Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA O Q UI M IC A ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA BI “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO PARA DETERMINAR IA Y ALBUMINA SÉRICA EN EL ÁREA DE BIOQUÍMICA FA RM AC DEL LABORATORIO QUINTANILLA S.R.L.” INFORME DE PRÁCTICAS PRE-PROFESIONALES DE PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL BL I O TE CA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO Br. IRIGOIN LÓPEZ, SULI MAGALI BI AUTOR: ASESOR: Dr. ALVA PLASENCIA, PEDRO MARCELO TRUJILLO – PERÚ 2012 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación IC A Dedicatorias: Q UI M A Dios: BI O Por el inmenso amor que me regalas, por AC IA Y bendecir a mis seres queridos y sobre FA RM todo por la fortaleza necesaria poder lograr mis metas. BI BL I O TE CA DE que me brindaste para Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación A mis padres Manuel Irigoin y Emperatriz López: Sabiendo que jamás encontraré la forma de agradecer su constante apoyo y confianza, IC A sólo espero que comprendan que mis, Q UI M esfuerzos y logros han sido también BI O suyos e inspirados en ustedes. DE FA RM AC IA Y Con amor O TE CA A mis hermanos Víctor y José: BL I Gracias por prestarme su ayuda cuando BI más lo he necesitado y apoyarme en los momentos más difíciles. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Agradecimientos: A Richard Cáceda y Cynthia Tello: M IC A Gracias por brindarme su confianza, su apoyo O Q UI y por contribuir en la realización de IA Y BI este informe, muchas gracias O TE CA DE FA RM AC por todo. BI BL I Un sincero agradecimiento al Dr. Pedro Alva Plasencia por su apoyo y asesoramiento en la realización del presente trabajo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación A la Dra. Judith castro Guzmán: Gracias por la amistad, por su confianza, por A el interés y el valioso apoyo brindado, sin Q UI M IC vuestra ayuda jamás hubiera realizado O y concluido satisfactoriamente DE FA RM AC IA Y BI este informe. O TE CA Al Dr. Ángel Quintanilla Lora: BL I Gracias por la confianza, el apoyo y por la BI oportunidad brindada para realizar el internado y aprender mucho de todos ustedes. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación A mis amigos: María, Doris, Jesús, compañeros, profesores y IC A demás personas quienes de alguna BI O Q UI M manera colaboraron conmigo. AC IA Y Gracias por el cariño y apoyo moral que siempre FA RM recibí de ustedes y con el cual he logrado DE culminar mi esfuerzo, terminando así O TE CA mi carrera profesional, que es para agradecimiento. BI BL I mí la mejor prueba de cariño y Muchas gracias… Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación FA RM AC IA Y BI O PRESIDENTE Q UI M Jesús G. Gallardo Meléndez IC ---------------------------------------- A JURADO EVALUADOR ----------------------------------- MIEMBRO BI BL I O TE CA DE Mayar L. Ganoza Yupanqui ----------------------------------Pedro M. Alva Plasencia MIEMBRO Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación PRESENTACIÓN Señores miembros del jurado: IC A Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el Reglamento para la Q UI M obtención de GRADOS Y TÍTULOS DE LA FACULTAD DE FARMACÍA Y O BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO, presento a BI vuestra consideración y elevado criterio el Informe de Prácticas Pre-profesionales, DEL Y “VALIDACIÓN MÉTODO ANALÍTICO IA intitulado: AC ESPECTROFOTOMETRICO PARA DETERMINAR ALBUMINA SÉRICA FA RM EN EL ÁREA DE BIOQUÍMICA DEL LABORATORIO QUINTANILLA DE S.R.L.” con el que pretendo obtener el Título de Químico Farmacéutico. O TE CA Dejo a vuestra consideración, señores miembros del jurado la calificación del BI BL I presente Informe de Prácticas Pre-profesionales. Trujillo, noviembre del 2012 Suli Magali Irigoin López Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación INDICE M IC A RESUMEN…………………………………………………....i BI O Q UI ABSTRACT………………………………………..…………ii IA Y I. INTRODUCCIÓN ................................................................... 1 AC II. MATERIAL Y MÉTODO ..................................................... 5 FA RM III. RESULTADOS........................................................ ….….. 20 DE IV. DISCUSIÓN ......................................................................... 24 O TE CA V. CONCLUSIONES ................................................................ 28 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................. 29 BI BL I ANEXOS ..................................................................................... 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación RESUMEN La finalidad de este trabajo fue demostrar que el Método espectrofotométrico para la Cuantificación de albúmina utilizado en el área de Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. cumple con los requisitos establecidos en la norma ISO/IEC/NTC IC A 17025 que un laboratorio requiere para ser reconocido por su competencia técnica para M ejecutar análisis clínicos de confiabilidad y de acuerdo a estándares internacionales. En Q UI el proceso de validación de cada uno de los procedimientos se determinaron los valores BI O para los test de: Linealidad, Precisión, Exactitud, Límite de Cuantificación y Robustez, IA Y utilizando estándar de albúmina de 5,4 g/dL; 4,05 g/dL; 2,7 g/dL; 2,025 g/dL y 1,35 AC g/dL. En los parámetros ensayados, se encontró que el método es lineal con un r = FA RM 0,997607 y t Student para el test de linealidad = 52,020983 > 2,16, tiene precisión, encontrándose para repetibilidad un C.V. < 2 % (1,76 %) y para precisión intermedia un DE C.V. < 2 % (1,11 %), se encontró un Límite de