bacterias lacteas del genero lactococcus lactis y su aplicacion a la

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
C12N 1/20 (2006.01)
A23B 4/22 (2006.01)
C12R 1/46 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 280 616
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 02799423 .5
86 Fecha de presentación : 18.09.2002
87 Número de publicación de la solicitud: 1456350
87 Fecha de publicación de la solicitud: 15.09.2004
54 Título: Bacterias lácteas del género Lactococcus lactis y su aplicación a la conservación de productos ali
menticios.
30 Prioridad: 21.09.2001 FR 01 12187
73 Titular/es: Patrice Daniel
La Baconnière, Saint Emilien de Blain
44130 Blain, FR
Sylvie Lorre
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.09.2007
72 Inventor/es: Daniel, Patrice y
Lorre, Sylvie
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
ES 2 280 616 T3
16.09.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
ES 2 280 616 T3
DESCRIPCIÓN
Bacterias lácteas del género Lactococcus lactis y su aplicación a la conservación de productos alimenticios.
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La presente invención se refiere a una nueva cepa de bacterias lácteas especie Lactococcus lactis.
Esta invención se refiere además a unos cultivos, biomasas, derivadas de esta cepa y su utilización en la conservación de productos alimenticios.
10
Esta invención se refiere también a unas composiciones que incorporan dicha cepa, a unos productos alimenticios
tratados por medio de dicha cepa y a unos procedimientos de conservación de dichos productos alimenticios.
La presente invención es el resultado de los estudios realizados en el campo de la conservación de productos
alimenticios, en particular de productos del mar, condicionados bajo vacío o en una atmósfera controlada.
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El pescado fresco es un alimento particularmente perecedero que hace su conservación difícil y que limita su distribución. La alteración del pescado fresco refrigerado es provocada por el desarrollo de microorganismos no patógenos
que producen amoníaco, unas aminas, hidrógeno sulfurado... El embalaje bajo vacío o bajo atmósfera modificada no
inhibe totalmente esta flora de alteración de la que una parte es capaz de adaptarse a unas condiciones de anaerobiosis.
Resulta de ello el desarrollo de olores desagradables que se concentran rápidamente, antes incluso de que el sabor del
pescado sea alterado. El “bajo vacío” y la atmósfera modificada son sin embargo unos modos de acondicionamiento
cada vez más apreciados puesto que alían las cualidades organolépticas y nutricionales del fresco y una duración de
conservación elevada.
La utilización de bacterias lácteas para preservar los alimentos refrigerados ha constituido el objeto de diferentes
patentes o publicaciones.
Así, Boudreaux et al. en 1989 utilizan unas células vivas de Lactobacillus que tienen la particularidad de no
fermentar y capaces de producir peróxido de hidrógeno para inhibir la flora de alteración y la flora patógena de los
alimentos refrigerados embalados (US nº 4.874.704). Sin embargo, el peróxido de hidrógeno resulta poco eficaz para
los pescados y plantea problemas en términos de reglamentación.
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Matrozza et al. (1989) añaden una mezcla de Streptococus lactis y de Pediococcus a base de células no viables para
inhibir la flora psicotrófica de la leche refrigerada sin obtener fenómeno de fermentación o de crecimiento de la flora
láctea (US nº 4.880.743). Este proceso de inhibición descansa por tanto sobre la producción de moléculas activas.
40
En el marco de un programa FAR en 2000, el equipo del Dr Hall de la universidad de Loughborough ha ensayado diferentes cepas de bacterias lácteas aisladas de productos marinos para preservar carne picada de pescadilla. La
aportación de fermento (cepas de Lactococcus o de Carnobacterium) no tuvo incidencia sobre las cualidades organolépticas de los productos ni sobre la inhibición de la flora de alteración.
