MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº63 BLGO. ELIZABETH ANAYA RAMÍREZ BLGO. GIOVANNA MENDOZA MUJICA BLGO. LOURDES GARCÍA USCAMAYTA TÉC. LAB. YSABEL FERNÁNDEZ SILVA 2006 PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA I. IDENTIFICACION Código del proyecto OGITT: 2-01-05-04-044 Centro de Referencia: Centro Nacional de Salud Pública Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas Título del Proyecto: “Prueba rápida para detectar anticuerpos para el diagnóstico de bartonelosis: ELISA indirecta” Autores: Blgo. Elizabeth Anaya Ramírez Blgo. Giovanna Mendoza Mujica Blgo. Lourdes García Uscamayta Téc. Lab. Ysabel Fernández Silva Lugar de ejecución: Distrito de Caraz (trabajo de muestreo) Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud (diagnostico serológico) Año de ejecución: 2006 PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA II. RESUMEN: Objetivo: Definir la sensibilidad y especificidad de un método ELISA para el diagnóstico rápido de bartonelosis en Caraz-Ancash, zona endémica de Perú. Material y Métodos: En julio del año 2006 se tomaron muestras biológicas (frotis, sangre y suero) a 125 personas procedentes de una zona endémica para la Enfermedad de Carrión como es el distrito de Caraz, departamento de Ancash. Asimismo fueron seleccionados sueros de la seroteca-2006 del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas correspondientes a 51 personas procedentes de zonas no endémicas y sin antecedente clínico- epidemiológico para bartonelosis. Finalmente se seleccionaron 32 sueros de pacientes con diagnóstico serológico confirmado para otras enfermedades bacterianas como brucelosis, leptospirosis, sífilis y rickettsiosis. Se utilizó como antígeno para la prueba ELISA indirecta, un lisado total de Bartonella bacilliformis procedentes de una cepa ATCC y un aislamiento 2005-INS de Perú. Resultados: Se encontró que 86 de las 125 personas muestreadas presentaron antecedente clínico-epidemiológico y/o frotis positivo a bartonelosis. La prueba ELISA indirecta mostró una Sensibilidad de 68.6% (59/86), una Especificidad de 94.1% (48/51), un VPP de 95.2% (59/62), un VPN de 64.0% (48/75) y una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 78.1% (25/32). Conclusiones: La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo no es una prueba idónea para ser usada como herramienta diagnóstica en bartonelosis ya que a pesar de su aceptable especificidad (94.1%) presentó una baja sensibilidad y VPN. Teniendo en cuenta la importancia de la Bartonelosis en Perú, el INS continuará los estudios hacia la búsqueda de una prueba rápida con mayor sensibilidad para ser aplicada como herramienta diagnóstica y que nos permita detectar anticuerpos antibartonela. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA III. INTRODUCCION La enfermedad de Carrión es una enfermedad autóctona de nuestro país, es causada por Bartonella bacilliformis una bacteria pleomorfica, intracelular gram negativa, aeróbica, unipolar con 2 a16 flagelos que crece lentamente en medio de agar sangre base columbia (1), que es transmitida principalmente por un mosquito de la especie Luztzomya verrucarum (2,3,4). La enfermedad se caracteriza por tener 3 fases; fase anémica, que se caracteriza por la anemia severa y la presencia de fiebre; el periodo intercalar, donde persiste la anemia pero la fiebre desaparece y la fase eruptiva, donde aparecen la erupción acompañada de síntomas leves como malestar general, cefaleas, etc (5,6,7). La sospecha clínica de bartonelosis en Perú se confirma en el laboratorio por aislamiento en agar sangre base columbia, lectura de láminas o frotis sanguíneo, las cuales detectan a la bacteria con una limitada sensibilidad (1,3,6,8,9,10). Sin embargo, un inadecuado diagnóstico clínico, la deficiente conservación de muestras en su traslado a los centros de referencia o, la muerte del paciente antes de tomar la muestra disminuyen la sensibilidad de los métodos ó impiden la realización de dichas pruebas. En otros países circulan otras especies de Bartonella y cuentan con técnicas serológicas estandarizadas entre las cuales se pueden mencionar Inmunofluorescencia (IFI), ELISA y Western blot (WB) (11,12,13,6,10,14,15). Estas pruebas aparte de ser utilizadas como diagnostico de enfermedades como el Arañazo del gato, también son utilizadas para estudios de seroprevalencia. En Perú también circulan algunas de éstas especies (B. henselae y B. quintana) y en