ELISA sándwich

Informes de los Laboratorios de
Referencia de la OIE
Actividades del año 2011
Enfermedad (o tema) para la(el) cual
es designado laboratorio de referencia
de la OIE:
Dirección del laboratorio:
Peste porcina Africana
Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria
(VISAVET)
Facultad de Veterinaria
Universidad Complutense de Madrid
Avda. Puerta de Hierro s/n 28040
Madrid
SPAIN
Tel.:
+34-913944082
Fax:
+34-913943908
Dirección de correo electrónico:
Sitio web:
jmvizcaí[email protected]
http://www.sanidadanimal.info
Nombre (incluir título y puesto) del
Jefe de laboratorio (responsable
oficial):
José Manuel Sánchez-Vizcaíno
Nombre (incluir título y puesto) del
experto de referencia
de la OIE:
José Manuel Sánchez-Vizcaíno
Nombre (incluir título y puesto) del
redactor de este informe (si difiere del
anterior):
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
1
Peste porcina Africana
Parte I: Resumen de las actividades generales
relacionadas con la enfermedad
1.
Prueba(s) usada(s) o disponible(s) en su laboratorio para la enfermedad o tema especificados
a)
Detección de virus:




Aislamiento viral en macrófagos alveolares porcinos y técnica de hemoadsorción.
Inmunofluorescencia directa
Detección del genoma viral: PCR convencional (Agüero et al., 2003), PCR a tiempo real con sonda
Taqman (King et al., 2003)
ELISA sándwich comercial (INGEZIM PPA DAS)
Todo ello según lo descrito en el Manual de Pruebas Diagnósticas y Vacunas para los Animales Terrestres
2008 (Capítulo 2.8.1)
b)
Detección de anticuerpos:




ELISA INDIRECTO (OIE)
ELISA kit comercial (INGEZIM PPA COMPACT)
Westernblot (Immunoblotting)
Dispositivos inmunocromatrográficos para detección de anticuerpos (INGEZIM PPA CROM detección
anticuerpos)
Todo ello según lo descrito en el Manual de las Pruebas Diagnósticas y de las Vacunas para los Animales
Terrestres 2008 (Capítulo 2.8.1)
2.
Prueba
Para
Especificidad
Total
Aislamiento y hemoadsorción
Aislamiento y detección viral
Grupo
20
INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA
Detección de virus
Grupo
50
ELISA sándwich
Detección de virus
Grupo
50
PCR convencional
Detección de virus
Grupo
150
PCR Tiempo Real (Sonda
Taqman)
Detección de virus
Grupo
150
ELISA indirecto (OIE)
Detección de anticuerpos
Grupo
180
ELISA comercial
Detección de anticuerpos
Grupo
180
Immunoblotting
Detección de anticuerpos
Grupo
70
Inmunocromatografía
Detección de anticuerpos
Grupo
100
Producción y distribución de reactivos de diagnóstico
Producción de reactivos para ELISA indirecto e Inmunoblotting. Distribución de reactivos de ELISA,
inmunoblotting, PCR y dispositivos de detección de anticuerpos por inmunocromatografía al laboratorio
hermanado National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology (NRIVVaM) de Rusia para la
instauración del diagnóstico serológico de PPA en el mismo.
2
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Peste porcina Africana
Parte II: Actividades específicamente relacionadas con el mandato
de los Laboratorios de Referencia de la OIE
3.
Armonización y normalización internacional de los métodos para las pruebas de diagnóstico o
la producción y evaluación de vacunas
a)
Creación y mantenimiento de una red de contactos con otros laboratorios de referencia de
la OIE designados para el mismo patógeno o enfermedad y organización de evaluaciones
de calidad regulares interlaboratoriales para asegurar la comparabilidad de resultados
–
b)
Organización de evaluaciones de calidad interlaboratoriales con otros laboratorios que no
sean de referencia de la OIE que usen pruebas para los mismos patógenos y enfermedades
para asegurar la equivalencia de resultados.
 Participación en un ensayo interlaboratorial para la evaluación de los dispositivos inmunocromatográficos
para detección de anticuerpos y antígenos desarrollados por INGENASA, en colaboración con el
Laboratorio Comunitario de Referencia para PPA (CISA-INIA). Dicha evaluación fue llevada a cabo con
muestras procedentes de todas las zonas actualmente afectadas por el vPPA en diferentes fases de
infección.
 Participación en un ensayo ciego interlaboratorial para la evaluación de nuevas técnicas de PCR
desarrolladas en el marco del proyecto europeo ASFRISK (técnicas de sonda UPL y LAMP). Dicho
ensayo fue organizado por el laboratorio Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle
Marche (IZS-UM).
 Evaluación del conjugado de Inmunofluorescencia Directa (IFD) fabricado en NRIVVaM durante el
curso de virología clásica en Madrid. Esto se realizó mediante un estudio con muestras de campo
procedentes de Rusia y África analizadas por la técnica de IFD en paralelo con el conjugado UCMINGENASA elaborado a partir de un anticuerpo monoclonal anti vp72 del vPPA, y el conjugado
policlonal NRIVVaM. Se pretende llevar a cabo un ensayo ciego en el próximo año para evaluar el
funcionamiento y desarrollo de la técnica en el NRIVVaM.
4.
Preparación y suministro de estándares internacionales de referencia para las pruebas de
diagnóstico o las vacunas
Producción de controles positivos según los estándares internacionales, para las técnicas de PCR convencional y
tiempo real. Estos controles fueron obtenidos mediante clonación de la proteína p72 de PPAV de las siguientes
cepas (HAITI, E75, MALAWI, Ag72, E 70, UG 03H). Multiplicación de las cepas de VPPA E70, E75 y Li70 en
macrófagos alveolares porcinos y células COS.
5.
Investigación y desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y control
–
6.
Recopilación, análisis y difusión de datos epizootiológicos concernientes a la lucha
internacional contra las enfermedades
De manera rutinaria, nuestro laboratorio recopila la información disponible y sigue la evolución detallada de la
enfermedad en el mundo. Los nuevos brotes notificados son registrados en una base de datos propia y la evolución
epidemiológica de la enfermedad, así como los posibles cambios en la distribución de la misma, son analizados
rutinariamente.
Este año además, nuestro laboratorio ha colaborado con el Ministerio de Agricultura de España como
Observatorio Epidemiológico SUAT-VISAVET notificando cualquier cambio en la evolución de la enfermedad.
A lo largo del 2011, tres informes fueron enviados al Ministerio en relación a la epidemiología de PPA en la
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
3
Peste porcina Africana
Federación Rusa, analizando la localización y difusión de los nuevos brotes, así como el potencial riesgo que estos
suponen para España.
Participación en el Proyecto europeo ASFRISK cuyo objetivo principal es “Evaluación y control del riesgo de
Peste Porcina Africana en la UE”. Proyecto financiado por el 7º Programa Macro UE, finalizado en septiembre
de 2011. Durante el desarrollo de dicho proyecto se ha llevado a cabo un análisis del actual riesgo de introducción
de la PPA en la UE, así como la evaluación de la actual situación epidemiológica de la enfermedad destacando la
presencia de animales infectados sin presencia de anticuerpos ni signos relevantes de enfermedad en determinadas
regiones endémicas de África. Del mismo modo, se evaluaron las actuales técnicas diagnósticas para el
diagnóstico de estos animales, así como el desarrollo de nuevas técnicas de fácil y rápida ejecución.
Envío a la OIE de los resultados del diagnóstico de PPA realizado para Burkina Faso realizado a lo largo del 2011.
7.
Mantenimiento de un sistema de control de calidad, bioseguridad y seguridad biológica en
relación al patógeno y a la enfermedad
El Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET) cuenta con un laboratorio de de nivel 3 (378,99m2) de
bioseguridad para trabajar con agentes biológicos incluidos en el grupo de riesgo 3. Este laboratorio fue diseñado
conforme a la siguiente normativa:

Normas de Correcta Fabricación Europeas (GMP Edición 2002).

Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados
con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo.

“Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratorios” 4th edition (1999 CDC).

“Laboratory Biosafety Manual 2nd edition” (1993) editado por la OMS
Del mismo modo, el diagnóstico de PPA en nuestro centro, y todos los procedimientos relacionados con la
enfermedad se realizan conforme a estos requerimientos.
8.
Suministro de asesoramiento experto a la OIE o a los Países Miembros de la OIE
El Profesor José Manuel Sánchez-Vizcaíno ha sido requerido en dos ocasiones en el año 2011 por los servicios
veterinarios y el Ministerio de Agricultura de Rusia, para proporcionar asesoramiento científico y técnico en
relación con el control de PPA, en base a su gran experiencia en la erradicación y control de la misma en España.
Este asesoramiento se materializó en las siguientes conferencias, las cuales fueron seguidas de un intercambio de
opiniones y discusión con los expertos del país:
9.

Sánchez-Vizcaíno, JM. (2011). Participación como experto en el seminario "Complejo de medidas contra la
difusión de la peste africana de cerdo". 13ª Exposición Agrícola Rusa "Otoño Dorado 2011", Ministerio de
Agricultura de la Federación de Rusia, Gobierno de Moscú y Academia de Agricultura Rusa. Moscú, 07-17
Octubre.

Sánchez-Vizcaíno, JM. (2011). “Results of the elimination of ASF in Spain”. Ponencia. 19 th Veterinary
Congress Russian Veterinary Association, Moscú, 18-19 de Abril.
Suministro de formación científica y técnica al personal de otros Países Miembros de la OIE
En el mes de Abril de este mismo se inició un Twinning proyect entre nuestro laboratorio y el National Research
Institute for Veterinary Virology and Microbiology (NRIVVaM), laboratorio Nacional de Referencia de PPA en la
Federación Rusa. En el marco de dicho proyecto, tal y como se ha informado en el informe de seguimiento de
seguimiento remitido a la OIE, se ha llevado a cabo la formación de personal de este centro en los siguientes
ámbitos:
4

Formación del personal de NRIVVaM en materia de detección de anticuerpos mediante una visita inicial
realizada por Lina Mur al centro en Abril de este año.

Formación de cuatro miembros del NRIVVaM mediante su asistencia al curso “Peste porcina africana
(PPA) epidemiología y diagnóstico laboratorial” celebrado en la Universidad Complutense de Madrid del
27 de Junio al 1 Julio de este año.
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
Peste porcina Africana

Formación de dos miembros del NRIVVaM, responsables del diagnóstico de PPA en sus instituto, en
materia de virología clásica mediante un curso diseñado y desarrollado específicamente para cubrir los
objetivos del Twinning proyect. Este curso, titulado “Curso PPA diagnóstico virología clásica” se
desarrolló del 28 Noviembre al 2 Diciembre en la Universidad Complutense de Madrid.
10. Suministro de servicios para las pruebas de diagnóstico a otros Países Miembros de la OIE
Durante el 2011 se realizaron los siguientes diagnósticos oficiales de Peste Porcina Africana a Países Miembros de
la OIE:

En marzo de 2011 se recibieron 174 muestras procedentes de Burkina Faso para su diagnóstico de PPA.
Los resultados de los análisis tanto de detección de virus como de anticuerpos fueron comunicados a los
servicios veterinarios oficiales de Burkina Faso, así como a la OIE.

En julio de 2011 se recibieron 64 muestras procedentes de Burkina Faso para su diagnóstico de PPA. Los
resultados de los análisis tanto de detección de virus como de anticuerpos fueron comunicados a los
servicios veterinarios oficiales de Burkina Faso, así como a la OIE.