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Hutkins et al. (1993) introducen en los alimentos refrigerados conservados en anaerobiosis unas células vivas de
Pediococcus productoras de bacteriocinos. Las bacterias lácteas añadidas no se desarrollan en el alimento ni lo fermentan y no modifican por sus cualidades organolépticas (US nº 5.186.962). Estas bacterias productoras de bacteriocinos
resultan no viables a largo plazo. Además, los bacteriocinos son considerados como unos aditivos de tipo antibiótico
que provocan la aparición de gérmenes resistentes y que pueden perder así su eficacia.
Unos ensayos de preservación de salmón ahumado con la ayuda de una cepa de Lactococcus lactis productora de
nisina han sido realizados por Wessels y Huss en 1996. Resulta que la población de la de Lactococcus lactis decrece
en el salmón ahumado conservado a 10ºC, no siendo la cepa psicotrófica, ni adaptada a este tipo de sustrato. La acción
combinada de la sal y el porcentaje de CO2 permite aumentar los efectos bactericidas de la nisina contra las cepas de
Listeria monocitogenes (Nilsson et al. 1997).
Paralelamente, el mismo tipo de cepa ha sido estudiado por Chen Mei-Hui et al. Unos filetes de caballa han sido
inseminados por inmersión en una solución ácida y salada que contiene una alta concentración de células de Lactococcus lactis productora de nisina. Después de secado, los filetes son conservados a 4ºC en unas bolsas. Los autores no
han podido comparar la evolución de la flora de alteración entre filetes inseminados y no inseminados puesto que las
técnicas de recuento clásicas no permiten separar la flora de alteración del fermento añadido en gran cantidad (Chen
Mei-Hui et al. “Processing of low-slated mackerel fillets using biopreservative”. Journal of The Fisheries Society of
Taiwan, vol. 24, nº 4, 1997 (1997-12), páginas 327-326).
Unas bacterias lácteas aisladas de pescado, que presentan actividades inhibidoras con respecto a la flora de alteración del pescado o de las cepas de Listeria monocitogenes ha constituido el objeto de diferentes estudios (Stoeffels
et al. 1992; Pilet et al. 1995; Leroi et al. 1996). Las cepas estudiadas están todas emparentadas al género Carnobacterium. Un cepa de Leuconostoc aislada de pescado ha mostrado también aptitudes para inhibir cepas de Listeria
monocitogenes (Jeppensen y Huss, 1993). Sin embargo, estas cepas crecen a 30ºC. Es por tanto imposible separar la
flora de alteración de la cepa en curso de análisis microbiológico de rutina.
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La solicitud internacional WO 00/60947 describe unas nuevas cepas de bacterias productoras de ácido láctico.
Estas bacterias lácteas son todas aisladas de productos lácteos y crecen a 30ºC. Ninguna de las bacterias implicadas altera los alimentos a unas temperaturas inferiores a 7ºC puesto que no se desarrollan a estas temperaturas. La
población bacteriana está dividida por 100 después de una o dos semanas de conservación. Las inhibiciones de los
gérmenes patógenos sólo tienen lugar a temperaturas superiores a 8ºC. Las mismas son debidas a la presencia de
ácidos, de dióxido de carbono y de bacteriocinos u otros. En consecuencia, estas bacterias lácteas presentan diversos
inconvenientes puesto que son incapaces de inhibir unos gérmenes indeseables a unas temperaturas inferiores a 8ºC
sin producir bacteriocino y que las mismas se desarrollan a 30ºC.
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Un objeto de la presente invención es proponer una nueva cepa de bacteria láctea apta para retardar el desarrollo de
malos olores sobre productos alimenticios refrigerados preferentemente acondicionados en una atmósfera controlada
o bajo vacío y para inhibir unos gérmenes próximos así como unos gérmenes patógenos para prolongar la duración de
conservación (DLC) de los productos alimenticios, en particular los productos del mar acondicionados.
