Test de captura de híbridos (HC2 Digene, Qiagen)

TEST DE CAPTURA DE HIBRIDOS
(HC2 Digene, Qiagen)
Belén Lloveras
Hospital del Mar
Institut Català d’Oncologia
Barcelona
TEST DE CAPTURA DE HIBRIDOS
(HC 2)
•
•
•
•
Aspectos técnicos
Estudios realizados con HC2
Experiencia propia
Discusión
FDA Approves Expanded Use of HPV Test
The Food and Drug Administration (FDA) today approved expanded use of a laboratory test to detect the presence
in women of human papillomavirus (HPV), one of the most common sexually transmitted infections.
There are more than 100 types of HPVs. The test, the HC2 High-Risk HPV DNA Test, manufactured by Digene
Corp., of Gaithersburg, Md., can identify 13 of the high-risk types associated with the development of cervical
cancer. The HPV DNA test does not test for cancer, but for the HPV viruses that can cause cell changes in the
cervix. If left untreated, these changes can eventually lead to cancer in some women.
FDA initially approved the HPV DNA test in March 2000 for testing women who had abnormal Pap test results to
determine whether they needed to be referred for further examination. The new indication allows the test to be used
for screening, in conjunction with the Pap test, of women over age 30 for HPV infection. It should be used along
with the Pap test, a complete medical history and an evaluation of other risk factors to help physicians determine
what kind of follow-up is necessary.
“Knowing whether or not a woman is infected with high-risk HPV is added information that will help physicians
detect and treat early cell changes that might eventually lead to cervical cancer,” said FDA Commissioner Mark B.
McClellan, M.D., Ph.D. “FDA is committed to bringing safe and effective new technologies to the market quickly.”
Up to 20 percent of the sexually active U.S. population is believed to be infected with HPV at any one time. Most
women who become infected with HPV are able to eradicate the virus and suffer no apparent long-term
consequences to their health. But a few women develop a persistent infection that can eventually lead to precancerous changes in the cervix.
The HPV DNA test, like the Pap test, is performed by collecting cells from the cervix and then sending them to a
laboratory for analysis. The test detects high-risk types of HPV in cell DNA even before there are any conclusive
visible changes to the cervical cells.
Women who have normal Pap test results and no HPV infection are at very low risk (0.2%) for developing cervical
cancer. Women who have an abnormal Pap test and a positive HPV test are at higher risk (6%-7% or greater) of
developing cervical cancer if not treated.
FDA approved the expanded use of the test based on published literature describing studies of a cross section of
women with normal and abnormal Pap test results who tested positive or negative for high -risk types of HPV. FDA
also took into account additional input from professional societies, FDA advisory panel members and other
interested parties in arriving at a decision.
The HPV DNA test is not intended to substitute for regular Pap screening. Nor is it intended to screen women under
30 who have normal Pap tests. Although the rate of HPV infection in this group is high, most infections are short-
HC2
VPH
VPH
PHYLOGENETIC CLASSIFICATION
EPIDEMIOLOGIC CLASSIFICATION
HIGH RISK
HIGH RISK
LOW RISK
16, 18, 31, 33, 35,
70
39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 68, 82, 26,
53, 66
LOW RISK
73
6, 11, 40, 42, 43, 44
54, 61, 72, 81, CP6108
Muñoz et al. New Engl J Med 2003;348:518-27
PHYLOGENETIC CLASSIFICATION
EPIDEMIOLOGIC CLASSIFICATION
HIGH RISK
HIGH RISK
LOW RISK
16, 18, 31, 33, 35,
70
39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 68, 82, 26,
53, 66
LOW RISK
73
6, 11, 40, 42, 43, 44
54, 61, 72, 81, CP6108
Muñoz et al. New Engl J Med 2003;348:518-27
FIG. 1. Schematic representation of the locations of the different general primer sets (MY
09/11, GP51/61, and SPF) on the HPV genome. The circular HPV DNA genome is represented
by a single line, and boxes show the positions of the various early (E) and late (L) genes.
Within the L1 region, the positions of the amplification targets as well as the expected
amplimer sizes for each of the primer sets are indicated.
CAPTURA DE HIBRIDOS
HC2 DIGENE
Ac anti-hibrido + PA
Sonda RNA
DNA-HPV
Ac anti-hibrido
Sustrato
luminiscente
Desnaturalización
?
Hibridación
?
Captura
?
Ac + PA
?
Sustrato
?
