
úo
6000
fe
>o)
o- 5000
4000
O
x
3mMG:f=0.8502
22 mM G : f=0.8291
3000
2000
100
150
200
250
300
350
400
450
Diámetromedio(pm)
9000
8000
7000
(¡)
6000
úo
-U'
>=
> o ) 5000
o-
4000
3000
O
n
3 mM G : É=0.8937
22mMG:f=0.7912
2000
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 G.0e+4 8.0e+4 1.0e+5 1.Ze+S
Area(Urn')
Fig.-4.12.Contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl),de islote
único,en relacióncon el tamañodel islote,con glucosa3 mM y 22 mM.
GráficaA: diámetromediodel islote;gráficaB: áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
75
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La figura 4.13 presentala relacióndirectaentretamañodel islote y contenidoinicial de
insulinainmunorreactiva
en agua(Win-IRI=EX-IRI+ W-IRD.
Regresión
linealsimple:diámetromediovs Win-IRI
3mMG
rt=O.8649,
a: 1263,b: 18.904
22mMG
r2:0.8566.a=1407- b=20.267
Regresión
linealsimple:áreavs Win-IRI
3mMG
P:0.8496,a=353t, b=0.0491
22mMG
P:o s n a, 13 524,b:0.0626
Seobservaqueal sumarla secreción
de insulinaal contenidode insulinainmunorreactiva
en agua, las rectas de regresión,respectodel diámetro del islote, siguen siendo practicamente
paralelas,
y respecto
del áreadel islotesiguensiendosecantes,
perocoincidiendo
el puntode corteen
el origende coordenadas,
manteniendo
la pendiente
mayorla del grupo22 mM G.
Las figuras 4.14 y 4.15 representan la relación directa entre contenido total de insulina
inmunorreactiva en ácido (A-IRI y Ain-IRI).
Regresiónlinealsimple:diámetromediovs A-IRI
3mMG
12:0.895
0, a:-8306,b=322.457
22 mMG
12:0.89I l, r-1394, b193.7 62
Regresión
linealsimple:áreavs A-IRI
3mMG
12:0.8828,
a:303I 8, b:0.8390
22mMG
?:0.81 sa, a:28867,b:o.g tgl
Larecta de regresióndel áreadel islotefrenteal contenidode insulinainmunorreactiva
en
ácidomuesta unapendientepróximaa la unidad,lo quenospermite equipararestudiosde secreción
respectodel área del islote como respectodel contenidode insulina,siempreque no se altere el
contenidode insulinaen lascondicionesexperimentales.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
76
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
10000
9000
8000
EE
7000
=E
6000
¿E
5000
O
¡
4000
3000
100
150
200
250
3mMG:É=0.8049
22 mM G : É=0.8500
300
350
400
450
Diámetro
medio(Um)
10000
9000
8000
ET
7000
=E
6000
¿E
5000
4000
O
n
3mMG:É=0.B4go
22 mM G : 12=0.8176
3000
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.Oe+S 1.2e+S
Area(pm')
Fig.- 4.13. Contenidode insulinaínmunorreactiva
en agua (Win-lRl=EX-lRl+V!-1ft¡¡,
de isloteúnico,en relacióncon el tamañodel islote,con glucosa3 mM y 22 mM.
GráficaA: diámetromedio del islote;gráfica B: área plana der isrote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.4e+5
1.2e+5
1.0e+5
o
+ E 8.0e+4
<b,
o-
6.0e+4
O
tr
4.0e+4
2.0e+4
100
150
200
250
3mMG:f=0.8950
22 mM G : É=0.8911
300
350
400
450
Diámetromedio(pm)
1.4e+5
1.2e+5
1.0e+5
o
E_É,8.0e+4
<5o-
6.0e+4
4.Ae+4
O
n
3mMG:r'=0.8828
22 mM G : f=0.8736
2.0e+4
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.Oe+S 1.2e+S
Area(pm')
Fig.-4.14.Contenido
totalde insulinainmunorreactiva
en ácido(AlRl), de islote
único,en relacióncon el tamañodel islote,con glucosa3 mM y 22 mM.
GráficaA: diámetromediodel islote;gráficaB: áreaplanadel islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
1.4e+5
1.2e+5
1.0e+5
_(D
É.6
L@
.=\
o)
<r,
\(1
8.0e+4
6.0e+4
O
D
4.0e+4
2.0e+4
100
150
200
250
3mMG:É=0.8960
22 mM G : l=0.8922
300
350
400
450
Diámetromedio(pm)
1.4e+5
1.2e+5
1.0e+5
-o
É6
LU)
#E
\o_
8.0e+4
6.0e+4
4.0e+4
O
n
3mMG:l=0.8838
22mMG:f=0.8743
2.0e+4
0.0e+0 2.0e+4 4.Ae+4 6.0e+4 B.0e+4 1.Oe+S 1.2e+S
Area (pmt)
totalinicialde insulina
inmunorreactiva
enácido(A-lRl),de
fig.- a-f5. Contenido
isloteúnico,en relación
conel tamañoderisrote,conglucosa3 mMy )z mrvt.
GráficaA: diámetro
mediodelislote;gráficaB: áreapianadelislote.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La figura 4.16 muestrala recta de regresiónlineal simple entre contenidototal de insulina
del islote (AinJRI) y la secreción,a las dos concentraciones
de glucosa
Regresiónlineal simple: Ain-IRi vs EX-IRI
3mMG
P:o.zlgr, a:-58,b=0.00397
22 mMG
P:0.8t OZ,a:7,b=0.00806
Representando
la secreciónde insulina (EXJRI) respectodel contenido de insulina
inmunorreactiva
en medio ácido(A-IRI) se observaque las pendientes
de ambasrectasde regresión
coincidencon las de las rectasde regresiónde áreadel islotefrentesecreciónde insulina,lo que se
explicadebidoa que la pendientede la rectade regresióndel áreadel islote frenteal contenidode
insulinaes aproximadamente
la unidad.La pendiente
de la rectadel grupo22 mM es el doblede la
pendiente
delgrupo3 mM.
La figura 4.17 presentala rectade regresiónlineal simpleentrecontenidototal de insulina
del islote(Ain-lRI)y cantidadde insulinainmunorreactiva
enagua(W-IRI).
Regresión
linealsimple:Ain-IRI vs W-IRI
3mMG
r2=0.9134, a=l 879, b=0.0524
22mMG
12=0.9| 87. u=-| 532.b=0.0586
Seobservaun alto coeficientede regresiónen ambosgrupos.Lasrectassecortanlo mismo
que cuandose representael ¡áreadel islote frente a W-IRI, la pendientesigue siendoligeramente
superioren el grupo22 m]|i/,perosin diferenciasignificativa.Los islotespequeñoscon un contenido
de 40 nglislotecontienenun 9.8% de W-IRI, peroen los islotesgrandescon 100ng de insulinatotal
hay un 7.2Yode W-IRI, quesensiblemente
inferior.
La figura 4.18muesfa la rectade regresiónlineal simpleentrecontenidototal de insulina
del islote(Ain-IRI) y cantidadde insulinainmunorreactiva
en aguainicial (win-IRI).
Regresiónlineal simple:Ain-IRI vs Win-IRI
3mMG
P:0.9209,a:1821,b=0.0564
22 mMG
P=0.9350,a=l 5 40,b:0.0667
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
80
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
900
800
!
