Degradación de la cercosporina mediante sistemas biológicos

Diseño de un Reactivo de Inmunoaglutinación para Diagnosticar
Infección por Leptospiras patógenas
Directora: Dra. Verónica González
Co-Directora: MSc. Bibiana Vanasco
Lugar de trabajo: Laboratorio del Grupo de Polímeros (INTEC) y laboratorio de
Leptospirosis (FBCB).
OBJETIVOS
Objetivo General:
Optimización de un ensayo de inmunoaglutinación que permita diagnosticar infección por
leptospiras patógenas.
Objetivos Particulares:
a) Obtención de un Homogenato de Leptospira interrogans y una de proteína
recombinante.
b) Acoplamiento covalente de las proteínas antigénicas sobre partículas con
funcionalidad superficial carboxilo.
c)
Búsqueda de las condiciones de reacción para la realización del inmunoensayo.
d) Aplicación de los complejos látex-proteína en ensayos de inmunoaglutinación.
Comparación con otras técnicas de diagnóstico.
ANTECEDENTES
La leptospirosis, producida por la bacteria Leptospira interrogans, es una de las
zoonosis más comunes de amplia distribución mundial (1) que afecta a humanos y a un
amplio rango de animales constituyendo un importante problema de salud pública, aunque
se desconoce la prevalencia real de esta enfermedad (2).
Los pacientes con leptospirosis pueden producir anticuerpos que reaccionan con
varios serovares (antígenos género específicos, que son compartidos por leptospiras
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patógenas y saprofitas) y antígenos serovar específicos y serogrupo específicos. Después
de la enfermedad aguda, los anticuerpos comunes desaparecen gradualmente, mientras que
los anticuerpos específicos para serogrupos y serovares pueden persistir por años.
El diagnóstico de la leptospirosis comprende el diagnóstico clínico, bacteriológico,
molecular y serológico. El diagnóstico serológico es el más solicitado en caso de sospecha
de leptospirosis. La microaglutinación (MAT) es la prueba de referencia por su insuperable
especificidad diagnóstica (serovar/serogrupo) en comparación con las otras pruebas
disponibles actualmente. En la MAT, el reactivo de aglutinación consiste de leptospiras
vivas con siete días de desarrollo en el cultivo, por lo que para su aplicación se necesita
personal entrenado, un cepario y un chequeo del antígeno. La técnica ELISA es útil para
un diagnóstico más temprano que la MAT ante cuadros inespecíficos como leptospirosis,
detecta infecciones recientes, es sensible y tiene buena concordancia con la MAT. Sin
embargo, la prueba de ELISA consta de varias etapas, su realización tarda entre 90 y 100
minutos y requiere kits relativamente caros.
En Argentina también se utiliza la aglutinación directa con antígenos
termorresistentes, que es un reactivo artesanal, que utiliza leptospiras enteras provenientes
de cultivo, inactivadas con calor y formol, que es producido por el laboratorio de referencia
de la Red Nacional de Laboratorios. Este reactivo tiene como desventajas la baja
sensibilidad y especificidad en etapas tempranas de la enfermedad y tiene variabilidad en
sus resultados debido a que su interpretación es subjetiva sumadas a las dificultades en la
visualización de la reacción.
Un método de detección alternativo, es el ensayo de inmunoaglutinación, donde
partículas de látex monodispersas se sensibilizan con antígenos (o anticuerpos) de interés,
de manera tal que ante la presencia de anticuerpos (o antígenos) específicos en un fluido
humano, se produzca la aglutinación de las mismas. Este método resulta rápido, es de
sencilla realización e interpretación, presenta relativamente alta sensibilidad analítica y es
especialmente útil en aquellos laboratorios con escaso personal y equipamiento.
Los látex de inmunodiagnóstico se han utilizado exitosamente para la detección de
Artritis Reumatoidea, Toxoplasmosis, Malaria, Brucelosis, Leptospirosis, Rotavirus, Virus
Influenza Aviar entre otros (3-10). La detección de la inmunoaglutinación se puede realizar
visualmente o mediante métodos instrumentales. El método visual (9,10) es simple y
rápido, y no requiere equipamiento especial, pero sus resultados son subjetivos e
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inadecuados para la cuantificación. Las técnicas instrumentales generalmente usadas son:
turbidimetría, nefelometría, y dispersión de luz dinámica. La sensibilidad y exactitud del
inmunoensayo depende del método usado para detectar la aglutinación (11).
El anclaje de las biomoléculas sobre las partículas de látex se puede realizar
mediante adsorción física o mediante unión química. Durante la adsorción pasiva puede
ocurrir cierta desnaturalización y desorción de la proteína, reduciendo la actividad del
inmunoreactivo (12). Estos inconvenientes pueden eliminarse si la proteína se une
covalentemente a grupos funcionales presentes en la superficie de las partículas del látex.
Para el acoplamiento covalente de las proteínas, se emplean látex hidrofílicos
funcionalizados de tamaño de partícula y densidad de grupos funcionales uniformes. La
naturaleza hidrofílica aumenta la estabilidad de los complejos látex-proteína, y previene
interacciones inespecíficas (13). La uniformidad en el tamaño y la densidad de grupos
funcionales aumenta la estabilidad coloidal y permite una distribución homogénea de las
proteínas sobre la superficie de las partículas.
