FUNDACION PRODUCE CHIHUAHUA, A

FUNDACION PRODUCE CHIHUAHUA, A.C.
FORMATO DE PROTOCOLO EN EXTENSO PARA PROYECTOS
Titulo del Proyecto: CONSERVACIÓN DE CEPAS DE Mycobacterium bovis,
AISLADAS EN EL ESTADO DE CHIHUAHUA.
Sector: Pecuario y/o Laboratorio, Comité, Unión Ganadera.
Sistema Productivo: Bovinos Leche y/o cepas de Mycobacterium bovis.
Tipo Proyecto: Transferencia de tecnología. Este proyecto es con la finalidad de
contar con un banco de cepas de Mycobacterias aisladas en el Estado de Chihuahua.
Estabón: Primario.
Estatus del Proyecto: Nuevo.
Fecha de Inicio: 2010/03/18
Fecha de Término: 2013/03/18
Grupo de Interés: Unión Ganadera Regional de Chihuahua y Comité Estatal de
Fomento y Protección Pecuaria de Chihuahua, AC.
Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Microbiología Animal INIFAP.
Finalidad: Este proyecto es con la finalidad de contar con un banco de cepas de
Mycobacterias aisladas en el Estado de Chihuahua.
Propósito: Se pretende con esta acción contar con cepas tipificadas genéticamente y
con esto regionalizar los aislamientos de Mycobacterium bovis para realizar mapas
nozoologicos de tuberculosis bovina en el Estado de Chihuahua.
Demanda: El laboratorio del Comité de Fomento y Protección Pecuaria del Estado de
Chihuahua en la actualidad realiza el diagnóstico de Tuberculosis bovina con métodos
mleculares así como su tipificación. Por lo que es necesario contar con el apoyo de
la Fundación Produce Chihuahua para establecer un banco de cepas de
Mycobacterium bovis tipificadas genéticamente y su preservación.
Descripción del Producto: Contar con un método de conservación de cepas aisladas
de Mycobacterium bovis en el Estado de Chihuahua.
Tipificar las cepas aisladas por métodos moleculares.
Conservar el ADN de dichas cepas.
Municipios: Todos los Municipios del Estado de Chihuahua que envíen muestras al
Centro de Diagnóstico Integrado y de Investigaciones en Salud Animal del Estado de
Chihuahua.
Palabras Clave: Banco de Cepas de Mycobacterias.
Introducción: La Tuberculosis Bovina es una zoonosis producida por Mycobacterium
bovis que causa una enfermedad crónica que conduce a una baja producción de
leche y carne. A pesar de que el hospedador primario es el bovino, otras especies de
interés económico son infectados con M. bovis, incluidos animales de vida salvaje los
que pueden ser hospedadores. La principal motivación para la erradicación de la
Tuberculosis bovina en los países lo constituye primariamente el riesgo para la salud
humana y luego la prohibición de la comercialización de productos bovinos y la
disminución en la productividad del ganado.
Antecedentes: En los últimos 20 años se han desarrollado nuevos métodos de
aislamiento, identificación, estudios de sensibilidad y tipificación, para las
micobacterias. Además, aunque con menor importancia en el ámbito de la salud
pública, la frecuencia de aislamiento de micobacterias no tuberculosas va
aumentando y, al mismo tiempo, se van describiendo nuevas especies susceptibles
de producir patología. En el año 1975 el género Mycobacterium comprendía
alrededor de 30 especies, actualmente se han descrito alrededor de un centenar. Es
necesario llegar en la identificación al nivel de especie para orientar el tratamiento de
las distintas micobacterias, incluso dentro del complejo tuberculosis.
Los objetivos que se persiguen para conservar las cepas microbianas en un
laboratorio son: cultivos puros, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos
el 70-80% de las células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente
estables. Los dos primeros objetivos no son muy difíciles de conseguir pero el tercero
puede presentar dificultades, por tal motivo existen varios métodos de conservación
para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilización general.
MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO: Son los mejores ya que se
paraliza el crecimiento de las células microbianas garantizando al máximo la
estabilidad genética. Dentro de estos métodos encontramos la congelación y la
liofilización.