3 mMG : f=0.7193
22mMG:f=0.8102
700
a
o
600
c
500
TO
xq
ui O
o 400
o
o)
o- 300
200
100
0
4.Oe+4
6.0e+4
8.0e+4
Ain-lRl
pg/islote
Fig.-4.16,Regres.ión
entrecontenido
totatde insufina
(A-fRf)y
ll-qql_qlrnpte
secreción
deinsutina
(EX-lRl)
de isloteúnico,conglucosa
3 mMy iz mvt.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
_ g 6000
do
aa
=6osooo
O
tr
2.0e+4
4.0e+4
6.0e+4
3 mM G : É=0.9134
22mMG:f=0.g187
8.0e+4
1.0e+5
1.2e+S
Ain-lRl
pg/islote
Fig..-4.t.7.Regresión
linealsimpleentrecontenido
totalde insulina(A-lRt)y
contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(w-lRl)de isloteúnico,con
glucosa3 mM y 22 mM.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
EE
l6
=E
n
2.0e+4
4.0e+4
6.0e+4
3mMG:f=0.9209
22mMG:f=0.93S0
8.0e+4
1.0e+5
1.2e+5
Ain-lRl
pg/islote
Fig.-4.1.8.Regresión
linealsimpleentrecontenido
totatde insulina(A-lRl)y
contenidoinicialde insulinainmunorreactiva
en agua(wn-lRl),de iilote
único,conglucosa3 mM y 22 mM.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
/'T\
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SO
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o0s O0oss
T
I
200 pm
Figura 4.19. Tamañoy forma de los islotesutilizadosen el experimentode las
figuras4.ll a4.18.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
El coeficiente de regresión aumenta ligeramenteal sumar Ia secreción de insulina al
contenido W-IRI. Ambas rectas se cortan, siendo mayor Ia pendiente del grupo 22 mM; y respecto del
contenido total medio de insulina de todos los islotes, la diferencia de Win-IRI es sisnificativa
(p<0.0s).
La figura 4.19 representael tamañoy forma de los islotesutilizados en el experimentode
las figuras 4.ll a 4.18.
4.4. Determinación mediante RIA inespecílico de las distintas insulinas
inmunorreactivascontenidasen el islote
Segúnse describeen materiales
y métodos,paradeterminar
el contenidode insulinadel
islote, se rompe medianteultrasonidosel islote en 2 ml de agua y se cuantificael contenidode
insulina inmunorreactiva
en agua (W-IRI) y, medianteacidificación,el contenidode insulina
inmunorreactiva
en ácido (A-IRI). La proinsulinaen el islote se encuentrasolubley libre como
monómero,y es cuantificada
por RIA inespecífico
como insulina,pero la insulinase encuentra
en
formade hexiímero,coordinadaconZn2+(Hill er al., l99l) (Bryantet al., 1993)(Bently et al., 1992),
quepor impedimentoestéricono debeunirseal anticuerpoantiínsulinadel RIA hastaque serompa
la
uniónZn2+-insulinamedianteáci do.
La figura 4.20acorresponde
al esfudiode 333 islotesde diferentes
ratones,indicandola
regresiónde orden2, con los límitesde 95% de confianzade la mediay 95%de predicción,de la
relaciónqueexisteentreA-IRI y W-IRI (gráficoA) con 12:0.7409,y de la relaciónentreA-IRI y la
fracciónde insulinainmunorreactiva
en agua(100 W-IRVA-IRI)(gráficoB) con 12:0.0919y un
valor mediode 10.05%, muy próximo alarazón proinsulina/insulina
total encontrada
en rata,que
alcanza
un valordel ll.5Yo(Leahy,1993).
La figura 4.20bserefierea los mismosdatosde la figura 4.20a,peroindicandolas líneas
de regresióncorrespondientes
a cadaratón.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
85
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
12000
10000
8000
c)
úo
6000
-a
>=
>o)
o-
4000
2000
0
0.0e+0 2.0e+4 4.Oe+4 6.0e+4 8.0e+4 1.0e+5 1.2e+S
18
Ain-lRl
pg/islote
16
14
*n
c
S10
É.
q8
F6
4
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.0e+5 1.2e+S
Ain-lRl
pg/islote
Fig.'4.20a.Relaciónentrecontenido
totalde insulina(A-lRl),de isloteúnico,y
contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl)(gráficaA), y entrela
fracciónde insulinainmunoneactiva
en agua(100w-lRl/A-lRl)(graf¡caB).
Se indicanlos límitesdel 95%de confianza
de la mediay del 95%de predicción.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
10000
8000
6000
o
Éo
aa
>=
>o)
o-
4000
2000
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.Oe+S 1.2e+S
18
Ain-lRl
pg/islote
16
14
É.
-r
c
12
S10
É.
f8
F6
4
0.0e+0 2.0e+4 4.0e+4 6.0e+4 8.0e+4 1.0e+5 1.2e+5
ffiilL
Fig.-4.20b.Relacióndel contenido
totalde insulina(A-lRl),de isloteúnico,con
el contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(w-lRl)(gráficaA), y con la
fracciónde insulinainmunoneactiva
en agua(100W-lRl/A-lRl)
(gráficaB).
Se indicanlaslíneasde regresión
correspondientes
a los islotesde cadaiatón.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
87
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.5.La albúmina (BSA) no es necesariaen el medio de incubación para
estimular la secreciónde insulina con glucosa
Para comprobarsi la albúmina es necesaria,en el medio de incubación,para inducir con
glucosala secreciónde IRI, se han estudiado30 islotesrlnicoscon glucosa22 mM, en presenciay en
ausenciade BSA. La preincubaciónse ha realizado en medio KRB 5 mM G, sin BSA, durante 90
minutos, despuésde eliminar la BSA del medio de aislamiento,con varios lavadosen dicho medio
KRB. Los islotesse han repartidoen tres gruposde l0 islotesdenominados:
Con BSA: medio KRB-BSA22 mM G.
Sin BSA: medio KRB 22mM G. sin BSA.
BSA Post: medio KRB 22mM G, sin BSA. En estemétodo se añadeBSA, despuésde la
incubacióny de habersacadoel islote,a la misma concentraciónque en el control con BSA (7.5 g/l).
En Ia figura 4.21 se observaque en el grupo Sin BSA hay una secreciónmuy escasade
IRI, en cambio el grupo BSA Post, incubado igual que el grupo Sin BSA, no muestra diferencia
significativa con el grupo control Con BSA.
4.6. El contenido de IRI total se puede determinar en presencia de
BSA, sin ácido.
Sedeterminó
el contenido
totalde IRI de los islotesdel experimento
de la figura 4.21,
añadiendo
ácidoa la mitad de los islotesde cadagrupo,comose describeen materialesy métodos,y
BSA 30 /l alaot" mitadde los islotes,utilizandolos mismosvolúmenesen ambosmétodos.
La figura 4.22 muestraque no hay diferenciasignificativaentreel contenidototal de IRI
determinado
en presenciade alb{rmina(ban'asBSA) y el contenidototal determinado
con ácido(barra
HCI) delgrupoincubadoSinBSA.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
88
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Glucosa22 mM
a
-9
:f
.=
800
(:
>ia
Lli q)
-6
U'
ooo
o,
o-
Con BSA
BSA Post
Sin BSA
Fi$.4.21.-secreciónmediade insulinainmunoreactiva
(EX-lRl),de isrote
único,con Glucosa22mM.Preincubación
5 mM G, sin BSA,g0 minutos.