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Otro objetivo de la invención es proponer una nueva cepa de bacteria láctea incapaz de desarrollarse a 30ºC de manera que permita el recuento de la flora de alteración de productos alimenticios en el marco de análisis microbiológicos
de rutina.
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A este fin, la presente invención proporciona una nueva cepa de bacterias lácteas, a saber Lactococcus lactis apropiada para una explotación en el campo de la conservación de los productos alimenticios, en particular de productos
del mar.
Una muestra de cultivo del microorganismo, de acuerdo con la invención, llamada cepa Lactococcus lactis LLO,
ha sido depositada el 11 de Septiembre de 2001 bajo el Tratado de Budapest en la colección nacional del cultivo de
microorganismos francesa (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux - 75724 PARIS CEDEX 15. La muestra ha
recibido el número CNCM I-2716.
De acuerdo con esta invención, los cultivos, biomasas obtenidas a partir de la cepa mencionada anteriormente
están también previstos. Evidentemente, esta invención incluye las cepas de Lactococcus lactis obtenidas a partir de
mutación, variación, recombinación de la cepa Lactotoccus lactis LLO y que presenta una temperatura de crecimiento comprendida entre 2ºC y 25ºC con una temperatura óptima de crecimiento próxima a 20ºC y una capacidad de
ralentización del desarrollo de la flora de alteración de productos alimenticios refrigerados.
Otro objeto de la invención se refiere a la utilización de cepas, cultivos, biomasas, de Lactococcus lactis LLO para
la conservación de productos alimenticios como agente retardante de la aparición de malos olores o que ralentiza el
desarrollo de la flora de alteración de productos alimenticios refrigerados y preferentemente acondicionados en una
atmósfera reducida de oxígeno.
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Otro objeto de la invención se refiere a una composición caracterizada porque contiene por lo menos la cepa
Lactococcus lactis LLO o una variante o un mutante de ésta.
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Otro objeto de la invención se refiere a una composición alimenticia para la conservación en estado refrigerado
de productos alimenticios, en particular de productos del mar, acondicionados preferentemente bajo una atmósfera
reducida de oxigeno, caracterizada porque comprende por lo menos Lactococcus lactis LLO o una variante o mutante
de ésta.
Otro objeto de la invención se refiere a un producto alimenticio conservado en estado refrigerado y preferentemente
acondicionado bajo una atmósfera reducida de oxigeno, caracterizado porque dicho producto presenta en su superficie
una barrera biológica constituida por lo menos por Lactococcus lactis LLO o una variante o mutante de ésta.
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Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de conservación en estado refrigerado de productos alimenticios, en particular de productos del mar, preferentemente acondicionados en la atmósfera reducida de oxigeno
antes del consumo, caracterizado porque consiste en poner en contacto el producto alimenticio a conservar y Lactococcus lactis previamente al acondicionamiento de dicho producto de manera que formen una barrera biológica en
superficie de dicho producto que ralentiza el desarrollo de malos olores y el crecimiento de la flora de alteración de
dicho producto.
La invención se comprenderá mejor con la lectura de la descripción siguiente de ejemplos de realización, con
referencia a la figura única anexa que representa, en forma de tres columnas, las migraciones de diferentes fragmentos
de restricción del ADN cromosómico de la cepa LLO.
La cepa Lactobacillus lactis LLO ha sido aislada a partir de filetes de pescadilla refrigerados conservados en
presencia de un contenido reducido de oxígeno.
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La cepa Lactococcus lactis LLO corresponde a la definición de una bacteria láctea. La misma se emparenta al
género Lactococcus especie Lactis. Su metabolismo en la leche o el caldo de pescado no produce ningún fenómeno
de alteración. La misma inhibe la flora de alteración de la pescadilla, del salmón y de los crustáceos.
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En el plano morfológico, las células de la cepa Lactococcus lactis LLO son ovoides, inmóviles. Las mismas
aparecen por pares o en cadenas.
