PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS - BVS

MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR
ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO
DE BARTONELOSIS: ELISA INDIRECTA
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº63
BLGO. ELIZABETH ANAYA RAMÍREZ
BLGO. GIOVANNA MENDOZA MUJICA
BLGO. LOURDES GARCÍA USCAMAYTA
TÉC. LAB. YSABEL FERNÁNDEZ SILVA
2006
PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA
INDIRECTA
I.
IDENTIFICACION
Código del proyecto OGITT: 2-01-05-04-044
Centro de Referencia: Centro Nacional de Salud Pública
Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas
Título del Proyecto: “Prueba rápida para detectar anticuerpos para el diagnóstico de bartonelosis: ELISA
indirecta”
Autores:
Blgo. Elizabeth Anaya Ramírez
Blgo. Giovanna Mendoza Mujica
Blgo. Lourdes García Uscamayta
Téc. Lab. Ysabel Fernández Silva
Lugar de ejecución:
Distrito de Caraz (trabajo de muestreo)
Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud (diagnostico serológico)
Año de ejecución: 2006
PRUEBA RÁPIDA PARA DETECTAR ANTICUERPOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BARTONELOSIS: ELISA
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II.
RESUMEN:
Objetivo: Definir la sensibilidad y especificidad de un método ELISA para el diagnóstico rápido de
bartonelosis en Caraz-Ancash, zona endémica de Perú. Material y Métodos: En julio del año 2006 se
tomaron muestras biológicas (frotis, sangre y suero) a 125 personas procedentes de una zona endémica para
la Enfermedad de Carrión como es el distrito de Caraz, departamento de Ancash. Asimismo fueron
seleccionados sueros de la seroteca-2006 del Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas correspondientes a 51
personas procedentes de zonas no endémicas y sin antecedente clínico- epidemiológico para bartonelosis.
Finalmente se seleccionaron 32 sueros de pacientes con diagnóstico serológico confirmado para otras
enfermedades bacterianas como brucelosis, leptospirosis, sífilis y rickettsiosis. Se utilizó como antígeno para
la prueba ELISA indirecta, un lisado total de Bartonella bacilliformis procedentes de una cepa ATCC y un
aislamiento 2005-INS de Perú. Resultados: Se encontró que 86 de las 125 personas muestreadas
presentaron antecedente clínico-epidemiológico y/o frotis positivo a bartonelosis. La prueba ELISA indirecta
mostró una Sensibilidad de 68.6% (59/86), una Especificidad de 94.1% (48/51), un VPP de 95.2% (59/62), un
VPN de 64.0% (48/75) y una reacción cruzada con otras etiologías bacterianas de 78.1% (25/32).
Conclusiones: La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente
trabajo no es una prueba idónea para ser usada como herramienta diagnóstica en bartonelosis ya que a pesar
de su aceptable especificidad (94.1%) presentó una baja sensibilidad y VPN. Teniendo en cuenta la
importancia de la Bartonelosis en Perú, el INS continuará los estudios hacia la búsqueda de una prueba
rápida con mayor sensibilidad para ser aplicada como herramienta diagnóstica y que nos permita detectar
anticuerpos antibartonela.
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III.
INTRODUCCION
La enfermedad de Carrión es una enfermedad autóctona de nuestro país, es causada por Bartonella
bacilliformis una bacteria pleomorfica, intracelular gram negativa, aeróbica, unipolar con 2 a16 flagelos que
crece lentamente en medio de agar sangre base columbia (1), que es transmitida principalmente por un
mosquito de la especie Luztzomya verrucarum (2,3,4). La enfermedad se caracteriza por tener 3 fases; fase
anémica, que se caracteriza por la anemia severa y la presencia de fiebre; el periodo intercalar, donde
persiste la anemia pero la fiebre desaparece y la fase eruptiva, donde aparecen la erupción acompañada de
síntomas leves como malestar general, cefaleas, etc (5,6,7). La sospecha clínica de bartonelosis en Perú se
confirma en el laboratorio por aislamiento en agar sangre base columbia, lectura de láminas o frotis
sanguíneo, las cuales detectan a la bacteria con una limitada sensibilidad (1,3,6,8,9,10). Sin embargo, un
inadecuado diagnóstico clínico, la deficiente conservación de muestras en su traslado a los centros de
referencia o, la muerte del paciente antes de tomar la muestra disminuyen la sensibilidad de los métodos ó
impiden la realización de dichas pruebas.
En otros países circulan otras especies de Bartonella y cuentan con técnicas serológicas estandarizadas
entre las cuales se pueden mencionar Inmunofluorescencia (IFI), ELISA y Western blot (WB)
(11,12,13,6,10,14,15). Estas pruebas aparte de ser utilizadas como diagnostico de enfermedades como el
Arañazo del gato, también son utilizadas para estudios de seroprevalencia. En Perú también circulan algunas
de éstas especies (B. henselae y B. quintana) y en mayor proporción la B. bacilliformis, sin embargo; aún no
se cuenta con pruebas serológicas como herramientas de diagnóstico.