Con BSA:KRB-BSA.
BSAPost KRB.BSAañadidadespuésde incubación,
sin islote.
Sin BSA:KRB.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
89
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
ContenidoTotal-lRl
É'
q)
jo
<.9,
5E
F
Gon BSA
Sin BSA
p<0.05
Fi$.4.22.-Contenidototalde insulinainmunorreactiva
de islotesúnicos,
incubados
con Glucosa22mM,en presencia
de BSA(ConBSA)y sin
BSA(Sin BSA)en el mediode incubación,
añadiendo
ácido(HCt)o
albúmina(BSA)al aguaen quese ha rotoel islote
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Glucosa22 mM
o
-rY .J
O
= E
5B
6000
a.
Con BSA
BSA Post
Sin BSA
Fi$.4.23.-Contenido
de insulinainmunoneactiva
en agua(w-lRl),de islote
único,conGlucosa22mM.Preincubación
s mM G, sin BSA,90 minutos.
Con BSA:KRB-BSA
BSAPost:KRB.BSAañadidadespuésde incubación,
sin islote.
Sin BSA:KRB.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
9l
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.7. La albúmina (BSA) en el medio de incubación aumenta el
contenido de insulina inmunorreactiva en ácido (A-IRI), pero no el contenido
de insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI)
La figura 4.23 indica el contenido de insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI), de los
que no hay diferenciaen los tres
islotesutilizadosen el experimentode la figura 4.21, observándose
grupos, en cambio, como se observa en la figura 4.22 hay diferencia sigrrificativa en la insulina
inmunorreactivaen ácido (banas HCI) entre los islotes incubadosCon BSA y Sin BSA. La IRI
determinada en presencia de BSA también presenta diferencia, en el mismo sentido, p€ro no es
significativa.
4.8. La secreción de insulina, inducida por K+ 50 mM o por glucosa y
potenciada por IBMX, se relacionan con la insulina inmunorreactiva en agua
(IBMX) es un inhibidorde la fosfodiesterasa,
enzimaqueconvierte
La metilxantina
el
cAMP en AMP de formairreversible,por lo tantoel efectode la metilxantinaeselevarlos nivelesde
de la secreción
de insulina.
cAMP en la célula,el cualesun potenciador
Cadaexperimentoconstade dos grupos,de 15 islotescadauno, incubadoscadauno por
separadoa la misma concentración
de glucosa,con IBMX a concentraciónsaturada,en uno de los
grupos.
Comoseobservaen las figuras4.24(5.5mM G), 4.25(11mM G), 4.26(14 mM G) y 4.27
(EXJRI), provocadopor IBMX,
(22 mM G), el aumentoen la secreciónde insulinainmunorreactiva
en agua(W-IRI), sin encontrar
se corresponde
con la disminuciónen la insulinainmrurorreactiva
diferenciasignificativaen la sumade ambos(EX-IRI+W-IRI:Win-IRI).
En el experimentode la figura 4.26 Ia preincubaciónse realizódurante2.5 horasy con
glucosa22 mM, y seobservaque la fracciónde contenidode insulinainmunorreactiva
en agua(100
(-10%),lo que estáde
inferior(4%) queen otrosexperimentos
W-IRVA-IRI) esconsiderablemente
acuerdocon lo observadoen el experimentode la figura 4.22, es decir un mayor tiempo de
exposiciónconBSA y glucosa22 mM aumentael contenidode insulinainmunorreactiva
en ácido (AIRI) sin afectarla W-IRI.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
Glucosa5.5 mM
6000
5000
4000
_o
o
ú.a
3000
o)
o-
2000
1000
0
-1000
G
G+IBMX G
G+IBMX G
G+IBMX
Fig.'4.24.El aumentode la secreción
de insulina(EX-lRl),potenciado
por IBMX,
con 5.5 mM G, se corespondecon la disminución
delcontenidode insulina
inmunorreactiva
en agua(W-lRl).
=
+
\A/in-lRl W-lRl EX-lRl.
A-lRl=46933!.248Apgfistote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
Glucosa11 mM
6000
5000
p<0.01
o
_o
É. E
3000
o)
o-
1000
0
\Mn-lRl
-1000
G
G+IBMX G
G+IBMX G
G+IBMX
Fig.-4.25.El aumentode la secreciónde insulina(EX-lRl),potenciadopor IBMX,
e,on11 mM G, se @rrespondecon la disminución
del contenidode insulina
inmunoneactiva
en agua(W-lRl).
\Mn-fRl= W-fRf+ EX-lRl.
A-lRl=31957r 1205pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
Glucosa
14 mM
6000
4000
p<0.01
N.S.
.,9
_o
É.
-b,p 3000
o_
2000
1000
0
-1000
G+IBMX
G+IBMX
G+IBMX
Fig' 4.26.El aumentode la secreción
de insulina(EX-lRl),potenciado
por IBMX,
con 14 mM G, se corresponde
con la disminución
del contenido
de insulina
inmunoreactivaen agua(W-lRl).
\Mn-lRl=W-lRl+ EX-lRl.
A-fRf= 50853*. 2491pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
9s
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
Gfucosa22 mM
6000
5000
4000
o
_o
É.6
o)
o-
3000
2000
1000
0
\Mn-lRl
-1000
G+IBMX
G+IBMX
G+IBMX
Fig.-4.27.El aumentode la secreción
de insulina(EX-lRl),potenciado
por IBMX,
cnn22 mM G, se conesponde
con la disminución
delcontenido
de insulina
inmunorreactiva
en agua(W-lRl).
\Mn-lRl=W-lRl+EX-lRl.
A-lRl=38014t 2559pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
96
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La figura 4.28 presentalos resultadosde la incubaciónde 40 islotes únicos, en presencia
de glucosa3 mM, en dos grupos(n:20): uno con K+ 5 mM y otro con K+ 50 mM. La secreción(EXIRI) aumentacon K* 50 mM y se relacionacon la W-IRI, que disminuyeen la misma cantidad,en los
30 minutosde incubación.
En la figura 4.29 se muestranlos resultadosde otro experimentocomo el anterior(n:15 en
cada grupo), pero incubadosdurante60 minutos. El aumentode secreciónya no se conesponde con
la disminución de la insulina inmunorreactivaen agua (W{RI), Io que puede indicar que dicha
fracciónse reponelentamente.
4.9. La adrenalina inhibe la secreción de
y actúa sobre la
insulina inmunorreactiva en agua
La figura 4.30indicaquela presencia
diazóxido100 ¡rM inhibela secreción
inducidacon
glucosa22 mM, pero no se observadiferenciasignificativaen W-IRI, aunquela secreciónsin
diazóxidosecorresponde
conla disminución
de W-IRI.
