Sistema de Revisiones en Investigación Veterinaria de San Marcos Efectos patológicos de las especies reactivas de oxígeno en espermatozoides UPG Veterinaria REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Medicina Veterinaria Agosto 2014 TABLA DE CONTENIDO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 2 FORMACIÓN DE LA ROS ...................................................................................... 3 ANTIOXIDANTES PRESENTES EN EL PLASMA SEMINAL ............................ 5 ESTRÉS OXIDATIVO .............................................................................................. 6 DAÑO ESPERMÁTICO PRODUCIDO POR EL ESTRÉS OXIDATIVO .............. 7 PEROXIDACIÓN LIPÍDICA .................................................................................... 9 DAÑO DE ADN ...................................................................................................... 10 CONCLUSIÓN ........................................................................................................ 10 LITERATURA CITADA ......................................................................................... 11 Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 1 EFECTOS PATOLÓGICOS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN ESPERMATOZOIDES Shirley Sujey Evangelista Vargas [email protected] 1. INTRODUCCIÓN El primer ROS que se produce en la Las especies reactivas de oxígeno o mitocondria espermática es el O2-, el cual (reactive son primero se oxida y luego se reduce compuestos que se producen durante el convirtiéndose en H2O2. A su vez el H2O2 proceso de respiración aeróbica en la primero se oxida y luego se reduce mitocondria espermática como parte de la convirtiéndose en radical hidroxilo (OH•), el reducción del oxígeno (Makker et al., 2009). cual es el ROS más reactivo (Koppers et al., Su gran reactividad se debe a que poseen 2008). ROS electrones oxygen desapareados species), que les hace El daño oxidativo se produce cuando reaccionar con otras moléculas orgánicas en ocurre un desequilibrio entre la producción y procesos de óxido-reducción. degradación de las ROS. Este daño oxidativo Las ROS se subdividen en dos tipos: se puede dar por dos causas: por una los radicales libres y los no radicales. Siendo deficiencia del sistema antioxidante o un los radicales libres el anión superóxido (O2-) incremento en la formación de ROS (Aitken y el radical hidroxilo (OH•). Mientras que el y Fisher, 1994). Estas moléculas son principal no radical es el peróxido de sumamente reactivas e intervienen en la hidrógeno (H2O2) (Aitken y Fisher, 1994). fisiopatología de la muerte celular y su Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 2 principal mecanismo de citotoxicidad es la correlacionados con niveles elevados de peroxidación lipídica de las membranas ROS en el mismo. También se ha observado celulares (Jones et al., 1979). A su vez los que existe un incremento en la producción ROS también causan degradación proteica de (Koppers et al., 2008), disminución de la congelamiento, lo cual genera trabas en la motilidad implementación (Wang fragmentación del et al., ADN 1997) y espermático ROS durante de el esta proceso de biotecnología reproductiva en algunas especies. (Kasimanickam et al., 2006; Lukanov et al., Actualmente se vienen desarrollando 2009). Estos daños son provocados por el diversos estudios enfocados en determinar malondialdehído, el cual es uno de los cuáles son los niveles tolerables de ROS que productos finales de la peroxidación lipídica no afectan la viabilidad espermática y y que tiene capacidad altamente mutagénica estrategias (Marnett, 1999). antioxidantes como agentes que previenen o En la actualidad existen diversos que implican el uso de disminuyen el estrés oxidativo. estudios sobre la producción de ROS y su efecto sobre los espermatozoides. Ya que se 2. FORMACIÓN DE LA ROS ha demostrado que los espermatozoides son En primer lugar debemos recordar sumamente sensibles a los niveles elevados que por definición, un radical libre es de podido cualquier átomo con al menos un electrón determinar tanto en animales domésticos, desapareado en la capa más externa, el cual animales de laboratorio y en el hombre, que es capaz de una existencia independiente. Un los porcentajes elevados de espermatozoides radical libre se forma fácilmente cuando se anormales están rompe un enlace covalente entre moléculas y Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 3 ROS. Así en mismo, se ha eyaculados un electrón queda con cada átomo recién O2 formado (Buonocore et al., 2010). Los autooxidación en la mitocondria, producto radicales libres son altamente reactivos e de estas reacciones se produce la reducción inestables, sólo logran volverse estables de un electrón formando O2-. Por más que el cuando O2- es poco reactivo, puede liberar Fe2+ de sustraen electrones de lípidos, pasa por una serie de reacciones de proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o proteínas cualquier molécula cercana, causando de Chang, 2011). Posteriormente el O2- puede este modo una cascada de daños. Hay dos pasar por dismutación y formar H2O2 tipos principales de especies de radicales espontáneamente o por catálisis enzimática libres: las ROS y las especies reactivas de por intermedio de la superoxido dismutasa. nitrógeno (Buonocore et al., 2010). También es un precursor para la formación Las ROS contienen dos electrones no apareados en la capa exterior. Como se ferrosulfuradas (Dickinson y de OH• catalizado por metales a través de la reacción de Fenton. mencionó anteriormente, los ROS más El H2O2 es el estado de reducción de comunes son: el anión superóxido (O2-), el dos electrones del O2, formado por la radical hidroxilo (OH•) y el peróxido de dismutación de O2- o por reducción directa hidrógeno (H2O2) (Dickinson y Chang, de O2. El H2O2 es soluble en lípidos y por 2011). ende capaz de difundir por membranas Dentro de la mitocondria (Buonocore et al., 2010). continuamente se está formando el O2-. La El OH• posee una vida media corta tasa de formación del mismo depende de la de alrededor de 10-9 segundos. El OH• es el cantidad de oxígeno (O2) que fluye a través estado de reducción de tres electrones del de las mitocondrias en un momento dado. El O2. El OH• es virtualmente eliminado en el Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 4 mismo sitio de la formación, ya que fluorescentes específicas para ambas ROS. interactúa con la primera molécula que se El diacetato de diclorodihidrofluoresceina encuentra. (DCFH-DA) es una sonda fluorescente Es extremadamente reactivo, ataca componentes por ello inestable la celulares considerado y mayoría y altamente de puede los específica para H2O2, diclorodihidrofluoresceina La (DCFH) es dañar oxidada por el H2O2 intracelular en cualquier tipo de célula (Buonocore et al., diclorofluoresceina (DCF) que se une al 2010). El radical hidroxilo se produce ADN y emite una fluorescencia verde. principalmente cuando hay un exceso de Mientras que el dihidro de etidio (DHE) es producción de anión superóxido y peróxido una sonda específica para O2-, el cual lo de hidrógeno en la reacción de Habere- oxida en bromuro de etidio que se une al Weiss: ADN y emite una fluorescencia roja. Es entonces, Así mismo una gran parte de OH• proviene de la descomposición del H2O2 catalizada por metales, siendo el hierro el más común, de acuerdo con la reacción de por intermedio de estas evaluaciones indirectas que en la actualidad se puede determinar el porcentaje de espermatozoides que se encuentran produciendo ambas ROS. Fenton: 3. ANTIOXIDANTES PRESENTES EN Mahfouz et al. (2009) logró establecer un EL PLASMA SEMINAL Los antioxidantes son sustancias que protocolo para detección de H2O2 y O2espermatozoides. Para ello utilizó sondas cuando están presentes en bajas concentraciones en comparación con el Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 5 sustrato oxidable, retasa o previene daño estructural y funcional de la célula significativamente la oxidación de dichos espermática (Bansal et al., 2011). Sin sustratos. Los antioxidantes pueden inhibir o embargo, los espermatozoides no tienen la retardar la oxidación habilidad de resintetizar los componentes de captando radicales de dos formas: libres o mediante mecanismos que no involucran la captación membrana y poseen baja capacidad antioxidativa (Jones et al., 1979). de radicales libres. Entonces, se considera que los antioxidantes minimizan el daño oxidativo, por lo tato protegen a las células, incluyendo a los espermatozoides (Fuchs et al., 1997), ya que previenen la formación de ROS o disminuyen el efecto de los mismos. El plasma seminal y el propio espermatozoide producen antioxidantes como parte de la prevención del daño oxidativo. Estudios realizados en humanos demuestran la presencia de antioxidantes enzimáticos naturales como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa, glutation peroxidasa (GP) y glutation reductasa (GPx) en el plasma seminal (Smith et al., 1996). 4. ESTRÉS OXIDATIVO En la década de los 80, el estrés oxidativo fue definido como la perturbación en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes en favor de los primeros (Sies, 1985). Sin embargo, Da Silva et al (2010) proponen un cambio en la definición, mencionando que la definición de Sies (1985) no tiene en cuenta que la generación de radicales libres puede generar beneficios para las células. Por lo tanto proponen un cambio en la definición, considerando por ello al estrés oxidativo como: la perturbación grave en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes en favor de Todos ellos neutralizan el exceso de ROS quebrando la cadena oxidativa y previenen el Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 6 los primeros, y que por lo tanto conduce a un daño potencial