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En lo que concierne sus características de cultivo, estas células son Gran positivo, catalasa negativa, oxidasa negativa. Las mismas no forman esporas. Son anaerobias facultativas y tienen un metabolismo fermentativo. La fermentación de la glucosa se acompaña de una ligera producción de gas. La cepa sin embargo homofermentativa. Pertenece al
género Lactococcus.
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La cepa no hidroliza la arginina, la urea o el almidón, no produce indol, ni hidrógeno sulfurado y no acidifica la
leche. La misma no reduce los nitratos, y es α hemolítica. Produce acetoina.
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La cepa es psicotrófica y se desarrolla entre 2 y 25ºC con un óptimo decrecimiento progresivo a 20ºC. Se cultiva
en los medios de cultivo siguientes: MRS pH 6,5, Elliker, M17, gelosa Trípticasa Soja a la sangre. La misma no crece
sobre medio gelosado de ROGOSA, ni a 30ºC. Se desarrolla sobre la carne de pescado o de crustáceos refrigeradas
sin aportar a la misma olor ni sabor alterado.
Ha sido realizado un antibiograma con la cepa LLO para estudiar su resistencia con respecto a algunos antibióticos.
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El test se ha realizado sobre el medio de Mueller Hinton que contiene 1,7% de agar y 5% de sangre caballo, el
pH es de 7,3. El espesor de la gelosa en las cajas de Petri es constante, el mismo es de 4 mm. Se trata de un medio
estandarizado según las normas O.M.S.
La cepa LLO es cultivada en un caldo MRS pH 6,5 durante 48 a 36 horas a 15ºC hasta obtención de la fase
estacionaria. El cultivo es diluido a 1/10 en un caldo Mueller Hinton. La concentración aproximada de la suspensión
es de 106 bacterias/ml.
Los medios gelosados son inundados completamente con 2 ml de la suspensión. El exceso de líquido es retirado y
las cajas son puestas a secar 10 minutos a temperatura ambiente. Los discos antibióticos son depositados con la ayuda
de una pinza (4 máximo). Las cajas son incubadas a temperatura ambiente durante 48 horas.
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Los resultados son los que siguen:
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Una identificación genética has sido realizada por electroforesis en campo pulsado después de digestión del genoma
por un encima de restricción de sitios raros.
El modo operativo es el siguiente:
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La biomasa bacteriana que proviene de 10 ml de cultivo (48 horas en medio MRS, 18ºC) es recuperada por centrifugación (10 mn a 4.000 g). El residuo celular es tomado de nuevo en 10 ml de tampón TE (tris 10 mM, EDTA 1
mM, pH7,5) después homogeneizado al vórtex. La D0600 es a continuación tomada. Se centrifuga (10 mn a 4000 g)
y se toma de nuevo el residuo en DO600/o,7 ml de tampón T100E (Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 7,5). Se mezcla
V/V la suspensión celular con una gelosa LMP (de bajo punto de fusión) en fusión (2% en TE). Se deja enfriar a 4ºC
y se corta los plugs de 1 mm de espesor. Se incuban 4 horas a 37ºC en 3 ml de tampón T100E que contiene 2 mg/ml
de lisozima. Se retira a continuación la mezcla de reacción. Se incuba 16 horas a 37ºC en 3 ml de tampón TESP (tris
10 mM; EDTA 0,5 M; Sarkosyl 10% pH 7,5) que contiene 3 mg de pronasa. Después de incubación, se lavan 6 veces
los plugs con 10 ml de tampón TE (30 mn cada lavado) y después se deja digerir 4 horas por el encima de restricción
en las condiciones siguientes: volumen total 120 µl, 30U de enzima, 1,2 µl de BSA y 1/10 de tampón preconizado por
el fabricante OZYME.
Después de digestión, se lava el plug en tampón TE (20 mn) y después se carga el gel de migración.
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El aparato utilizado es un GeneLine (Beckman)
La enzima utilizada es Apa I.