En la figura 4-31 se observaque la adrenalinaI mM inhibe la secreción(EX-IRD inducida
con glucosa22mM, y la W-IRI disminuyeligeramente,sin diferenciasignificativa,talvezdebido al
reducido contenidode A-IRI (28 nglislote),pero en la figura 4.32 se compruebaque la secreciónse
inhibe con adrenalinay el contenido de W-IRI se reduce,respectodel control con glucosa 22 mM.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
o
_o
É. p 3000
o)
o-
2000
1000
SmM 50mM SmM 50mM SmM 50mM
K*+Glucosa3mM
Fig.-4.28.El K- 50 mM aumentala secreción
de insulina(EX-lRl),respectode
K* 3 mM,y la insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl)disminuye-en
la misma
cantidad.
\Mn-lRf= W-lRl+ EX-lRl.
A-lRl=35646t 1934pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
60 minutos
7000
6000
5000
4000
o
_o
r.E
3000
o)
o-
2000
1000
0
-1000
SmM 50mM SmM 50mM SmM 50mM
K+Glucosa3mM
Fig.-4.29.El K* 50 mM aumentala secreción
de insulina(EX-lRl),respectode
K 3 mM,perola insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl)no disminuye
en la
mismacantidad,en 60 min.de incubación.
\Mn-lRl=WlRl +EX-lRl
A-lRl=50634f 3083pg/islote
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
Gfucosa 22 mM
6000
5000
4000
o
_o
r.7
3000
o)
o-
2000
1000
0
-1000
G
G+DzX
G
G+DzX
G
G+Dzx
Dzx= Diazóxido100¡rM
Fig.'a.30.El diazóxidoinhibela secreción
de insulina(EX-lRl),inducidaporglucosa
22 mM,y la insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl)no varía'significativamente.
W-lRl=W-lRl+EX-lRl.
A-fRl= 34913t 1725pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
100
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
7000
6000
5000
4000
_o
g
É.
-b,.e 3000
o-
2000
1000
0
-1000
5.5 mM 22 mM 5.5 mM 22 mM S.5mM 22 mM
Glucosa+Adrenalina
1 mM
Fig.-4.31.La adrenalina
inhibela secreción
de insulina(EX-lRl),inducidapor
glucosa22mM,respectode 5 mM,y la insulinainmunorreactiva
en agua(W-lnl)
no varíasignificativamente.
\Mn-lRl= W-lRl+ EX-lRt.
A-lRl=27788r 1S53pg/islote.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Glucosa22 mM
p<0.01
p<0.001
5000
4000
o
_o
t .s 3000
o)
o-
2000
1000
0
Win-lRl
-1000
+AdrGG+AdrGG+Adr
Glucosa+ Adrenalina
1 mM
Fig.-4.32.La adrenalina
inhibela secreción
de insulina(EX-lRl),inducidapor
gfuoosa22 mM,y disminuye
fa insulinainmunoneactiva
en agua(W-fRl).
\Mn-lRl=W-lRl+ EX-lRl.
A-fRl= 53429t.2648 pg/islote.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
4.l0.La glucosainduce Ia síntesisde insulina inmunorreactiva en agua
Para observarel efecto de la glucosa sobre la insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI) , se
ha realizado la incubación de islotes, cada uno por separado,en dos grupos de concentraciónde
glucosa 3 mM y 22 mM, determinandola secreciónde insulina (EX-IRI), a distintos tiempos de
incubación(30, 60 y 120 minutos) en cada experimento,y el contenidode insulina (W-IRI y A-IRI)
de cadaislote.
La figura 4.33 muestralos resultadoscon 30 minutos de incubación(n:20 en cadagrupo),
indicandoque hay diferenciasignificativa en secreciónde insulina inmunoneactiva(EX-IRI); no hay
diferencia significativa en la insulina inmunorreactivaen agua (W-IRI), aunque es ligeramente
superior en el grupo de 22 mM, pero si que hay diferencia significativa en la suma (EX-IRI+WIRI:Win-lRI).
La figura 4.34 corresponde
a otro experimento
con 60 minutosde incubación(n:15 en
cadagrupo).Se observaque hay diferenciasignificativaen secreciónde insulinainmunorreactiva
(EX-IRI);no hay diferenciasignificativa
en la insulinainmunorreactiva
en agua(W-IRI),aunquees
ligeramente
inferioren el grupode 22 mM, y tampocohay diferenciasignificativaen la suma(EXIRI+W-IRI:Win-IRI).
En el experimentode la figura 4.35, realizadocon 120 minutosde incubación(n:20 en
cada grupo), se observaque el contenidototal A-IRI disminuyesignificativamente
en los islotes
incubados
con glucosa22 mM (A-IRI3 **= 54798* 4024pg/islote,A-IRI22,¡a: 43892t 3243
pglislote,p<0.05),por lo quelasmediasde EX-IRI y W-IRI debencalcularserespectode A-IRI de su
grupo. Se compruebaque en 120 minutos de incubaciónel aumentode secreción(EX-IRI) se
corresponde
con la disminuciónde W-IRI.
Estosresultadosindican que la insulinainmunorreactivaen agua(W-IRI) mantienesus
niveles,por efectode la glucosa,durante30 minutosy a partirde 60 minutosde incubacióncomienza
a disminuirhastalos nivelesde secreciónen 12Aminutos,probablemente
debidoal agotamientode
lasreservas
celulares
esenciales.
deaminoácidos
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
t03
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
30 minutos
7000
6000
5000
4000
o
+,
_o
t.g
3000
(t)
o-
2000
1000
0
-1000
3mM 22mM 3mM 22mM 3mM 22mM
Glucosa
Fig.-4.33.La glucosa22mM aumentala secreción
de insulina(EX-lRl),y no
disminuye
elcontenidode insulinainmunorreactiva
en agua(W-lRl)del íslote
único,en 30 minutosde incubación,
respectode glucosa3 mM.
p¡.
+E¡-¡
\A/in-l
Rl=W-lRl
A-lRl= 64228t 3136pg/islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
104
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
60 minutos
7000
6000
5000
4000
q)
_o
É.6
3000
())
o-
2000
1000
0
-1000
3mM 22mM 3mM 22mM 3mM 22mM
Glucosa
Fig.-4.34,La glucosa22mM aumentala secreción
de insulina(EX-lRl),
y el contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(w-lRl)disminuye,
sin diferenciasignificativa,
en G0minutosde incubación,
respectode
glucosa3 mM.
\Mn-lRl=W-lRl+EX-lRl.
A-lRl=50625r 2566pg/istote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
105
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
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120minutos
7000
6000
5000
4000
_o
''E
g e 3ooo
o)
o-
2000
1000
-1000
3mM 22mM 3mM 22mM 3mM 22mM
Glucosa
Fig.-4.35.La glucosa22mM aumentala secreción
de insulina(EX-lRl),
y el contenido
de insulinainmunorreactiva
en agua(W{Rl)disminuye
en 120minutosde incubación,
respectode glucosa3 mM.
\Mn-lRl=W-lRl+E¡-¡¡¡.
A-lRf3n,,r=
54798*,4A24pg/islote.
A-fRl22,n"=
43892!.3243pg/islote.
