Metodologías para implementar Estándares Internacionales de pureza del Azafrán Análisis Microbiológicos Dª Olga Acevedo Regalado Dr. Rafael Rotger Dr. José Luis Novella Dra. Leonor Nozal Normativa microbiológica sobre especies • Normativa española (R.D. 2242/1984, de 26-IX): • Ausencia de microorganismos patógenos y sus toxinas • Ausencia de Salmonella en 25 g • Escherichia coli: ≤10 UFC/g • Esporulados anaerobios sulfito-reductores: ≤103 UFC/g • Recomendaciones ICMSF (1974, 2005): • Aerobios mesófilos totales: ≤10 106 UFC/g • Hongos y Coliformes: ≤104 UFC/g • E. coli y Clostridium perfringens: ≤103 UFC/g • Recomendaciones R d i dde lla U Unión ió Europea E (2004/24/CE) (2004/24/CE): • Ausencia de Salmonella en 25 g • Bacillus cereus: satisfactorio ≤102 UFC/g; g; aceptable p ≤103 UFC/gg • Clostridium perfringens: satisfactorio ≤103 UFC/g; aceptable ≤104 UFC/g • Enterobacteriaceae: para discriminar especies irradiadas • Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE Análisis de la calidad microbiológica de 80 muestras de azafrán • Origen: Detección de Salmonella 25 g azafrán + 225 ml Agua Peptona + 0.1% Tween80 Enriquecimiento selectivo Detección de Staphylococcus Pre-enriquecimiento Pre enriquecimiento (16 h h, 37 ºC) C) Homogeneizado – – – – – – Irán: 33 Italia: 15 Grecia: 15 España: 14 Marruecos: 2 I di 1 India: Stomacher Recuentos de bacterias y hongos Dil i Diluciones d decimales i l Recuento de bacterias y hongos Filtración para recuento de mohos y levaduras Sabouraud (2-4 días at 24 ºC) 5 min a 80 ºC para recuento de esporulados Dil i Diluciones 10-11 a 10-44 Recuento de aerobios totales, coliformes, lif E Enterobacterias t b t i y E. E coli. li Anaerobios sulfitoreductores reductores, Clostridium perfringens y Bacillus cereus cereus. Resultados del análisis microbiológico de 80 muestras de azafrán • Ausencia de Salmonella en 25 g en todas las muestras, confirmada por PCR. • Presencia P i d de E. E colili en 5 muestras t (6 25%) (6.25%), confirmada por PCR. • Presencia de Staphylococcus aureus en 3 muestras (3.75%), confirmada por PCR. • Ausencia de Aspergillus spp. spp • 76 muestras (95%) cumplieron la normativa española. Niveles de microorganismos en azafrán Aerobios totales Aerobios esporulados Enterobacterias Coliformes totales 70 50 Clostridios Sulfito-red. Clostridium perfringens 40 Levaduras Mohos 30 20 10 7 610 E 10 E 10 E 510 E 6 5 10 E 410 E 4 310 E 10 E 10 E 210 E 3 2 110 E 10 E 10 0 < % de m muestras 60 Porcentaje de muestras con niveles i l más á elevados l d % de muesttras de ca ada país Irán *Incumplen normativa española **Sobrepasan recomendaciones ICMSF 70 60 Grecia 50 It li Italia 40 España 30 20 10 ** >1 0 10 ra s s> va Le in g r fr pe du en us re B. E4 E2 E2 >1 0 E1 li > 10 co E. ce C. * lif o Co ac ob t er En rm t er es ia s >1 0E >1 0 4* E4 * 6* 0E >1 al ot bT ro Ae * 0 Supervivencia de S l Salmonella ll en azafrán fá 1,E+07 1,E+06 Log g UFC 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 , Enteritidis Enteritidis FT1 Typhimurium DT104 1,E+01 Tiempo de reducción decimal (D): 2 días Typhimurium DT104B Control* Control 1,E+00 0 4 Días *Promedio de las 4 cepas en ausencia de azafrán 7 Propuesta de método microbiológico Triturar 25 g azafrán en molino de bolas para análisis químico y microbiológico Pesar ∼5 g (±0 (±0.1) 1) y resuspender en 45 ml de agua de peptona tamponada (ISO 6579) (±0,1% Tween80) Detección de Salmonella CULTIVO ((ISO 6579)) Reposar 10 min Tª amb. Recuentos: E. coli PCR 0,5 ml Mezclar Dos alícuotas 1 ml Anaerobios esporulados sulfito reductores sulfito-reductores O Pre-enriquecimiento 16±1 h, 37 ºC PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa Cebadores para el gen invA de Salmonella 5’-CGGTGGTTTTAAGCGTACTCTT-3’ 5 CGG GG GCG C C 3 5’-CGAATATGCTCCACAAGGTTA-3’ 0,5 ml preenriquecimiento Filtración Electroforesis en agarosa D t Detección ió Nº de ciclos: Minutos: Tª (ºC) 1 5 94 1 94 1 55,6 1 72 3 72 30 1 TOTAL: 4-6 HORAS Lisis DNA + cebadores + Taq-polimerasa Taq polimerasa purificación DNA Detección de Salmonella por cultivo (ISO 6579) Dos alícuotas de 1 ml del preenriquecimiento q • Caldo Rappaport-Vassiliadis • Caldo Muller-Kauffman 24 h Otro agar selectivo para Salmonella XLD Agar 24 h Identificación bioquímica y serológica 24-48 h Resultados de la validación interlaboratorios Método: E Especificidad ifi id d Sensibilidad Exactitud Concentración de Salmonella Alta: [5×106] Media: [5×103] Baja: [5×102] PCR Cultivo (ISO 6579) 100 0 % 100.0 100 0 % 100.0 77.8 % 66.7 % 100.0 % 83.4 % 18.8 % 16.7 % 66.2 % 75.0 % Media de dos réplicas réplicas, analizadas por 9 laboratorios laboratorios.