Informe Frec Mutac asociadas a R-TB - BVS-INS

Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
Centro Nacional de Salud – INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
TITULO:
FRECUENCIA
DE
MUTACIONES
GENÉTICAS
ASOCIADAS
MULTIDROGORESISTENCIA EN Mycobacterium tuberculosis
Autor
Blg. Roger Iván Calderón Espinoza
Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. Instituto Nacional de Salud.
Av. Defensores del Morro 2268. Chorrillos, Lima 9 - Peru
Tlfn (511) 2516151 Anx 424
Fax (511) 2516151 Anx 541
Movil. (511)-99397772
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Frecuencia de mutaciones genéticas asociadas a multidrogoresistencia en Mycobacterium tuberculosis
A
Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
Centro Nacional de Salud – INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RESUMEN
Organización: Pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar procedentes de
comunidades de alta incidencia de tuberculosis resistente en Lima.
Objetivo: Determinar la frecuencia de las mutaciones involucradas a la resistencia a
las principales drogas de M. tuberculosis y evaluar la capacidad predictiva de
resistencia y multidrogoresistencia en pacientes nunca tratados y antes tratados.
Diseño: Determinar la secuencia nucleotídica de regiones de los genes asociadas con
resistencia antituberculosa en M. tuberculosis y analizar la capacidad predictiva de la
presencia de mutaciones y su aplicabilidad en el diseño de estrategias de detección de
multidrogoresistencia a partir de mutaciones alelo-específicas.
Resultados: Se determino la secuencia nucleotídica en aislamientos de MTB
procedentes de pacientes con diagnóstico de TB Pulmonar BK[+]. La frecuencia de
mutaciones para el gen rpoB (n= 88) fue 68.2% para el codón 531 (S531L), 17% para
el codón 526 y 14.8% para el codón 516. En katG (n=95), 46.3% de los aislamientos
resistentes a isoniacida presentaron la mutación S315T y en el gen rpsL (n=80) las
mutaciones en el codon 43 (Lys →Arg), 88 (Lys →Thr) presentaron una frecuencia de
8,8 % cada una. Además se determino la variabilidad genética a 38 aislamientos de
MTB MDR mediante Spoligotyping encontrándose 02 cepas con genotipo Beijiing, así
como representantes del genotipo LAM (Latinoamericano 1 y 9), Harlem (1 y 3), y T1.
Conclusión: Este trabajo permitió la determinación de cambios nucleotídicos
responsables de la resistencia a tres drogas antituberculosas de primera linea, lo cual
puede explicar las diferencias en los regímenes terapéuticos y tasas de cumplimiento
de tratamiento en cada una de las regiones evaluadas. Estos resultados pueden
orientar la aplicación de metodologías de detección de resistencia mediante el análisis
alelo específico contribuirá con el control de la tuberculosis, identificando correcta y
oportunamente a los pacientes infectados con bacilos resistentes y MDR, permitiendo
la reducción de casos de TB y TB resistente en nuestro país.
Palabras Clave: Tuberculosis multiresistente; validación, PCR UHG-Rif
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INTRODUCCIÓN
La resistencia antimicrobiana en Mycobacterium tuberculosis (MTB) emerge por subóptimos tratamientos y amenaza a los esquemas de tratamiento (DOTS: Direct
Observed treatment short course), disminuyendo así la efectividad del control de la
enfermedad. En nuestro país, la resistencia a drogas del MTB afecta al 17.8 % y
23.5% % de los casos de TB nunca tratados y antes tratados respectivamente. Los
pacientes infectados con MTB resistente o MDR presentan una menor efectividad de
curación, por lo que se busca un tratamiento alternativo, que pueda controlar
efectivamente la TB MDR a pesar de la actual terapia cuyo proncipál objetivo es
disminuir la emergencia de mutantes (Rattan y col., 1998) muy a pesar de la presión
selectiva generada (Long, 2000).
En el caso de pacientes en los que se ignora que contienen cepas resistentes, el
régimen terapéutico inicial es inefectivo (Ramaswamy y Musser, 1998). Así la
incapacidad de la detección temprana de pacientes con cepas resistentes se convierte
en un factor principal de la generación de cepas de MTB-MDR (Rattan y col., 1998).