Diferencia
significativa
en A-lRl,p<0.05.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
DISCUSION
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
5. DISCUSION
5.1. El funcionamiento integrado del islote resuelve Ia
heterogeneidadde las célulasB aisladas
5.1.1.No existenislotessilentes
La heterogeneidad
encontradaen célulasB dispersascorrelacionacon la heterogeneidaden
la secreción de insulina, y conduce a un modelo funcional para el islote basado en umbrales de
activación variables(Bennett et al., 1996), pero los islotesse compoftancomo un sincitio funcional
en la respuestaa los niveles de glucosa,cancelandola heterogeneidada nivel celular (Valdeolmillos
et al., 7993). Las células B aisladasno respondentodas a la glucosa segregandoinsulina, como se
observa con el ensayo de placa hemolítica (Salomon y Meda, 1986) (Soria et al., 1991), y la
proporciónde célulasB que respondenaumentaal aumentarla concentraciónde glucosadel medio de
incubación.Las células utilizadas en dicho ensayoprocedende distintos islotes y se piensa que las
célulasque no respondena la glucosapuedenprocederde islotessilentes.Nuesfios resultados,como
muestra la figura 4.1, que representala secreciónde 491 islotes procedentesde distintos ratones,y en
distintos experimentos,a distintas concentracionesde glucosa, indican que no hay islotes pancreáticos
de ratón silentes, probablementeporque las uniones intercelulares(gap junctions) contribuyen a que
las células oscilen sincrónicamente,superandola heterogeneidad secretora,que muestran las células
B aisladas, cuando las células están agrupadasen el islote. En cuanto a las uniones intercelulares,
Andreu (Andreu et al., 1997) ha comprobado que las células B oscilan sincrónicamentecuando están
agrupadasen los islotes. El acoplamiento de las células parece esencial para mantener la conducta
oscilatoria,ya que las célulasaisladasno oscilan(Valdeolmillos et al., 1989)(Santoset al., l99l).
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
108
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
5.1.2. Los islotes responden a la glucosa en forma concentracióndependiente
Los islotes son variables en la secreciónde insulina inducida por glucosa, y como se
observaen la figura 4.2, en la que se indican los valores de secreciónmedia, con su error estándar,
correspondientesa distintos ratones, y en distintos experimentos,a distintas concentracionesde
glucosa,hay variabilidad intraindividuo y variabilidad interindividuo.La variabilidad intraindividuo
se observa en las distintas pendientesde las rectas que unen la secreciónmedia de insulina a las
distintas concentracionesde glucosa, es decir, distintos ratonespresentandistinta sensibilidada la
glucosa. La variabilidad interindividuo se observa en la diferencia significativa que hay entre la
secreciónmedia de insulina de cada ratón a una misma concentraciónde glucosa.Ambos tipos de
variabilidad,intra e interindividuo, se corrigen,en general,en cierta medida presentandolos valores
de secreciónrespectbdel contenidototal de insulinadel islote,como se observaen la figura 4.3.
5.1..3.EI tamaño del islote es un factor de variabilidad
Se piensaque el islote controlala secreciónde insulinacomo un sincitio o unidad
funcional,independientemente
deltamañodel isloteo del númerode célulasB quelo componen,
y en
la prácticaexperimental
los resultados
de secreción
de insulinasesuelenexpres¿f
por islote,sin tener
en cuentael tamañodel mismo,pero es de esperar,que si el númerode célulasB del islote es
proporcionalal tamañodel mismo,la secreciónde insulinatambiéndebeserproporcionalal tamaño
del islote.En la figura4.11 semuestranlos resultados
de la incubación
de los islotesde un rató¡ a
dosconcentraciones
de glucosa,3 mM y 22 mM, en funcióndel tamañodel islote.Seobservaque Ia
secreciónes directamenteproporcionalal tamañodel islote, por lo que el islote no controla la
queislotesmayoresque300 pm
secrecióncomounaunidadindependiente
del tamaño.Se comprueba
con glucosa3 mM producenmássecreciónque islotesmenoresque200 pm con glucosa22 mlll..En
la figura 4.6 semuestrala secreción,
en otro experimento,
conglucosa14mM, en funcióndel tamaño
del islote.Calculando,mediantela rectade regresión,la secreciónde insulinaa distintosdirímetros
mediosdel islote(150¡rm,200pm y 300 pm) observamos
lossiguientes
resultados:
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Figura4.6
pglislote/30
150pm -+ 1i067
minutos
conGlucosa14mM
200 ¡rm-+ 1896pglislote/3O
minutos
300pm -+ 3555pg/islote/30
minutos
Figura4.1I
150pm + 96 pglislote/3O
minutos
conGlucosa3 mM
200pm + 167pglislote/30
minutos
300pm -+ 307pglislote/30
minutos
Figura 4.1I
150pm -+ 351pglislote/3O
minutos
con Glucosa22 mM
200 pm -+ 481pglislote/3O
minutos
300pm -+ 740pglislote/30
minutos
que los islotesde un ratón,con glucosa14 mM, producenmássecreción
Y se comprueba
(superiora 200%)quelos de otro ratóncon glucosa22 mM, respectode un mismotamañode islote,
lo que indicavariabilidadinterindividuo,
respectode un mismotamañode islote.Parauna misma
concentraciónde glucosa se demuestraque el tamaño del islote es un factor importanteque
contribuyea la variabilidadintraindividuoen la secreciónde insulina.
quela secreciónde insulina(EX-IRI) esdependiente
Demostramos
del tamañodel islote,y
seríaconvenientereferir la secreciónrespectode un determinadotamañoestandarizado
cuandose
estudiendiferenciasde secreciónde insulina.La secrecióntambiénse puedeexpresarrespectodel
contenidototal de insulina,pero al ser modificableéstepor algunassustancias,
o en determinadas
condiciones,
y serel errorde su determinación
mayorqueel de la medidadel tamañodel islote,sería
máscorrectoexpresarla secreciónde IRI en funcióndel tamañode islote.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
5.2. Insulinas inmunorreactivascontenidasen el islote
5.2.1, La incubación de los islotes en presencia de albúmina aumenta el
contenido total de insulina inmunorreactiva en ácido (A-IRI)
Los islotespresentanvariabilidaden tamaño; el número de célulasy el tamañodel islote de
Langerhansde rata varía desdeunaspocas células y <40 pm de diámetro hasta 5000 células y 400 ¡rm
de diámetro (Bonner-Weir, l99l), y es de esperarque el número de células B sea directamente
proporcionalal tamañodel islote,por lo que, si el contenidode insulinade cadacélula es constante,el
contenido total de insulina del islote debe ser directamente proporcional al tamaño del islote. Este
hecho Io hemos comprobadocon los experimentoscuyos resultadosmostramosen las figuras 4.8 y
4.14, en las cuales se representael tamaño del islote (diámetro (A) y área(B)) frente al contenido
total de insulina, de cada islote, determinado en medio ácido (A-IRI). En el experimento de la figura
4.8 los islotesno fueron incubadosa 37oC,sino que se mantuvieronsobrehielo, duranteel tiempo de
medición del tamaño del islote, para inhibir la síntesis,maduracióny secreciónde Ia insulina. Los
islotesdel experimentode la figura 4.14 fueron incubadoscomo se describeen materialesy métodos,
es decir, durante30 minutos,a37oC, en presenciade albúmina(BSA) y con glucosa3 mM y 22 mM.