Cuantificación de 0,48 g/dL, siendo el O TE CA método también robusto con respecto a las variables de analistas, tiempo de reacción y temperatura de reacción. En conclusión, se aportó y registró la evidencia necesaria para BL I demostrar que el método validado cumple con lo establecido por las políticas de calidad BI del laboratorio y aseguran que el método es adecuado para su aplicación en el análisis de Albúmina, bajo las condiciones particulares y requerimientos del Laboratorio Quintanilla S.R.L. Palabras claves: Validación, Albúmina, Linealidad, Precisión, Robustez, Detección, Cuantificación. i Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación ABSTRACT The finality of this work was to demonstrate that the method spectrophotometric by quantification of albumin used in the area of Biochemistry Laboratorio Quintanilla S.R.L. meets the requirements of ISO / IEC / NTC 17025 requires a laboratory to be recognized IC A for technical competence in testing clinical reliability and according to international M standards. In the process of validation of each of the values were determined procedures Q UI for testing linearity, precision, accuracy, limit of quantification and robustness, using BI O standard albumin 5,4 g / dL; 4,05 g / dL; 2,7 g / dL; 2,025 g / dL and 1,35 g / dL. In the IA Y parameters tested, it was found that the method is linear with an r = 0,997607 Student t test AC for linearity = 52,020983> 2,16 is precision repeatability found for a C.V <2% (1,76%) FA RM and intermediate precision a C.V <2% (1,11%) found a limit of quantification of 0,48 g / dL, the method is also robust with respect to the variables of analysts, reaction time and DE reaction temperature. In conclusion, it was contributed and recorded the evidence O TE CA necessary to prove that the validated method complies with the policies of laboratory quality and ensure that the method is suitable for application in the analysis of albumin, BI BL I under the particular conditions and requirements Laboratorio Quintanilla S.R.L. Keywords: Validation, Albumin, linearity, accuracy, robustness, detection, quantification. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación I. INTRODUCCIÓN Hoy en día todos los productos y servicios de una empresa tienen que asegurar la calidad esperada, por lo que en lo que respecta a Laboratorios como son los clínicos deben implementar las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL), normas que permiten asegurar resultados confiables. IC A La finalidad de un laboratorio de análisis clínicos es producir resultados Q UI M relevantes y confiables para la toma de decisiones, estos datos deben ser obtenidos con O técnicas analíticas confiables, precisas y adecuadas para su fin. Esto, no es tan fácil de BI lograr en la realidad, como se ha demostrado en múltiples estudios entre laboratorios, IA Y que muestran que laboratorios diferentes, utilizando una misma metodología analítica AC y personal experimentado, analizando una misma muestra, obtienen resultados con FA RM variabilidad.1, 2 DE Para poder disminuir esta variabilidad, en el mundo se constituyeron asociaciones y O TE CA agrupaciones con en el fin de poder estandarizar estos métodos, dando origen a los principios de las “Buenas Prácticas”, dentro de las cuales surgieron los principios de BL I las Buenas Prácticas de Laboratorio, el cual contiene normatividades generales a BI seguir respecto a la calidad de los procedimientos. Dentro de esto, el personal que compone el laboratorio deben estar capacitados, ser proactivo y con responsabilidades bien definidas, quienes, así como los resultados obtenidos, están bajo un control riguroso mediante los controles de calidad, los programas de aseguramiento de la calidad y gestión de calidad.2, 3 Dentro de las BPL, se establecen las normas para la Validación, ya sea de métodos analíticos o procesos; las validaciones son Sistemas de Aseguramiento de la Calidad mediante los cuales se establecen evidencias documentadas para demostrar 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación que un proceso o método analítico conducirá, con un alto grado de seguridad a la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. En otras palabras, proporciona un alto grado de confianza de que un proceso o método analítico específico, producirá en forma consistente un resultado que cumpla con sus especificaciones predefinidas. 2, 3,4, 5, 6, IC A Dentro del complicado Sistema de Gestión de Calidad, la validación de métodos Q UI M analíticos constituye una etapa fundamental, que aporta a la demostración de las O competencias necesarias para llegar a generar resultados confiables y precisos, sin BI embargo el Sistema de Gestión de Calidad debe ser aplicado a todo el proceso analítico IA Y incluyendo todas sus fases tanto pre analítica, analítica como post analítica, AC constituyendo la validación de los métodos sólo una parte de todo este complejo sistema FA RM proceso.2, 4, 5, 7 DE La validación dependiendo de las características del método puede ser: método O TE CA normalizado, ejecutado tal y como se establece en el documento; método normalizado modificado, en el cual se hayan realizado cambios que puedan tener repercusión sobre BL I la calidad de los resultados; por ejemplo cambio en la metodología de extracción, BI cambio en la matriz, extensión del rango, equipamiento nuevo, etc; y método interno, elaborado por el laboratorio o sacado de la bibliografía pero sin datos de performance del método.8, 9 La Validación debe aplicarse cuando se requiere incorporar una técnica nueva al trabajo de rutina del laboratorio, también cuando se comparan dos metodologías o bien cuando se está desarrollando un método o técnica nueva, en este sentido se está realizando la incorporación de una técnica nueva al trabajo de rutina del laboratorio y por tanto es necesario realizar la validación. 