En septiembre de 2011 se recibieron 106 muestras procedentes de Burkina Faso como colaboración con
nuestro centro para la creación de un banco de muestras que nos permita la continuación de la
investigación y el suministro de controles de PPA en nuestro laboratorio.
11. Organización de reuniones científicas internacionales en nombre de la OIE o de otros
organismos internacionales
Nombre del evento
Lugar
Fecha
Organización
Financiación
Asistentes
“Peste porcina africana
(PPA) epidemiología y
diagnóstico
laboratorial”
Universidad
Complutense
de Madrid
27 Junio al
1 Julio
Laboratorio de
Referencia de la
OIE para PPA, en
colaboración con el
Centro de
Investigación en
Sanidad Animal
(CISA-INIA)
Proyecto
europeo
ASFRISK
(KBEE-20071-3-05, GA
211691)
28 veterinarios de
la Región
Caucásica, Rusia
y países
colindantes, así
como algunos
países de la UE
Este fue un curso práctico destinado a la formación de veterinarios especializados en el control y diagnóstico de
laboratorio de enfermedades infecciosas, especialmente enfocado a la detección temprana y control de la PPA.
Incluyó sesiones tanto teóricas como prácticas y discusiones acerca de los temas tratados. Los participantes se
dividieron en dos grupos (epidemiología y laboratorio) durante tres sesiones del curso, existiendo otras dos sesiones
(inicial y final) comunes para todos los participantes. Toda la información proporcionada durante el curso, así como
los protoclos empleados y conclusiones finales fueron proporcionadas a los asistentes en un CD interactivo.
12. Participación en estudios científicos internacionales colaborativos
–
13. Publicación y difusión de información concerniente al trabajo de la OIE (incluidas una lista de
las publicaciones científicas, las actividades de publicación por internet, las presentaciones en
conferencias internacionales)

Presentaciones en conferencias y reuniones internacionales

Sánchez-Vizcaíno, JM. (2011). Participación como experto en el seminario "Complejo de medidas contra la
difusión de la peste africana de cerdo". 13ª Exposición Agrícola Rusa "Otoño Dorado 2011", Ministerio de
Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011
5
Peste porcina Africana
Agricultura de la Federación de Rusia, Gobierno de Moscú y Academia de Agricultura Rusa. Moscú, 07-17
Octubre

Sánchez-Vizcaíno, JM. (2011). "African swine fever Overview: Global Importance, ASF Virus Biology and
Disease Control Measures". Workshop "African swine fever Diagnostics, Surveillance, Epidemiology and
Control: Identification of Researchable Issues Targeted to the Endemic Areas within sub-Saharan Africa".
ILRI. Nairobi (Kenia), 19-22 Julio.

Sánchez-Vizcaíno, JM, Martínez-López, B., Mur, L., (2011). "African Swine Fever update" Plenary lectures.
International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases, Barcelona, 12-15 Junio.

Martínez-López, B., Perez, A.M., Francesco, F., Rolesu, S., Patta, C., Sánchez-Vizcaíno, JM
(2011). "A bayesian mixed multivariate logistic regression model for the evaluation of the african swine fever
risk factors in Sardinia". Poster. International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases,
Barcelona, 12-15 Junio

Sánchez-Vizcaíno, JM. (2011). “Results of the elimination of ASF in Spain”. Ponencia. 19 th Veterinary
Congress Russian Veterinary Association, Moscú, 18-19 de Abril.

Publicaciones científicas en revistas con examen por pares

Mur, L., Martínez-López, B., Martínez-Avilés, M., Costard, S., Wieland B., Pfeiffer, D., Sánchez-Vizcaíno,
JM. “Quantitative risk assessment for the introduction of African swine fever 1 virus into the European Union
by legal import of live pigs”. doi:10.1111/j.1865-1682.2011.01253.x

Sánchez-Vizcaíno, JM., Mur, L., Martínez-López, B. African swine fever: an epidemiological update.
doi:10.1111/j.1865-1682.2011.01293.x

Mur, L., Boadella, M., Martínez-López, B, Gallardo, C., Gortazar, C., Sánchez-Vizcaíno, J.M. Monitoring of
African swine fever in wild boar population from the latest endemic area of Spain. In press.

Otras comunicaciones

Mur, L., Martínez-López, B., Sánchez-Vizcaíno, JM. African swine fever: are we aware? In press (Pig
progress magazine)
_________
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Informes anuales de los Centros de referencia de la OIE, 2011