Calculando,mediante la recta de regresión, el contenido de insulina a distintos di¿árnetros
medios ( I 50
pm,200 pm y 300 pm) del islote obtenemoslos siguientesresultados:
Figura4.8
150pm -+ 24521pglislote
(islotesno incubados)
200 pm -+ 38920pglislote
300pm -+ 67716pglislote
Figura4.14
150pm -+ 40063pglislote(aumenta630A)
conGlucosa3 mM
200 pm -+ 56185pglislote(aumenta44Yo)
300 pm -+ 88431pglislote(aumenta3lo/o)
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
ill
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
Figura4.14
150pm -+ 42670pg/islote(aumentaT4oó)
conGlucosa22 mM
200 pm -+ 57358pglislote(aumenta4ToA)
300 pm -+ 86735pglislote(aumenta29%o)
No se observa diferencia significativa entre el contenido de los islotes incubados a distinta
concentraciónde glucosa, pero sí entre los incubadosy los no incubados,aumentandoel contenido en
los islotes incubados, y este aumento es diferente segrln el tamaño del islote, siendo el aumento de
insulinatotal superioren los islotespequeñosque en los grandes.Se puedepensarque estadiferencia
es debida a variabilidad entre ratones,pero en los resultadosmostrados en la figura 4.22, siendo los
islotes de un solo ratóny habiendoincubadolos islotescon glucosa 22mM en dos grupos, uno con
BSA y otro sin BSA, se observaque el contenidototal de insulina, determinadoen medio ácido. es
significativamente diferente en ambos grupos (p<0.01):
SinBSA
32039+.3446pg/islote
ConBSA
51342+ 5494pglislote(aumenta60%)
El contenidode insulina,en medioácido,encontrado
en los islotesdel gruposin BSA se
corresponde,
segúnel experimentode la figura 4.8, conun diiímetrode 175¡rm,y el contenidode los
islotesincubadoscon BSA se corresponde,
segúnel experimentode la figura 4.14, taatbiéncon un
diámetrode 175 pm del grupo de islotesincubadoscon glucosa22 mM. El aumento del 60vo
observadoen el experimentode la figura 4.22, en el que los islotesson de un mismo ratón, es
equivalenteal encontrado
en los islotesde la figura 4.14,respectode los islotesdel experimentode la
figura4'8, conglucosa22 mM. Estonospermiteconcluirquela incubaciónde los islotes,durante30
minutos,aumentasignificativamente
el contenidode insulina,determinado
en medio ácido,debidoa
la presenciade BSA en el medio de incubación,y no debidoal aumentode la concentraciónde
glucosa.
Mediante estudiosmorfométricosde gránulossecretoresde células B de ratón, Dean
(Dean,1973;citadopor Howell y Tyhurst,I 982)observóun promediode unos13000gránulos/célula
B, y Howell calculóque hay unas200000moléculasde insulinapor gnínuloen célulasB de rata
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
rt2
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
(Howell,1974;citadopor Howelly Tyhurst,1982).Teniendoen cuentaqueel díámetrode unacélula
B esde unos 12 pm podemoscalcularqueun islote,aproximadamente
esférico,de unos150pm de
diámetrocontieneunas1000células;con estosdatosobtenemos
queel contenidomediode insulina
de un islotede unas1000célulasdebeser:
1000cél.Blislotex 13000grán./cél.
B x 200000moléc./grán.
x 1 mol/6.0231023moléc.x
6000g/molx l012púe:25900 pglislote
Que es muy próximo al valor obtenido,segin los resultadosmostradosen la ñgura 4.8,
paraun islotede 150¡rm =24521pglislote,aunqueéstedeberíaserinferior,puestodaslascélulasdel
isloteno son B. ComodescribeBonner-Weir(Bonner-Weir,l99l) el islote de Langerhans,
de rata,
estáformadopor un núcleode célulasB envueltas
enun manto,de un grosorde unaa trescélulas,de
célulasno-B. Ademáslos microcapilares
que formanla jnfraestructura
de un islotetambiénocupan
volumen.La arteriolaentraen el islotede Langerhans
por una de lasdiscontinuidades
del mantode
célulasno-B, y llega directamente
al núcleode célulasB, desdedondese ramificaen capilares
que siguenun caminotortuoso,primeroa travésdel núcleode célulasB y despuésa
fenestrados,
travésdel mantode célulasno-B.Los microcapilares
eferentes
confluyenen vénulascolectoras.
El
tipo de microvascularización
varía según el tamañodel islote. En los islotes grandes,los vasos
eferentesconfluyenen el espaciosubcapsular,
en los pequeñosse extiendenpor el tejido exocrino
unos50 - 100pm antesde confluiren lasvénulascolectoras.
Si tenemosen cuentaque,suponiendo
los islotesesféricos,
al duplicarel diámetrode una
esferasu volumensemultiplicapor 8, a los islotesde 300 ¡rm les deberiacorresponder
un contenido
de insulinade207200pglislote,peronuestrosresultadosmuestransólo67716pg/isloteen los islotes
sin incubar,y hasta 88431pg/isloteen los islotesincubados.Estacantidad,tan pequeñarespectode
lo esperado,podría explicarseporque en los islotes grandeslos microcapilaresocupen mucho
volumen,o porqueIa proporciónde célulasB no aumenteproporcionalmente
al volumendel islote,o
porqueel contenidode insulinaen las célulasB de los islotesgrandesseamenorque en las de los
islotespequeflos,unao variasde estasposibilidades
podríacontribuira que el contenidode insulina
del isloteno aumenteproporcionalmente
al cubodel radiodel islote,y deberíanestudiarse.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universidad de Alicante. 1997
|l3
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
La determinacióndel contenido total en medio ácido implica la interferenciapositiva del
ácido sobre el RIA. Si determinamosinsulina en el medio KRB-BSA obtenemosvalores de c.p.m.
similaresa los del estándar0 nglml, pero si añadimosácido al medio, a la misma concentraciónque
en el método de etanol-ácido,las c.p.m. disminuyen incluso por debajo de las del est¿íLndar
de 16
ng/ml, lo que obliga a diluir la muestrapara reducir la acidezy por tanto la interferencia.
Puestoque la insulina total del islote se puededeterminar en presenciade BSA, como se
observa en la figura 4.22, sugerimos que debería estandarizarseeste método para eliminar la
interferencia del ácido, aunqueesto supondríacambiar los valores de referencia.
5.2.2. El islote contiene dos fracciones de insulina inmunorreactiva
Las IRI contenidasen la célula B se encuentran,principalmente,en dos formas
moleculares:proinsulinae insulina;otras formas,como preproinsulinae intermediarios
de la
conversión
de proinsulinaen insulina,sonminoritarias
(Orci et al., 1984)(Orci et al., 1985)(Orci el
al.,1987)(Orciet al.,1988)(Howell,1984)(Rhodes
et al.,1987).
La proinsulina
seencuentra,
comomonómero,
almacenada
en losgránulosinmaduros;
y en
rataseha determinado,
porHPLC,comoun I 1.5%del contenido
totaldeIRI (Leahy,1993).
La insulinaseencuentraalmacenada
en los gránulosmaduros,cristalizadacomo
hexámero
y coordinadaconzn2+ (Hill et al., 1991)(Bryantet at., 1993)(Bently et al., 1992)(Huangy Arvan,
1995),lo queproduciniimpedimento
paraunirseal anticuerpo
estérico
antiinsulinadel p¡A.
La insulinaliberadapor los islotesprocedede los grrínulosmaduros,por lo que Ia insulina
estarácoordinadacon Zn2+ en forma de hexámero,y no se podrá determinarcon RIA, por
impedimentoestérico,a no ser que intervengaalgúnmecanismoque rompala unión Zn2+-Insulina.