mayor proporción la B. bacilliformis, sin embargo; aún no se cuenta con pruebas serológicas como herramientas de diagnóstico. La bartonelosis sigue avanzando a lo largo de los diferentes departamentos del país, por ello es necesario realizar estudios de seroprevalencia que nos permiten determinar la magnitud y dinámica de la enfermedad (1). Dentro de las técnicas que se utilizan para hacer este tipo de estudios es el western blot (11,14, ) y ELISA (12,6,10,13,15). El western blot es una técnica altamente sensible y especifica pero implica métodos complejos y caros, difíciles de manejar en laboratorios regionales, en contraste con la técnica de ELISA altamente sensible y de PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA menor especificidad, de bajo costo y de fácil implementación (16). En nuestro país se han realizado pocos estudios de este tipo por lo que no ha sido posible determinar la dinámica de la infección en zonas endémicas, esto se debe a que no hay una prueba rápida y estandarizada para B. bacilliformis que sea suficientemente sensible para realizar este tipo de estudios (1). La detección de anticuerpos de bartonelosis a partir de muestras de sueros, constituiría una prueba rápida de enorme utilidad para el diagnóstico de ésta enfermedad de importancia pública en nuestro país donde la letalidad sigue siendo alta y es más frecuente cuando se presenta en forma de brotes en áreas nuevas de transmisión, así tenemos Shumpillan (Ancash) 88%, Quillabamba 18.8% (2), Valle sagrado de los Incas 23%, Cajamarca 11% (1). En éste trabajo notificaremos la sensibilidad y especificidad de un método ELISA empleando antígeno crudo total de B. bacilliformis. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA IV. MATERIAL Y METODOS: En julio del año 2006 fueron colectados muestras biológicas correspondientes a frotis, sangre y suero de 125 personas con antecedente clínico-epidemiológico procedentes del distrito de Caraz, departamento de Ancash. Todas las muestras fueron procesadas en el laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud. Sueros : Se colectaron 125 sueros de pacientes con antecedente clínico-epidemiológico de bartonelosis procedentes de Caraz, zona endémica de Ancash. Los casos positivos están documentados por antecedente clínico-epidemiológico, frotis de sangre periférica y/o cultivo. 51 sueros de personas sin antecedente clínico-epidemiológico de bartonelosis procedentes de Loreto, Madre de Dios, Junín, Chiclayito-Piura y Lima, sin antecedente de haber viajado a zonas endémicas, fueron seleccionados como controles negativos a partir de la seroteca-2006 del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas. Para evaluar la reacción cruzada (especificidad) se utilizaron 32 sueros confirmados como positivos para otras enfermedades como: brucelosis, leptospirosis, sífilis, y rickettsiosis, confirmadas por clínica y serología. Cepa y/o antígeno : Bartonella bacilliformis del American Type Culture Collection (ATCC 35685) y cepa 1155-INS procedente de un aislamiento 2005 de Huarochirí-Lima área de Perú donde la Bartonelosis es endémica y que ha sido confirmada por cultivo y técnicas moleculares, fueron cultivadas en medio bifásico agar sangre base columbia suplementado con 10% sangre de carnero desfibrinada como fase sólida y RPMI como fase líquida (1), se realizaron subcultivos en 10 placas con agar sangre base columbia, incubadas a 28°+/- 1°C y cosechadas entre el séptimo y décimo día. Las colonias de B.bacilliformis pequeñas, transparentes con apariencia de gotas de rocío, de crecimiento confluente fueron resuspendidas en buffer PBS a pH 7.4. Cada cepa de Bartonella fue cosechada y lavada por centrifugación a 2500 rpm x 5 minutos con buffer PBS pH 7,4 por tres veces. El pellet fue resuspendido en buffer hepes pH 7.4 (12) y sometido a PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA lisis mediante sonicación a 0.8 mA, 20 Kz durante 1 minuto por 5 veces con intervalos de 1 minuto, el antígeno total lisado se mantiene en condiciones de refrigeración durante todo el procesamiento de lisis (17). Finalmente se sometió a 2 lavados por ultracentrifugación de 32700 rpm x 60 min. (12) El pellet obtenido es finalmente resuspendido en agua destilada estéril a partir del cual se realizó el dosaje de proteínas por el método de Lowry (16). Ensayo inmunoenzimático. De cada concentración de antígeno total de B. bacilliformis, se preparó diluciones con solución