10 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación El producto de un Laboratorio Clínico son los resultados que se emiten de los diferentes análisis clínicos, los cuales tienen que ser validados, considerando el potencial riesgo que traería al informarse resultados no reales. Dentro los análisis que se desarrollan en un Laboratorio Clínico, se encuentra el de Albúmina Sérica; la albúmina sérica es el principal contribuyente de las proteínas totales plasmáticas. Entre sus múltiples funciones se pueden mencionar: Transporte de A una amplia variedad de sustancias como hormonas esteroides, ácidos grasos, bilirrubina, M IC catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso; mantenimiento de la Q UI presión coloidosmótica, que estaría relacionado con su bajo peso molecular y su gran BI O carga neta; la albúmina fija y desdobla varios compuestos, como por ejemplo el calcio y Y ácidos grasos de cadena larga. Además, la albúmina es capaz de fijar iones de metales AC IA pesados tóxicos así como numerosos fármacos, por lo cual bajas concentraciones de FA RM albúmina en sangre tienen graves efectos farmacocinéticos. Los aumentos anormales de albúmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con la deshidratación que DE provoca la reducción en el contenido del agua plasmática.10, 11 O TE CA La hipoalbuminemia ocurre en condiciones patológicas tales como pérdida excesiva de proteínas en el síndrome nefrótico, desnutrición, infecciones prolongadas, BL I quemaduras severas. En casos graves de hipoalbuminemia, la concentración plasmática BI de la albúmina máxima alcanza 2,5 g/dL (380 μmol/L). Debido a la baja presión osmótica en el plasma, el líquido pasa de los capilares sanguíneos al tejido (edema). La determinación de la albúmina permite supervisar a pacientes bajo dieta controlada y constituye un test excelente del funcionamiento hepático.12, 13 Actualmente, en el área de Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L., para la cuantificación de Albúmina se utilizan kits de reactivos de marca WIENER LAB el cual contiene: El reactivo de trabajo para la cuantificación de albúmina sérica, que se 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación utiliza mediante coloración por punto final; dentro de la técnica descrita, se ha realizado la siguiente modificación: la disminución en forma proporcional de la cantidad de reactivo y muestra, esta modificación tiene como objetivo conocer la utilidad de trabajar con muestras pequeñas, en pacientes pediátricos y hospitalizados, ya que muchas veces se requiere procesar mayor número de ensayos y la obtención de más A muestra no siempre es la más óptima. M IC Conociendo la importancia del proceso de validación dentro del Sistema de Q UI Gestión de Calidad y conociendo también que valores erróneos traen como BI O consecuencia un mal diagnóstico es que se decidió realizar éste trabajo de investigación; Y para lo cual se planteó la siguiente interrogante: AC IA ¿Cumplirá con los criterios de validación el método espectrofotométrico para la FA RM cuantificación de albúmina sérica utilizando el kit de reactivos WIENER LAB DE empleado en el área de Bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L.? O TE CA Los objetivos a alcanzar fueron: Validar el método espectrofotométrico para la cuantificación de albúmina BL I sérica utilizando el kit de reactivos WIENER LAB empleado en el área de BI Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. Determinar los parámetros de validación del método espectrofotométrico para la cuantificación de albúmina sérica: linealidad, exactitud, precisión, límite de cuantificación y robustez, utilizando el kit de reactivos WIENER LAB empleado en el área de Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación II. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Muestra Suero patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo A con título conocido de proteínas totales (Biuret o Kjeldhal): 9,6 g/dL Q UI M IC y albúmina (Unión BCF): 5,40 g/dL. BI O Materiales de Laboratorio Baño maría Tomas. Cronómetro Espectrofotómetro Stat Fax 3300. Gradilla de plástico Guantes de látex Micropipetas regulables de 5 µL a 10 µL (Pipet4u) y de 100 O TE CA DE FA RM AC IA Y µL – 1000 µL (TECO DIAGNOSTICS). Puntas para micro pipetas hasta 200 µL y hasta 1000 µL Tubos de ensayo. BI BL I Reactivos Reactivo BCF: solución de 3,3’,5,5’-tetrabromocresolsulfonftaleina (empolioxietilenlaurileter). 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación MÉTODO Fundamento de la reacción La albúmina reacciona específicamente con la forma aniónica de la 3,3', 5,5’-tetrabromocresolsulfonftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,9. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de M IC A albúmina presente en la muestra.13 Q UI Condiciones de reacción: BI O - Longitud de onda: 625 nm en espectrofotómetro. Y - Temperatura de reacción: 15 °C -28°C. AC IA - Tiempo de reacción: 10 minutos FA RM - Volumen de muestra: 10 µL - Volumen de Reactivo BCF: 3.5 mL O TE CA DE - Volumen final de reacción: 3.51 mL Procedimiento B S D Suero Patrón - 10 µL - Muestra - - 10 µL Reactivo BCF 3,5 mL 3,5 mL 3,5 mL BI BL I En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: Mezclar con varilla. Mantener los tubos entre 15 °C y 28°Cdurante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm llevando a cero con el blanco de reactivo. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Estabilidad de la mezcla de reacción final: El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.13 La modificación que se realizó fue la disminución en forma proporcional de la cantidad de reactivo y muestra a utilizar. S D Suero Patrón - 5 µL - Muestra - - 5 µL Reactivo BCF 1,75 mL 1,75 mL 1,75 mL Q UI M IC A B Para determinar si el método modificado, empleado en la cuantificación de BI O Albúmina sérica cumple con los criterios de validación, se evaluaron los AC IA Y siguientes test: FA RM Linealidad Para evaluar la linealidad se hizo uso de un estándar o suero patrón que DE viene con el kit de reactivos PROTI 2 de concentración para O TE CA albúmina de 5.4 g/dL, con el cual se realizó diluciones cuyas concentraciones fueron de 4,05g/dL, 2,70g/dL, 2,025g/dL, 1,35 g/dL, BL I las cuales fueron analizadas cada uno por triplicado y por un mismo BI analista. Precisión Para determinar la precisión del método, se evaluó su repetibilidad y su reproducibilidad de la manera que se describe a continuación: 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Repetibilidad: Se realizó un número de 10 determinaciones de la dilución de 4,05g/dL, por un mismo analista, el mismo día, con los mismos reactivos y los mismos instrumentos. Precisión Intermedia: Para su determinación se empleó un estándar de 4,05g/dL, el cual IC A se analizó en dos días diferentes, por dos analistas en un número Q UI M de tres determinaciones; por analista y por día. BI O Exactitud Y Se evaluó a través de un análisis repetitivo de 3 concentraciones: 5,4 AC IA g/dL, 4,05 g/dL y 1,35 g/dL. El análisis de cada uno de estos FA RM estándares se llevó a cabo por triplicado. DE Límite de Cuantificación O TE CA Se determinó mediante el análisis repetitivo de un blanco. El blanco utilizado fue el reactivo para la determinación de albúmina sérica BL I del kit de reactivo PROTI 2 y se llevó a cabo 10 determinaciones. BI Robustez La robustez se determinó de acuerdo al diseño de Youden & Steiner, siendo las variables evaluadas: Temperatura de reacción, analista (2 analistas) y tiempo de reacción.1, 4, 6,14 Cada una de las determinaciones a realizar se efectuó empleando la técnica descrita en el inserto del kit de reactivos de la marca provista por el fabricante WIENNER LAB. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS1, 4, 6, 14, 15, 16, 17 LINEALIDAD Cálculos para el test de Regresión Fórmula empleada para el cálculo de la Pendiente o Coeficiente de Regresión “b”. n IC M Q UI 2 n x 2 Y BI x x y O b xy A La pendiente b fue determinada empleando la fórmula siguiente: AC IA Donde: FA RM x= Concentración de las muestras utilizadas. y= Absorbancias obtenidas en las lecturas de las muestras O TE CA DE n= Número de determinaciones. Fórmula empleada para el Cálculo del Intercepto “a” BI BL I Su determinación se hizo mediante la siguiente fórmula: a y b x n 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Ecuación de la Recta de Regresión Con los datos obtenidos en este procedimiento se procedió a elaborar la recta de regresión, la cual tuvo la siguiente fórmula: y bx a Donde: M IC estándares y muestras utilizadas. A y = Absorbancias obtenidas a partir de las lecturas de los Q UI x = Concentración de las muestras utilizadas. BI O b = Pendiente de la recta de regresión. AC ordenadas. IA Y a= Intercepto de la regresión lineal con el eje de FA RM Cálculo del Coeficiente de Correlación “r” O TE CA r DE Para su determinación se empleó la siguiente fórmula: y 2 y 2 2 n BL I x2 x xy n x y n BI Cálculo del Coeficiente de Determinación “r2” Se determinó mediante la siguiente fórmula: r 2 (r )2 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Cálculos efectuados en el Test de Linealidad de la Pendiente b Cálculo del valor de la varianza residual “ S 2y , x ” Se la halló a través de la siguiente fórmula: y ay bxy 2 2 y,x S n 2 IC A Donde: M b = Pendiente de la recta de regresión. Q UI a = Intercepto con el eje de ordenadas. BI O n = # de determinaciones. IA Y Cálculo del valor de la varianza de la pendiente b “ S 2b ” FA RM AC Se determinó empleando la fórmula siguiente: S 2y , x S x 2 ( x ) 2 n O TE CA DE 2 b Cálculo del valor de la desviación estándar de la pendiente b “ S b ” BL I Se obtuvo a partir del valor de la varianza de la pendiente b ( S 2b ) BI mediante la siguiente fórmula: Sb S 2b 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza de la Pendiente “b” Se empleó la siguiente fórmula: Int.Conf . b tSb Donde: A b = Pendiente. M IC t = ttab para un nivel de significancia del 95% y n-2 grados Q UI de libertad. IA Y BI O S b = Desviación estándar de la pendiente. AC Cálculos efectuados en el Test de Proporcionalidad FA RM Cálculo de la Varianza del Término Independiente “ S a2 ” S S 2 a 2 b x 2 n BL I O TE CA DE Se utilizó la siguiente fórmula: BI Fórmula empleada para determinar la Desviación Estándar del Término Independiente “Sa” Para determinar la Desviación Estándar se utilizó la siguiente fórmula: Sa S a2 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Fórmula empleada para determinar el Intervalo de Confianza del Intercepto “a” Para determinarla se aplicó la siguiente fórmula: Int.Conf. a tSa Donde: A a = Intercepto. M IC t = ttab para un nivel de significancia del 95% y n-2 grados Q UI de libertad. BI O S a =Desviación estándar del intercepto IA Y Cálculo del valor de texp FA RM AC El valor de texp se determinó empleando la siguiente fórmula: b Sb DE t exp O TE CA Donde: S b = Desviación estándar de la pendiente b. BI BL I b = Pendiente de la recta de regresión. El método será lineal si, para la pendiente (b) texp es mayor al ttab y para el intercepto (a) texp es menor al ttab, con el 95% de confianza y n-2 grados de libertad y el coeficiente de correlación (r) es igual o mayor que 0,990. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación PRECISIÓN Repetibilidad Determinación de las Concentraciones Prácticas a partir de las absorbancias. Los valores de las concentraciones prácticas se obtuvieron al empelar la fórmula elaborada a partir de la ecuación IC M ya b Q UI x A de la recta obtenida en la curva de calibración: BI O Donde: Y x = Concentración práctica AC IA y = Absorbancia FA RM b = Pendiente de la recta de regresión. ordenadas. O TE CA DE a = Intercepto de la regresión lineal con el eje de BI BL I Determinación de la Media “ x ” Se utilizó la fórmula siguiente: n x xi i 1 n Donde: x Media n = Número de determinaciones 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Determinación de la Desviación Estándar “s” Para hallarla se empleó la fórmula siguiente: 2 x x i n S i 1 n 1 Determinación del Coeficiente de Variación (CV) M S * 100 x Q UI CV IC A Se hizo uso de la fórmula descrita a continuación: BI O Donde: IA Y s = Desviación Estándar AC x = Media FA RM Determinación de los Intervalos de Confianza Individual y de la Media. Intervalos de Confianza Individual x t tab * S BI BL I O TE CA DE Se hicieron uso de las siguientes fórmulas: Donde: x Media ttab= Valor de t tablas para un 95% de confianza y n-1 grados de libertad. s = Desviación estándar 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Intervalo de Confianza de la Media x t tab * s n Donde: IC A x Media M ttab= Valor de t tablas para un 95% de confianza y Q UI n-1 grados de libertad. BI O s = Desviación Estándar FA RM Precisión Intermedia: AC IA Y n = Número de determinaciones. Los valores de concentraciones prácticas, de la media, de la DE desviación estándar, del coeficiente de variación y de los O TE CA Intervalos de Confianza se obtuvieron de manera idéntica que en el test de repetibilidad. BL I El método será preciso si en los procedimientos de Repetibilidad y BI Precisión Intermedia se obtiene un coeficiente de variación menor al 2%. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación EXACTITUD Cálculo de las Concentraciones Prácticas a partir de las absorbancias. Las concentraciones fueron obtenidas mediante la siguiente fórmula, obtenida a partir de la curva de calibración: A ya b IC x M Donde: BI O Q UI x = Concentración práctica y = Absorbancia Y Cálculo del Porcentaje de Recuperación AC IA En la determinación de la exactitud del método los valores de las siguiente forma: FA RM concentraciones se expresaron como porcentaje de recuperación de la cc. Pr áctica 100 cc.Teórica O TE CA DE % Re cuperación Cálculos efectuados en la aplicación de la Prueba t Student BI BL I Para la aplicación de esta prueba fue necesaria la determinación del valor de texp mediante la siguiente fórmula: texp 100 % R n CV Donde: % R = Valor del promedio de los % de Recuperación. n = Nº de determinaciones. C.V = Coeficiente de variación. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación El método será exacto si el valor de ttab es mayor que el texp, al 95% de confianza y n-1 grados de libertad en la aplicación de la t Student. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Se obtuvo mediante la aplicación de la siguiente fórmula: A K Sbl b IC C LQ Q UI M Donde: O CLQ =Límite de cuantificación. BI K = Constante (10 para el límite de cuantificación). AC IA Y b = Pendiente obtenida en el test de linealidad. FA RM ROBUSTEZ Se empleó el diseño de Youden & Steiner, el cual se muestra en el 1 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c s t u v w x y z BL I Factor / Prueba BI O TE CA DE siguiente esquema: Resultado Siendo: A: Temperatura de reacción: 20 ° C. a: Temperatura de reacción: 37 ° C. B: Analista 1 b: Analista 2 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación C: Tiempo de Reacción: 5 minutos. c: Tiempo de Reacción: 25 minutos. s, t, u, v, w, x, y, z: concentraciones de Albúmina determinadas en cada prueba. A continuación se procederá a determinar las diferencias para cada factor, empleando la fórmula siguiente: IC A VA = 1/4 (s+t+u+v) - (w+x+y+z) Q UI IA Y BI Vx S 2 O VC = 1/4 (s+u+w+y) - (t+v+x+z) M VB = 1/4 (s+t+w+x) - (u+v+y+z) AC Donde: FA RM VA, VB, VC =Valor de las diferencias existentes entre las variables DE estudiadas. O TE CA Si V x S 2 y la diferencia no es significativa, el método será robusto para esa variable. (S = desviación estándar hallada en el test BI BL I de repetibilidad). 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación III. RESULTADOS Cuadro 1: Parámetro de linealidad en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Criterio de aceptación Resultado Coeficiente de correlación (r) r > 0,990 0,997607 Coeficiente de determinación (r2) r2> 0,990 Conformidad Conforme Q UI M IC A Estimadores estadísticos Conforme Criterio de aceptación DE Test de verificación de la pendiente L.C no incluye el cero texp>ttabla O TE CA a. Límite de confianza (LC) Conformidad L.S= 0,078183 L.I= 0,071949 Conforme texp= 52,021 ttabla= 2,160 BL I b. Test de t Resultado FA RM AC Estimadores estadísticos IA Y BI O 0,9952 BI Test de verificación de la variable independiente a. Límite de confianza (LC) L.C incluye el cero texp < ttabla b. Test de t L.S= 0,014207 L.I= -0,07166 Conforme texp= 0,7115 ttabla= 2,160 ttabla: 2,160 para: α = 0,05 y n-2 grados de libertad Límite inferior (L.I) Límite superior (L.S) 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación LINEALIDAD 0.450 IC A y = 0.0751x + 0.0035 R² = 0.9952 M 0.400 UI BI O Q 0.300 Y 0.250 AC I A 0.200 0.150 M S A I C N A V R O S B A 0.100 FA R ABSORBANCIAS 0.350 TE CA 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 CONCENTRACION