Considerando
queel Znz+sefansporta,en la sangre,unidoprincipalmente
a la albúmina(Masuokay
Saltman,199a)(Tibaduizay Bobilya,1996)(Kiilerichy Christiansen,
1986),podríaserestamolécula
la que capteZn2+,fisiológicamente,
dejandolibre la insulina,lo que nos conducea suponerquein
vitro la albúminatambiénpuederealizarel mismomecanismo.
En la figura 4.21, quemuestrala
secreciónde insulinade islotesincubados
con albúmina y sin albúrmina,
se comprueba
que no se
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determinatoda la secreciónde IRI, inducida por glucosa 22 mM, cuando los islotes se incuban sin
BSA, respectodel control con BSA, en cambio sí que se determina,y en la misma cantidad que el
control, la secreciónde IRI cuandoal medio, en el que se han incubadolos islotessin BSA, se añade
BSA. Esto indica que la albúmina aumenta la reactividad de la insulina liberada por el islote,
probablementeporque capte el Zn2+ del hexámero de insulina, dejando libre la insulina como
monómeroparaque puedaunirse al anticuerpoantiinsulinadel RIA.
La presencia
de lasdosformasmoleculares,
insulinahexámero
y proinsulina,
en lascélulas
B del isloteimplicacuatroposibilidades
paralaforma molecularde la W-IRI:
l.- Mezclade proinsulina
y de insulina(estaúltimacomoproductode
solubilidadde la insulinatotal).
2.- Insulinasola,comoproductode solubilidad
de la insulinatotal.
3.- Proinsulina
sola.
4.- Ningunade lasdos,esdecir,otraformadeIRI queno seainsulina
hexámero
o proinsulina.
W-IRI, como productode solubilidad,quedaexcluido porque la solubilidadde una
sustanciaes una constante,y los resultadosde nuestrosexperimentosindican que W-IRI es
proporcionalal contenidototal de A{RI y tambiénal tamañodel islote.
El aumentode la inmunorreactividad
del contenidototal de insulinaen presenciade ácido
o de BSA, respectode la inmunorreactividad
en agua,comoseobservaen las figuras4.22(contenido
de insulinatotal)y 4.23 (contenidode W-IRI), apoyala hipótesisdel impedimentoestérico,el cual se
eliminaríarompiendola unión Zn2+-insulina,lo mismo que sucedecon la secreciónde los islotes
incubadossin BSA, comose muestraen la figura 4.21, ouyainmunorreactividad
aumentaal añadir
BSA. Deducimosque al no ser necesariala BSA en el medio de incubación,para estimularla
secreciónde insulina,su exclusiónevitará interferenciasque provocala albúmina, tales como la
unióna la albúminade lassustancias
quesequierenestudiar,
comopuedenserhormonas
esteroideas.
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ácidosgrasos,fárrmacos,
metales,etc.,o las burbujasque se formanen los estudiosde perifusiónde
islotes.
Si W-IRI fuesemonómerode insulina,consecuencia
de una conversiónintragranular
del
hexámero,
previaa la secreción
inducidapor glucosa,deberíaobservarse
morfológicamente,
y aúnno
ha sido descritoen la literatura;ademásla insulinaliberadapor los islotesseríainmunorreactiva
sin
BSA enelmediodeincubación.
Nos quedasólo la terceraposibilidad,es decir,W-IRI es proinsulina,gue se sabeque es
monómero,solublee inmunorreactiva,
y el valor obtenidode I00xW-IRI/A-IRI,un lOYo como
muestralafigura4.20,es
semejantealaproporcióndeproinsulinaencontradaenrata,un
11.5%.
La figura5.1esun esquema
de la distribución
de las insulinasinmunorreactivas
contenidas
enel islote.
Síntesis
(.)
\Ñ
1
ffi
W-IRI
(Proinsulina)
{¿
I
q)
¡r
¡r
A-IRI
(Insulin a)u-Qo'*),
a
-l
M
9
Secreción
Figura5.1.Distribuciónde las insulinasinmunorreactivas
contenidas
en
el islote.
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Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
5.3. Los secretagogosinducen la liberación de insulina
inmunorreactiva y modifican la insulina inmunorreactiva en agua
(w-rRr)
Estádescritoen la literaturaque la glucosaactivala síntesisde proinsulina(Skellyet al.,
1996),su conversión
en insulina(Modes et al., 1987)y la secreción
de insulina.Identificadala WIRI conproinsulina,
consideremos
la relaciónentresecreción
(EX-IRI)y contenido
de W-IRI:
Efecto de la isobutilmetilxantina(IBMX).- El aumentode cAMP, por glucagóny orras
quepotenciala respuesta
hormonas,
secretora
de la glucosa,seacompaña
de unarápidafosforilación
de sustratosespecíficos
de la proteínquinasaA (Christiey Ashcroft,1985),apoyandoel papel
moduladorde éstaen Ia regulación
de secreción
de insulina.Sehanestudiado
los sustratos
de proteín
quinasaA en islotesde Langerhans,
premarcados
con 32Pi,y estimulados
con forskolina(activador
de adenilatociclasa)(Christiey Ashcroft, 1985),y tambiénen islotespermeabilizados
expuestosa
cAMP, en presenciaae ¡y321erf (Jones et al., 1988), demostrandonípidos cambios en la
fosforilación
depéptidoscitosólicos
y de membrana.
La glucosaelevapor sí mismael cAMP de la célulaB, pero es improbable
queesteefecto
contribuyasignificativamente
al mecanismoiniciadorde la glucosa.Si se aplicacAMp, con baja
concentración
de glucosa,no seestimulala secreción
de insulina(Christiey Ashcroft,l9g4); y si se
inhibe la proteínquinasaA con un análogodel cAMP, la glucosasigue estimulandola secreciónde
insulina(Persaudet al., 1990).La metilxantina(IBMX) es un inhibidor de la fosfodiesterasa,
que
transformael cAMP en AMP de forma irreversible,por lo cual su presenciaen el medio de
incubaciónaumentalos nivelesde cAMp en la célulaB.
El cAMP activala proteínquinasaA, que pareceinterveniren el procesode migraciónde
los griínulosmaduros,en relaciónal citoesqueleto,
hacia la membranaplasmática,favoreciendola
probabilidad
de exocitosis(Christiey Ashcroft,1985)(Christiey Ashcroft,1984)(persaud,
et al.,
1990)(Ammailáet a1.,1994)(Howell, 1984).Por lo tanto la secreciónde insulina,inducidapor
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glucosay potenciada
por IBMX, disminuiráel contenidode gránulosmaduros,y con ellos el de
insulina,quc se repondráa partir del poot de proinsulinaniLpidamente,
el cual deberádisminuiren la
mismacantidadhastaquesesinteticenuevaproinsulina.
Las figuras4.24,4.25,4.26y 4.27 muestran
los resultados
de la incubaciónde islotescon
IBMX, comparados
con el controlsin IBMX, a distintasconcentraciones
de glucosa.La disminución
de W-IRI, en la mismacantidadque la secreción(EX-IRI) potenciada
por IBMX, indicaríaque la
conversión
de proinsulinaen insulinaes másnípidaquela síntesisde proinsulinaen los 30 minutos
de incubación.