PBS 1X pH 7.2-7.4 para obtener concentraciones finales de 1/100, 1/200 y 1/400 equivalentes a 5ug/ml, 2.5 ug/ml y 1.25 ug/ml, las que son impregnadas en cada pocillo de las tiras ELISA fondo plano (Inmulon) con 100ul de cada dilución de antígeno e incubándolas por toda la noche a 4°C. Utilizando un lavador de microplacas (Labsystem modelo Multiwash II) las tiras ELISA son sometidas al proceso de lavado por 5 veces con solución PBS 1X ph 7.2–7.4 + 0.05% de Tween 20 (sigma). En la fase de bloqueo se utiliza 100ul para cada pocillo de solución PBS ph 7.2-7.4 + 3% de skim milk (difco) por una hora a 37°C. Realizar el proceso de lavado y conservar las tiras ELISA bloqueadas a -20°C hasta su uso. Cada vez que se utilice las tiras ELISA impregnadas y bloqueadas se retiran de la congeladora y se deja a temperatura ambiente por 10-20 minutos antes de la corrida. Se prepararon 3 diluciones de cada suero (1/50, 1/100 y 1/200) en solución PBS pH 7.2-7.4 y se agrega 100ul de cada pocillo, dejando en incubación a 37°C por una hora (12,17) Lavar las tiras ELISA y añadir a cada pocillo 100ul de conjugado IgG anti-humano unido a enzima peroxidasa (Sigma) preparado en PBS pH 7.2-7.4 en concentraciones de 1/3000 y 1/6000 , se deja incubar a 37°C por 30 minutos. Realizar el proceso de lavado, adicionar 100ul de solución cromófora ABTS (Calbiochem) e incubar por 30 min. a 37°C. Finalmente agregar 100ul de solución de parada SDS al 1 % y realizar las lecturas con un lector ELISA (Thermolabsystems) con filtro de 405 nm y filtro referencial de 630 nm. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA ANALISIS DE DATOS Obtenidas las lecturas, se procedió a analizar los datos para obtener los valores de Especificidad, Sensibilidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo de la prueba, aplicando las siguientes fórmulas: Valor de Corte ( VC ) Se procedió a realizar el cálculo del Valor de corte en base a las lecturas de los controles negativos y positivos obtenidos. VC= XCN + 2DS Sensibilidad ( Se ) Se = Positivos Positivos verdaderos + falsos negativos Especificidad ( E ) E= Negativos Negativoss verdaderos + falsos positivos PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA V. RESULTADOS V.1. Cepa y/o antígeno : Para elegir la dilución de antígeno apropiada se obtuvo 510 µg/ml de concentración proteica con una producción en masa de antígeno de Bartonella bacilliformis del American Type Culture Collection (ATCC 35685) y cepa 1155-INS. V.2. Titulación de antígeno : Se probaron 3 diferentes diluciones seriadas (Tabla Nº1), de las cuales se obtuvieron valores de densidad óptica (OD) del suero positivo y del suero negativo. Se determinó la mejor dilución dividiendo el valor del OD del suero positivo entre el valor del OD del suero negativo, con el fin de obtener una valor (ratio) que represente la dilución optima a la cual el valor del OD del positivo se separa más del valor del OD del negativo. Además se probaron estas diluciones a distintos diluciones del suero positivo y del suero negativo. De ésta manera se halló que la dilución óptima del antígeno fue 1/200 con un ratio de 12,67 a una dilución de suero de 1/50. (Tabla Nº 1) ANTIGENO DILUCIONES DILUCIONES DE SUERO 1/200 1/100 1/50 1/100 5,07 7,08 11,47 1/200 7,99 9,23 12,67 * 1/400 7,26 9,52 12,22 Tabla Nº 1. Titulación de antígeno a diferentes concentraciones de suero, el conjugado se trabajo a dilución 1/6000. Los resultados están expresados en ratios, OD del suero positivo entre OD del suero negativo. (*) Valor de ratio más alto. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA V.3. Titulación de conjugado : Los datos también son representados con ratios, donde también se probaron diluciones del suero positivo y negativo (Tabla Nº2). La dilución óptima fue 1:6000 con un ratio de 12,67. CONJUGADO DILUCIONES DILUCIONES DE SUERO 1/200 1/100 1/50 1/3000 4,69 3,09 5,60 1/6000 7,99 9,23 12,67 * Tabla Nº 2. Titulación del conjugado a diferentes diluciones de suero. El antígeno se trabajó a una dilución de 1/200. Los resultados están expresados en ratios, OD del suero positivo entre OD del suero negativo. (*) Valor de ratio más alto. V.4. Determinación de Sensibilidad y Especificidad : Después de encontrar la dilución óptima del antígeno, del suero, y del conjugado se procesaron los sueros controles y los casos confirmados por antecedente clínico-epidemiológico, frotis de sangre periférica y/o cultivo, y se halló el punto de corte con lo que se calculó la sensibilidad y especificidad con las fórmulas descritas anteriormente. VC= XCN + 2DS VC= 0.1 INDIVIDUOS PRUEBA (ELISA) INFECTADOS NORMALES TOTAL POSITIVO a 59 b 03 a+b 62 NEGATIVO c 27 d 48 c+d 75 a+c 86 b+d 51 n TOTAL Tabla Nº 3. Resultados serológicos hallados con dos poblaciones de individuos infectados y normales. 