a las células y órganos. Se ha determinado que las ROS pueden funcionar como moléculas de señalización. Además existe evidencia que 5. DAÑO ESPERMÁTICO sugiere que los espermatozoides pueden PRODUCIDO POR EL ESTRÉS producir concentraciones bajas y controladas OXIDATIVO de ROS, específicamente de O2 y H2O2, las Diversos estudios sugieren que son cuales promueven los procesos de necesarias pequeñas cantidades de ROS para capacitación, hiperactivación y la reacción activar la capacitación, hiperactivación y del acrosoma (Bansal y Bilaspuri., 2011), las reacción acrosomal de los espermatozoides mismas que son cruciales para la adquisición (Makker et al., 2009). Sin embargo, las ROS de también los espermatozoide. También se ha determinado espermatozoides cuando se producen en que condiciones oxidativas leves resultantes grandes los de bajas concentraciones de ROS pueden constituyentes celulares e induciendo la estimular la unión entre el espermatozoide y muerte celular. la zona pelúcida (Bansal y Bilaspuri., 2011). resultan nocivas cantidades para dañando ROS Efectos Benéficos • Capacitación espermática • Fecundación • Transmisión de señales la capacidad del Efectos Dañinos • Peroxidación lipídica de las membranas celulares • Daño oxidativo de proteínas bioquímicas de la superficie • Mutación del ADN celular mediante la unión • Activación de factores de receptor-ligando fecundante muerte celular Adaptado de: Buonocore et al., 2010 Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 7 Los ROS tienen afinidad por oxidar a oxidativo genera una amplia gama de los lípidos, produciendo una reacción que se patologías conoce con el nombre de peroxidación reproductiva. Investigaciones recientes han lipídica. son determinado que el 25% a 40% de los daño hombres infértiles evaluados presentan altos inducido por el estrés oxidativo debido a que niveles de ROS en sus muestras seminales sus (De Iuliis et al., 2007). Es por ello que en la Los espermatozoides particularmente susceptibles membranas grandes plasmáticas cantidades de al contienen ácidos grasos actualidad que se afectan la considera función sumamente poliinsaturados y su citoplasma contiene importante evaluar cuáles son los niveles de bajas enzimas producción de ROS en espermatozoides de antioxidantes, es por ello que debe evitarse diferentes especies de animales. Debido a enfrentarlos a altas concentraciones de ROS. que se considera que los ROS a altas Por lo tanto, las ROS deben ser inactivadas concentraciones de forma continua para mantener sólo una infertilidad debido a los efectos tóxicos que pequeña cantidad necesaria para mantener la generan, los cuales afectan la calidad y la función normal de los espermatozoides funcionabilidad de los espermatozoides. concentraciones de (Venero, 2002). inductores de Es a través de la marcación con El estrés oxidativo se produce como consecuencia de la producción excesiva de ROS y una alteración en los mecanismos antioxidantes son que protegen a los espermatozoides. Se considera que el estrés sondas fluorescentes que se pudo determinar que los espermatozoides producen H2O2 y O2- ante diferentes estímulos o medios. Por ejemplo se determinó en humanos que eyaculados con altos porcentajes de espermatozoides anormales (Aziz et al., Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 8 2004) o con leucospermia (Makker et al., grasos poliinsaturados contienen más de dos 2009 ) producen altos niveles H2O2 y O2-. dobles enlaces carbono-carbono, lo cual los hace También se comprobó que durante los sumamente sensibles a la oxidación. Las ROS procesos de centrifugación (Mahfouz et al., 2010) y criopreservación (Wang et al., 1997) son responsables de la oxidación de muchos componentes celulares, de estos el OH• es el mayor iniciador de la peroxidación lipídica se elevan los niveles de ROS. (Aitken et al., 1989). Así mismo se determinó que tanto las formas maduras espermatozoides como inmaduras producen de normalmente La mayoría de ácidos grasos poliinsaturados no se encuentran conjugados y poseen más de un doble enlace entre sus carbonos. La presencia de ROS, siendo esta producción más elevada en un doble enlace adyacente a un grupo metileno las formas inmaduras (Mahfouz et al., 2010). hace los enlaces metileno-hidrógeno más débil. Además se comprobó que medios con Por lo tanto el hidrógeno se vuelve más elevada concentración de H2O2 afectan en susceptible a ser sustraído. Una vez que se ha menor sustraído el hidrógeno, el radical producido se grado la viabilidad de los espermatozoides, a diferencia de los medios con elevada concentración de O2- el cual es más letal (Mahouz et al., 2010). estabiliza mediante la reordenación de los enlaces dobles, que forman un radical dieno conjugado que puede ser oxidado. Esta fase de la peroxidación lipídica es considerada la fase de iniciación (Marnett, 1999). 