Efecto del K+ 50 mM en el medio de incubación.- El canal de K-41p es responsabledel
potencial de membranade la célula B, y su inhibición despolarizala membrana, lo cual abre los
canalesde Ca2+ dependientesde potencial,que conducena un aumentode la
[Ca2+]i, causandola
secreciónde insulina (Martín y Soria, 1995) (Nadal et al., l9g4). El k+ 50 mM en el medio de
incubaciónbloquea los canalesde K-41p, lo que provoca en los islotes la secrecióntransitoria de
insulina.Está descritoel efecto activador,en los islotes, del Ca2+, mediadopor calmodulina,sobre la
adenilato ciclasa, que aumenta el cAMP potenciando la secreción de insulina, pero no la inicia, y
sobre la fosfodiesterasa,que reduce el nivel de cAMP reduciendo la secreciónde insulina (Christie y
Ashcroft, 1985).En la figura 4.26 se compruebaque la estimulaciónde la secrecióncon K+ 50 mM
en 30 minutos se correspondecon la disminución de W-IRI; pero en 60 minutos, como muestra Ia
figara 4.29, se observauna recuperacióndel nivel de W-IRI, respectodel control.
Efectode inhibidoresde Ia secrecíónde insulina.El diazóxido,una sulfonamida,incrementala actividaddel canalde K-41p produciendo
un efecto inhibidor en la secreciónde insulina (Kozlowski et al., 1989; citado por Ashcroft y
Ashcroft,1991).La figura 4.30 muestrael efectoinhibidordel diazóxidosobrela secreciónde
insulina,y el aumentode secrecióninducidopor glucosase corresponde
con la disminuciónde W-
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IRI, aunqueestadisminuciónno es estadísticamente
significativa,
probablemente
debidoa la poca
secreción
de IRI inducidapor la glucosa22mM.
La adrenalinaI mM inhibela secreción
(EX-IRI),comose observaen las figuras4.3I y
4.32,y disminuyesignificativamente
el contenidode W-IRI, comomuestrala figura 4.32, lo que
indicaríaquela adrenalinaI mM activala conversión
de proinsulinaen insulina(disminución
de WIR[), estandode acuerdocon el aumentode gránulosobservadopor Dean (Dean,1976;citado por
Howelly Tyhurst,1982)incubando
islotesderatónconglucosay adrenalina.
Efectode la glucosa22 mM.-La glucosa22 mM activala síntesis,
conversión
y secreción
respecto
de glucosa3 mM (Pipeleers
er at.,1973;citado
por Malaisse,
l99l) (Hoenig et at., 19g6)
(Hutchins
y Merrell,1985)(Rhodes
et al.,1987)(Lindeet al., t989)(Schuitet at.,l99l) (Huangy
Arvan,1995)(Malideet a1.,1995)(Skellyet at.,1996).La figura4.33muestralos resultados
de la
incubación
de islotesconglucosa3 mM y 22 mM, durante30 minutos;se comprueba
quela glucosa
22mM aumenta
la secreción,
peroesteaumentono secorresponde
conuna disminuciónde la W-IRI,
comoseha observado
con IBMX o con K+ 50 mM, sinoquees ligeramente
superior,indicandoque
la glucosaactivatantola secrecióncomola síntesisde insulina.La figura4.34 muestralos resultados
de otro experimento,en las mismas condicionesque el anterior, pero durante 60 mínutos de
incubación;
seobservaquela W-IRI es ligeramente
inferioren los islotesincubados
con glucosa22
mM, perosin quela diferencialleguea serestadisticamente
significativa.En la figura4.35 se indican
los resultadosde otro experimentoen que los islotesse incubarondurante120 minutos;la W-IRI
disminuyesignificativamenteen el grupo de islotes incubadoscon glucosa22 mM; además se
observaen esteexperimentoque el contenidototal de A-IRI disminuyesignificativamenteen el grupo
con glucosa22 mM. Con estosresultadospodemosconcluirque en 30 minutosde incubacióncon
glucosa22 mM se mantienenlos nivelesde W-IRI en el islote,y que comienzana disminuiren una
hora, hastareducirseen cantidadligeramentesuperiora la liberadaen dos horas de incubación,
probablemente
porquelas célulasB ca¡ecende reservasde aminoácidos,
al menosde los esenciales.
paxamantener
continuamente
la síntesis
de proinsulina.
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El método utilizado en estamemoria puedeser utilizado para estudiarsíntesis, conversión
y secreciónde insulinapor islote único.
Proponemosel esquemafinal, mostradoen la frgura 5.2, como recopilación de nuestros
resultados.La célula B contiene reservas de aminoácidos a partir de los que se sintetiza la
preproinsulina,la cual se convierteen proinsulinaque se almacenaen los gránulos inmaduros,y se
transforma en insulina, que cristaliza en forma de hexámero, coordinada conZnz+, acumulándoseen
los gránulosmaduros,a partir de los cualesse libera la insulina al medio extracelular,por acción de
los secretagogos,en el proceso de exocitosis.La insulina en el medio extracelularcontinúa como
hexámero (Insulina)u-(Zn2+)r,cuyos iones Zn2+ son captados por la albúmina dejando libre la
insulina como monómeropara que actúe sobre los receptoresde sus célulasdiana. La glucosa activa
los tres pasosde síntesis,maduracióny exocitosis.La IBMX, que aumentael cAMp, activa el paso de
exocitosis.El K+ 50 mM activa el paso de exocitosis.La adrenalinainhibe la exocitosisy activa la
maduración.
CélulaB
Medio
Extracelular
Adrenalina
Qgorulina)u-(árt.),
.,BSA
Glucosa
IBMX (cAMP)
K"50 mM
J--
6Insulina
Figura5.2.Esquemafinal.
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2BSA-zf*
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CONCLUSIONES
t21
Variabilidad funcional de los islotes pancreaticos de raton. Bernardo Olivera Alonso.
6. CONCLUSIONES
1.- No existen islotes pancreáticos de ratón silentes.
2.- La secreción de insulina (EX-rRI) por el islote único presenta
variabilidad interindividuo.
3.- La secreciónde insulina del islote único es dependientedel tamaño
del islote.
4.- El contenido de insulin¿ del islote
es dependientedel tamaño
del islote.
5.- La albúmina (BSA) no es necesaria para estimular la secreción de
insulina con glucosa22 mM en los islotes únicos.
6.- La inmunorreactividadde Ia IRI contenidaen el islote aumentaen
presenciade albúmina(BSA)rlo mismoque en medioácido.
7.'El conúenidode A-IRI total del islote aumenta incubando los islotes
a37 "C, durante 30 minutos, en presencia de albúmina (BSA).
8.-La insulina inmunorreactiva en agua (W-IRI) se corresponde con
proinsulina.
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9.- El aumentode la secreciónde insulina (EX-IRI), estimuladopor K+
50 mM o potenciadopor IBMX, se refleja en la disminuciónde w-IRI en 30
minutosde incubación.
10.- La Adrenalina I mM inhibe la secreción de IRI y disminuye el
contenido de insulina inmunorreactiva en agua (W-IRJ).
ll.- La glucosa 22 mM activa la secreciónde IRI y mantiene los niveles
de insulina inmunorreactiva en agua (w-IRr) durante 30 minutos.
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