Reacción qluminiscente
RLU/CO > 1 = POSITIVO
? Lectura
5 SONDAS HPV BAJO RIESGO (A) : 6 / 11 / 42 / 43 / 44
13 SONDAS HPV ALTO RIESGO (B) : 16 / 18 / 31/ 33 / 35 / 39 / 45 / 51 / 52 / 56 / 58 / 59 / 68
LAVADOR DE PLACAS DIGENE
PROCESO DEL HC2
LUMINOMETRO
DIGENE
LAVADO
Y DETECCIÓN
PROCESAMIENTO DE DATOS
INFORME DE RESULTADOS
INFORME DE RESULTADOS
Tablas
N = 124
REPRODUCIBILIDAD INTRALABORATORIO 93.5 %
HC2
• Reproducibilidad
• Formato kit
• Fácil introducción en laboratorios de
citología
• Estudios clínicos
APLICACIONES DIAGNOSTICAS DEL
TEST DE HPV
CRIBADO
SELECCIÓN DE ASC-US (TRIAGE)
SEGUIMIENTO POST-TRATAMIENTO
CONTROL DE CALIDAD
Comparison of three management strategies for
patients with atypical squamous cells of
undetermined significance: Baseline results
from a randomized trial.
D.Solomon, M. Schiffman, R.Tarone.
JNCI 2001;93:293-9
ASCUS LSIL TRIAGE STUDY
(National Cancer Institute, Bethesda)
• 2.000.000 ASCUS / año en U.S.A.
• ALTS (nov 96 ? dic 98):
– estudio randomizado y multicentrico (4)
– objetivo: comparar la sensibilidad y
especificidad de 3 estrategias:
1. Colposcopia / Biopsia
2. HPV-HC2 + citologia líquida :
HPV+ ? Colposcopia
Cito=HSIL ? Colposcopia
3. Repetición de la citologia
ALTS: RESULTADOS
Análisis de 3488 mujeres con ASCUS:
• Colposcopia
1163
100 % colposcopia
• HPV-HC2 + citol líq
1161
56 % colposcopia
• Repetición citologia
8 % colposcopia
LSIL n=1572
1164
ALTS: RESULTADOS
Los datos de la colposcopia inmediata definen la
prevalencia de enfermedad:
25.4 % Normal (sin biopsia)
46.9 % Normal (con biopsia)
1.7 % Atipia
14.5 % CIN 1
6.3 % CIN 2
11.4 % HSIL
5.1 % CIN 3
72.3 %
ALTS: RESULTADOS
CITOLOGIA vs. HPV
Resultados HPV (HC2)
Citologia
Missing
Neg
ASCUS
LSIL
HSIL-CIN 2
HSIL-CIN 3
Total
Neg
9
934
541
67
7
0
Miss
3
73
38
38
9
3
Pos
6
453
555
525
191
36
Total
18
1460
1134
630
207
39
1558
164
1766
3488
ALTS: RESULTADOS
HISTOLOGIA
QC Hist
Colposc
HPV triage
Neg
Atipia esc
CIN 1
CIN 2
CIN 3
539
20
167
72
59 131
237
10
111
59
77
Total
857
494
Conservador
136
19
2
16
12
44
93
56
ALTS: RESULTADOS
HISTOLOGIA
QC Hist
Colposc
HPV triage
Neg
Atipia esc
CIN 1
CIN 2
CIN 3
539
20
167
72
59 131
237
10
111
59
77
Total
857
494
? 42%
Conservador
136
19
2
16
12
44
93
56
1992-2002: 15 estudios con 5454 mujeres seguidas por ASCUS
con citologia, test VPH, colposcopia y biopsia
HPV test (cualquier)
HPV (HC2)
Repetición citol
Sens*
Espec*
84.4%
94.8%
81.8%
72.9%
67.3%
57.6%
* para CIN2 +
34%
24295
381
10%
2.7%
Kjaer et al. Cancer Res 2006
20-29 años
N= 8656
40-50 años
N= 1578
Kjaer et al. 2006
Kjaer et al. 2006
Riesgo absoluto de desarrollar CIN3 + en mujeres jóvenes (<30) con citologia
normal y dos tests de HPV en un intervalo de 2 años.
Cancer treatment reviews 2004
The results of this overview suggest that there might be a role for a HPV
DNA test at the follow up period. Actually, the sensitivity of HPV testing in
primary diagnosis of CIN seems to be similar to that in prediction of treatment
failure.
Some treatment failures may have a negative HPV test in the presence of an
abnormal cytology. Therefore a combined cytological evaluation together
with a HPV test may increase the safety of the follow up surveillance.
This is the case in one study,where the sensitivity of HPV testing in the first
postoperative visit was 44.7%, the corresponding sensitivity of cytology was
46.8% but HPV testing was positive in 11 cases with a negative smear at this
visit giving a combined sensitivity of 70.2%.
EL VPH COMO FACTOR PREDICTIVO DE PERSISTENCIA/RECIDIVA
TRAS CONIZACION CERVICAL POR LESION ESCAMOSA
INTRAEPITELIAL DE ALTO GRADO (H-SIL)
ME FERNANDEZ MONTOLI, B LLOVERAS Y COL. AEPCC 2008
• 311 pacientes sometidas a conización cervical con asa
diatérmica desde enero de 1996 a diciembre de 2006.
• criterio de inclusión el diagnóstico histológico de CIN 2-3
en la conización.