La bartonelosis sigue avanzando a lo largo de los diferentes departamentos del país, por ello es necesario
realizar estudios de seroprevalencia que nos permiten determinar la magnitud y dinámica de la enfermedad
(1). Dentro de las técnicas que se utilizan para hacer este tipo de estudios es el western blot (11,14, ) y
ELISA (12,6,10,13,15).
El western blot es una técnica altamente sensible y especifica pero implica métodos complejos y caros,
difíciles de manejar en laboratorios regionales, en contraste con la técnica de ELISA altamente sensible y de
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menor especificidad, de bajo costo y de fácil implementación (16). En nuestro país se han realizado pocos
estudios de este tipo por lo que no ha sido posible determinar la dinámica de la infección en zonas
endémicas, esto se debe a que no hay una prueba rápida y estandarizada para B. bacilliformis que sea
suficientemente sensible para realizar este tipo de estudios (1).
La detección de anticuerpos de bartonelosis a partir de muestras de sueros, constituiría una prueba rápida de
enorme utilidad para el diagnóstico de ésta enfermedad de importancia pública en nuestro país donde la
letalidad sigue siendo alta y es más frecuente cuando se presenta en forma de brotes en áreas nuevas de
transmisión, así tenemos Shumpillan (Ancash) 88%, Quillabamba 18.8% (2), Valle sagrado de los Incas 23%,
Cajamarca 11% (1).
En éste trabajo notificaremos la sensibilidad y especificidad de un método ELISA empleando antígeno crudo
total de B. bacilliformis.
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IV.
MATERIAL Y METODOS:
En julio del año 2006 fueron colectados muestras biológicas correspondientes a frotis, sangre y suero de 125
personas con antecedente clínico-epidemiológico procedentes del distrito de Caraz, departamento de Ancash.
Todas las muestras fueron procesadas en el laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de
Salud.
Sueros : Se colectaron 125 sueros de pacientes con antecedente clínico-epidemiológico de bartonelosis
procedentes de Caraz, zona endémica de Ancash. Los casos positivos están documentados por antecedente
clínico-epidemiológico, frotis de sangre periférica y/o cultivo.
51 sueros de personas sin antecedente clínico-epidemiológico de bartonelosis procedentes de Loreto, Madre
de Dios, Junín, Chiclayito-Piura y Lima, sin antecedente de haber viajado a zonas endémicas, fueron
seleccionados como controles negativos a partir de la seroteca-2006 del Laboratorio de Metaxénicas
Bacterianas. Para evaluar la reacción cruzada (especificidad) se utilizaron 32 sueros confirmados como
positivos para otras enfermedades como: brucelosis, leptospirosis, sífilis, y rickettsiosis, confirmadas por
clínica y serología.
Cepa y/o antígeno : Bartonella bacilliformis del American Type Culture Collection (ATCC 35685) y cepa
1155-INS procedente de un aislamiento 2005 de Huarochirí-Lima área de Perú donde la Bartonelosis es
endémica y que ha sido confirmada por cultivo y técnicas moleculares, fueron cultivadas en medio bifásico
agar sangre base columbia suplementado con 10% sangre de carnero desfibrinada como fase sólida y RPMI
como fase líquida (1), se realizaron subcultivos en 10 placas con agar sangre base columbia, incubadas a
28°+/- 1°C y cosechadas entre el séptimo y décimo día. Las colonias de B.bacilliformis pequeñas,
transparentes con apariencia de gotas de rocío, de crecimiento confluente fueron resuspendidas en buffer
PBS a pH 7.4. Cada cepa de Bartonella fue cosechada y lavada por centrifugación a 2500 rpm x 5 minutos
con buffer PBS pH 7,4 por tres veces. El pellet fue resuspendido en buffer hepes pH 7.4 (12) y sometido a
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lisis mediante sonicación a 0.8 mA, 20 Kz durante 1 minuto por 5 veces con intervalos de 1 minuto, el
antígeno total lisado se mantiene en condiciones de refrigeración durante todo el procesamiento de lisis (17).
Finalmente se sometió a 2 lavados por ultracentrifugación de 32700 rpm x 60 min. (12) El pellet obtenido es
finalmente resuspendido en agua destilada estéril a partir del cual se realizó el dosaje de proteínas por el
método de Lowry (16).