La identificación temprana de los pacientes resistentes es una meta por lograr. La
detección molecular de la resistencia por PCR-SSCP y PCR heteroduplex es rápida
(Williams y col., 1995). Pero en TB, la resistencia es debida por cambios nucleotídicos
en la secuencia nucleotídica de los genes blancos de las drogas. Dado que la
aparición de mutaciones sigue un patrón característico, el presente trabajo intenta
describir la frecuencia de mutaciones que representen el mayor porcentaje de
aislamientos resistentes y MDR de dos zonas de Lima.
La inespecificidad, inexactitud y demora en el diagnóstico tienen un serio impacto tanto
para el paciente como para los programas de control. Los esquemas de tratamiento
requieren de métodos diagnósticos que puedan determinar la resistencia primaria y
adquirida, lo cual optimizaría el control de la enfermedad.
Dado que los existentes sistemas de detección de resistencia son muy lentos, es
necesario que el desarrollo e implementación de nuevas estrategias de detección
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temprana de la resistencia antituberculosa, ya que proporcionarán la información en el
tiempo adecuado, lo cual permitirá dirigir con eficacia el tratamiento antituberculoso.
En nuestro país no existen métodos de detección rápida, altamente sensibles y
específicos para la detección de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a
medicamentos. Nuestros resultados servirán para detectar las mutaciones más
frecuentes encontradas en los bacilos tuberculosos encontrados en una muestra
poblacional de pacientes procedentes de regiones con alta incidencia de resistencia y
drogoresistencia. Cada mutación genética frecuente puede consolidarse como un
marcador de resistencia para los nuevos sistemas de tamiz en la detección de la
resistencia a drogas en pacientes con tuberculosis.
El tratamiento de enfermedades infecciosas con combinaciones de efectivos
antibióticos es un método comprobado que limita la emergencia y la diseminación de
nuevos o ya existentes patógenos antibiótico-resistentes (Williams y Gillis 1999). La
resistencia a la rifampicina es resultado de mutaciones que ocurren en una discreta
región central del gen rpoB, de aproximadamente 69 pb ubicado entre los codones 507
al 533 (Musser, 1995), las cuales confieren cambios conformacionales que dirigen a
una unión defectiva de la droga. Por su parte la resistencia a isoniacida está asociada
con una variedad de mutaciones que afectan a uno o más genes tales como los que
codifican a la catalasa-peroxidasa (katG), una proteína envuelta en la síntesis de ácido
micólico (inhA) y un gen recientemente descrito que codifica una alquil-hidroperóxido
reductasa (ahpC), y que esta envuelto en la respuesta celular al estrés oxidativo
(Telenti y col., 1997). La resistencia
a etambutol y pirazinamida por su parte se
caracterizan por la aparición de mutaciones en los genes embA-B y pncA-B, y por
último, las mutaciones en los genes rpsL, gyrA y rrs generan la resistencia a
estreptomicina (Musser, 1995).
Dado que la aparición de mutaciones sigue un patrón característico, el presente
trabajo intenta describir la frecuencia de mutaciones que representen el mayor
porcentaje de aislamientos resistentes y MDR de dos zonas de Lima.
Para ello se hará un monitoreo de la secuencia nucleotídica de los genes asociados a
la resistencia a las principales drogas antituberculosas y finalmente se evaluará la
capacidad predictiva que tengan los distintos cambios nucleotídicos en la resistencia o
MDR antituberculosa. La información obtenida será útil para el establecimiento de
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nuevos métodos diagnósticos para la detección temprana y específica de
Mycobacterium tuberculosis resistentes y MDR, los cuales sean útiles, a mediano
plazo, para el mejoramiento y optimización del control de la enfermedad en el país.
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OBJETIVOS
•
Determinar la frecuencia de las mutaciones involucradas a la resistencia a las
principales drogas a partir aislamientos de M. tuberculosis provenientes de
pacientes con tuberculosis pulmonar resistente y multidrogoresistente.
-
Determinar las mutaciones en los principales genes implicados en la
resistencia a drogas antituberculosas (rpoB, katG y rpsL) en aislamientos
resistentes y multidrogoresistentes de M. tuberculosis.