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Tres condiciones de migración son aplicadas a fin de separar en las mejores condiciones los diferentes fragmentos
de restricción obtenidos. Los resultados están proporcionados en la figura única.
La primera columna corresponde a 10s de pulso durante 16 horas para identificar los fragmentos grandes.
La segunda columna corresponde a 7 s de pulso durante 16 horas para identificar los fragmentos intermedios.
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La tercera columna corresponde a 2 s de pulso durante 7 horas y después 4 s de pulso durante 4 horas para
identificar los fragmentos pequeños.
El tampón de migración es TBE 0,25 X y la temperatura es de 12ºC.
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Los resultados están representados en la figura única.
Los efectos inhibidores de la cepa LLO han sido buscados en caja de Petri por la técnica de dobles cepas.
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Las cepas indicadoras han sido cultivadas durante 24 a 48 horas a 30ºC en caldo M17 o MRS para las bacterias lácteas y en caldo nutritivo para las no lácteas, antes de ser inseminadas en el mismo medio que contiene
1% de agar. La concentración final de cepa indicadora es del orden de 107 CFU/ml. Esta gelosa mantenida en sobrefusión a 46ºC es vertida en caja de Petri sobre una gelosa idéntica que contiene 1,2% de agar previamente enfriada. Después de gelidificación de la segunda capa, una gota del residuo de la cepa “O” cultivada en caldo M17
a 20ºC durante 3 días y lavada con agua fisiológica es depositada sobre cada gelosa. Las cajas son incubadas a
30ºC.
La escala de sensibilidad de las cepas indicativas con respecto a la cepa LLO establecida tal como sigue:
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Ausencia de halo: Halo de 1 mm alrededor del depósito: +
Halo de 2 a 3 mm alrededor del depósito: ++
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Los resultados obtenidos son proporcionados en la tabla siguiente:
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La cepa LLO está inhibida por la cepa Lactococcus lactis ATCC 11454 productora de nisina.
Unas experiencias de inseminación de filetes de pescadilla conservados en aerobio han sido realizados con la cepa
Lactococcus lactis LLO. Estas experiencias se describen a continuación:
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Unos filetes de pescadilla han sido comprados a un pescadero. Los filetes testigos son guardados en una bolsa y
conservados en el refrigerador a 5ºC. Los filetes de ensayo son inseminados con la cepa LLO por pulverización de la
cepa LLO en suspensión en agua fisiológica antes de ser guardados en una segunda bolsa y conservados a 5ºC. Sobre
estos dos tipos de filetes se efectúan unos análisis sensoriales y unos análisis microbiológicos. Los análisis sensoriales
son realizados a partir de la muestra testigo y ensayo.
El olor y el sabor después de cocción de cada muestra son notados según una escala de notas tal como sigue:
0
Pútrido
1-2
Muy malo
3-4
Malo
5-6
Aceptable
7-8
Satisfactorio
9-10
Muy satisfactorio
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Los análisis microbiológicos se efectúan en particular por recuento de los gérmenes mesófilos aerobios. Los recuentos son realizados a partir de una extracción de 10 g de carne puesta en suspensión en 90 ml de agua fisiológica
estéril y homogeneizados durante 3 minutos. Esta suspensión es considerada como la suspensión madre.
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Los recuentos de los gérmenes mesófilos aerobios que cultivan a 30ºC en 3 días son realizados a partir de diluciones
al décimo de la suspensión madre utilizando la técnica de recuento en profundidad. El medio de cultivo es la gelosa
PCA, gelosa ordinaria para el recuento en microbiología alimenticia.
5
La cepa LLO es recontada sobre gelosa MRS pH 6,5 utilizando la técnica de recuento en profundidad, las cajas
son incubadas 5 días a 15ºC.