Ensayo inmunoenzimático. De cada concentración de antígeno total de B. bacilliformis, se preparó
diluciones con solución PBS 1X pH 7.2-7.4 para obtener concentraciones finales de 1/100, 1/200 y 1/400
equivalentes a 5ug/ml, 2.5 ug/ml y 1.25 ug/ml, las que son impregnadas en cada pocillo de las tiras ELISA
fondo plano (Inmulon) con 100ul de cada dilución de antígeno e incubándolas por toda la noche a 4°C.
Utilizando un lavador de microplacas (Labsystem modelo Multiwash II) las tiras ELISA son sometidas al
proceso de lavado por 5 veces con solución PBS 1X ph 7.2–7.4 + 0.05% de Tween 20 (sigma). En la fase de
bloqueo se utiliza 100ul para cada pocillo de solución PBS ph 7.2-7.4 + 3% de skim milk (difco) por una hora a
37°C. Realizar el proceso de lavado y conservar las tiras ELISA bloqueadas a -20°C hasta su uso. Cada vez
que se utilice las tiras ELISA impregnadas y bloqueadas se retiran de la congeladora y se deja a temperatura
ambiente por 10-20 minutos antes de la corrida.
Se prepararon 3 diluciones de cada suero (1/50, 1/100 y 1/200) en solución PBS pH 7.2-7.4 y se agrega
100ul de cada pocillo, dejando en incubación a 37°C por una hora (12,17)
Lavar las tiras ELISA y añadir a cada pocillo 100ul de conjugado IgG anti-humano unido a enzima peroxidasa
(Sigma) preparado en PBS pH 7.2-7.4 en concentraciones de 1/3000 y 1/6000 , se deja incubar a 37°C por
30 minutos. Realizar el proceso de lavado, adicionar 100ul de solución cromófora ABTS (Calbiochem) e
incubar por 30 min. a 37°C. Finalmente agregar 100ul de solución de parada SDS al 1 % y realizar las
lecturas con un lector ELISA (Thermolabsystems) con filtro de 405 nm y filtro referencial de 630 nm.
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ANALISIS DE DATOS
Obtenidas las lecturas, se procedió a analizar los datos para obtener los valores de Especificidad,
Sensibilidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo de la prueba, aplicando las siguientes
fórmulas:
Valor de Corte ( VC )
Se procedió a realizar el cálculo del Valor de corte en base a las lecturas de los controles negativos y
positivos obtenidos.
VC= XCN + 2DS
Sensibilidad ( Se )
Se =
Positivos
Positivos verdaderos + falsos negativos
Especificidad ( E )
E=
Negativos
Negativoss verdaderos + falsos positivos
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V.
RESULTADOS
V.1. Cepa y/o antígeno : Para elegir la dilución de antígeno apropiada se obtuvo 510 µg/ml de concentración
proteica con una producción en masa de antígeno de Bartonella bacilliformis del American Type Culture
Collection (ATCC 35685) y cepa 1155-INS.
V.2. Titulación de antígeno : Se probaron 3 diferentes diluciones seriadas (Tabla Nº1), de las cuales se
obtuvieron valores de densidad óptica (OD) del suero positivo y del suero negativo. Se determinó la mejor
dilución dividiendo el valor del OD del suero positivo entre el valor del OD del suero negativo, con el fin de
obtener una valor (ratio) que represente la dilución optima a la cual el valor del OD del positivo se separa más
del valor del OD del negativo. Además se probaron estas diluciones a distintos diluciones del suero positivo y
del suero negativo. De ésta manera se halló que la dilución óptima del antígeno fue 1/200 con un ratio de
12,67 a una dilución de suero de 1/50. (Tabla Nº 1)
ANTIGENO
DILUCIONES
DILUCIONES DE SUERO
1/200
1/100
1/50
1/100
5,07
7,08
11,47
1/200
7,99
9,23
12,67 *
1/400
7,26
9,52
12,22
Tabla Nº 1. Titulación de antígeno a diferentes concentraciones de suero, el conjugado se trabajo a dilución
1/6000. Los resultados están expresados en ratios, OD del suero positivo entre OD del suero negativo. (*) Valor
de ratio más alto.
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V.3. Titulación de conjugado : Los datos también son representados con ratios, donde también se probaron
diluciones del suero positivo y negativo (Tabla Nº2). La dilución óptima fue 1:6000 con un ratio de 12,67.
CONJUGADO
DILUCIONES
DILUCIONES DE SUERO
1/200
1/100
1/50
1/3000
4,69
3,09
5,60
1/6000
7,99
9,23
12,67 *
Tabla Nº 2. Titulación del conjugado a diferentes diluciones de suero. El antígeno se trabajó a una
dilución de 1/200. Los resultados están expresados en ratios, OD del suero positivo entre OD del
suero negativo. (*) Valor de ratio más alto.