MÉTODOS ALTERNATIVOS: Se utilizan cuando no se pueden utilizar los métodos de
conservación a largo plazo ya sea por falta de equipo y/o que la cepa no se adapte a
estos métodos. Dentro de estos métodos encontramos la transferencia periódica,
suspensión en agua estéril y/o agentes nutritivos. Conviene tener en cuenta que
nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el
microorganismo empleando varios de estos métodos.
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Problemática: El laboratorio del Comité de Fomento y Protección Pecuaria del Estado
de Chihuahua en la actualidad realiza el diagnóstico de Tuberculosis bovina con
métodos moleculares así como su tipificación. Por lo que es necesario contar con el
apoyo de la Fundación Produce Chihuahua para establecer un banco de cepas de
Mycobacterium bovis tipificadas genéticamente y su preservación.
Justificación: En los últimos años han aparecido un conjunto importante de técnicas
nuevas que es necesario utilizar de manera complementaria para generar una
información rápida y completa. El laboratorio ha desarrollado técnicas de amplificación
de ácidos nucleicos para la detección de micobacterias y la tipificación molecular para
la identificación de cepas de interés, pero se ha hecho indispensable la preservación
de dichas cepas para seguir con su estudio. Por lo que el objetivo de este trabajo es
contar con un banco de cepas de Mycobacterias aisladas en el Estado de Chihuahua,
para su tipificación genética y regionalización de los aislamientos para la realización
de mapas nozoológicos de tuberculosis bovina en el Estado.
MATERIALES Y METODOS:
Material de campo.
Con al apoyo de la campaña estatal de tuberculosis bovina, se tomarán muestras de
campo para aislar mycobacterias, estas muestras se les extraerá ADN, para
procesarlas por Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR, con iniciadores
específicos para Micobacterias del Complejo Mycobacterium Tuberculosis CMT.
Existen varios métodos para extraer ADN de diferentes organismos el que a
continuación se presenta puede ser utilizado para tejido, fluidos y bacterias aisladas.
Procedimiento.
A) Tomar 100 µg de tejido y ponerlo en 450 µl de PBS. Centrifugar a 12,000 g durante
1 minuto y decantar el sobrenadante.
B) Tomar 10 ml de muestra de fluidos y Centrifugar a 12,000 g durante 1 minuto y
decantar el sobrenadante.
C) Tomar 10 ml de cultivo bacteriano , centrifugar a 12,000 g durante 5 minutos
decantar el sobrenadante.
D) Tomar 3 colonias de bacterias, agregar 500 µl PBS y centrifugar a 12,000 g
durante 5 minutos decantar sobrenadante.
E) Agregar 400 µl de TE mas 50 µl de lisozima (10 mg/ml), agitar en vortex e incubar
al menos 1 hora ( puede ser toda la noche) a 37° C.
F) Adicionar 75 µl de SDS al 10%/ y 6 µl de proteinasa K (10 mg/ml), agitar en vortex
e incubar durante 10 minutos a 65° C.
G) Adicionar 100 µl de NaCl 5M
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H) Adicionar 100 µl de una solución de CTAB/NaCl (precalentada a 65° C.), agitar en
vortex hasta que la mezcla tome una forma
lechosa. Incubar a 65° C. Durante 10 minutos.
I) Adicionar aproximadamente 750 µl de una solución de cloroformo/alcohol
isoamílico, agitar con vortex durante 10 segundos y
centrifugar 5 minutos a 12,000 g.
J) Transferir el sobrenadante en volúmenes de 200 µl a un micro tubo limpio y estéril
(aproximadamente 600 µl, tniendo cuidado
de no tomar la Interfase lo cual podría contaminar el ADN.
K) Al volumen obtenido agregar alcohol isopropílico en una cantidad que represente el
60%. Si se obtuvieron 600 µl de sobrenadante
agregar 360 µl de isopropanol.
L) Dejar reposar la muestra a -20° C. Durante 30 minutos.
M) centrifugar a 12,000 g durante 15 min.
N) Descartar el sobrenadante dejando aproximadamente 20 µl sobre el precipitado.
O) Adicionar 500 µl de alcohol etílico al 70% agitar el tubo con la mano unas 10
veces. Centrifugar 5 minutos a 12,000 g. Descartar el
sobrenadante dejando al menos 2 µl sobre el precipitado.
P) Centrifugar a 12,000 g durante 1 minuto y descartar cuidadosmante con un pipeta
el sobrenadante. Observar que no quedan rastros de
etanol.