6. PEROXIDACIÓN LIPÍDICA La peroxidación lipídica se define como el deterioro oxidativo por el que pasan los ácidos grasos poliinsaturados que forman la membrana plasmática de los espermatozoides. Estos ácidos Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Obviamente esto nos lleva a deducir que cuantos más grupos metilenos posea el ácido graso poliinsaturado, más suceptible será a la peroxidación (Maia et al., 2010). Esa es la forma en la que se inicia el proceso de peroxidación. La Página 9 propagación de la peroxidación lipídica depende del mismo. El daño del ADN inducido por el de las estrategias antioxidantes empleadas por el estrés oxidativo puede acelerar el proceso de la espermatozoide. apoptosis de células germinales que conduce a la Uno de los productos finales de la peroxidación disminución del número de espermatozoides lipídica es el malondialdehído (MDA), el cual es asociados con la infertilidad masculina y el altamente mutagénico. El MDA produce daño a aparente deterioro de la calidad del semen nivel del ADN nuclear y mitocondrial, así (Mata-Campuzano et al., 2012). mismo produce una alta toxicidad en la célula La mayoría del daño en el ADN en los espermática (Marnett, 1999). Maia et al., (2010) espermatozoides humanos fueron asociados con lograron establecer un protocolo de detección un aumento del estrés oxidativo, así también la indirecto de los niveles de peroxodación lipídica mayoría de la fragmentación del ADN y daño en muestras espermáticas, dicha metodología oxidativo estaba presente en las células no estimulaba la generación de MDA, el cual era viables (Mata-Campuzano et al., 2012). Estos cuantificado mediante espectofotometría. Con lo resultados refuerzan la ventaja de la medición de cual no solo se nota la huella de la exposición a la producción de ROS, la peroxidación de ROS (peroxidación lípica), sino también se lípidos, y la fragmentación del ADN con el determina la presencia de uno de los agentes objetivo de obtener una estimación cuantitativa citotóxicos más potentes que puede producir la del número o porcentaje de células espermáticas reacción en cadena desatada por el estrés dañadas en la población total del eyaculado, y oxidativo, el MDA. permiten la identificación de estos tipos de daño en las muestras de semen de baja calidad. 7. DAÑO DE ADN El estrés oxidativo no sólo genera daño en la 8. CONCLUSIÓN membrana plasmática del espermatozoide, sino El estrés oxidativo se generaría como también daña la integridad del ADN en el núcleo consecuencia de la producción excesiva de ROS Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas Página 10 y/o por una alteración en el mecanismo de las células germinales y de los espermatozoides defensa antioxidante. La extensa revisión de la eyaculados, lo que lleva a la disminución del literatura que se ha realizado indica que el estrés número oxidativo produce una serie de daños patológicos eyaculado. de espermatozoides viables por en el espermatozoide, generan procesos de Cabe resaltar que medir la producción de infertilidad y de no ser solucionado podría ROS espermático es una tarea sumamente generarse esterilidad en los machos cuyos engorrosa pero no imposible, ya que se cuentan eyaculados presentan una alta concentración de con técnicas de medición indirecta mediante el ROS. En la actualidad múltiples estudios han uso de sondas fluorescentes las cuales se oxidan demostrado que tanto espermatozoides humanos en presencia de las ROS. Así mismo se puede como realizar la detección indirecta de la peroxidación animales producirían de ROS. animales Por domésticos desgracia, los lipídica, mediante la medición de los niveles de espermatozoides no pueden reparar el daño malondialdehído y la determinación de daño de inducido por el exceso de ROS porque carecen ADN mediante pruebas de determinación de de los sistemas de enzimas citoplasmáticos fragmentación de ADN. necesarios para llevar a cabo esta reparación. Aún existe mucho por estudiar con Esta es una de las características que hacen que a respecto a la producción de ROS espermático y los espermatozoides sumamente susceptibles al los mecanismos antioxidantes presentes en el daño oxidativo. plasma seminal en diferentes especies de Existen dos sistemas a través de los mamíferos. cuales las ROS generan daño oxidativo en los espermatozoides: el daño de la membrana plasmática y el daño del ADN en el núcleo del espermatozoide. El daño del ADN inducido por ROS puede acelerar el proceso de la apoptosis de Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas 9. LITERATURA CITADA 1. Aitken R, Clarkson J, Fishel S. 1989. Generation species, of lipid reactive oxygen peroxidation and Página 11 human sperm function. Biol Reprod 40:83-197. ML. 2. Aitken R, Fisher H. 1994. Reactive oxygen 6. Buonocore G, Perrone S, Tataranno species generation and human spermatozoa: the balance of benefit and risk. Bioessays 16:259267. 2010. 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