TEORICA BI BL IO 0.000 0.000 DE 0.050 Gráfico 1: Recta de regresión obtenida en el test de linealidad en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Cuadro 2: Parámetro de precisión en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Estimadores estadísticos Criterio de Resultado Conformidad aceptación C.V. < 2 % 1,759 % Conforme Precisión Intermedia C.V. < 2 % 1,1051 % Conforme IA Y BI O Q UI M IC A Repetibilidad AC Cuadro 3: Parámetro de exactitud en la validación del método espectrofotométrico para ttabla Resultado Conformidad 2,306 1,35 < 2,306 Conforme aceptación t exp< t tab BI BL I t Student DE estadísticos Criterio de O TE CA Estimadores FA RM determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Cuadro 4: Límite de cuantificación en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Resultado Límite de cuantificación 0,480 g / dL Q UI M IC A Parámetro O Cuadro 5: Parámetro de robustez en la validación del método espectrofotométrico para Criterio de estadísticos aceptación Factores FA RM Estimadores AC IA Y BI determinar albumina sérica en el área de bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. DE Temperatura de reacción O TE CA Vx S 2 Analista Tiempo de reacción Conformidad 0,027 < 0,109 0,008 < 0,109 Conforme 0,004 < 0,109 BI BL I Vx Resultado 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación IV. DISCUSION En el presente trabajo se desarrolló la validación del método analítico para determinar Albumina sérica en el Área de Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. Los test a evaluar en un estudio de validación de un método dependerán de la naturaleza del mismo. Para determinar si el método empleado en la cuantificación de Albúmina sérica cumple con IC A los criterios de validación, se evaluaron los siguientes test: Linealidad, precisión, exactitud, Q UI M límite de cuantificación y robustez. O Para evaluar el parámetro de linealidad, los resultados deben hallarse mediante Y BI métodos estadísticos adecuados como el cálculo de una línea de regresión por el método de IA los mínimos cuadrados, la intersección con el eje de ordenadas o variable independiente FA RM AC (b), la pendiente de la línea de regresión (m) y la suma de los cuadrados residuales.18 En el cuadro Nº 01 se presenta el coeficiente de determinación (r2 = 0.9952), del que se DE deriva el coeficiente de correlación “r” = 0,997607que nos indica el grado de relación O TE CA entre la concentración (x) y la respuesta (y), el cual su valor máximo es cercano a 1. Según AEFI, Bioanalytical Methods Validation e ICH establecen para el test de Linealidad, que el BL I coeficiente de correlación debe ser mayor o igual r > 0,990. Los valores obtenidos suponen BI una correlación aceptable con una probabilidad superior al 99,90%.19, 20 Sin embargo, un valor del coeficiente de correlación muy cercano a la unidad no puede tomarse como indicador absoluto de linealidad, sino que además se tiene que demostrar mediante el empleo de una prueba parar la linealidad, siendo uno de los más confiables la prueba de t Student, la cual aplicada al test, tal como se muestra en la cuadro Nº 1, para que cumpla con los criterios de aceptabilidad según los organismos internacionales: texp> ttab, y valor del texp (52.020983) obtenido es mucho mayor al ttab (2,16) (n-2= 13 grados de 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación libertad) con un nivel de confianza del 95 %, con esto nos demuestra que el método cumple con el test de linealidad. Para el test de Linealidad, en el gráfico Nº 01 se observa en la ecuación resultante del test de Linealidad para hallar las concentraciones, La pendiente “b” está relacionada con la sensibilidad del método, de forma que a mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta A del método frente a los cambios de la concentración del analito), de modo que, en este Q UI M IC caso, puede diferenciar concentraciones al encontrar lecturas cercanas.4 El término “a” independiente u ordenada en el origen, es la intersección de la recta con el BI O eje de ordenadas y es indicativo del error sistemático si es que no pasa cerca del origen de IA Y coordenadas; en éste caso existe un error sistemático por exceso5. En el test de AC proporcionalidad vemos que los límites de confianza no incluyen al cero, lo que significa FA RM que el método analítico presenta sesgo; como ya lo mencionamos, éste es por exceso.4 DE En lo que respecta al test de precisión, que es el grado de dispersión de los datos analíticos O TE CA respecto a su valor medio, se evaluó la repetibilidad como una medida de ésta, la cual se define como el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de BL I procedimientos analíticos efectuados sobre una muestra homogénea por un mismo analista BI bajo las mismas condiciones, es decir es la capacidad del método para dar resultados semejantes cuando se aplica repetidamente en una muestra. La precisión se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación, AEFI establece que el coeficiente de variación sea menor que 2 %. En el caso de la determinación de la repetibilidad, tal como se muestra en el cuadro Nº 2 se obtuvo un coeficiente de variación igual a 1,759 %, siendo menor al valor máximo del criterio de aceptación.4, 6, 21 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Referente a la precisión intermedia, el cual se realizó en diferentes días, en el cuadro Nº 02, se presenta un C.V.