Los resultados obtenidos son los que siguen:
10
En lo que contienen las pruebas organolépticas, la tabla anterior proporciona los resultados:
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En lo que concierne a los recuentos, la tabla siguiente reproduce los resultados obtenidos:
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Las experiencias realizadas permiten constatar que los productos alimenticios inseminados con la cepa Lactococcus
lactis LLO son siempre de mejor calidad organoláptica que los testigos. Se constata en particular una gran disminución
de los olores de amoníaco o de H2 S que permiten un aumento de la duración de conservación de productos alimenticios
tratados. El consumo regular de productos alimenticios inseminados no genera ningún desorden digestivo ni fenómeno
de alergia. Se constata también que el desarrollo de la flora banal es retardado.
Los resultados obtenidos permiten por tanto concluir que la posibilidad de utilizar una composición que comprende
la cepa Lactococcus lactis LLO o una variante o un mutante de ésta como composición alimenticia para la conservación en estado refrigerado de productos alimenticios. Por refrigeración, se entienden unos productos alimenticios
conservados en una zona de temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y 12ºC. A la inversa, se constata que esta cepa no se desarrolla a una temperatura de 30ºC. Esto permite un recuento de la flora de los productos
alimenticios en el marco de análisis microbiológicos de rutina.
Se constata también que el efecto de esta cepa es aumentado cuando es aplicada sobre unos productos alimenticios
conservados en una atmósfera reducida de oxígeno.
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Unas experiencias han sido así realizadas sobre salmón fresco escocés (salmo salar), que proviene de unan granja
de cría en las islas Shetland, es viscerado y puesto en hielo durante 4 días antes del tratamiento. Este salmón es
fileteado con la piel. Uno de los filetes sirve de testigo, el otro de ensayo.
En lo que concierne a la preparación de un testigo, un filete de salmón fresco testigo es cortado en ocho porciones
de 100 a 200 g después embalado en unas bolsas individuales y puesto bajo vacío antes de ser almacenado en una
cámara fría entre 2 y 4ºC.
La muestra ensayo es preparada de la misma manera con excepción del hecho de que comprende entre la etapa de
cortado y la etapa de embalaje una etapa de inseminación por pulverización con la cepa LLO en suspensión en agua
fisiológica.
Sobre la base de estas dos muestras se han efectuado por una parte unos análisis sensoriales, por otra parte unos
exámenes microbiológicos. Los análisis sensoriales se han realizado a partir de una muestra de testigo y ensayo.
El color de la carne es controlado visualmente. Después de apertura de las bolsas, el olor es anotado según una
escala de notas. Si es necesario, la muestra es cocida en agua agitada durante algunos minutos antes de ser de nuevo
anotado.
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La escala de notas se establece tal como sigue:
5
0
Pútrido
1-2
Muy malo
3-4
Malo
5-6
Aceptable
7-8
Satisfactorio
9-10
Muy satisfactorio
10
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En lo que concierne a los exámenes microbiológicos, el pH es medido en diferentes puntos de las muestras. El
valor considerado es una mediana de 3 mediciones. Los recuentos son realizados a partir de una extracción de 10 g de
carne puesta en suspensión en 90 ml de agua fisiológica estéril y homogeneizados durante 3 minutos. Esta suspensión
es considerada como la suspensión madre.
20
Los recuentos de los gérmenes mesófilos aerobios que cultivan a 30ºC en 3 días son realizados a partir de diluciones
al décimo de la suspensión madre utilizando la técnica de recuento en profundidad. El medio de cultivo es la gelosa
PCA, gelosa ordinaria para el recuento en microbiología alimenticia.
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La cepa LLO es recontada sobre gelosa MRS pH 6,5 utilizando la técnica de recuento en profundidad, las cajas
son incubadas 5 días a 15ºC.