• HPV-AR pre y post conización, a los 6 meses de la
intervención mediante HC2.
• Se valoran: edad, el estado inmunológico, el resultado
anatomopatológico (número de cuadrantes, afectación de
márgenes), HPV-AR y carga viral pre y post conización.
EL VPH COMO FACTOR PREDICTIVO DE PERSISTENCIA/RECIDIVA
TRAS CONIZACION CERVICAL POR LESION ESCAMOSA
INTRAEPITELIAL DE ALTO GRADO (H-SIL)
ME FERNANDEZ MONTOLI, B LLOVERAS Y COL. AEPCC 2008
Las variables categóricas se comparan mediante test de ?2, y
las continuas mediante T test y test de Mann–Whitney. El
grado de asociación entre las variables y el riesgo de
persistencia/recidiva se mide mediante regresión logística.
Los modelos se ajustan por edad en el momento de la
conización
EL VPH COMO FACTOR PREDICTIVO DE PERSISTENCIA/RECIDIVA
TRAS CONIZACION CERVICAL POR LESION ESCAMOSA
INTRAEPITELIAL DE ALTO GRADO (H-SIL)
ME FERNANDEZ MONTOLI, B LLOVERAS Y COL. AEPCC 2008
• La frecuencia global de persistencia/recidiva es del 25%.
• Si se considera el estado inmunológico, la prevalencia es
del 19% en pacientes no inmunodeprimidas y del 62% en
pacientes inmunodeprimidas (Infección por VIH, trasplante de
órganos).
• La mujeres inmunodeprimidas tienen un riesgo 5.58 veces
superior de presentar enfermedad residual/recidiva al de las
que no lo son (P<0.001, OR (IC:95%) = 5.58 ( 2.03-15.3)
EL VPH COMO FACTOR PREDICTIVO DE PERSISTENCIA/RECIDIVA
TRAS CONIZACION CERVICAL POR LESION ESCAMOSA
INTRAEPITELIAL DE ALTO GRADO (H-SIL)
ME FERNANDEZ MONTOLI, B LLOVERAS Y COL. AEPCC 2008
• La positividad de HPV-AR post conización incrementa el
riesgo de persistencia/recidiva 17.56 veces (P=0.06, OR (IC
95%) (1.51-10.95)
• Los casos con persistencia/recidiva presentan una carga
viral significativamente superior (P<0.001). No hay diferencias
en los valores de carga viral previa al cono entre pacientes
con o sin enfermedad residual
HPV-AR post conización y enfermedad
residual
enfermedad residual
% casos
100
50
0
HPV-
HPV+
No Persistencia Persistencia
EL VPH COMO FACTOR PREDICTIVO DE PERSISTENCIA/RECIDIVA
TRAS CONIZACION CERVICAL POR LESION ESCAMOSA
INTRAEPITELIAL DE ALTO GRADO (H-SIL)
ME FERNANDEZ MONTOLI, B LLOVERAS Y COL. AEPCC 2008
• La afectación del margen endocervical de la pieza de
conización se asocia a riesgo de persistencia 5.03 veces
superior al de los casos no afectos (P=0.004, OR (IC 95%) =
5.03 (1.68-15.03)
• Una edad superior a 35 años aumenta el riesgo de
persistencia 2.38 veces, pero con resultado cercano a
significación (P=0.59).
• No se han observado diferencias significativas en el
número de cuadrantes afectos en el espécimen de
conización ni en HPV-AR o carga viral pre-conización.
CITOLOGIA LIQUIDA + HC2
ASC-US
CRIBADO
CRIBADO
=ASC-US
N = 1000
N = 250
NORMAL
N = 125
TEST HPV
HOSPITAL
citol
CITOLOGIA
COLPOSCOPIA /BIOPSIA
TEST HPV
N = 125
TEST DE VPH EN EL CONTROL DE
CALIDAD EN CITOLOGIA
CITOLOGIA NEGATIVA / VPH +
REVISIÓN DE LA CITOLOGIA
DONDE SE ESCONDE EL
VPH??
CITOLOGIA NEGATIVA I VPH +
HUB 2002
MATERIAL
77 citologias (74 pacientes)
32 biopsias (41.5%)
RESULTADOS
ASC-US
ASC-H
LSIL
12 (15%)
1 (1.2%)
2 (2.4%)
ASC-H
ASC-H
ASC-US
CIN I
CAPTURA DE HIBRIDOS (HC2)
VENTAJAS:
• Formato de kit
• Reproducible
•Sensibilidad “clínica” adecuada
• Posibilidad de automatizar
LIMITACIONES:
• No tipifica
• Elevado nº muestras
CAPTURA DE HIBRIDOS (HC2)
APLICACIONES
• ASCUS
• CRIBADO
• SEGUIMIENTO POST TRATAMIENTO
• CONTROL DE CALIDAD
HPV
HPV
HPV
HPV
HPV
HPV
Esto no es un coilocito
Esto no es un coilocito