= 1.1051 % y lo establecido por la AEFI que sea menor al 2%, la precisión intermedia se obtiene cuando dentro del mismo laboratorio se varían uno o más factores entre cada uno de los procedimientos.4, 19 La exactitud es la capacidad del método analítico para proporcionar resultados lo más A cercanos posibles al valor teórico, la falta de exactitud puede ser por defecto o por exceso. M IC Las desviaciones por exceso suelen producirse cuando existen interferencias analíticas y la Q UI selectividad del método no es la adecuada, los resultados finales son superiores a los BI O verdaderos. En éste caso debería modificarse el método para hacerlo más selectivo. Las Y desviaciones por defecto suelen darse en métodos analíticos muy laboriosos, con varias FA RM disminución de la recuperación.4, 14,16 AC IA fases, extracciones, purificaciones, etc., que se traducen inevitablemente en una Para determinar la exactitud, se obtuvo el porcentaje de recuperación media el cual fue de DE 99.0382%, no existiendo diferencia significativa con el 100 %, En el cuadro Nº 03 se O TE CA observa un texp = 1.35 que es menor al ttablas = 2,306, teniendo como criterio de aceptación BL I que el ttablas debe de ser mayor al texp , con esto el método cumple con el test de exactitud.4 BI Límite de cuantificación es la mínima concentración de un analito que podemos determinar con una precisión y exactitud adecuadas, se expresan como concentración del analito. En el cuadro Nº 04 se observa el Límite de cuantificación de 0.480g/dL, siendo resultados óptimos y muy aceptados.4, 6 En el caso del parámetro robustez, según AEFI, es definida como el grado de influencia que cambios en las condiciones analíticas ejercen sobre la fiabilidad del método analítico. Es importante evaluarla porque permite localizar factores que originan fluctuaciones y los 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación que necesitan una atención especial por cuanto son origen de variaciones significativas en los resultados. En el estudio, los cambios a los que fue sometido el método analítico, en concentración de 4.05 g/dL fueron: la variación de analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 25 minutos) y temperatura de reacción (20 oCy 37oC). Se consideran como aceptables aquellos valores absolutos de las diferencias obtenidas de acuerdo al diseño de Youden & Steiner que sean menores o iguales al valor del producto de su desviación estándar IC A multiplicado por 2, en el cuadro Nº 05 se observa que el valor del producto de su Q UI M desviación estándar multiplicado por 2 es 0.109, y los resultados obtenidos en cada O operación son de 0.027, 0.008 y 0.004, siendo estos valores menores a 0.109. Tomando en BI cuenta esto, se aprecia en los resultados que el método es robusto a las variaciones de IA Y analistas, tiempo de reacción (5 minutos y 25 minutos) y temperatura de reacción (20 oC y FA RM AC 37 oC). Al haberse comprobado experimentalmente que no hay influencia de los factores estudiados recomienda la realización de este test dentro de los límites de temperatura BI BL I O TE CA DE establecidos.4, 6, 21 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación V. CONCLUSION El método espectrofotométrico para cuantificación de albúmina sérica en el área de bioquímica, del laboratorio Quintanilla S.R.L.; es lineal con un “r” = 0,997607 con valor del A texp = 52.020983 obtenido con un nivel de confianza del 95 %; es preciso con coeficiente M IC de variación igual a 1,759 % para repetibilidad y con coeficiente de variación igual a Q UI 1.1051 % para precisión intermedia; es exacto con un porcentaje de recuperación media de diferentes tiempos de reacción de 05 minutos y 25 minutos y Y diferentes analistas, BI O 99.0382 % y texp = 1.35; tiene un límite de cuantificación de 0.480g/dL, y al emplear AC IA temperatura de reacción de 20 oC y 37 oC, tiene robustez; cumpliendo con los parámetros BI BL I O TE CA DE FA RM de validación establecidos. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. D’Ocon C. Fundamentos y Técnicas de Análisis Bioquímico: Principios de Análisis instrumental 2da ed. ED. Thomson. 2003 Madrid. Pp. 1 – 10, 233 – 257. 2. Rodríguez G. “Aseguramiento de la calidad analítica y norma ISO 17025 en laboratorios clínicos y químicos”. Rev. Costarricense de Ciencias Médicas. San José, IC A Costa Rica. Vol (22)1-2. Junio, 2001.[Fecha de Acceso: 14 de Abril del 2012] Q UI M Disponible en: O http://www.ia.csic.es/sea/revista/VOL3634/03.pdf#search=%22protocolo%20de%20va Y BI lidacion%22 IA 3. Sabater J. Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP) y Garantía de Calidad (Quality FA RM AC assurance): Principios básicos. 1era ed. ED. Díaz de Santos.1988 Madrid pp 1,104. 4. Castro M. et al. Validación de Métodos Analíticos. 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The United States Pharmacopeial Convention: Impreso en United Book Press; 2011. 19. US Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research: Guidance for Industry. Bioanalytical Methods Validation. Mayo, 2001.[Fecha de Acceso: 14 de Abril del 2012] Disponible en: 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación http://www.fda.gov/cder/Guidance/4252fnl.pdf#search=%22guidance%20for%20indus try%20bioanalytical%20methods%20validation%20for%20human%20studies. 20. US Department of Health and Human Services: Guidance for Industry: Validation of Analytical Procedures: Methodology. Julio, 1999. 