-
Determinar la frecuencia de mutaciones asociada a la resistencia y
multidrogoresistencia
-
Evaluar la capacidad predictiva de resistencia y multidrogoresistencia, de
las mutaciones encontradas en pacientes nunca tratados y antes tratados.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño experimental
Se realizó un estudio observacional para determinar la frecuencia de mutaciones
encontradas en los genes rpoB, katG y rpsL de Mycobacterium tuberculosis resistente
a drogas (rifampicina, isoniacida y streptomicina. La selección de aislamientos
resistentes fue realizada siguiendo el resultado de susceptibilidad antituberculosa por
el método de proporciones de Canetti y col. variante económica.
Las muestras clínicas fueron obtenidas en los Laboratorios de Referencia de las
Direcciones Regionales de Lima Este y de Lima Ciudad. Los procedimientos de cultivo
y susceptibilidad antituberculosa fueron realizados en el Laboratorio de Referencia
Nacional de Micobacterias; mientras que el PCR Secuenciamiento fue realizado en el
Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, del Instituto Nacional de Salud.
Población y reclutamiento de los participantes
La muestra fue conformada por pacientes procedentes de dos localidades de Lima,
cuyos registros indicaron una elevada tasa de TB-resistente. Los casos incluidos
fueron pacientes con diagnóstico de TB pulmonar con baciloscopía positiva, siendo
nunca tratados pero con antecedente de contacto de tuberculosis resistente, o antes
tratados (recaída, fracaso o abandono). Además de ello debieron presentar un
resultado de resistencia a por lo menos una droga antituberculosa.
Procedimientos
Un volumen de 3 mL de cada muestra de esputo fue descontaminado con NaOH/N–
acetil–L–cisteína, neutralizada, resuspendida en buffer fosfato9, una tercera parte fue
separada e inactivada por calentamiento a 95°C dura nte 15 minutos. Luego para
asegurar una máxima pureza y conservación, el ADN genómico fue purificado
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mediante el protocolo para lisados celulares usando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen,
Hilden, Germany).
Mediante el uso de un Termociclador PE Applied Biosystem 2400, un fragmento de
195 pb del gen rpoB fue amplificado usando oligonucleótidos reportados por Whelen y
col (1995). La amplificación de las regiones en el gen katG, involucrada en la
resistencia a isoniacida fue realizada usando los oligonucleótidos reportados por
Telenti y col, 1997. Por su parte la secuencia del gen rpsL fue amplificada usando los
primers reportados por Victor y col., (1998).
Usando 5 ng de ADN genómico de cada aislamiento como molde se realizaron las
amplificacioines y luego los productos fueron purificados y su secuencia nucleotídica
fue determinada en el secuenciador automático ALF Express de Amersham Pharmacia
Biotech del Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Instituto Nacional de
Salud e interpretadas en el software ALFWin TM Sequence Analyser 2.0 1998.
Ensayo de genotipificación mediante Spoligotyping
Fue usado un kit comercialmente disponible (Isogen Bioscience BV, Maarssen, The
Netherlands) de acuerdo a como es descrito en el manual de procedimientos. En
resumen, se amplificaron unas regions especiadores intergenicos con los primers DRa
and DRb con un set de 43 oligonucleotidos spaciadores derivados de las secuencias
especiadoras de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis P3. Los productos fueron
hibridizados en una membrane pre cubierta y las señales fueron detectadas por
quimioluminiscencia.
Analisis de los perfiles fue realizado por coparacion en la base de datos de
spoligotipos (CDC) definiendo claramente los genotipos y lineajes.
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RESULTADOS
95 muestras de esputo frotis positivos fueron analizadas mediante secuenciamiento de
los genes katG, 88 muestras fueron analizadas para el gen rpoB y 80 para el gen rpsL.
Estas muestras de esputo fueron obtenidas de pacientes con tuberculosis pulmonar
analizando sólo aquellas muestras en las cuales los resultados presentaron resistencia
a por lo menos las drogas rifampicina, isoniacida y estreptomicina y en las que
pudieron completarse la amplificación por PCR.
El perfil de susceptibilidad antituberculosa encontrada en los aislamientos procedentes
de los pacientes de Lima Ciudad y Lima Este muestra que la resistencia a isoniacida
se presentó en un 59.4%, a rifampicina en 56.1%, a estreptomicina en 52.2% y la
multidrogoresistencia se presento en 53.9%. En los pacientes nunca tratados se
encontro que la resistencia a isoniacida se presentó en 35.6%, rifampicina en 28.9%,
estreptomicina en 33.3% y la MDR 28.9%. Por su parte en los pacientes antes tratados
se encontró que la resistencia a isoniacida se presentó en 67.4%, a rifampicina en
65.2%, estreptomicina en 58.5% y la MDR 62.2%.