V.4. Determinación de Sensibilidad y Especificidad : Después de encontrar la dilución óptima del antígeno,
del suero, y del conjugado se procesaron los sueros controles y los casos confirmados por antecedente
clínico-epidemiológico, frotis de sangre periférica y/o cultivo, y se halló el punto de corte con lo que se calculó
la sensibilidad y especificidad con las fórmulas descritas anteriormente.
VC= XCN + 2DS
VC= 0.1
INDIVIDUOS
PRUEBA (ELISA)
INFECTADOS
NORMALES
TOTAL
POSITIVO
a
59
b
03
a+b
62
NEGATIVO
c
27
d
48
c+d
75
a+c
86
b+d
51
n
TOTAL
Tabla Nº 3. Resultados serológicos hallados con dos poblaciones de individuos
infectados y normales.
137
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RESULTADO
ABREV.
VALOR (%)
SENSIBILIDAD
S
68,6
ESPECIFICIDAD
E
94,1
VALOR PREDICTIVO POSITIVO
VPP
95,2
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO
VPN
64,0
Tabla Nº 4. Resultados de la evaluación de la prueba ELISA para bartonelosis
hallado en el presente trabajo.
La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo
presentó una aceptable especificidad (94.1%), una baja sensibilidad y VPN, tal como se muestra en la
Tabla N°4.
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VI.
DISCUSION
Pruebas de laboratorio como inmunofluorescencia (IFA), hemaglutinación indirecta (HAI) y ELISA para la
detección de anticuerpos de Bartonella bacilliformis han sido desarrolladas y utilizadas en estudios
epidemiológicos de áreas donde la Enfermedad de Carrión es endémica, sin embargo; su sensibilidad y
especificidad no han sido determinadas y aún no existen apropiadas pruebas comerciales (10).
En el presente trabajo, se empleó en la prueba ELISA antígeno total de Bartonella bacilliformis preparado
a partir de cultivos en agar Columbia suplementado con 10% sangre de carnero desfibrinada a diferencia
de lo reportado por Knobloch y Chamberlin (15,20) quienes emplean sangre humana desfibrinada al 5% y
antígeno producido en células Vero. La preparación del antígeno se realizó siguiendo una modificación de
lo señalado por Chomel y Céspedes (12,17) a fin de optimizar la prueba como lo reportado por otros
autores (6,14,20,21). Sin embargo, la sensibilidad obtenida en el presente trabajo fue mucho menor a lo
reportado por Regnery y col. (18,19) quien al utilizar para B.henselae las proteínas de membrana externa
como antígeno obtiene 88% de sensibilidad y 94% especificidad para una prueba IFA y una sensibilidad y
especificidad de 94.1 y 99.2% respectivamente para detección de anticuerpos IgM, y de 86.2 y 95.9%
respectivamente para IgG.
Maguiña y col. (21) describe un ELISA para B.bacilliformis con 89% sensibilidad en casos de enfermedad
aguda y 100% en casos con enfermedad crónica, mientras que nuestra prueba ELISA demostró una
sensibilidad de 68.6 y 94.1 de especificidad en casos agudos y crónicos. Uno de los mayores problemas
de una prueba ELISA es la reacción cruzada, tal como se observó en el presente trabajo frente a sueros
con brucelosis y leptospirosis principalmente. En 1985 Knobloch (15) no observó reactividad cruzada en la
prueba ELISA para B.bacilliformis, sin embargo; en 1988 el mismo autor (14) reportó que el antígeno
crudo de Bartonella aplicado a una ELISA reacciona con anticuerpos anti Chlamydia psitacii..
Posteriormente, se describe una prueba inmunoblot empleando antígeno total sonicado para
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B.bacilliformis con 94% sensibilidad en enfermedad crónica y 70% en enfermedad aguda, mostrando una
reacción cruzada principalmente con brucellosis (6), tal como se observó en el presente trabajo.
VII.
CONCLUSIONES
Esta información indica que pruebas serológicas para B.henselae, B.quintana y B.bacilliformis pueden ser
útiles clínica y epidemiológicamente pero se requieren estudios de optimización y validación clínica.
La especificidad para la determinación de anticuerpos con antígeno crudo de Bartonella debería ser
confirmada con otras pruebas como inmunoblot o inmunoprecipitación (14)
La prueba rápida ELISA indirecta para detectar anticuerpos y estandarizada en el presente trabajo no es una
prueba idónea para ser usada como herramienta diagnóstica en bartonelosis ya que a pesar de su aceptable
especificidad (94.1%) presentó una baja sensibilidad (68.6) y VPN (64.0). Teniendo en cuenta la importancia
de la Bartonelosis en Perú, el INS continuará los estudios hacia la búsqueda de una prueba rápida con mayor
sensibilidad para ser aplicada como herramienta diagnóstica y que nos permita detectar anticuerpos
antibartonela.
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VIII.
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