Los resultados obtenidos son los que siguen:
En lo que concierne a los tests organolépticos, la tabla siguiente proporciona los resultados:
30
35
40
En lo que concierne a las variaciones del pH, la tabla siguiente reproduce los resultados obtenidos:
45
50
En lo que concierne a los recuentos, la tabla siguiente proporciona los resultados obtenidos:
55
60
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Los resultados muestran claramente que no existe ninguna diferencia significativa entre el pH de los testigos y de
los productos tratados. A la inversa, las cualidades organolépticas de los productos así como el desarrollo de la flora
banal presentan unos resultados positivos comparados con las muestras testigo.
5
Otros ensayos han sido realizados sobre unas gambas de cría descabezadas y congeladas. Estas gambas son puestas
a descongelar en agua tibia durante 5 minutos, antes de ser cocidas en agua hirviente salada con 20 g/l durante 1 minuto.
Después de un rápido enfriado bajo agua corriente, las gambas son sumergidas en un baño helado de agua salada con
20 g/l.
10
Las gambas “testigo” son embaladas por lotes de diez en unas barquillas bajo atmósfera modificada. Las gambas
“ensayo” son previamente inseminadas con la cepa LLO por pulverización de la cepa LLO en suspensión en agua
fisiológica. Las mismas son a continuación embaladas por lotes de diez en unas barquillas bajo atmósfera modificada
y conservadas a 4ºC.
15
Unos análisis sensoriales son realizados a partir de una muestra “testigo” y “ensayo”. El color de la carne es
controlado visualmente. Después de apertura de las bolsas, el sabor es anotado según una escala de notas idéntica a la
proporcionada para el ejemplo del salmón anterior.
20
Unos recuentos son realizados a partir de una extracción de 10 g de gambas puestos en suspensión en 90 ml de agua
fisiológica estéril y homogeneizados durante 3 minutos. Esta suspensión es considerada como la suspensión madre.
Los recuentos de gérmenes mesófilos, aerobios que se cultivan a 30ºC en 3 días, son realizados a partir de diluciones
al décimo de la suspensión madre utilizando la técnica de recuento en profundidad. El medio de cultivo es la gelosa
PCA, gelosa ordinaria para el recuento en microbiología alimenticia.
25
La cepa LLO es recontada sobre gelosa MRS pH 6,5 utilizando la técnica del recuento en profundidad, las cajas
son incubadas 5 días a 15ºC.
En lo que concierne a los tests organolépticos, la tabla siguiente proporciona los resultados.
30
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En lo que concierne a los recuentos, la tabla siguiente proporciona los resultados obtenidos:
45
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Es por tanto posible prever una aplicación industrial de esta cepa en el marco del procedimiento de conservación de
productos alimenticios refrigerados. El procedimiento consistirá entonces en poner en contacto el producto alimenticio
a conservar y la cepa de Lactococcus lactis LLO previamente al acondicionamiento del producto de manera que forme
una barrera biológica en superficie del producto que ralentiza el desarrollo de malos olores y el crecimiento de la flora
de alteración del producto. Evidentemente, esta puesta en contacto deberá efectuarse después de cualquier tratamiento
del producto, en particular si éste último debe sufrir un tratamiento térmico. La puesta en contacto podrá efectuarse
por inoculación del producto alimenticio a conservar con aproximadamente 105 -107 células que permanecen viables
de Lactococcus lactis LLO por gramo de producto a conservar. Diversos procedimientos de inoculación pueden ser
previstos según la forma de presentación de la cepa. Así, la cepa de Lactococcus lactis LLO puede estar en forma
liofilizada. Esta cepa Lactococcus lactis LL, puede también presentarse en forma de una suspensión. La inseminación
del alimento puede efectuarse tanto por pulverización de un polvo que incorpora la cepa Lactococcus lactis LLO, o
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por pulverización de una suspensión celular que incorpora la cepa citada, o por inmersión del alimento en un baño que
contiene la cepa. La cepa podrás ser utilizada sola o en mezcla con un soporte.