Q) Permitir secar el ADN a temperatura ambiente durante 45 minutos, o secar en una
centrífuga de vacío durante 20 minutos a 40° C.
R) Resuspender el ADN en T, la suspensión puede ser almacenada a 4°C. Para su
uso futuro.
S) Para estimar la cantidad de ADN correr un gel de agarosa al 0.8% en una solución
de TBE o TAE.
Las muestras que sean positivas a la prueba de PCR serán sometidas a
Spoligotyping, esto con el fin de determinar sus características por de patrones
genéticos.
Obtención de las cepas de micobacterias.
También con la ayuda de la Campaña de Erradicación de la Tuberculosis Bovina en el
Estado de Chihuahua, se contará con aislados de diferentes regiones del estado. Los
aislados se cultivarán en medios específicos y se tipificarán por métodos bioquímicos
y moleculares, se resembraran para obtener al menos 150 mg de biomasa bacteriana
de cada una de las cepas que se obtengan.
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A estas bacterias aisladas también se les extraerá el ADN y se procesarán de la
misma forma que las muestras clínicas. y serán analizadas por PCR y Spoligotyping.
Para evaluar la cantidad y calidad del DNA extraído de las micobacterias se
determinará la absorbancia 260 y 280 nm.
“Spoligotyping”
El DNA de los distintos aislados se amplificará por PCR utilizando un par de
oligonucleótidos específicos dirigidos contra la región DR, ( DRa
5’ GGT TTT GGG TCT GAC GAC 3’ marcado con biotina en la región 5’ y DRb 5’
CCG AGA GGG GAC GGA AAC 3’. Los productos de amplificación serán hibridados
con una serie de oligonucleótidos sintéticos cuyas secuencias corresponden a las
regiones espaciadoras de las DR de M tuberculosis y M. bovis BCG, los que estarán
unidos covalentemente a una membrana de nylon en carriles paralelos y las
hibridaciones se detectarán utilizando un conjugado de estreptoavidina - peroxidasa y
un sustrato quimiluminiscente de acuerdo con el procedimiento descrito por van
Soolingen (37).
Análisis de los datos
Con las radiografías se construirá una matriz “0s” y “1s” de acuerdo a la ausencia (0)
o presencia (1) de fragmentos presentes en las
réplicas de cada aislado. Esta matríz se utilizará para determinar el índice de distancia
genética (D=1-S), entre cada par de aislado siguiendo
la metodología de Nei y Li (36) donde:
S= [2 Nab / ( Na + Nb)]
S= Similitud
Nab= Número de bandas de los aislados a y b tiene en común.
Na= Número de bandas en aislados a.
Nb= Número de bandas en aislados B.
La matriz de distancias genéticas para los diferentes aislados se obtendrá con el
programa de computadora RAPDPLOT desarrollada por
Black (38) para análisis filogenéticos de poblaciones. Para el agrupamiento de
aislados por similitud genética en un dendrograma (árbol
genético) la información en la matriz de distancia genética, será evaluada por un
análisis grupal (clusters) por el método de UPGMA
(“unweigteg pairwise group method averages, clusters analysis) (39). El análisis se
llevará a cabo usando los programas NEIGHBOR y
DRAWGRAM del paquete computacional para análisis filogenéticos PHYLIP
desarrollado por Felsenstein (40), en la Universidad de
Washington, Seattle; Microsoft Drawing será utilizado para obtener los dendrogramas
de alta calidad resolutiva.
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Aislamiento de cepas
Tipificación de cepas por
pruebas bioquímicas.
Tipificación de cepas por
técnicas moleculares.
Elección del método de
conservación
Implementación del método
de conservación
Extracción de ácidos
nucleicos de las cepas
conservadas
Tipificación de cepas por
técnicas moleculares.
Implementación del
método de conservación
de ADN
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CRONOGRAMA DE PRODUCTO:
Producto a generar
Tipo de Producto
Contar con un método de
conservación
de
cepas
aisladas de Mycobacterium
bovis en el Estado de
Chihuahua.
Tipificar las cepas aisladas por
métodos moleculares.
Elección del método de
conservación.
Trimestre
Implementación
del
método de conservación.
Extracción de ácidos
nucleicos.
Tipificación de cepas.
Conservar el ADN de dichas Elección del método de
cepas.
conservación de ADN.
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