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Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 1: Kit de reactivo usado en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Proti 2. Albumina Estándar Lote 1105068760 Lote 068760 Exp. /Venc. 05/2013 Exp. /Venc. 05/2013 IC A Anexo Nº 2: Datos experimentales obtenidos en el test de Linealidad en la validación del Q UI M método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del XY X2 IA BI O laboratorio Quintanilla S.R.L. 0,413 2,23 29 5,4 0,405 2,19 29 5,4 0,406 2,19 29 4,05 0,306 1,24 16 2 4,05 0,312 1,26 16 3 4,05 0,312 1,26 16 1 2,7 0,202 0,55 7 2 2,7 0,198 0,53 7 3 2,7 0,199 0,54 7 1 2,03 0,180 0,36 4 2 2,03 0,157 0,32 4 3 2,03 0,155 0,31 4 1 1,35 0,101 0,14 2 2 1,35 0,102 0,14 2 3 1,35 0,101 0,14 2 g/dL (X) 1 5,4 Absorbancia (Y) Muestra 1 1 BI BL I O TE CA DE Muestra 2 Muestra 4 Muestra 5 FA RM 2 3 Muestra 3 AC Y Nº Repeticiones 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 3: Datos experimentales de regresión lineal obtenidos en el test de linealidad, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Resultado Pendiente b 0,075066 Intercepto a 0,003520 Ecuación de la Recta y = 0,075066x + 0,003520 BI O Q UI M IC A Parámetros de Regresión 0,9952 AC IA Y Coeficiente de Determinación (r2) FA RM Anexo Nº 4: Datos experimentales para Linealidad de la Pendiente (b), obtenidos en el DE test de Linealidad, en la validación del método espectrofotométrico para determinar O TE CA albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Pendiente BI BL I Parámetros del Test de Linealidad de la Varianza Residual ( s 2y , x ) Varianza de la Pendiente ( S 2b ) Desviación Estándar de la Pendiente ( Sb ) Resultado 0,000066 2,08223 E-06 0,000065 Superior 0,078183 Intervalo de Confianza de la Pendiente Inferior 0,071949 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 5: Datos experimentales del Test de Proporcionalidad, obtenidos en ensayo de Linealidad, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Resultado Varianza del Intercepto ( Sa2 ) 2,44769 Desviación Estándar del Intercepto ( Sa ) 0,004947 IC A Parámetros del Test de Proporcionalidad M Superior 0,014207 Q UI Intervalo de Confianza del Intercepto Y BI O Inferior -0,07166 IA Anexo Nº 6: Datos experimentales obtenidos en el test de Repetibilidad en la validación FA RM AC del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Concentración Práctica 0,333 4,05 4,39 0,340 4,05 4,48 0,336 4,05 4,43 0,328 4,05 4,32 5 0,341 4,05 4,50 6 0,333 4,05 4,39 7 0,325 4,05 4,28 8 0,328 4,05 4,32 9 0,339 4,05 4,47 10 0,325 4,05 4,28 DE Concentración Teórica 2 3 BI 4 BL I 1 Absorbancias O TE CA Muestra 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Cuadro 7: Datos experimentales obtenidos en el test de Repetibilidad en la validación del método espectrofotométrico para determinar Albumina sérica en el Área de Bioquímica del Laboratorio Quintanilla S.R.L. 10 Media 4,39 Desviación Estándar 0,077173 Intervalos de confianza individual Superior 4,5611 Inferior 4,2119 Intervalos de confianza de la media Superior 5,1018 Inferior 3,6712 BI O Q UI M IC A Nº de análisis IA Y Anexo Nº 8: Datos experimentales obtenidos en el test de Precisión Intermedia, en la AC validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de Concentración Teórica Concentración Práctica 0,306 4,05 4,03 2 0,312 4,05 4,11 3 0,312 4,05 4,11 1 0,308 4,05 4,06 2 BL I 0,312 4,05 4,11 3 0,314 4,05 4,14 1 0,306 4,05 4,03 2 0,314 4,05 4,14 3 0,316 4,05 4,16 1 0,311 4,05 4,10 2 0,317 4,05 4,18 3 0,310 4,05 4,08 1 BI Analista Analista 1 Analista 2 1 O TE CA Analista Absorbancias DE Muestra 2 FA RM bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 9: Datos experimentales obtenidos en el test de Exactitud, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. Absorbancias ensayo Concentración Concentración Teórica Práctica 5,45 0,413 5,40 2 0,405 5,40 3 0,406 1 0,306 2 IC 1 Q UI M Muestra 4,05 4,03 0,312 4,05 4,11 0,312 4,05 4,11 0,101 1,35 1,30 2 0,102 1,35 1,31 0,101 1,35 1,30 O TE CA DE 3 Y BI 3 IA AC FA RM 2 1 BI 5,36 BL I 5,35 5,40 Muestra 3 O 1 Muestra A Nº de 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 10: Datos experimentales obtenidos en el test de Exactitud, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. % DE RECUPERACION 1 101.0173 2 99.0437 M IC A Nº de ensayo Q UI Muestra BI O 1 99.2904 99.4943 2 101.4679 DE FA RM Muestra AC 1 IA Y 3 3 101.4679 1 96.1918 2 97.1786 3 96.1918 O TE CA 2 BI BL I Muestra 3 PROMEDIO 101.0173 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 11: Datos experimentales obtenidos en los test de Límite de cuantificación, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de Absorbancia 1 0,0000 0,000 2 0,0000 0,001 3 0,0000 4 0,0000 5 0,0000 M IC A Concentración Q UI bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 0,006 FA RM AC IA Y BI O 0,003 0,0000 0,008 0,0000 0,009 8 0,0000 0,009 9 0,0000 0,009 0,0000 0,010 BI BL I O TE CA 7 DE 6 0,006 10 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 12: Datos experimentales obtenidos en el test de Robustez, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 8 25 Minutos 05 Minutos 25 Minutos Int. Cinthya Tello 05 Minutos Int. Cinthya Tello IA 25 Minutos AC Int. Suli Irigoin BI Int. Suli Irigoin O Q UI 20 º C 7 20 º C 6 0,322 0,306 0,301 0,296 0,299 BI BL I O TE CA Y FA05 Minutos RM 0,342 0,324 Int. Cinthya Tello Int. Cinthya Tello 25 Minutos 0,324 DE Int. Suli Irigoin 05 Minutos Absorbancia Int. Suli Irigoin Tiempo de Reacción Analista 5 M 20 º C IC A 4 20 º C 3 37 º C 37 º C Temperatura de Reacción 2 37 º C 1 37 º C Factor / Ensayo 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Anexo Nº 13: Variables utilizadas para el test de Robustez, en la validación del método espectrofotométrico para determinar albumina sérica en el área de bioquímica del laboratorio Quintanilla S.R.L. 37 º C Temperatura de Reacción 2 20 º C Analista 1 Int. Suli Irigoin Analista 2 Int. Cinthya Tello Tiempo de Reacción 1 05 Minutos Tiempo de Reacción 2 25 Minutos BI BL I O TE CA DE FA RM AC IA Y BI O Q UI M IC A Temperatura de Reacción 1 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/