137 PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA RESULTADO ABREV. VALOR (%) SENSIBILIDAD S 68,6 ESPECIFICIDAD E 94,1 VALOR PREDICTIVO POSITIVO VPP 95,2 VALOR PREDICTIVO NEGATIVO VPN 64,0 Tabla Nº 4. Resultados de la evaluación de la prueba ELISA para bartonelosis hallado en el presente trabajo. La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo presentó una aceptable especificidad (94.1%), una baja sensibilidad y VPN, tal como se muestra en la Tabla N°4. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA VI. DISCUSION Pruebas de laboratorio como inmunofluorescencia (IFA), hemaglutinación indirecta (HAI) y ELISA para la detección de anticuerpos de Bartonella bacilliformis han sido desarrolladas y utilizadas en estudios epidemiológicos de áreas donde la Enfermedad de Carrión es endémica, sin embargo; su sensibilidad y especificidad no han sido determinadas y aún no existen apropiadas pruebas comerciales (10). En el presente trabajo, se empleó en la prueba ELISA antígeno total de Bartonella bacilliformis preparado a partir de cultivos en agar Columbia suplementado con 10% sangre de carnero desfibrinada a diferencia de lo reportado por Knobloch y Chamberlin (15,20) quienes emplean sangre humana desfibrinada al 5% y antígeno producido en células Vero. La preparación del antígeno se realizó siguiendo una modificación de lo señalado por Chomel y Céspedes (12,17) a fin de optimizar la prueba como lo reportado por otros autores (6,14,20,21). Sin embargo, la sensibilidad obtenida en el presente trabajo fue mucho menor a lo reportado por Regnery y col. (18,19) quien al utilizar para B.henselae las proteínas de membrana externa como antígeno obtiene 88% de sensibilidad y 94% especificidad para una prueba IFA y una sensibilidad y especificidad de 94.1 y 99.2% respectivamente para detección de anticuerpos IgM, y de 86.2 y 95.9% respectivamente para IgG. Maguiña y col. (21) describe un ELISA para B.bacilliformis con 89% sensibilidad en casos de enfermedad aguda y 100% en casos con enfermedad crónica, mientras que nuestra prueba ELISA demostró una sensibilidad de 68.6 y 94.1 de especificidad en casos agudos y crónicos. Uno de los mayores problemas de una prueba ELISA es la reacción cruzada, tal como se observó en el presente trabajo frente a sueros con brucelosis y leptospirosis principalmente. En 1985 Knobloch (15) no observó reactividad cruzada en la prueba ELISA para B.bacilliformis, sin embargo; en 1988 el mismo autor (14) reportó que el antígeno crudo de Bartonella aplicado a una ELISA reacciona con anticuerpos anti Chlamydia psitacii.. Posteriormente, se describe una prueba inmunoblot empleando antígeno total sonicado para PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA B.bacilliformis con 94% sensibilidad en enfermedad crónica y 70% en enfermedad aguda, mostrando una reacción cruzada principalmente con brucellosis (6), tal como se observó en el presente trabajo. VII. CONCLUSIONES Esta información indica que pruebas serológicas para B.henselae, B.quintana y B.bacilliformis pueden ser útiles clínica y epidemiológicamente pero se requieren estudios de optimización y validación clínica. La especificidad para la determinación de anticuerpos con antígeno crudo de Bartonella debería ser confirmada con otras pruebas como inmunoblot o inmunoprecipitación (14) La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo no es una prueba idónea para ser usada como herramienta diagnóstica en bartonelosis ya que a pesar de su aceptable especificidad (94.1%) presentó una baja sensibilidad (68.6) y VPN (64.0). Teniendo en cuenta la importancia de la Bartonelosis en Perú, el INS continuará los estudios hacia la búsqueda de una prueba rápida con mayor sensibilidad para ser aplicada como herramienta diagnóstica y que nos permita detectar anticuerpos antibartonela. PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA VIII. BIBLIOGRAFIA 1. Pachas P. Enfermedad de Carrión (Bartonelosis) en el Perú. Ministerio de Salud, Oficina General de Epidemiologia y Instituto Nacional de Salud 2001. 2. 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