En el Grupo de Polímeros del INTEC se han realizado trabajos de investigación
relacionados al proceso de síntesis de partículas de látex funcionalizadas (14,15), a la
caracterización de tamaños de partículas por técnicas ópticas (16-19), a la sensibilización
de partículas de látex con proteínas (20-26) y a la aplicación de los complejos látexproteína en ensayos de immunoaglutinación (24-26). El grupo de Leptospirosis de la
Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas ha desarrollado y validado reactivos ELISA
para diagnóstico de leptospirosis humana, bovina y canina utilizando diferentes tipos de
antígenos (27-31). También ha desarrollado pruebas moleculares para diagnóstico de
leptopirosis humana aguda (32).
PLAN DE TRABAJO PROPUESTO
Actualización Bibliográfica
En esta tarea se buscará que el estudiante adquiera manejo de búsqueda bibliográfica a
través de las distintas bases de datos, como actividad permanente a lo largo de todo el
proyecto.
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Obtención de un Homogenato de Leptospira interrogans
Se realizará el cultivo de Leptospira interrogans cepa Hardjoprajitno (serovar Hardjo,
serogrupo Sejroe). La cepa utilizada corresponde a un banco de cepas de referencia
tipificado por técnicas serológicas y moleculares.
El cultivo de la cepa de Leptospiras se realizará en medio líquido. El cultivo se lavará y
sonicará para obtener el homogenato que aportará la mezcla de antígenos necesaria para la
sensibilización de las partículas de látex.
Obtención de una proteína recombinante de Leptospira interrogans
En trabajos previos diseñamos y sintetizamos una proteína recombinante correspondiente a
la lipoproteína LipL32 (LipL32Δ150NΔ67C), que tiene una deleción de los primeros 150
residuos aminoacídicos del extremo amino y los últimos 67 del extremo carboxilo de la
proteína y que incluye los dos epitopes mínimos de reconocimiento de esta lipoproteína
previamente descripta por nuestro grupo (27). Esta proteína mostró una buena reactividad
en ensayos ELISA.
Sensibilización de las Partículas de Látex
Se realizará el acoplamiento covalente del Homogenato y de la proteína recombinante
LipL32 de L. interrogans sobre partículas con funcionalidad carboxilo bajo distintas
condiciones de pH y concentración de antígeno, tamaño y concentración de partículas y
densidad de carga superficial.
Ensayos de Inmunoaglutinación
Se estudiará la influencia de distintos factores sobre el ensayo de inmunoaglutinación, tales
como: el tiempo de reacción, la composición del buffer de reacción, la concentración del
látex y la cantidad de proteína antigénica unida.
Se realizarán ensayos de imnunoaglutinación utilizando los complejos látex-proteína
obtenidos enfrentándolos a un panel de sueros positivos (que presenta anticuerpos
específicos contra L. interrrogans) y negativos (sin anticuerpos específicos) y se analizará
la sensibilidad y especificidad del ensayo.
Comparación con otras Técnicas de Diagnóstico
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La reactividad será comparada frente a la MAT y a técnicas de ELISA, utilizando el
Homogenato y la proteína recombinante como antígenos. Para ello se utilizará un panel de
sueros preexistente.
METODOLOGÍA
Obtención del Homogenato de Leptospira interrogans
Este procedimiento parte de los cultivos de 7-14 días de desarrollo (etapa exponencial) de
las cepas de leptospiras en medio líquido de Ellinghausen, McCullough, Johnson, Harris
(EMJH). El cultivo se centrifugará 20 minutos a 10.000 g, se lavará con buffer fosfato
salino pH 7,2 y finalmente se sonicará 2 veces por 2 minutos.
Obtención de la proteína recombinante
La obtención de antígenos recombinantes se realizará por técnicas de ADN recombinante a
partir de Leptospira interrogans (L. Copenhageni serogrupo Icterohaemorrahiae) cultivada
axénicamente en medio líquido de EMJH, durante 7-14 días. Los clones serán obtenidos en
células de Escherichia coli, con plásmidos comerciales. Los productos de expresión serán
purificados por técnicas cromatográficas y controlados por electroforesis.
Sensibilización de las Partículas de Látex
Se activarán los grupos carboxilo superficiales mediante una carbodiimida soluble en agua:
la N-(3-dimetilamino propil) N’-etil carbodiimida (EDC) para convertir los grupos
carboxilo superficiales en acilureas (que reaccionan fácilmente con los grupos amino de las
proteínas). Luego se efectuará el acoplamiento de las proteínas antigénicas de L.
interrogans (proteínas presentes en el Homogenato y proteína recombinante LipL32) sobre
las partículas carboxiladas.
Los experimentos se realizarán a temperatura ambiente y a diferentes pH, con el objeto de
encontrar las condiciones de reacción que maximicen la cantidad de proteína unida sobre
las partículas.
Ensayos de Inmunoaglutinación
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Los complejos látex-proteína obtenidos con diferentes cantidades de proteínas unidas, se
enfrentarán a sueros positivos (que presentan anticuerpos específicos contra L.
interrogans) y negativos. El seguimiento de la reacción se realizará mediante diferentes
técnicas: método visual, DLS, y espectrofotometría. Se estudiará la influencia de distintos
factores sobre el ensayo de inmunoaglutinación como ser: el tiempo de reacción, la
composición del buffer de reacción, la concentración del látex y la cantidad de proteína
antigénica unida. En el caso particular de la espectrofotometría, se estudiará la influencia
de la longitud de onda en la detección del proceso de inmunoaglutinación.
Comparación con otras Técnicas de Diagnóstico
Se realizará la evaluación de la reactividad frente a los paneles de sueros preexistentes de
muestras de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad.
Se determinarán los parámetros de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y de
corte, y área bajo la curva ROC tomando como método de referencia a la MAT. Se
compararán los resultados frente a dos ELISAs, uno obtenido con antígeno extractivo y el
otro con la proteína recombinante.
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