El análisis de la secuencia del gen katG mostró que el codon 315 presento mutaciones
en el 46.3% de las muestras analizadas. El cambio nucleotídico S315T presentó una
frecuencia del 44.2%, mientras que el cambio nucleotídico S315N presentó sólo una
frecuencia del 2.1%.
El análisis de la secuencia del gen rpoB mostro que el codon 531 presento mutaciones
en el 68.2% de las muestras analizadas. El cambio nucleotídico S531L presentó una
frecuencia del 67.05%, mientras que el cambio nucleotídico S531W presentó una
frecuencia del 1.14%. Así mismo el codon 526 presentó mutaciones en el 12.5% de las
muestras analizadas, teniendo el cambio nucleotidico H526R una frecuencia de
5.68%, el cambio H526L presentó una frecuencia de 3.41%.Por su parte el codon 516
presento mutaciones en el 14.8% de las muestras analizadas, teniendo el cambio
nucleotídico D516V una frecuencia del 9.09%, y los cambios D516G y D516Y una
frecuencia de 3.41% y 2.27% respectivamente.
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El análisis de la secuencia del gen rpsL mostró que los codones 43 y 88 presentaron
mutaciones en una frecuencia de 8.8% cada una.
Es importante señalar que una pequeña proporción de muestras analizadas no
presentaron mutaciones (< 2%) en la región analizada mientras que fueron resistentes
por el método estándar de determinación de susceptibilidad antituberculosa.
El análisis de spoligotyping fue realizado en 38 aislamientos seleccionados de acuerdo
a su resultado de susceptibilidad antituberculosa. Los aislamientos analizados fueron
multidrogoresistentes que procedían indistintamente de Lima Ciudad y Lima Este. Los
patrones geneticos mostrados por el análisis mencionado se muestran en la Fig. Nº 1.
En ella se pueden observar la variabilidad geneática de los perfiles obtenidos, tales
que comparados con las base de datos internacionales mostraron los lineajes
LatinoAmericano (LAM3, LAM9); T1, Haarlem (Haa1 y Haa3) y el linaje Beijing (02
individuos).
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DISCUSIÓN
El análisis nucleotídico de los genes rpoB, katG y rpsL han permitido explicar
ampliamente el mecanismo asociado a la resistencia tanto a rifampicina, isoniacida y
estreptomicina, respectivamente. En este trabajo, la mayor parte de los individuos
analizados ha mostrado una adecuada concordancia entre la presencia de mutaciones
en esos genes y la aparicion de resistencia a los fármacos antituberculosos
mencionados.
Un muy bajo porcentaje de casos analizados no ha presentado mutaciones en la
region analizada pudiendo entonces localizarse en diferentes lugares o fuera de las
denominadas “regiones calientes”, fuertemente asociadas a fármaco-resistencia. Tal
es el caso de la presencia de mutaciones en el gen rpoB, el 1% de los casos
analizados no mostraron mutaciones en la region de 81pb, pudiendo corresponder con
mutaciones en los codones 176 y otras fuera del cluster I, tal y como es reportado en
trabajos anteriores. En el caso de isoniacida, la presencia de otros genes asociados a
resistencia, tales como los genes ahpC, el gen inhA así como su región reguladora, el
gen kasA, entre otras presentan responsabilidad alguna en la determinación de la
resistencia. Sin embargo tambien existe la posibilidad de encontrar mutaciones en el
codon 463 en el gen katG que podría explicar la baja tasa de mutagénesis del codon
315 para el caso de resistencia a este fármaco antituberculoso de suma importancia
en la terapia.
La presencia de mutaciones en los codones 516, 526 y 531 en el gen rpoB es
completamente excluyente entre ellas. Sin embargo se han encontrado acompañadas
por mutaciones silenciosas o aquellas que no conducen a un cambio aminoacidico en
la proteína “blanco” del fármaco, en los codones 532 y 533.
Es importante anotar que la presencia de mutaciones en el codon 315 del gen katG es
mas frecuente en la población multidrogoresistente en antes tratados (46.8%) que en
nunca tratados (37.5%). Asi tambien el cambio S315N se dio solo en el 2.5% de los
casos antes tratados.