Esta cepa posee por tanto las propiedades:
5
- de desarrollarse sobre los productos del mar, tales como pescados, crustáceos u otros, a las temperaturas de
refrigeración,
- de no alterar el alimento,
10
- permitir, en ciertas condiciones, ralentizar el desarrollo de la flora banal de alteración del alimento y de inhibir
ciertos patógenos,
- de retrasar la aparición de olores indeseables, tales como olores de amoníaco o H2 S.
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Su eficacia está incrementada cuando el alimento es embalado al vacío, bajo atmósfera modificada o cualquier otro
acondicionamiento que reduzca la presencia de oxigeno.
La misma no se desarrolla a 30ºC y puede ser recontada en un análisis microbiológico alimenticio corriente.
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REIVINDICACIONES
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1. Cepa de Lactococcus lactis llamada cepa Lactococcus lactis LLO y depositada en la CNCM bajo el número de
acceso CNCM I-2716.
2. Cualquier cepa de Lactococcus lactis de acuerdo con la reivindicación 1 u obtenida por mutación, variación,
recombinación de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque presenta una temperatura de
crecimiento comprendida entre 2ºC y 25ºC con una temperatura óptima de crecimiento próxima a 20ºC y una capacidad
de ralentización del desarrollo de la flora de alteración de productos alimenticios refrigerados.
3. Cultivos, biomasas obtenidas a partir de cepas de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2.
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4. Composición, caracterizada porque comprende por lo menos la cepa Lactococcus lactis LLO o una variante o
un mutante de ésta de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2.
5. Composición según la reivindicación 4, caracterizada porque la cepa Lactococcus lactis LLO está en forma
liofilizada.
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6. Composición según la reivindicación 4, caracterizada porque la cepa Lactococcus lactis LLO está en forma de
una suspensión.
7. Composición alimenticia para la conservación en estado refrigerado de productos alimenticios, en particular
de productos del mar, acondicionados preferentemente bajo atmósfera reducida de oxigeno, caracterizada porque
comprende la cepa Lactococcus lactis LLO o una variante o un mutante de ésta según una de las reivindicaciones 1 y
2 en particular como agente activo que retarda la aparición de malos olores y/o el desarrollo de bacterias patógenas o
no.
8. Producto alimenticio conservado en estado refrigerado y acondicionado preferentemente bajo atmósfera reducida de oxigeno, caracterizado porque dicho producto presenta en su superficie una barrera biológica constituida por
lo menos por Lactococcus lactis LLO o una variante o un mutante de ésta de acuerda con una de las reivindicaciones
1 y 2.
9. Utilización de cepas, cultivos, biomasas, de Lactococcus lactis LLO de acuerdo con una de las reivindicaciones
1 a 3, como agente retardante de la aparición de malos olores sobre unos productos alimenticios conservados en estado
refrigerado y acondicionados preferentemente bajo atmósfera reducida de oxigeno.
10. Utilización de cepas, cultivos, biomasas, de Lactococcus lactis LLO de acuerdo con una de las reivindicaciones
1 a 3, como agente ralentizante del desarrollo de la flora de alteración de los productos alimenticios refrigerados y
acondicionados preferentemente bajo atmósfera reducida de oxigeno.
11. Procedimiento de conservación en estado refrigerado de productos alimenticios, en particular de productos
del mar, acondicionados en una atmósfera reducida de oxigeno antes del consumo, caracterizado porque consiste en
poner en contacto el producto alimenticio a conservar y Lactococcus lactis LLO de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2 previamente al acondicionamiento de dicho producto de manera que forme por lo menos una barrera
biológica en superficie de dicho producto que ralentiza el desarrollo de malos olores y el crecimiento de la flora de
alteración de dicho producto.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se pone en contacto el producto alimenticio
a conservar y Lactococcus lactis LLO por inoculación del producto a conservar con aproximadamente 105 -107 células
que permanecen viables de Lactococcus lactis LLO por gramo de producto a conservar.
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ES 2 280 616 T3
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