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Algunos estudios con modelos animales han determinado la importancia de
aislamientos pertenecientes al lineaje Beijing, debido a su alto grado de virulencia, sin
embargo la investigación de las características de diseminación y epidemiología de
estos lineajes se ha encontrado restringida debido a que la metodología de
determinación de perfiles mediante RFLP presenta algunas limitaciones.
Sin embargo, el spoligotyping se presenta como una estrategia rápida en la
determinacion de lineajes, lo cual puede establecer prevalencia y entender la dinamica
de diseminación de cepas.
La prevalencia de Beijing es muy baja en Sudamérica (2%); de 3 a 5% en Centro
América, Europa y África; 10% en el medio Oriente; 13% en Oceanía; 16% en Norte
America y entre el 45 y 86% en los países del asiaticos. Por su parte existe tambien
una importante diseminación del genotipo Haarlem (H), en países de Europa, mientras
que en Sud America en donde el genotipo T y LAM tienen una prevalencia superior (30
y 50% respectivamente), sugiriéndose que el lineaje H pudo haber ingresado a
Sudamérica luego de la colonización europea. El ingreso de estos genotipos y su
elevada diseminación en estos últimos tiempos puede explicar fenómenos aun no bien
definidos como la alteración e incremento de los niveles de multidrogoresistencia en el
país, por lo que es necesario construir nuevas investigaciones orientadas a vigilar,
prevenir y controlar la transmisión de cepas pertenecientes principalmente a genotipos
como Beijing, ya que pueden desestabilizar el éxito obtenido por los actuales
programas de tratamiento de la tuberculosis en el país.
Finalmente, mediante este trabajo estaría demostrando la potencial utilidad de los
ensayos basados en la determinación de la susceptibilidad antituberculosa mediante el
screening o tamizaje de mutaciones en los genes asociados a resistencia. Sólo la
deteccion de mutaciones en los codones 516, 526 y 531 del gen rpoB puede detectar
al 95.5% de los casos resistentes a rifampicina, mientras tanto que el barrido de
deteccion en la region completa desde el codon 507 a 542 podría identificar al 98.9%
de los casos resistentes a la droga y perfectamente a todos los MDR.
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El desarrollo de ensayos como Inno LiPA y PCR Alelo-específico presentarán sus
diferencias en la identificación de pacientes con TB MDR en laboratorios de países en
desarrollo, colocando al PCR-UHG Rif o Deteccion por hibridación alelo específica en
una adecuada posición como herramienta de laboratorio aplicada al diagnóstico de TB
resistente. La implementación podría permitir la correcta identificación y diagnóstico de
pacientes con TB MDR en pacientes con alta sospecha de tuberculosis resistente en la
comunidad, tales como los pacientes antes tratados y contactos de pacientes con
tuberculosis resistente que provengan de algunas zonas de los distritos de Lima y
Callao, en donde se hayan ubicado bolsones de TB y TB–resistente, así también como
aquellos pacientes hospitalizados, presidiarios, VIH positivos, que conforman
reconocidos grupos de riesgo para TB MDR, favoreciéndose la oportunidad de recibir
un optimo tratamiento que permita la disminución de la transmisión de esta
enfermedad en países en desarrollo como el Perú.
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Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular
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Frecuencia de mutaciones genéticas asociadas a multidrogoresistencia en Mycobacterium tuberculosis
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Fig. Nº 01: Patrones de aislamientos de Mycobacterium tuberculosis
multidrogoresistentes procedentes de pacientes con diagnóstico de
tuberculosis pulmonar de Lima Ciudad y Lima Este, período Marzo a Setiembre
del 2003.
M.tb H37Rv
M. bovisP3
Único
Haarlem 3
Haarlem 1
Unico
T1
Único
Haarlem 3
T1
LAM5
Único
LAM9
T1
LAM3
Único
Único
T1
X1
T1
Haarlem 3
Negativo
Único
Haarlem 3
Único
Único 1
Único
Haarlem 3
Único
Único
Beijiing
Unico
LAM5
Único
Beijiing
LAM9
Unico 1
Haarlem 3
Unico 1
T1
Unico
Frecuencia de mutaciones genéticas asociadas a multidrogoresistencia en Mycobacterium tuberculosis